CN1840684A - 利用链霉菌发酵生产诺西肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诺西肽的发酵制备方法，该方法利用发明人筛选并保藏的具有生产诺西肽能力的链霉菌(Streptomyces glaucogriseus)HSC－SN－1－52，CCTCC No.M 205133，在优化条件下发酵培养该新菌株，包括：发酵培养基配方筛选，硫源及特定氨基酸的补加发酵工艺选定，发酵液采用逆流色谱精制法制得诺西肽制品。本发明所得菌种诺西肽产率达1500mg/L以上，收率为75％以上。

Description

利用链霉菌发酵生产诺西肽的方法

(一)技术领域  本发明涉及一种新的能大量合成诺西肽能力的微生物链霉菌，还涉及利用该微生物链霉菌发酵生产诺西肽的方法。

(二)背景技术

诺西肽是一种含硫多肽类抗生素，最初由一株从阿根廷土壤中分离到的链霉菌经培养后产生的。后来的研究者又找到了产生诺西肽的其他链霉菌菌种。目前诺西肽的产生菌主要有活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)、抗生素链霉菌(S.antibioticus)和青灰色链霉菌(S.glaucogriseus)。其中人们对活跃链霉菌的研究最多。诺西肽是一种黄色微细结晶粉末，熔点为310-320℃，320℃分解，

几乎无光学活性。元素组成为C49.6％，H 4.0％，N 14.4％，O 16.7％，S 15.8％。诺西肽的分子式为C₅₁H₄₃N₁₃O₁₂S₆，分子量为1222.37。诺西肽易水解，与硫链丝菌素相比更易被氧化。诺西肽可溶于DMF、DMSO、吡啶、氯仿、二氧六环，微溶于甲醇、乙醇、乙酸乙醋，不溶于水，是脂溶性抗生素。诺西肽在体外能有效地抑制革兰氏阳性菌的生长。和大多数硫链丝菌素族的物质一样，诺西肽能够通过紧密结合在23S rRNA的L11蛋白上而阻碍延伸因子Tu和G与50S核糖体的亚基结合，从而抑制细菌蛋白质的合成，达到抑菌的作用确。诺西肽对革兰氏阳性的球菌、杆菌以及对青霉素、链霉素、四环素以及其它一些诸如新生霉素、螺旋霉素等的耐药葡萄球菌有抑菌活性，同时诺西肽对一些革兰氏阴性菌，如卡他奈必瑟氏菌(Nersseria catarrhalis)出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella mul tooida)有抑菌活性。在体外实验中，诺西肽对葡萄球菌和链球菌的活性与青霉素G相似，或优于青霉素G。但在动物体内实验中，诺西肽对经过葡萄球菌和链球菌感染过的小鼠无作用。

诺西肽的分子结构如下：

诺西肽有水溶性差、毒性极低和在动物体内无残留的特点，解决畜禽的肉、蛋、奶中的抗生素残留问题，而且仅以5-10ppm的浓度加入饲料中就可以提高禽畜的出肉率7％，也可加入鱼饵中有预防鱼类的坏死性肠炎和加快其生长的作用，对鸡和猪的生长也有很好的效果。还有文献报道，诺西肽还有抑制乙肝病毒抗原分泌，同时还有促进肝细胞生长的作用。由于它具有用量低、应用范围广、动物体内不残留等特点。又可明显促进鸡、猪、鱼等动物的生长，目前它最大的用途是被开发成一种商品化的新型非吸收型的饲料添加剂。

80年代法国和日本已正式用此抗生素作饲料添加剂，目前只有少数几个国家掌握了其生产工艺。由于其水溶性差尚不能应用于临床，各国抗生素专家都致力于它的生物合成途径和基因工程的研究(Markus C C，Torsten S，Kevin P F，el al.Pyridinyl polythiazole class peptide antirioticmicrotic micrococcin，Secreted by foodbornh staphylococcus eguorm Ws2733.is biosynthe sized nonribosomally.Eu J Biochem，2001，268：6390-6392；周佩，李继杨，张玲等，诺西肽突变生物合成的研究，中国抗生素杂志，1995，20(3)：159-162)，企图改变其生物合成途径，获取结构改变的类似化合物用于临床。美国Floss实验室在对诺西肽的结构改造或修饰方面做了大量的工作，并用同位素示踪等方法对这一天然抗生素的生物合成途径、分子结构中C、N骨架的来源等加以研究(Floss H G.Biosynthesisof the thiopeptide antibiotic nosiheptide and thiostrepton.InternationalCongress on Natural Products Park City Utah，1988，July，17)，取得了大量的研究成果。例如，通过补加一系列带有多重标记的相同或者不同的稳定同位素的前体试验得到了诺西肽的组成信息。补加L-[1，2-¹³C₂]-Ser和L-[2，3-¹³C₂]-Ser后用¹³c-¹³c核磁(NMR)分析结果表明，Ser作为一个完整的三碳单位掺入到吡啶环中，两分子的Ser形成独特的吡啶环，同时Ser通过脱水形成脱氢丙氨酸参与诺西肽的合成，Ser衍生成Cys后共同合成噻唑环部分。¹³C双标记的色氨酸(Trp)(-COOH和吲哚环C-2)试验明确显示了-COOH经过分子内重排连接于吲哚环的C-2上，同时α-C和侧链上的氮丢失，亚甲基还原为甲基，只有C-4上的一碳单位来自于蛋氨酸(Met)的甲基。

从九十年代初开始，国内周佩等人引入美国华盛顿大学菌种就诺西肽的发酵工艺和菌种诱变方面开始进行研究，而国外在八十年代末到九十年代则在进行诺西肽的生物合成，以及诺西肽片段的化学合成研究。通过放射性物质及C标记的前体物的补料实验，对活跃链霉菌合成诺西肽进行了研究(周佩，李继杨，张玲等，诺西肽突变生物合成的研究，中国抗生素杂志，1995，20(3)：159-162)，发现至少有五种氨基酸(Glu、Cys、Thr、Ser、Trp)直接参与了诺西肽的生物合成。根据参与的能力的强弱依次为丝氨酸、L-甲基甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸、谷氨酸、半胱氨酸。尽管实验发现1mmol/L的半胱氨酸已抑制了诺西肽的生物合成，但是在更低的浓度下仍可以检测到半胱氨酸掺入到诺西肽的分子中。丝氨酸是一个十分有效的前体物，同时它也参与了一碳代谢。丙氨酸虽然是脱氢丙氨酸的可能前体，但它不参与诺西肽的生物合成。放射活性显示苏氨酸明显地参与了诺西肽的生物合成。根据对已知的含杂环的抗生素的新生肽链合成的机制，Mocek等III推测硫肽类抗生素的合成机制是非核糖体合成。

我国在80年代末期由周佩等开始进行研究(饲料添加剂那西肽的深层培养研究，工业微生物，1990，20(3)：7；含硫多肽类抗生素那西肽的菌种诱变及产量提高，工业微生物，2000，30(1)：50-52)，利用经典的方法对菌种进行诱变处理，使产量达到了1500u/ml，是出发菌株的1.6倍。发酵工艺主要包括培养温度、培养时间、初始pH、接种量、培养基组成等方面。周佩等对诺西肽的发酵工艺进行了比较详细的研究，获得了较为适用于工业生产的摇瓶配方。

Tanaka等发现诺西肽产生菌Streptomyces antibioticus 8446-CCl后，曾对其发酵工艺作了初步的研究，所用的培养基配方为糊精(2.5％)、干酵母(2.0％)，NaCl(0.5％)，CaCO₃(0.4％)，以上培养基120℃灭菌20分钟。种子培养基配方与发酵培养基相同。种子用摇瓶培养48小时27℃后以2％的接种量转入发酵罐中，27℃，300r/min培养96小时，培养过程中要求良好的通气效果，每分钟通入的空气的体积与发酵液的体积之比为1∶10。经此后再无报道。

目前诺西肽的检测方法主要有微生物效价测定法(中华人民共和国药典，二部，北京：化学工业出版社，2000：81)，分光光度法(李霞，吴佩玲，林文彬，等，分光光度法在诺西肽工业生产中的应用，中国医药工业杂志，1999，30(12)：548)，薄层色谱法(Claude P，Claude G.MarieM.Indentification of nosiheptide in feeds and detection of residues in animaltissues.J Asoc Off Anal Chem，1979，62(5)：976)，高效液相色谱法(HPLC)。其中分光光度法测定诺西肽的含量能快速了解生产水平，对于生产的中间控制有较大意义，并且与微生物效价测定法无显著性差异。

周佩、李霞等在对那西肽的分离提取和精制的研究结果表明(饲料添加剂那西肽的分离提取和精制，工业微生物，1992(6)：19-22)，乙醇、丙酮、甲醇以及四氢呋喃对菌丝体内那西肽的提取效果较好。考虑到价格和毒性，采用丙酮和乙醇比较合适。在pH9.0时提取效果最好。精制时，将粗品溶于少量四氢呋喃，过滤，滤液浓缩(必须仍然是清的，如果见混浊需重新过滤)，然后加入正己烷，有少量黄色沉淀析出，放冰箱过夜，离心，得沉淀。再用四氢呋喃溶解，正己烷沉淀，然后真空干燥，即得精品。或者将粗品溶于少量混合溶剂(二氯甲烷∶无水乙醇＝4∶1)中，过滤，滤液加入等体积的乙醚，少量沉淀(絮状)出现，加塞，静置，在布氏漏斗上过滤，得滤饼，用乙醚洗两次，干燥，即得精品。

由上述文献资料可见，目前关于诺西肽的生产菌株研究主要集中于活跃链霉菌，本菌株Streptomyces glaucogriseus HSC-SN-1-52是自行从土壤中分离到的，其合成诺西肽的研究尚未见有报道；采用逆流色谱精制诺西肽的研究也未见有报道。

(三)发明内容  本发明的任务是提供一种能合成诺西肽的微生物菌株，并提供一种利用该新的微生物发酵生产诺西肽的方法。

本发明的能合成诺西肽的的微生物新菌株，是链霉菌的一个菌种：Streptomyces glaucogriseus HSC-SN-1-52，此菌株是从土壤中培养分离筛选得到。

此菌株已于2005年11月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保存号CCTCC No.M 205133。

此菌株的形态学特征如下：

1、形态特征

菌株菌落呈灰绿色绒状、表面有皱。在酵母膏麦芽浸汁培养基(ISP2)上培养15天，在光学显微镜和电子显微镜下可以观察到气生菌丝和基内菌丝多、发达，菌丝不断，成熟培养特长有孢子链；孢子链长，着生于气生菌丝上，呈螺旋型；在气生菌丝上形成长螺旋链的孢子。孢子卵形，成熟孢子表面可能带刺。孢子不游动。

2、培养特征

在大多数培养基中，气生菌丝白色，孢子蓝灰色、青灰色，绿灰色等；在其它培养基中为绿色，绿灰色等。

3、生理生化特征

参照《伯杰氏细菌分类手册》第9版的内容进行生理生化鉴定。不还原硝酸成亚硝酸盐；明胶中度液化(10天)；石蕊牛奶微弱胨化(10天)；蛋白胨-酵母膏-铁琼脂及酪氨酸培养基上产类黑精素。水解腺嘌呤、次黄嘌呤和酪氨酸，但不水解鸟嘌呤、黄嘌呤(5天)。利用侧金盏花醇、半乳糖、葡萄糖、肌醇、麦芽糖、蜜二糖、鼠李糖、水杨苷；中度利用阿拉伯糖、果糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、棉子糖、核糖、蔗糖、海藻糖、木糖；微弱利用半乳糖醇；不利用甘油。

4、细胞壁化学组成

细胞壁水解物含有L，L-二氨基庚二酸，细胞壁I型。为典型的链霉菌(Streptomyces)。

5、菌种分类

依据形态特征与胞壁化学成分定属的原则，本菌种属于链霉菌属(Streptomyces)；依据培养特征与生理特征定种的原则，确定其与青灰链霉菌(Streptomyces glaucogriseus)特征最为接近，故暂定名为青灰链霉菌。但该菌种在孢子形态、颜色及牛奶胨化等方面与青灰链霉菌不同，而且有关该菌种的文献报导很少，推测其为一种青灰链霉菌变种。该菌种产一种诺西肽抗生素。

该新的菌株通常所用的培养基含有：碳源(例如葡萄糖、乳糖、淀粉等)，氮源(如黄豆饼、鱼粉、硫酸铵、硝酸盐等)，有机营养物质(如酵母抽提物，蛋白胨，胰蛋白胨，植物蛋白胨，牛肉膏，玉米浆)，无机营养成分(如硫、镁、钾、锌、铁、钴和锰)等。培养条件：好氧培养，pH7.2至7.6，温度25℃至30℃，最好在28℃～30℃，培养3～8天。

本发明所涉及的微生物Streptomyces glaucogriseus HSC-SN-1-52(CCTCC No.M 205133)是通过以下的程序筛选得到的：

取分离土样→加入适当浓度制霉菌素和酚进行分离筛选→诺西肽测定→菌种诱变筛选→高产菌种HSC-SN-1-52→菌种保藏。

筛选用的培养基为斜面培养基，其配方(各重组份重量百分比，g/L)：可溶性淀粉2.0；牛肉膏0.1；NaCl 0.05；FeSO₄ 7H₂O 0.0001；K₂HPO₄0.05；KNO₃ 0.1；MgSO₄ 7H₂O 0.05；Agar 2.2；pH7.2～7.6。

本发明的另一重要特征是利用该新的微生物Streptomycesglaucogriseus HSC-SN-1-52(CCTCC No.M 205133)制备诺西肽的方法，包括：

(1)将菌株CCTCC No.M 205133进行斜面活化，菌种在28℃下斜面培养3～5天，然后种子培养2～3天，摇瓶种子培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：可溶性淀粉3.0；酵母粉0.1；黄豆粉2.0；FeSO₄ 7H₂O 0.0001；K₂HPO₄ 0.05；MgSO₄ 7H₂O 0.05；Agar 2.2；pH7.2～7.6；

(2)配制发酵培养基，经灭菌后接菌种，发酵培养基配方，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：玉米淀粉3-4.5，葡萄糖0.5-1.5，黄豆粉3-4.5，酵母粉0.1-0.3，NaCl 0.4，CaCO₃ 0.4，自来水配制，调节pH7.2～7.6；

调节pH用1mol/LNaOH调节。

(3)发酵工艺

a.菌种的接种量为发酵培养基溶液的5％～10％(同单位体积之比)；

b.发酵过程中，长菌温度为28℃～30℃，时间为5～8天；

(4)分离提取：发酵结束，发酵液用等量的95％乙醇浸泡提取，提取液真空浓缩至1/4体积。

(5)精制：加等体积正丁醇溶解，上逆流色谱仪进行分离，收集诺西肽馏分浓缩蒸干即可，诺西肽得率为78.2％(测定方法：中华人民共和国药典.二部.北京：化学工业出版社，2000：81)。目前诺西肽的检测方法主要有微生物效价测定法(中华人民共和国药典，二部，北京：化学工业出版社，2000：81)，分光光度法(李霞，吴佩玲，林文彬等，分光光度法在诺西肽工业生产中的应用，中国医药工业杂志，1999，30(12)：548)，薄层色谱法(Claude P，Claude G.Marie M.Indentification ofnosiheptide in feeds and detection of residues in animal tissues.J Asoc OffAnal Chem，1979，62(5)：976)，高效液相色谱法(HPLC)。其中分光光度法测定诺西肽的含量能快速了解生产水平，对于生产的中间控制有较大意义，并且与微生物效价测定法无显著性差异。

本发明发酵过程中培养液内补充硫源，或补充硫源和特定氨基酸丝素肽，可促进诺西肽的合成，补加方式为间歇补加；补加的硫源是硫酸钾，间歇三次添加硫酸钾总量为0.001～0.2克；硫源的提供方式可以是其水溶液，或者是固体粉末直接添加，其水溶液浓度为0.4％；基酸丝素肽分间歇三次添加，总量为0.002～0.4g。

本发明具有如下特点：

采用本发明的菌株Streptomyces glaucogriseus HSC-SN-1-52(CCTCCNo.M 205133)具有产生诺西肽的能力，摇瓶培养诺西肽产率1700mg/L，10升罐上培养7天诺西肽产率1500mg/L；发酵72小时、96小时、120小时补加硫源和/或特定氨基酸促进诺西肽的合成；诺西肽的分离提取采用逆流色谱工艺进行，诺西肽的收率达78.2％。

(四)具体实施方案  下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是限制本发明的范围。

实施例1：

斜面培养基配方：各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L，其配比为：可溶性淀粉2.0；牛肉膏0.1；NaCl 0.05；FeSO₄ 7H₂O 0.0001；K₂HPO₄ 0.05；KNO₃ 0.1；MgSO₄ 7H₂O 0.05；Agar(即琼脂粉)2.2；pH7.2～7.6；

发酵培养基配方(各组分的含量均为重量体积百分比，g/L)：玉米淀粉3；葡萄糖0.5；黄豆粉3.0；酵母粉0.1；NaCl 0.4；CaCO₃ 0.4；pH7.2～7.6；自来水配制；

发酵工艺：

将菌株CCTCC No.M 205133进行斜面培养活化，斜面菌种培养3-5天；

按上述发酵培养基配方配制80mL发酵液于500ml三角瓶中，经灭菌后接种，菌种的接种量为培养基溶液的5％(以斜面孢子悬浮液接种)，即4mL孢子悬浮液；300转/分，25℃～30℃振荡培养5天；发酵结束，分光光度法测定发酵液诺西肽效价为870mg/L。

实施例2：

斜面培养基配方：同实施例1；

发酵培养基(各组分的含量均为重量体积百分比，g/L)：玉米淀粉4.0；葡萄糖1.0；黄豆粉3.5；酵母粉0.3；NaCl 0.4；CaCO₃ 0.4；pH7.2～7.6；自来水配制；

发酵工艺：

将菌株CCTCC No.M 205133进行斜面培养活化，斜面菌种培养3-5天；

按上述发酵培养基配方配制80mL发酵液于500ml三角瓶中，经灭菌后接种，菌种的接种量为培养基溶液的7％，即5.6mL孢子悬浮液((以斜面孢子悬浮液接种)；300转/分，28℃～30℃振荡培养8天；发酵72小时、96小时、120小时分别进行补加硫源(三次共加入硫酸钾的量为0.001g，以浓度为0.4％的硫酸钾溶液方式加入，加入的体积数，以总量0.001g硫酸钾为标准)及特定氨基酸(三次共加入0.002g丝素肽)；发酵结束，分光光度法测定发酵液诺西肽效价为1700mg/L。

实施例3：

斜面培养基：同实施例1；

摇瓶种子培养(各组分的含量均为重量体积百分比，g/L)：可溶性淀粉3.0；酵母粉0.1；黄豆粉2.0；FeSO₄ 7H₂O 0.0001；K₂HPO₄ 0.05；MgSO₄7H₂O 0.05；Agar 2.2；pH7.2～7.6；

发酵培养基(各组分的含量均为重量体积百分比，g/L)：玉米淀粉4.5；葡萄糖1.5；黄豆粉4.0；酵母粉0.3；NaCl 0.4；CaCO₃ 0.4；pH7.2～7.6；自来水配制；

硫源的提供方式：接种培养72小时、96小时、120小时间歇补加三次；

发酵工艺：

将菌株CCTCC No.M 205133进行斜面培养活化，斜面菌种培养3-5天；然后接种入摇瓶种子培养基中进行摇瓶菌种培养，摇瓶菌种培养2-3天；

按上述发酵培养基配方配制10L发酵液于发酵罐中，经灭菌后接种子液，菌种的接种量为培养基溶液的7％，即700mL；在开始培养72小时、96小时、120小时共加入0.2g硫酸钾(三次共加入硫酸钾的量为0.2g，以浓度为0.4％的硫酸钾溶液方式加入，加入的体积数，以总量0.2g硫酸钾为标准)；发酵过程中发酵温度28℃～30℃，搅拌转速220转/分，通气量1∶0.8～1.5(vvm)，时间6天；分光光度法测定诺西肽产率为1100mg/L；

诺西肽的提取精制：发酵结束，发酵液采用95％乙醇进行浸泡，离心机进行固液分离收集滤液，真空浓缩至1/4体积；用正丁醇溶解，上逆流色谱分离收集诺西肽组分，逆流色谱转速为800转/分，溶剂体系为正丁醇-水(1∶1)，然后浓缩蒸干，诺西肽收率76％，产品纯度86.4％。

实施例4：

斜面培养基：同实施例1；

摇瓶种子培养：同实施例3；

发酵培养基(各组分的含量均为重量体积百分比，g/L)：玉米淀粉4.5；葡萄糖0.5；黄豆粉4.4；酵母粉0.3；NaCl 0.4；CaCO₃ 0.4；pH7.2～7.6；自来水配制；

硫源的提供方式：接种培养72小时、96小时、120小时间歇补加三次；

发酵工艺：

将菌株CCTCC No.M 205133进行斜面培养活化，斜面菌种培养3-5天；然后接种入摇瓶种子培养基中进行摇瓶菌种培养，摇瓶菌种培养2-3天；

按上述发酵培养基配方配制10L发酵液于发酵罐中，经灭菌后接种子液，种子液的接种量为培养基溶液的10％，即1000mL；在开始培养72小时、96小时、120小时共加入0.2g硫酸钾(粉末固体)和特定氨基酸混合物(丝素肽0.4g)；发酵过程中发酵温度控制28℃～30℃，搅拌转速220转/分，通气量1∶0.8～1.2(vvm)，时间7天，分光光度法测定诺西肽产率为1500mg/L；

诺西肽的提取精制：发酵结束，发酵液采用95％乙醇进行浸泡，离心机进行固液分离收集滤液，真空浓缩至1/4体积；用正丁醇溶解，上逆流色谱分离收集诺西肽组分，逆流色谱转速为800转/分，溶剂体系为正丁醇-水(1∶1)，然后浓缩蒸干，诺西肽收率78.2％。产品纯度86.7％。

Claims (7)

1.一种利用链霉菌发酵生产诺西肽的方法，其特征是所述的能生产诺西肽的微生物菌株是链霉菌Streptomyces glaucogriseus HSC-SN-1-52，CCTCC No.M 205133，该菌株与含碳源、氮源、无机盐的培养基，进行发酵，经粗提、精制后获得诺西肽。

2.根据权利要求1所述的制备方法，利用微生物链霉菌CCTCC No.M 205133生产诺西肽的方法，包括：

(1)配制发酵培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，g/L：玉米淀粉3-4.5，葡萄糖0.5-1.5，黄豆粉3-4.5，酵母粉0.1-0.3，NaCl 0.4，CaCO₃ 0.4，自来水配制，调节pH至7.2～7.6；

(2)将菌株CCTCC No.M 205133进行斜面培养活化，摇瓶种子培养，种子液接入上述培养基中进行培养，发酵工艺：

a.种子液的接种量为发酵培养基溶液同单位的5％～10％；

b.发酵过程条件控制：温度为28℃，通风量1∶0.8～1.2vvm，时间为5～8天；

(3)发酵结束，发酵液用有机溶剂粗提、精制等得到精制诺西肽。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(2)的发酵过程中，采取补料方式补加硫源和/或特定氨基酸丝素肽，在接种后72h开始，在120h内加完。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是发酵过程补加的硫源是硫酸钾，分间歇三次添加，总量为0.001～0.2克；硫源的提供方式可以是其水溶液，或者是固体粉末直接添加，其水溶液浓度为0.4％。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是补加的特定氨基酸丝素肽，分间歇三次添加，总量为0.002～0.4g。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是发酵结束后用乙醇溶剂粗提，发酵液采用95％乙醇进行浸泡，离心机进行固液分离收集滤液，真空浓缩至1/4体积，获得诺西肽粗品。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是采用逆流色谱精制，粗提获得的浓缩诺西肽粗品，用正丁醇溶解，上逆流色谱分离收集诺西肽组分，逆流色谱转速为800转/分，溶剂体系为正丁醇-水(1∶1)，然后浓缩蒸干，获得精制诺西肽。