CN105916986A - 由接种微生物形成的接种物，和使用其生产抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种更有效率的生产抗生素的方法，特别是省略诺西肽生产中的预培养步骤，并且简单且容易地收集和接种固定量的微生物细胞量，从而使抗生素的生产可以更有效率的进行。本发明的特征在于当制备抗生素诸如诺西肽时，使用预培养中使用的抗生素生产菌诸如属于链霉菌属的放线菌，作为通过接种到固体载体上获得的接种物。

Description

由接种微生物形成的接种物，和使用其生产抗生素的方法

技术领域

本发明涉及微生物，更具体地，涉及接种物，其包括接种至固体载体的抗生素生产菌，和使用所述接种物生产抗生素的方法。

背景技术

诺西肽(Nosiheptide)是一种含硫多肽类抗生素。因为诺西肽有促进动物生长效果、改善饲料效率效果等，其是一种可商购获得的动物饲料添加剂。关于诺西肽的生产方法，已知包括培养活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)NRRL2954、U-227的生产方法(参见，例如专利文件1和2)

[文件列表]

专利文件

专利文件1：JP-B-40-880

专利文件2：JP-A-61-25495

发明概述：

发明所要解决的问题

抗生素的实际生产中，作为预培养的步骤，抗生素生产菌被培养于固体培养基，且将定量的细胞数量接种于小规模的液体培养基(种子培养基)并且培养以制备种子培养基。随后，将种子培养基接种至更大规模的生产用液体培养基(主要培养基)中并培养以生产抗生素。这个生产过程中在固体培养基上的预培养步骤需要大概1-2周，并且通过接种定量细胞数量的种子培养基的制备是重要的，且它们还会影响随后的抗生素的生产力。特别地，当定量的微生物细胞的收集通常是以一接菌环的量作为标准时，这个操作被复杂化并且很大程度上是依靠操作者的经验和感觉，且需要一个简便化的操作。

解决问题的方式

本发明人为实现抗生素的高效生产力已进行了集中研究，试图解决上文提及的问题，且发现一旦将用于抗生素生产的预培养的抗生素生产菌接种于固体载体以获得接种物后，1.每次抗生素生产中都进行的在固体培养基上的培养可被省略，并且2.通过自动化的接种和培养(若干个)使用定量抗生素生产菌接种的接种物，种子培养基可以被方便和有效率地制备，并且成功实现高效抗生素生产。另外，他们还发现，通过使用接种物，抗生素生产菌可以被长期稳定的冷藏保存，使本发明得以完成。

因此，本发明涉及以下的：

[1]一种抗生素生产菌的接种物，其包括接种至固体载体的抗生素生产菌；

[2]上文提及的[1]的接种物，其中所述固体载体是植物来源的固体物质；

[3]上文提及的[1]或[2]的接种物，其中于所述固体载体是一种或多种选自稻粒、麦麸、大豆种子的物质；

[4]上文提及的[1]至[3]中任意一项所述的接种物，其中于所述的抗生素生产菌是属于链霉菌属(Streptomyces sp.)的放线菌；

[5]上文提及的[4]所述的接种物，其中所述链霉菌属的放线菌是一种或多种活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)；

[6]上文提及的[5]所述的接种物，其中所述的一种或多种活跃链霉菌是选自活跃链霉菌NRRL2954、活跃链霉菌U-227和具有其等同性能的菌株；

[7]制备种子培养基的方法，其包括添加上文提及的[1]-[6]中任一项所述的接种物到生长培养基中并对其培养的步骤；

[8]生产抗生素的方法，其包括添加上文提及的[1]-[6]中任一项所述的接种物到用于生产抗生素的培养基中并对其培养的步骤，或者添加上文提及的[7]所述方法制备的种子培养基到用于生产抗生素的培养基中并对其培养的步骤；

[9]生产诺西肽的方法，其包括添加上文提及的[5]或[6]中所述的接种物到生产诺西肽的培养基中并对其培养的步骤。

发明效果

根据本发明，可以提供使用定量的抗生素生产菌接种并能够长期保存的接种物

使用本发明的接种物，在固体培养基上需要约1-2周的作为用于实际生产前所需的预培养步骤的培养可以被省略，并且用于制备种子培养基而惯例依靠操作者经验和感觉的定量的微生物细胞接种可以容易且确定地执行。

根据本发明的种子培养基的容易的制备方法和本发明的抗生素的制备方法，可以缩短操作时间，可以降低生产成本，并且可以实现有效率的生产力。本发明特别适合于生产诺西肽。

具体实施方案

本发明的接种物通过在固体载体上接种抗生素生产菌获得。作为抗生素生产菌，主要涉及放线菌。

作为生产抗生素的放线菌，主要涉及链霉菌属，拟无枝酸菌属(Amycolatopsis sp.)，糖多孢菌属(Saccharopolyspora sp.)等。

在本发明中，优选使用属于链霉菌属的放线菌。

属于链霉菌属的放线菌的例子包括：活跃链霉菌、抗生素链霉菌(Streptomyces antibioticus)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、加利利链霉菌(Streptomyces galilaeus)、青灰色链霉菌(Streptomyces laucogriseus)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、吸水链霉菌柠檬变种(Streptomyces hygroscopicusvar.limoneus)、卡那链霉菌(Streptomyces kanamycetius)、微小链霉菌(Streptomyces parvulus)、纤胡链霉菌(Streptomyces peuceticus)、轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)、筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)等。

在本发明的更优选的实施方案中，使用的诺西肽的生产细菌是活跃链霉菌、抗生素链霉菌和青灰色链霉菌。进一步优选地，使用了活跃链霉菌。作为活跃链霉菌，使用NRRL2954、U-227或者具有其等同性能的菌株是优选的，且特别优选的是U-227及具有其等同性能的菌株。U-227在国内保藏编号是FERMP-7705，并保藏在技术与评价国家研究所国际专利生物保藏中心(NationalInstitute of Technology and Evaluation the International Patent OrganismDepositary(NPMD))(2-5-8，Kazusakamatari，木更津市，千叶县，日本)保藏编号NITE BP-01698(原始保藏日期2013年8月28日)。如本文使用的，“具有等同性能的菌株”意思是是通过NRRL2954或U-227的传代获得的菌株。

在本发明中，可以使用选自上述抗生素生产菌中的一种，或可以选择两种或更多种并组合使用。

本发明使用的用于接种抗生素生产菌的固体载体是一种作为抗生素生产菌生存的营养来源的固体物质，并且不会对抗生素生产菌的生存造出不利影响，或者不会对抗生素生产菌的生存产生直接影响但是能够保持存活率，并且其实例包括的固体物质来源于动物和植物、合成的生物可降解物质诸如生物可降解树脂等、合成的部分可降解材料诸如生物可降解树脂与非生物降解树脂的混合物等等。来源于动物和植物的固体物质优选用于本发明的目的，且更优选地使用植物来源的固体物质。

动物和植物来源的固体物质的实例包括：禾本科植物、豆科植物等的谷物、种子、茎、根、种皮、果皮等，或者它们的研磨产物诸如稻粒、麦麸、大豆种子、谷壳、米糠、麦芽根、玉米杆、甘蔗渣等；果壳，坚果仁，或者坚果的研磨产物诸如核桃等；木粉诸如锯屑、刨花、散装木头等；鱼肉；再生纸；多糖如纤维素、淀粉、葡聚糖、琼脂等及它们的粉末或者颗粒；蛋白质如明胶等或者它们的粉末或颗粒，可以选择并使用其中的一种或多种。

在本发明中，植物来源的固体物质更优选使用如禾本科植物、豆科植物等的谷粒、种子或者它们的研磨产物，植物来源的多糖如纤维素、琼脂等或者它们的粉末或者颗粒。其中进一步优选使用稻粒、麦麸和大豆种子，且特别优选使用稻粒。

优选地，本发明中所使用的固体载体在灭菌后使用。灭菌可以根据已知方法执行，如洗涤后在高压灭菌锅中高压蒸汽灭菌等。

本发明中，抗生素生产菌可以通过已知方法接种到固体载体上。例如，将抗生素生产菌附着至固体载体上，其通过将从培养基收集的诸如微生物团块等的抗生素生产菌自身应用于选自上文的一种或多种固体载体上，或将抗生素生产菌的微生物细胞的冻于产物、通过将微生物细胞在盐水、磷酸盐缓冲液等中悬浮获得的悬浮液或用于培养抗生素生产菌的培养基添加至或与固体载体混合，或使用上文提及的微生物细胞的悬浮液或培养基浸透固体培养基进行实施。抗生素生产菌也可以在固体载体上培养。在这种情况下，抗生素生产菌可以被单独培养或者和两种或更多种类共存，其通过相关领域已知的多种方法如液体培养法，固相培养法等，在适合抗生素生产菌生长的有氧或者无氧条件下通过使用根据抗生素生产菌生长的液体或者固体培养基。

例如，当链霉菌属的放线菌被用作抗生素生产菌时，可以使用用于放线菌的一般培养基诸如酵母提取物-麦芽膏(YMG)琼脂培养基等、Bennett’s琼脂培养基、酵母淀粉琼脂培养基、白蛋白培养基等，同在在20℃-35℃，优选25℃-30℃下培养约1到2周获得的微生物细胞。

也可以使用在YMG液体培养基等培养链霉菌属的放线菌获得的培养基。

更优选地，通过在用于放线菌的琼脂培养基诸如YMG琼脂培养基等中，在20℃-35℃培养约1-2周后获得微生物细胞的团块，将从上文提及的琼脂培养基收集的微生物细胞接种到30mL-50mL液体培养基如YMG液体培养基等中，于20℃-35℃，优选25℃-30℃下，使其进行振荡培养37-48小时，并可以使用离心等收集。

当属于链霉菌属的放线菌在固体载体上培养时，例如，要接种到固体载体上，可以在上文提及的液体培养基或者上文提及的琼脂培养基中，在20℃-35℃下振荡培养或静置约7-10天。

在被上文提及的微生物细胞涂覆、添加、浸泡等处理后，附着抗生素生产菌的固体载体可以通过任选地干燥。

本发明中，“接种物”指的是通过上述方式接种或者附着到固体载体上的抗生素生产菌。作为本发明中的接种物，将抗生素生产菌接种到来源于动物和植物，例如禾本科植物或者豆科植物等等的谷物、种子、茎、根、种皮、果皮等，或者它们的研磨产物如稻粒、麦麸、大豆种子、谷壳、米糠、麦芽根、玉米杆、甘蔗渣等等；坚果壳，坚果核或者它们的研磨产物如核桃等；木粉末如锯屑、刨花、散装木头等；鱼肉；再生纸；多糖如纤维素、淀粉、葡聚糖、琼脂等，或它们的粉末和颗粒；明胶等蛋白质或者他们的粉末和颗粒的固体物质上是优选的，将抗生素生产菌接种到植物来源的固体物质上，如禾本科植物、豆科植物等的颖果、种子或其粉碎产物，植物来源的多糖如纤维素、琼脂等或者它们的粉末和颗粒等是更优选的，且将抗生素生产菌接种到选自稻粒、麦麸、大豆种子中的一种或多种是进一步优选的。

本发明的接种物中，优选将抗生素生产菌附着，使得固体载体表面呈灰色，并且以每个固体载体上约10⁵-10¹⁰个抗生素生产菌接种抗生素生产菌。

本发明的接种物的保存方法，可以采用适合的保存细菌特别是抗生素生产菌的保存方法，且优选不会使固体载体变性的方法。

例如，在通过向植物来源的固体物质上接种如链霉菌属的放线菌等获得接种物时，可以使用无菌水或者液体石蜡等切断氧气的方法如用蒸馏水密封的水保存法、液体石蜡覆盖法等方法，依靠冻干或者干燥如冷冻保存、L-干燥法(Sakane等人；Microbio1.Cult.Coll.Vol.1291-97(1996))等停止微生物的新陈代谢活动的方法，优选包括保存在冰箱中的冷冻保存方法。

本发明也提供了种子培养基的制备方法，其包括向本发明中的接种物添加生长培养基，和培养其的步骤。特别地，当使用了包括植物来源的固体物质作为固体载体的本发明的接种物时，可以通过向生长培养基中加入1到3个接种物并培养给定的时期获得种子培养基。

在本发明中的种子培养基的制备方法中，培养可以在已知培养条件下执行且合适地使用适合于接种至固体载体的链霉菌属的放线菌生长的已知培养基作为生长培养基。例如，当使用通过接种链霉菌属的放线菌获得的接种物时，优选在约30ml-40ml在专利文件2中实施例描述的生长培养基中，在20℃-35℃条件下振荡培养30-48小时。

此外，本发明提供了生产抗生素的方法，其包括将本发明中的接种物添加至用于生产抗生素的培养基并进行培养的步骤，或者将通过本发明的种子培养基的制备方法获得的种子培养基添加至生产抗生素的培养基并进行培养的步骤。

由于通过本发明生产方法生产的抗生素的自然变化取决于接种于接种物上的抗生素生产菌的种类，由链霉菌属的放线菌生产的抗生素的实例包括诺西肽、竹桃霉素、阿克拉霉素、链霉素、卡那霉素、吩噁嗪酮稠环抗肿瘤抗生素、博莱霉素、道诺霉素、井冈霉素等。

关于其他链霉菌属以外的放线菌生产的抗生素，例如，对于拟无枝酸菌属可以提及例如利福霉素，且对于糖多孢菌属的放线菌生产的抗生素可以提及红霉素。

在本发明的生产方法中，作为用于生产抗生素与本发明的接种物或者种子培养基添加的培养基，可以使用适合生产上文提及的抗生素的已知的培养基，且添加接种物或者种子培养基之后进行的培养可以在已知的培养条件下和通过已知的方法执行。

当本发明的接种物加入用于生产抗生素的培养基并进行培养时，入接种到植物来源的固体物质时通过添加约1-3个接种物，可以以良好的再现性生产足够量的抗生素。

通过本发明的生产方法生产的抗生素，可以用对于每种抗生素已知的方法如溶剂重结晶法、柱层析法等方法从培养基中分离并回收。

本发明中抗生素的生产方法，特别优选用于生产诺西肽。

对于诺西肽的生产，使用一种或多种选自活跃链霉菌、抗菌素链霉菌和青灰色链霉菌的诺西肽生产细菌的接种物，可以直接被添加至用于生产诺西肽的培养基并进行培养；或者将上文提及的接种物加入生长培养基并培养形成的种子培养基添加至用于生产诺西肽的培养基并进行培养。

作为用于生产诺西肽的接种物，优选使用活跃链霉菌作为诺西肽生产菌接种的接种物，更优选使用选自活跃链霉菌NRRL2954、活跃链霉菌U-227或具有其等同性能的菌株的一种或多种接种的接种物，且特别优选使用活跃链霉菌U-227或具有其等同性能的细菌接种的接种物。

作为生产诺西肽的培养基，可以使用已知用于生产诺西肽的培养基，其在JP-A-61-25495(上文提及的专利文件2)，JP-A-62-179395等中描述，且还可以在将使用诺西肽生产菌接种的接种物或使用所述接种物制备的种子培养基添加至用于生产诺西肽的培养基后在如JP-A-61-25495(上文提及的专利文件2)等中描述的已知的培养条件下执行培养。

通过本发明的生产方法生产的诺西肽，可以通过已知方法如包括使用有机溶剂和柱层析组合进行萃取和沉淀的方法(如JP-B-40-880(上文提及的专利文件1)中描述的)从培养基中分离并回收。

上文提到的用于本发明制备接种物、制备种子培养基和生产诺西肽等的培养基可以各自根据已知组合物制备，或也可以使用通过Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.，Japan BD等提供的可商购获得的产品。

实施例

虽然本发明的实施例在下文显示，但本发明并不受其限制。

参考实施例1固体载体的制备(稻粒)

将稻米(50g)用水洗涤并在水浴中静置过夜。在室温适度干燥后，将18g置于烧瓶中，用木灰(0.15g)均匀包覆，并在高压灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌(120℃×20分钟)。

实施例1接种物的制备

将活跃链霉菌(以保藏号：NITE BP-01698保藏于National Institute ofTechnology and Evaluation the International Patent Organism Depositary(NPMD))在酵母提取物-麦芽提取物(YMG)琼脂培养基上培养(约1-2周)。将预培养的菌株通过一接菌环分配，接种于含有YMG液体培养基(40mL)的烧瓶中并在27℃(25-30℃)振荡培养。培养37-48小时后，收集微生物细胞团块，取1mL团块并添加至上文的稻子(烧瓶)混合并混合。混合物在27℃(25-30℃)培养7-10天以获得接种到稻粒上的接种物。

实施例2通过使用接种物生产诺西肽

将一个或两个在上文提及的实施例1中制备的接种物在30L发酵罐中培养以获得诺西肽。诺西肽的产量在表1显示。

如表1中所示，三次生产几乎获得相同产量的诺西肽。当用本发明的接种物培养以生产诺西肽时，在生产培养基中获得定量的微生物细胞，这表明使用本发明的接种物进行的诺西肽生产可以得到优越的重复性。

[表1]

表1

(培养方法)

在30L的发酵罐中，向大豆粉(87.5g/L)、大豆蛋白(17.5g/L)、甘氨酸(0.5g/L)、磷酸二氢钾(0.625g/L)、磷酸氢二钾(0.625g/L)、七水合硫酸亚铁(40mg/L)、七水合硫酸锌(40mg/L)、四水合硫酸锰(20mg/L)、五水合氯化钻(10mg/L)、消泡剂CA330(由NOF CORPORATION生产)(适量)、消泡剂KM-70(由Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.生产)(适量)、水混合成的培养基(17.5L)，添加必需的葡萄糖(70g/L)和硫酸铵(2g/L)，并且将混合物培养14天-16天。需要时，执行种子培养。

(诺西肽产量的测量)

培养基中诺西肽的浓度通过高效液相层析(HPLC)方法定量获得，使用有机溶剂获得提取物中的诺西肽。产物效价通过将培养基干燥并通过生物测定方法定量获得，使用有机溶剂获得提取物中的诺西肽。生产上文提及的诺西肽三次。在每次中，测量培养基中诺西肽的浓度和最终干产物中含有的诺西肽的量(也指示了“产物效价”)。

实施例3用长期保存的接种物生产诺西肽

使用长期冷藏保存的接种物以上文提及的实施例2中相同的方式生产诺西肽。每个使用的接种物的产物效价如表2所示。

[表2]

表2

如表2所示，即使当使用制备后冷藏保存了1-6年的接种物生产诺西肽时，和新制备的接种物相比，产物效价没有表现出较大减少。

实施例4制备接种物和生产诺西肽

使用活跃链霉菌U-481-32-21作为抗生素生产菌，并以和实施例1相同的方式，获得使用上文提及的放线菌接种的稻粒(接种物)。

即使使用实施例4中接种物时，也可如实施例2生产诺西肽。和实施例3相似，长时间冷藏保存后，产物效价没有发生较大减少。

这里使用的U-481-32-21是通过活跃链霉菌NRRL2954传代后获得的生产微生物。

工业实用性

通常，为了抗生素生产，需要在预培养步骤中将抗生素生产菌在固体培养基上培养1至2周，用接菌环收集定量的菌，并将其接种到液体培养基以制备种子培养基。通过使用本发明的接种物，上文提及的在固体培养基上进行的预培养步骤就变成非必需的。此外，因为本发明的接种物上附着有定量的菌细胞(细菌数量)，培养可以通过向培养基中直接加入接种物而不是使用接种环收集并接种操作定量的细菌细胞(其是常规执行的，取决于操作者的经验和感觉)而容易地开始，且操作高度的简便并具有优秀的操作性。另外，因为接种物可以长时间冷藏保存，并且具有优越的保藏稳定性，也具有高度的便利性。

本发明可以优选地被用于通过将属于链霉菌的放线菌(其是诺西肽生产菌)接种生产诺西肽，所述放线菌作为抗生素生产菌以获得接种物。

本申请基于于日本提交的专利申请号2013-210878(申请日：2013年10月8日)，将所述内容以全文并入本文。

Claims (9)

1.抗生素生产菌的接种物，其包括接种至固体载体的抗生素生产菌。

2.根据权利要求1所述的接种物，其中所述固体载体是植物来源的固体物质。

3.根据权利要求1或2所述的接种物，其中所述固体载体选自稻米、麦麸和大豆种子中的一种或多种。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的接种物，其中所述抗生素生产菌是属于链霉菌属的放线菌。

5.根据权利要求4所述的接种物，其中所述属于链霉菌属的放线菌是一种或多种活跃链霉菌。

6.根据权利要求5所述的接种物，其中所述一种或多种活跃链霉菌选自活跃链霉菌NRRL2954、活跃链霉菌U-227和具有其等同性能的菌株。

7.制备种子培养基的方法，其包括将根据权利要求1-6中任一项所述的接种物添加至生长培养基并对其培养的步骤。

8.生产抗生素的方法，其中包括将根据权利要求1-6中任一项所述的接种物添加至用于生产抗生素的培养基并对其培养的步骤，或者将根据权利要求7所述的方法制备的种子培养基添加至用于生产抗生素的培养基并对其培养的步骤。

9.生产诺西肽的方法，其包括将权利要求5或6所述的接种物添加至用于生产诺西肽的培养基并对其培养的步骤。