JPS6311341B2

JPS6311341B2 -

Info

Publication number: JPS6311341B2
Application number: JP13848685A
Authority: JP
Inventors: Masa Narita; Kenichi Yano; Koichi Yokoi; Kazuhiko Irinoda; Toshiaki Nakajima
Original assignee: SSP Co Ltd
Current assignee: SSP Co Ltd
Priority date: 1985-06-25
Filing date: 1985-06-25
Publication date: 1988-03-14
Also published as: JPS62434A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、新規化合物SS7313A及びその製造
法並びにこれを含有する免疫調節剤に関する。〔従来の技術及びその問題点〕従来、数多くの免疫調節作用を有する化合物が
天然物中から単離され、また合成によつて製造さ
れている。しかし慢性関節リウマチや全身性エリテマトー
デスなどの自己免疫疾患に対して、満足できる効
果を示す医薬は未だ得られていない。本発明者らは新規で有用な物質を得べく、天然
の土壌から数多くの微生物を単離し、その生産物
について種々研究を行なつた結果、福岡県北九州
市の土壌から分離した菌株が抗腫瘍作用を有する
抗生物質SS7313Bを生産することを見出し、先に
特許出願した（特願昭58−232595号）。〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは、上記菌株の培養液について更に
検討を行なつていたところ、この中にSS7313Bと
は全く異なつた新規な化合物SS7313Aが存在す
ること、そして、この新規化合物が優れた免疫調
節作用を有し、医薬として有用であることを見出
し、本発明を完成した。すなわち、本発明は次の式で表わされる化合物SS7313A及びその製造法並
びにこれを含有する免疫調節剤を提供するもので
ある。本発明のSS7313Aを産生するS7313株は次のよ
うな菌学的性質を有する。 (1) 形態胞子形成菌糸は気菌糸より単純分枝し、車軸
分枝は認められない。気菌糸の先端部は直状又
は波状である。胞子のう、鞭毛胞子、菌核はい
ずれも認められない。また基中菌糸の分断も認
められない。電子顕微鏡観察によると、胞子の
表面は平滑であり、形は円筒形である。胞子の
大きさは0.5〜0.7×0.7〜0.9μmであり、通常50
個以上が連鎖している。 (2) 各種培地における生育状態（27℃、14日間培
養） S7313株の各種培地上での生育状態は次表の
とおりである。

【表】 (3) 生理的性質生育温度範囲（酵母エキス、麦芽エキス寒
天培地、14日培養）生育可能温度８〜37℃ 生育至適温度 27〜30℃ ゼラチンの液化陽性澱粉の加水分解陽性脱脂牛乳の凝固陰性脱脂牛乳のペプトン化陽性メラニン様色素の生成陽性硝酸塩の還元陽性セルロースの分解陰性 (4) 炭素源の利用（プリドハム・ゴドリーブ寒天
培地、27℃、14日培養）Ｄ―グルコース＋Ｌ―アラビノース − シユクロース − Ｄ―キシロース＋イノシトール − Ｄ―マンニトール＋Ｄ―フラクトース＋Ｌ―ラムノース − ラフイノース − ガラクトース＋サリシン＋ (注) ＋は利用する、−は利用しない。以上の性状、及び細胞壁組成としてLL―ジア
ミノピメリン酸を含むことより、S7313株がスト
レプトミセス属に属することは明らかである。さ
らに同菌株の菌学的性状をワツクスマン著「ジ・
アクチノミセテス（The Actinomycetes）」第２
巻（1961年）、シヤーリングとゴツトリーブの
ISP報告「インターナシヨナル・ジヤーナル・オ
ブ・システマテイツク・バクテリオロジー
（International Journal of Systematic
Bacteriology）」第18巻、69頁、279頁（1968
年）、同第19巻、391頁（1969年）、同第22巻、265
頁（1972年）及び「バージーズ・マニユアル・オ
ブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）」第８版（1974年）よりS7313株
の近縁種を検索するとS7313株のように気菌糸の
色がイエロー・カラー・シリーズ、胞子鎖が直状
又は波状で50個以上の胞子が連鎖し、胞子表面が
平滑で、メラニン様色素を生成する株としては、
ストレプトミセス・カボウレンシス
（Streptomyces cavourensis）とストレプトミセ
ス・グリセオブルネウス（Streptomyces
griseobruneus）等の種が認められる。次に
S7313株と上記２種の標準株との比較を行なつた
結果を示すと次表のとおりである。

【表】

【表】上表にみられるようにS7313株とストレプトミ
セス・グリセオブルネウスとは、気菌糸の色調、
裏面の色調、可溶性色素の点で異なる。他方、ス
トレプトミセス・カボウレンシスとは裏面の色
調、可溶性色素がやや異なるがその他の菌学的性
状で両者はよく一致する。したがつて、S7313株
はストレプトミセス・カボウレンシスに属する一
菌株であると同定した。本発明者らはS7313株を公知の菌株と区別する
ためにストレプトミセス・カボウレンシスS7313
（Storeptomyces cavourensis S7313）と命名し、
工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号微工
研菌寄第7357号（FERM Ｐ―7357）として寄託
した。本発明の化合物SS7313Aは、上記菌株を栄養
源含有培地に接種し、好気的に培養することによ
り製造される。SS7313A生産株としては上記
S7313株はもとより、その人工変異株あるいは自
然変異株であつてもSS7313Aを生産する能力を
有するものであれば、すべて本発明に使用するこ
とができる。上記S7313株の人工変異株は、他の
放線菌同様、例えば紫外線、コバルト60照射、化
学変異誘起剤等により容易に得ることができる。次にSS7313Aの製造における菌株の培養につ
いて説明する。すなわち、ストレプトミセス属に
属するSS7313A生産菌株の培養には通常の放線
菌の培養法が用いられる。栄養培地としては、資化しうる炭素源、窒素
源、無機物などを適当に含有する限り合成培地、
半合成培地あるいは天然培地のいずれでも使用可
能である。炭素源としては、例えばグルコース、フラクト
ース、キシロース、ガラクトース、澱粉、グリセ
リン、デキストリン、糖蜜等が単独または組合せ
て用いられる。さらに菌の資化性によつては炭化
水素、アルコール類、有機酸等も用い得る。窒素
源としては、無機もしくは有機窒素化合物、例え
ば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、グルタミン酸ソ
ーダなど、または天然物、例えば大豆抽出物、大
豆粉、酵母エキス、乾燥酵母、綿実粕、ベジタブ
ル・プロテイン、ソイトン等が単独または組合せ
て用いられる。無機物としては、例えば炭酸カル
シウム、塩化ナトリウム、硫酸銅、塩化マンガ
ン、硫酸亜鉛等が単独または組合せて用いられ
る。その他、S7313株の発育を助けSS7313Aの生
産を促進する物質あるいはシリコン油又はアデカ
ノール（商品名）等の一般的消泡剤を適宜培地に
添加することもできる。培養地としては一般の放線菌の培養に用いられ
る方法が採用されるが、通常は液体培地による振
盪培養あるいは深部通気培養が好ましい。培養は
好気的条件下で行なわれ、培養に適当な温度は25
〜30℃であるが一般に27℃付近で培養するのが好
ましい。SS7313Aは振盪培養、深部通気培養の
いずれの場合もその生産量は２〜６日間の培養で
最高に達する。SS7313Aは、通常、菌体及び培
養液中に存在するので、その分離、精製は培養物
を過または遠心分離などによつて菌体と培養
液に分けた後、菌体及び培養液から通常の分離
法、例えば、溶媒抽出法、沈殿法、イオン交換樹
脂法、ゲル過法、吸着または分配カラムクロマ
ト法、透析法等の方法を適宜組合せて行なうのが
良い。好ましい分離、精製法の例としては次の方法が
挙げられる。すなわち、まず培養物を遠心分離に
付し、菌体及び培養液を得る。培養液は有機
溶媒、例えば酢酸エチルを用いて抽出する。菌体
はメチルアルコール、アセトンなどの親水性溶媒
で抽出し、この抽出液を減圧濃縮し、残留物を水
溶液とし、これを酢酸エチルなどを用いて抽出
し、培養液の酢酸エチル抽出液と合わせる。こ
うして得られた抽出液を減圧留去し、残渣をクロ
ロホルムのシリカゲルカラムクロマトグラフイー
に付す。得られた活性画分を減圧留去し、残渣を
さらに、酢酸エチルのシリカゲルカラムクロマト
グラフイーにて精製し、活性画分を集め、減圧濃
縮すると、無色油状のSS7313Aが得られる。以上のようにして得られたSS7313Aは、次の
ような理化学的性質を有する。＜理化学的性質＞分子量及び分子式 198、C₁₁H₁₈O₃ マススペクトル（FAB―MS）ｍ／ｚ 199（Ｍ＋Ｈ）⁺ 比旋光度〔α〕²⁵ _D＋18゜（C0.6、MeOH）紫外線吸収スペクトル第１図 λ^MeOH _naxnm（ε）：276（25700）赤外線吸収スペクトル（液膜法）第２図 ¹H―NMRスペクトル（90MHz）第３図重クロロホルム溶液中、TMSを基準物質と
して測定した。 ¹³C―NMRスペクトル（22.5MHz）重クロロホルム溶液中、TMSを基準物質と
して測定した。 δppm：204.6（ｓ）、143.8（ｄ）、141.1（ｄ）、
130.1（ｄ）、126.8（ｄ）、72.8（ｄ）、60.7（ｔ）、
49.3（ｄ）、35.9（ｔ）、18.6（ｑ）、13.9（ｑ）溶解性クロロホルム、アセトン、メタノールに可
溶。ｎ―ヘキサンに不溶。塩基性、酸性、中性の区別中性物質の色及び性状無色油状呈色反応バニリン―硫酸で黄色を呈する。薄層クロマトグラフイー担体：シリカゲルプレートF₂₅₄（メルク社製）

【表】上記の理化学的性質から、SS7313Aは、次式で示される新規化合物であり、その化学名は、
（6E、8Z）―１，３―ジヒドロキシ―４―メチル
―６，８―デカジエン―５―オンである。また、本発明のSS7313Aは次のように生物学
的性質を有する。＜生物学的性質＞マクロフアージの貧食能抑制作用 SS7313Aのマウス腹腔内マクロフアージの
貧食能に対する抑制効果を下記方法により試験
した。結果を第１表に示す。なお、表中の抑制
率は、SS7313A無投与群の貧食能(C)及び投与
群の貧食能（Ｔ）から、次式により求めた百分
率を以つて表わした。貧食能抑制率（％）＝（１−Ｔ／Ｃ）×100 実験方法： ICRマウスに２mlのチオグリコレート培地を
腹腔内に注射して、腹腔内マクロフアージの遊
出を惹起し、３日後0.4mg／Kg〜400mg／Kgの
SS7313Aを腹腔内に投与した。15時間後ダル
ベツコーリン酸緩衝液で各群の腹腔内マクロフ
アージを採取し、それをプラスチツクシヤーレ
に５×10⁵個／ml分注し、酵母
（Saccharomyces cervisiae）の菌液を加えた。
45分培養した後洗浄し、ギムザ染色を施し顕微
鏡下、酵母を貧食しているマクロフアージの細
胞数を算定し、貧食能とした。

【表】マクロフアージのスーパーオキサイド産生の
抑制作用 SS7313Aのマウス腹腔内マクロフアージの
スーパーオキサイド産生の抑制効果を下記方法
により試験した。結果を第２表に示す。なお表
中の抑制率は、SS7313A無処理群(C)及び処理
群（Ｔ）のスーパーオキサイド産生量から次式
により求めた百分率を以つて表わした。スーパーオキサイド産生の抑制率（％）＝（１−Ｔ／Ｃ）×100 実験方法： ICRマウスに２mlのチオグリコレート培地を
腹腔内に注射して腹腔内マクロフアージの遊出
を惹起し、４日後ダルベツコーリン酸緩衝液
で、腹腔内マクロフアージを採取した。マクロ
フアージ５×10⁵個／mlに対し、SS7313Aを
0.1μg／ml〜100μg／mlの終濃度になるよう添加
し、５％炭酸ガス培養器中で、37℃、2.5時間
培養後、65μMのチトクロームＣを添加し、再
び８分間培養する。次いでサイトカラシンＢを
40μg加えた後コンカナバリンＡを200μg添加
し、最終反応液量を2.0mlとした。マクロフア
ージから産生されるスーパーオキサイドによる
チトクロームＣの還元をダブルビーム比色計を
用い測定し、スーパーオキサイドの産生量を算
定した。

【表】抗体産生の抑制作用 SS7313Aのマウス脾細胞培養による羊赤血
球に対する抗体産生の抑制効果を下記方法によ
り試験した。結果を第３表に示す。なお、表中
の抑制率はSS7313A無処理群(C)及び処理群
（Ｔ）の抗体産生細胞数から次式により求めた
百分率を以つて表わした。抗体産生抑制率（％）＝（１−Ｔ／Ｃ）×100 実験方法：培養マウス脾細胞1.5×10⁷個に、SS7313Aを
0.01μg／ml〜10μg／mlの終濃度になるよう添加
し、1.5×10⁶個の羊赤血球とともに５％炭酸ガ
ス培養器中で37℃で培養し、４日後、各培養脾
細胞中の抗体産生細胞数を算定した。

〔発明の効果〕

本発明のSS7313Aは、免疫系の異常に重要な
役割を果すマクロフアージの貧食能、スーパーオ
キサイド産生能を抑制し、更に抗体産生をも抑制
し、安全性も高いことから免疫調節剤として有用
である。また、SS7313Aを含有する免疫調節剤は、慢
性関節リウマチ、全身性エリテマト−デス等の自
己免疫疾患を予防あるいは治療用として有用であ
る。〔実施例〕次に、実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説
明する。実施例１ SS7313Aの生産菌ストレプトミセス・カボウ
レンシスS7313（微工研菌寄第7357号）を、グリ
セリン1.5％、綿実粕1.5％、塩化ナトリウム0.3
％、Ｌ―アスパラギン0.2％（PH7.0）の液体培地
に接種し、28℃で２日間振盪培養して、種培養液
を調製した。次いで、グリセリン1.5％、グルコ
ース１％、綿実粕1.5％、塩化ナトリウム0.3％、
Ｌ―アスパラギン0.2％、炭酸カルシウム0.3％
（PH7.0）の液体培地16を、30容のジヤーフア
ーメンター中に仕込み、この培地中に前記の種培
養液を200mlを接種し、通気量16／分、撹拌数
400r.p.m、培養温度28℃の条件下で５日間培養し
た。培養終了後、培養液を遠心分離し、得られた
液（13）に７容の酢酸エチルを加え、３回
抽出した。この抽出液を減圧濃縮し、得られた油
状残渣に少量のクロロホルムを加え、不溶物を除
去した後シリカゲルカラムクロマトグラフイーに
供した。あらかじめクロロホルムで充填したキー
ゼルゲル60（メルク社製）のカラム（直径４cm：
長さ30cm）に前記のクロロホルム溶液を通導し、
クロロホルムで溶出した。溶出画分のうち、
SS7313Aの含まれる画分を集め、減圧濃縮し、
粗SS7313Aの淡黄色の油状物質2.8gを得た。次い
でこの油状物質を、酢酸エチルのシリカゲルカラ
ムに供した。あらかじめ酢酸エチルで充填したキ
ーゼルゲル60のカラム（直径３cm：長さ50cm）に
粗SS7313Aの酢酸エチル溶液を導通し、酢酸エ
チルで溶出した。溶出画分のうち、SS7313Aの
含まれる画分を集め、これを減圧濃縮し、
SS7313Aの無色油状物質2.1gを得た。実施例２錠剤下記の成分を常法（湿式法）に従つて打錠し、
１錠当り175mgの錠剤を製造した。 SS7313A 50（重量部）軽質無水ケイ酸 40 乳糖 48 カルボキシメチルセルロースカルシウム 25 ヒドロキシプロピルセルロース 7.5 タルク４ステアリン酸マグネシウム 0.5 計 175（重量部）実施例３カプセル剤下記の成分を常法に従つて散剤とした後、３号
カプセルに充填し、１カプセル当り200mgのカプ
セル剤を製造した。 SS7313A 50（重量部）軽質無水ケイ酸 40 バレイシヨデンプン 57.5 乳糖 50タルク 2.5 計 200（重量部）実施例４顆粒剤下記の成分を常法に従い押し出し造粒機にて、
顆粒となし、１包当り1000mgの顆粒剤を製造し
た。 SS7313A 100（重量部）軽質無水ケイ酸 80 結晶セルロース 200 乳糖 605ヒドロキシプロピルセルロース 15 計 1000（重量部）実施例５注射剤下記の成分で、SS7313Aを可溶化し、注射剤
を製造した。 SS7313A 100mg ポリソルベート80 600mg プロピレングリコール 500mgブドウ糖 200mg 注射用蒸留水にて、全量を５mlとする。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明化合物SS7313Aの紫外線吸収
スペクトル、第２図は同赤外線吸収スペクトル、
第３図は同 ¹H―NMRスペクトルをそれぞれ示
す図面である。

Claims

【特許請求の範囲】１式で表わされる化合物SS7313A。２ストレプトミセス属に属するSS7313A生産
菌を培養し、その培養物からSS7313Aを採取す
ることを特徴とするSS7313Aの製造法。３ SS7313A生産菌がストレプトミセス・カボ
ウレンシスS7313（Streptomyces cavourensis
S7313）株である特許請求の範囲第２項記載の製
造法。４式で表わされる化合物SS7313Aを含有する免疫調
節剤。