CN107868809B - 一种发酵生产那西肽的方法及发酵培养基 - Google Patents

一种发酵生产那西肽的方法及发酵培养基 Download PDF

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Abstract

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产那西肽的方法及发酵培养基。所述发酵培养基，包括以下重量份的组分：KNO30.5‑1份、(NH4)2SO40.8‑1.5份、NaCl 3‑5份、黄豆粉35‑45份、豆粕粉1‑2.5份、玉米淀粉45‑56份、淀粉酶0.01‑0.02份、轻质碳酸钙3.5‑5份。本发明发酵培养基原料成本低且易于获得，原料成本可降低约23.6％。采用本发明发酵培养基发酵生产那西肽，发酵液中那西肽含量可提高至5630ug/mL，显著优于现有技术，易于大力推广应用。

Description

一种发酵生产那西肽的方法及发酵培养基
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产那西肽的方法及发酵培养基。
背景技术
那西肽(Nosiheptide)又称诺西肽，是一种带有5个噻唑环的多肽类抗生素，其分子式为C51H43N13O12S6，相对分子量为1222。那西肽可用于饲料添加剂，于1998年被中国批准为三类新兽药，那西肽属于大分子物质，在体内不吸收，因此没有残留，目前已被欧共体、北美、日本等国广泛使用。那西肽作为饲料添加剂具有改善饲料利用率、用量低、只有抑菌作用而无杀菌作用、对革兰氏阳性菌有效，与其他抗生素无交叉耐药性、无残留、使用安全，对动物和人无任何毒副作用，对环境影响小等特点，属环保型饲料添加剂。
那西肽原料药的生产主要采用生物合成法。由于生产技术水平的限制，如菌种生产水平低，发酵液粘稠、需氧量大等因素限制，致使生产成本较大，不利于该产品的市场化。
发明内容
本发明目的在于提供一种发酵生产那西肽的方法及发酵培养基。
本发明技术方案如下：
一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，包括以下重量份的组分：KNO30.5-1份、(NH4)2SO4 0.8-1.5份、NaCl 3-5份、黄豆粉35-45份、豆粕粉1-2.5份、玉米淀粉45-56份、淀粉酶0.01-0.02份、轻质碳酸钙3.5-5份。
优选地，所述发酵培养基，包括以下重量份的组分：KNO3 0.5-0.8份、(NH4)2SO4 1-1.2份、NaCl 3.5-4.5份、黄豆粉38-40份、豆粕粉1.5-1.8份、玉米淀粉50-55-份、淀粉酶0.01-0.02份、轻质碳酸钙4-4.5份；
进一步优选地，所述发酵培养基包括以下重量份的组分：KNO3 0.8份、(NH4)2SO4 1份、NaCl 4份、黄豆粉38份、豆粕粉1.5份、玉米淀粉55份、淀粉酶0.015份、轻质碳酸钙4份。
本发明所述发酵培养基既可以制成干品培养基(培养基干粉)，也可以制成液体培养基。
当所述发酵培养基为干品培养基时，其制备方法包括按配方取各原料，按常规方法混合均匀即可。
当所述发酵培养基为液体培养基时，可向上述干品培养基中加入适量水而制成；或者按配比取各原料，按常规方法溶于水中，混合均匀即可。
优选地，所述发酵培养基为液体培养基，包括以下组分：KNO3 0.5-1g/L、(NH4)2S040.8-1.5g/L、NaCl 3-5g/L、黄豆粉35-45g/L、豆粕粉1-2.5g/L、玉米淀粉45-56g/L、淀粉酶0.01-0.02g/L、轻质碳酸钙3.5-5g/L。
优选地，所述发酵培养基为液体培养基，包括以下组分：KNO3 0.5-0.8g/L、(NH4)2SO4 1-1.2g/L、NaCl 3.5-4.5g/L、黄豆粉38-40g/L、豆粕粉1.5-1.8g/L、玉米淀粉50-55-g/L、淀粉酶0.01-0.02g/L、轻质碳酸钙4-4.5g/L。
进一步优选地，所述发酵培养基为液体培养基，包括以下重量g/L的组分：KNO30.8g/L、(NH4)2SO4 1g/L、NaCl 4g/L、黄豆粉38g/L、豆粕粉1.5g/L、玉米淀粉55g/L、淀粉酶0.015g/L、轻质碳酸钙4g/L。
优选地，所述淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶中的一种或两种。
优选地，所述淀粉酶酶活为10000-15000U，进一步优选为15000U。
本发明所述酶活的定义为：1mL酶液在70℃，pH6.0条件下，1分钟液化可溶性淀粉的毫克数。
本发明所述淀粉酶可通过市售购得，例如购自购自江苏锐阳生物科技有限公司。
如无特殊说明，本发明所述发酵培养基、种子培养基均以水配制。
本发明所述发酵培养基中的淀粉酶可在所述培养基灭菌后添加，添加时培养基的温度不超过使所述淀粉酶失活的温度。可以将淀粉酶或淀粉酶溶液无菌处理(非高热灭菌)后添加到所述发酵培养基中。所述无菌处理包括本领域常规方法，例如过滤除菌、辐照灭菌等。
本发明发酵培养基通过将常规发酵培养基中的酵母粉替换为豆粕粉，将葡萄糖替换为玉米淀粉，不但显著降低了原料成本；更重要的是还显著提高了发酵液中那西肽的含量；同时还将发酵时间从70h缩短到62h。
研究发现，将常规发酵培养基中的酵母粉分别替换为棉籽饼粉或花生饼粉，将葡萄糖分别替换为乳糖、糖蜜、蔗糖、果糖或纤维二糖，均不能显著提高发酵液中那西肽的含量。
本发明还包括上述发酵培养基在发酵生产那西肽中的应用。
本发明还提供一种发酵生产那西肽的方法，包括以下步骤：
1)斜面培养
将产那西肽的链霉菌在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，于28℃培养7天；
2)种子培养
将步骤1)制得的斜面菌种无菌条件下转接入灭菌的种子培养基中，在35℃、200-220rpm、湿度50％-60％的条件下，振荡培养30h，得到种子培养液；
3)发酵培养
将步骤2)制得的种子培养液接种于上述发酵培养基中，发酵培养至结束，得到发酵液。
其中，步骤1)所述斜面培养基包括如下成分：可溶性淀粉15g/L、牛肉膏3g/L、蛋白膝4g/L、K2HPO4 0.4g/L、NaCL 0.4g/L、MgSO4 1g/L、KNO31g/L、琼脂粉15g/L，pH7.0；
其中，步骤2)所述种子培养基包括如下成分：黄豆饼粉20g/L、葡萄糖50g/L、玉米浆10g/L、MgSO4 3g/L、CaCO3 4g/L，pH6.8。
其中，步骤3)种子培养液的接种量一般为5-10％(v/v)，优选为10％(v/v)。
其中，步骤3)发酵培养条件包括：发酵时间60-65h，发酵温度28-35℃，转速200-220rpm，湿度50％-60％；优选地，发酵培养条件包括：发酵时间62h，发酵温度28℃，转速220rpm，湿度55％。
本发明可用本领域市售可得的常规产那西肽的链霉菌菌种(streptomycesactuosus)进行发酵。
优选地，所述产那西肽的链霉菌为活跃链霉菌(streptomyces actuosus)BJX004，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.8732，保藏日期2014年1月17日。
本发明发酵培养基原料成本低且易于获得，原料成本可降低约23.6％。
本发明方法简便易行，发酵液中那西肽含量可提高至5630ug/mL，显著优于现有技术，易于大力推广应用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下所用淀粉酶为α-淀粉酶，酶活为15000U，由江苏锐阳生物科技有限公司提供。
以下所用产那西肽的链霉菌为活跃链霉菌(streptomyces actuosus)BJX004，保藏编号为CGMCC NO.8732。
以下发酵液中那西肽含量的检测方法包括如下步骤：
1)标准曲线的绘制
精密称取纳西肽标品5mg，加入0.lmL DMF，溶解后用硼酸混合液制备成lmg/mL的标准液，分别精确量取纳西肽100-800μg(0.1-0.8mL标准液)于8支试管中，用硼酸混合液补充至2mL，每管再加入10mL硼酸缓冲液和8mL水饱和正丁醇，摇匀，37℃水浴静置20min，取上清液4mL加无水乙醇4mL，在波长408nm处比色，读取OD值，绘制标准曲线，并求得曲线方程。
2)发酵液效价的测定
取发酵液5mL于试管中，加入5mL无水乙醇，加塞摇匀，37℃水浴保温45min，过滤，取滤液2mL，加入10mL硼酸缓冲液和8mL水饱和正丁醇溶液，充分摇匀，37℃静置20min，取上清液4mL，加无水乙醇4mL，在波长408nm处比色，读取OD值，将OD值代入标准曲线方程，即得计算结果，单位为μg/mL。
实施例1
一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，包括以下重量份的组分：KNO3 0.5份、(NH4)2SO4 0.8份、NaCl 3份、黄豆粉35份、豆粕粉1份、玉米淀粉45份、淀粉酶0.01份、轻质碳酸钙3.5份。
本实施例发酵培养基为干品培养基，其制备方法包括按配方取各原料，按常规方法混合均匀即可。
实施例2
一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，包括以下重量份的组分：KNO3 1份、(NH4)2SO4 1.5份、NaCl 5份、黄豆粉45份、豆粕粉2.5份、玉米淀粉56份、淀粉酶0.02份、轻质碳酸钙5份。
本实施例发酵培养基为干品培养基，其制备方法包括按配方取各原料，按常规方法混合均匀即可。
实施例3
一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，包括以下重量份的组分：KNO3 0.5份、(NH4)2SO4 1份、NaCl 3.5份、黄豆粉38份、豆粕粉1.5份、玉米淀粉50份、淀粉酶0.01份、轻质碳酸钙4份。
本实施例发酵培养基为干品培养基，其制备方法包括按配方取各原料，按常规方法混合均匀即可。
实施例4
一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，包括以下重量份的组分：KNO3 0.8份、(NH4)2SO4 1.2份、NaCl 4.5份、黄豆粉40份、豆粕粉1.8份、玉米淀粉55份、淀粉酶0.02份、轻质碳酸钙4.5份。
本实施例发酵培养基为干品培养基，其制备方法包括按配方取各原料，按常规方法混合均匀即可。
实施例5
一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，包括以下重量份的组分：KNO3 0.8份、(NH4)2SO4 1份、NaCl 4份、黄豆粉38份、豆粕粉1.5份、玉米淀粉55份、淀粉酶0.015份、轻质碳酸钙4份。
本实施例发酵培养基为干品培养基，其制备方法包括按配方取各原料，按常规方法混合均匀即可。
实施例6
一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，其为液体培养基，包括以下组分：KNO30.5g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、NaCl 3g/L、黄豆粉35g/L、豆粕粉1g/L、玉米淀粉45g/L、淀粉酶0.01g/L、轻质碳酸钙3.5g/L。
本实施例发酵培养基制备方法包括：按配方取各原料，将淀粉酶之外的原料按常规方法溶于水中，混合均匀后，按常规方法灭菌(例如121℃，30min)；冷却至室温；按配比将淀粉酶或淀粉酶溶液无菌处理(非高热灭菌)后添加到所得发酵培养基中。所述无菌处理包括本领域常规方法，例如过滤除菌、辐照灭菌等。
实施例7
一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，其为液体培养基，包括以下组分：KNO31g/L、(NH4)2SO4 1.5g/L、NaCl 5g/L、黄豆粉45g/L、豆粕粉2.5g/L、玉米淀粉56g/L、淀粉酶0.02g/L、轻质碳酸钙5g/L。
本实施例发酵培养基制备方法同实施例6。
实施例8
一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，其为液体培养基，包括以下组分：KNO30.5g/L、(NH4)2SO4 1g/L、NaCl 3.5g/L、黄豆粉38g/L、豆粕粉1.5g/L、玉米淀粉50g/L、淀粉酶0.01g/L、轻质碳酸钙4g/L。
本实施例发酵培养基制备方法同实施例6。
实施例9
一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，其为液体培养基，包括以下组分：KNO30.8g/L、(NH4)2SO4 1.2g/L、NaCl 4.5g/L、黄豆粉40g/L、豆粕粉1.8g/L、玉米淀粉55g/L、淀粉酶0.02g/L、轻质碳酸钙4.5g/L。
本实施例发酵培养基制备方法同实施例6。
实施例10
一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，其为液体培养基，包括以下组分：KNO30.8g/L、(NH4)2SO4 1g/L、NaCl 4g/L、黄豆粉38g/L、豆粕粉1.5g/L、玉米淀粉55g/L、淀粉酶0.015g/L、轻质碳酸钙4g/L。
本实施例发酵培养基制备方法同实施例6。
实施例11
一种发酵生产那西肽的方法，包括以下步骤：
1)斜面培养
将产那西肽的链霉菌在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，于28℃培养7天；所述斜面培养基包括如下成分：可溶性淀粉15g/L、牛肉膏3g/L、蛋白膝4g/L、K2HPO4 0.4g/L、NaCL 0.4g/L、MgSO4 1g/L、KNO31g/L、琼脂粉15g/L，pH7.0。
2)种子培养
将步骤1)制得的斜面菌种无菌条件下转接入灭菌的种子培养基中，在35℃、200-220rpm、湿度50％-60％的条件下，振荡培养30h，得到种子培养液；所述种子培养基包括如下成分：黄豆饼粉20g/L、葡萄糖50g/L、玉米浆10g/L、MgSO43g/L、CaCO3 4g/L，pH6.8。
3)发酵培养
将步骤2)制得的种子培养液接种于实施例10制得的发酵培养基中，发酵培养至结束，得到发酵液。
其中，步骤3)种子培养液的接种量为10％(v/v)。
其中，步骤3)发酵培养条件包括：发酵时间62h，发酵温度28℃，转速220rpm，湿度55％。
经检测，发酵液中那西肽的含量为5630ug/mL。
实施例12
一种发酵生产那西肽的方法，与实施例11的区别仅在于：采用实施例9制备的发酵培养基，且步骤3)发酵条件包括发酵时间65h，发酵温度35℃，转速220rpm，湿度60％。
经检测，发酵液中那西肽的含量为5504ug/mL。
实施例13
一种发酵生产那西肽的方法，与实施例11的区别仅在于：采用实施例8制备的发酵培养基，且步骤3)发酵条件包括发酵时间62h，发酵温度30℃，转速200rpm，湿度50％。
经检测，发酵液中那西肽的含量为5489ug/mL。
实施例14
一种发酵生产那西肽的方法，与实施例11的区别仅在于：采用实施例7制备的发酵培养基，且步骤3)发酵条件包括发酵时间62h，发酵温度35℃，转速220rpm，湿度60％。
经检测，发酵液中那西肽的含量为5406ug/mL。
实施例15
一种发酵生产那西肽的方法，与实施例11的区别仅在于：采用实施例6制备的发酵培养基，且步骤3)发酵条件包括发酵时间65h，发酵温度30℃，转速200rpm，湿度50％。
经检测，发酵液中那西肽的含量为5327ug/mL。
对比例1
一种发酵生产那西肽的方法，与实施例11的区别仅在于，步骤3)发酵培养基包括以下组分：KNO3 0.8g/L、(NH4)2SO4 1g/L、NaCl 4g/L、黄豆粉38g/L、酵母粉1.5g/L、葡萄糖5g/L、玉米淀粉50g/L、淀粉酶0.015g/L、轻质碳酸钙4g/L。
该发酵培养基的制备方法与实施例6相同。
经检测，发酵液中那西肽的含量为4525ug/mL。
对比例2
一种发酵生产那西肽的方法，与实施例12的区别仅在于，步骤3)发酵培养基包括以下组分：KNO3 0.8g/L、(NH4)2SO4 1.2g/L、NaCl 4.5g/L、黄豆粉40g/L、酵母粉1.8g/L、葡萄糖6g/L、玉米淀粉50g/L、淀粉酶0.02g/L、轻质碳酸钙4.5g/L。
该发酵培养基的制备方法与实施例6相同。
经检测，发酵液中那西肽的含量为4471ug/mL。
对比例3
一种发酵生产那西肽的方法，与实施例13的区别仅在于，步骤3)发酵培养基包括以下组分：KNO3 0.5g/L、(NH4)2SO4 1g/L、NaCl 3.5g/L、黄豆粉38g/L、酵母粉1.5g/L、葡萄糖6g/L、玉米淀粉45g/L、淀粉酶0.01g/L、轻质碳酸钙4g/L。
该发酵培养基的制备方法与实施例6相同。
经检测，发酵液中那西肽的含量为4321ug/mL。
对比例4
一种发酵生产那西肽的方法，与实施例11的区别仅在于，步骤3)发酵培养基包括以下组分：KNO3 0.8g/L、(NH4)2SO4 1g/L、NaCl 4g/L、黄豆粉38g/L、棉籽饼粉1.5g/L、乳糖5g/L、玉米淀粉50g/L、淀粉酶0.015g/L、轻质碳酸钙4g/L。
该发酵培养基的制备方法与实施例6相同。
经检测，发酵液中那西肽的含量为4483ug/mL。
对比例5
一种发酵生产那西肽的方法，与实施例12的区别仅在于，步骤3)发酵培养基包括以下组分：KNO3 0.8g/L、(NH4)2SO4 1.2g/L、NaCl 4.5g/L、黄豆粉40g/L、花生饼粉1.8g/L、糖蜜6g/L、玉米淀粉50g/L、淀粉酶0.02g/L、轻质碳酸钙4.5g/L。
该发酵培养基的制备方法与实施例6相同。
经检测，发酵液中那西肽的含量为4279ug/mL。
对比例6
一种发酵生产那西肽的方法，与实施例13的区别仅在于，步骤3)发酵培养基包括以下组分：KNO3 0.5g/L、(NH4)2SO4 1g/L、NaCl 3.5g/L、黄豆粉38g/L、花生饼粉1.5g/L、蔗糖6g/L、玉米淀粉45g/L、淀粉酶0.01g/L、轻质碳酸钙4g/L。
该发酵培养基的制备方法与实施例6相同。
经检测，发酵液中那西肽的含量为4157ug/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (15)

1.一种用于发酵生产那西肽的发酵培养基，其特征在于，由以下重量份的组分组成：KNO3 0.5-1份、(NH4)2SO4 0.8-1.5份、NaCl 3-5份、黄豆粉35-45份、豆粕粉1-2.5份、玉米淀粉45-56份、淀粉酶0.01-0.02份、轻质碳酸钙3.5-5份。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，由以下重量份的组分组成：KNO30.5-0.8份、(NH4)2SO4 1-1.2份、NaCl 3.5-4.5份、黄豆粉38-40份、豆粕粉1.5-1.8份、玉米淀粉50-55份、淀粉酶0.01-0.02份、轻质碳酸钙4-4.5份。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，由以下重量份的组分组成：KNO3 0.8份、(NH4)2SO4 1份、NaCl 4份、黄豆粉38份、豆粕粉1.5份、玉米淀粉55份、淀粉酶0.015份、轻质碳酸钙4份。
4.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基为液体培养基，由以下组分组成：KNO3 0.5-1g/L、(NH4)2S04 0.8-1.5g/L、NaCl 3-5g/L、黄豆粉35-45g/L、豆粕粉1-2.5g/L、玉米淀粉45-56g/L、淀粉酶0.01-0.02g/L、轻质碳酸钙3.5-5g/L。
5.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基为液体培养基，由以下组分组成：KNO3 0.5-0.8g/L、(NH4)2SO4 1-1.2g/L、NaCl 3.5-4.5g/L、黄豆粉38-40g/L、豆粕粉1.5-1.8g/L、玉米淀粉50-55-g/L、淀粉酶0.01-0.02g/L、轻质碳酸钙4-4.5g/L。
6.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基，由以下组分组成：KNO3 0.8g/L、(NH4)2SO4 1g/L、NaCl 4g/L、黄豆粉38g/L、豆粕粉1.5g/L、玉米淀粉55g/L、淀粉酶0.015g/L、轻质碳酸钙4g/L。
7.根据权利要求1-6任一项所述的发酵培养基，其特征在于，所述淀粉酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶中的一种或两种。
8.根据权利要求7所述的发酵培养基，其特征在于，所述淀粉酶酶活为10000-15000U。
9.根据权利要求7所述的发酵培养基，其特征在于，所述淀粉酶酶活为15000U。
10.根据权利要求1-9任一项所述发酵培养基在发酵生产那西肽中的应用。
11.一种发酵生产那西肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)斜面培养
将产那西肽的链霉菌在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，于28℃培养7天；
2)种子培养
将步骤1)制得的斜面菌种无菌条件下转接入灭菌的种子培养基中，在35℃、200-220rpm、湿度50％-60％的条件下，振荡培养30h，得到种子培养液；
3)发酵培养
将步骤2)制得的种子培养液接种于权利要求1-9任一项所述发酵培养基中，发酵培养至结束，得到发酵液。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤1)所述斜面培养基包括如下成分：可溶性淀粉15g/L、牛肉膏3g/L、蛋白膝4g/L、K2HPO4 0.4g/L、NaCL 0.4g/L、MgSO4 1g/L、KNO31g/L、琼脂粉15g/L，pH7.0；和/或，
步骤2)所述种子培养基包括如下成分：黄豆饼粉20g/L、葡萄糖50g/L、玉米浆10g/L、MgSO4 3g/L、CaCO3 4g/L，pH6.8。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，步骤3)发酵培养条件包括：发酵时间60-65h，发酵温度28-35℃，转速200-220rpm，湿度50％-60％。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤3)发酵培养条件包括：发酵时间62h，发酵温度28℃，转速220rpm，湿度55％。
15.根据权利要求11、12、14任一项所述的方法，其特征在于，所述产那西肽的链霉菌为活跃链霉菌(streptomyces actuosus)BJX004，保藏编号CGMCC NO.8732。
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