JP2004305211A

JP2004305211A - 放線菌培養培地、並びに、それを用いた放線菌による抗生物質の製造方法、放線菌の抗生物質産生能改善方法及び抗生物質のスクリーニング方法

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Publication number: JP2004305211A
Application number: JP2004085822A
Authority: JP
Inventors: Minoru Iimura; 穣飯村; Masayuki Hayakawa; 正幸早川
Original assignee: Yamanashi TLO Co Ltd
Current assignee: Yamanashi TLO Co Ltd
Priority date: 2003-03-24
Filing date: 2004-03-23
Publication date: 2004-11-04

Abstract

【課題】放線菌の抗生物質産生能を改善可能な放線菌培養培地、それを用いた放線菌による活性の高い抗生物質の効率的な製造方法、放線菌の抗生物質産生能を改善可能な方法、及び抗生物質産生菌の効率的なスクリーニング方法の提供。
【解決手段】穀物の破砕片を含む放線菌培養培地である。穀物の破砕片が穀物未利用部分である態様、穀物未利用部分が穀物殻である態様、穀物未利用部分が小麦フスマである態様等が好ましい。前記放線菌培養培地を用いて放線菌を培養する放線菌による抗生物質の製造方法である。平板培養及び液体培養の少なくともいずれかで培養された放線菌を前記放線菌培養培地を用いて培養する放線菌の抗生物質産生能改善方法である。前記放線菌培養培地を用いて微生物を培養する工程、及び培養後に抗生物質の存在を確認する工程を含む抗生物質産生菌のスクリーニング方法である。
【選択図】図１

Description

本発明は、新規で各種放線菌の抗生物質産生能を改善可能な放線菌培養培地、並びに、それを用いた放線菌による活性の高い抗生物質の効率的な製造方法、放線菌の抗生物質産生能を顕著に改善可能な方法、及び抗生物質の新規で効率的なスクリーニング方法に関する。

放線菌は、核膜を持たない原核生物でありグラム陽性菌に属する。また、代表的な土壌微生物であり、土壌中の難分解性物質を好んで分解利用することから自然界の物質循環と環境浄化に関しても重要な役割を果たしている。一方、ＷａｋｓｍａｎによってＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓが産生する抗細菌抗生物質ストレプトマイシンが発見されて以来、放線菌は、特に抗生物質生産菌として発酵工業や医薬産業において重要な菌群として扱われ、多くのスクリーニングが行われてきた（例えば、非特許文献１参照）。その結果、現在、微生物が生産する生理活性物質として発見されている化合物は、約１０，０００種とも言われるが、その３分の２は放線菌による生産物であり、実用化によって人類に多大なる恩恵を与えているものも多い。また、放線菌由来の抗生物質は抗細菌剤のみならず、抗真菌剤、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤等と多岐にわたり、その構造もβ-ラクタム系、アミノグリコシド系、マクロライド系、ヌクレオシド系など、幅広いことからも放線菌の二次代謝産物の多様性が窺い知れる。

このような放線菌を対象とした新規有用物質探索は、まず、放線菌の最大の生育場所である土壌を分離源として希釈平板法によって出現したコロニーを経験的にランダムに選択し、純粋分離を行った後、得られた分離株に対して各々に抗菌物質生産性を試験する方法が取られてきた（例えば、非特許文献２参照）。
しかし、これら従来における新規有用物質探索のためのスクリーニング方法の場合、作業が煩雑で困難な上、効率が悪いという問題がある。また、多くの新規有用物質探索のためのスクリーニングが行われてきた結果、抗生物質の多くが既知の物質と特定され、新規有用物質の発見についての報告は年々減少する傾向にある。

宮道慎二，生産微生物から見た生理活性物質探索の動向」，バイオサイエンスとインダストリー，１９９５年，５３(３)，ｐ２４０−２４７堀田国元，堀之内末治，「バイオサイエンスと放線菌」，日本放線菌学会編，医学出版センター，１９９４年

本発明は、従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、
本発明は、他の公知の液体培養、平板培養等を用いて前記放線菌を培養した場合に産生される抗生物質とは異なる抗生物質を効率的に生産することができ、該放線菌が産生する抗生物質の種類や量を変更乃至変化させることができ、新規な抗生物質の産生能を発現させることができる放線菌培養培地を提供することを目的とする。
また、本発明は、他の公知の液体培養、平板培養等により放線菌が産生した抗生物質とは異なる各種抗生物質を効率よく製造することができ、従来は有していないと考えられていた抗生物質の産生能を放線菌に新たに発現させることにより、放線菌の遺伝子組換え、菌株改良等を行うことなく、容易にかつ簡便にしかも効率的に抗生物質の製造を行うことができ、新規な抗真菌性物質をも製造可能な、放線菌による抗生物質の製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、公知の液体培養、平板培養等を利用して放線菌に産生させていた抗生物質の種類や量を変化乃至改善させることができ、該放線菌にそれまで発現していなかった抗生物質産生能を新たに発現させることができ、該放線菌の抗生物質産生能を顕著に変化乃至改善させることができ、従来では産生が容易ではなかった抗真菌性物質等の抗生物質をも効率的にかつ簡便に製造することが可能な、放線菌の抗生物質産生能改善方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、従来において行われていたような、新種放線菌等の抗生物質産生菌の分離及び該新種の抗生物質産生菌による新規抗生物質の分離・同定に主眼が置かれていた抗生物質のスクリーニング方法とは全く異なり、公知の放線菌等を利用しながら新たな抗真菌性物質等の抗生物質を容易にかつ簡便にスクリーニングすることができ、産業上極めて有益な、抗生物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞穀物の破砕片を含むことを特徴とする放線菌培養培地である。
＜２＞穀物の破砕片が穀物未利用部分である前記＜１＞に記載の放線菌培養培地である。
＜３＞穀物未利用部分が穀物殻である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の放線菌培養培地である。
＜４＞穀物が、小麦、大麦、オーツ麦、米、粟、稗及び豆類から選択される少なくとも１種である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の放線菌培養培地である。
＜５＞穀物未利用部分が小麦フスマである前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の放線菌培養培地である。
＜６＞使用時に穀物の破砕片に対し水を質量（ｇ）：体積（ｍｌ）（穀物の破砕片：水）で１：０．５〜１：２の割合で含有する前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の放線菌培養培地である。
＜７＞使用時に穀物の破砕片に対し水を質量（ｇ）：体積（ｍｌ）（穀物の破砕片：水）で１：０．７〜１：１．７の割合で含有する前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の放線菌培養培地である。
＜８＞放線菌による抗生物質の生産に用いられる前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の放線菌培養培地である。
＜９＞放線菌の抗生物質産生能の改善に用いられる前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の放線菌培養培地である。
＜１０＞抗生物質のスクリーニングに用いられる前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の放線菌培養培地である。
＜１１＞前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の放線菌培養培地を用いて放線菌を培養することを特徴とする放線菌による抗生物質の製造方法である。
＜１２＞抗生物質が抗真菌性物質である前記＜１１＞に記載の放線菌による抗生物質の製造方法である。
＜１３＞放線菌がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌から選択される少なくとも１種である前記＜１１＞から＜１２＞のいずれかに記載の放線菌による抗生物質の製造方法である。
＜１４＞Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｎｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓから選択される少なくとも１種である前記＜１３＞に記載の放線菌による抗生物質の製造方法である。
＜１５＞培養が、２０〜４０℃で２週間以内で行われる前記＜１１＞から＜１４＞のいずれかに記載の放線菌による抗生物質の製造方法である。
＜１６＞培養後に溶媒で抗生物質を抽出する前記＜１１＞から＜１５＞のいずれかに記載の放線菌による抗生物質の製造方法である。
＜１７＞平板培養及び液体培養の少なくともいずれかで培養された放線菌を、前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の放線菌培養培地を用いて培養することを特徴とする放線菌の抗生物質産生能改善方法である。
＜１８＞放線菌がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌から選択される少なくとも１種である前記＜１７＞に記載の放線菌の抗生物質産生能改善方法である。
＜１９＞Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｎｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓから選択される少なくとも１種である前記＜１８＞に記載の放線菌の抗生物質産生能改善方法である。
＜２０＞培養が、２０〜４０℃で２週間以内で行われる前記＜１７＞から＜１９＞のいずれかに記載の放線菌の抗生物質産生能改善方法である。
＜２１＞前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の放線菌培養培地を用いて微生物を培養する培養工程、及び培養後に抗生物質の存在を確認する抗生物質確認工程を含む特徴とする抗生物質産生菌のスクリーニング方法である。
＜２２＞抗生物質を産生した微生物を同定する同定工程を含む前記＜２１＞に記載の抗生物質のスクリーニング方法である。

（放線菌培養培地）
本発明の放線菌培養培地は、穀物の破砕片を少なくとも含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の成分を含んでなる。
前記穀物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、小麦、大麦、オーツ麦、米、粟、稗、豆類（大豆、小豆、えんどう豆、落花生等）、ライ麦、とうもろこし、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、小麦、大麦、オーツ麦、米、粟、稗及び豆類から選択される少なくとも１種であるものが、入手が容易であり、放線菌による抗生物質の製造、放線菌の抗生物質産生能の改善、抗生物質産生菌のスクリーニング等に有効である点で特に好ましい。

前記穀物の破砕片としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、該穀物自体の破砕片であってもよいし、該穀物から食品等の使用に供される利用部分を除去し、通常は廃棄処分等される穀物未利用部分の破砕片であってもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、省エネルギー、資源の有効利用等の観点からは、前記穀物未利用部分の破砕片が特に好ましい。

なお、前記穀物の破砕片の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、該穀物をそのまま、又は煮たりして軟質化させてから若しくは凍結させてから、脱穀、粉砕等することにより得ることができ、具体的には、前記穀物の破砕片が小麦フスマ又は大麦フスマの場合には小麦又は大麦を脱穀することにより得ることができ、前記穀物の破砕片が大豆おからの場合には大豆を煮て磨り潰した後に綿等で濾すことにより得られる。

前記穀物未利用部分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することできるが、例えば、穀物殻、穀物ピューレ、などが好適に挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、放線菌による抗生物質の製造、放線菌の抗生物質産生能の改善、抗生物質のスクリーニング等に有効である点で穀物殻が好ましい。なお、前記穀物殻としては、特に制限はなく、外殻、内殻等のいずれであってもよい。

前記穀物の破砕片の具体例としては、例えば、小麦フスマ、大麦フスマ、大豆おから、などが好適に挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記破砕片の大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、あまり微砕片化し過ぎると取扱性等に劣ることがあり、放線菌等の微生物を培養後に該放線菌培養培地からの抗生物質の分離・除去等が容易でない点で好ましくない傾向がある。

前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＨ調整剤、水、他の培地成分、などが挙げられる。これらのその他の成分としては、本発明の効果を害さない範囲内で目的に応じて適宜選択した量及び組合せで使用することができる。

前記ｐＨ調整剤としては、特に制限はなく、目的に応じて公知のものの中から適宜選択することができ、例えば、炭酸カルシウムなどが好適に挙げられる。
前記水の量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記使用時に穀物の破砕片に対し水を質量（ｇ）：体積（ｍｌ）（穀物の破砕片：水）で１：０．５〜１：２の割合であるのが好ましく、質量（ｇ）：体積（ｍｌ）（穀物の破砕片：水）で１：０．７〜１：１．７の割合であるのがより好ましく、前記穀物の破砕片が湿る程度がより好ましい。
前記水の量が多くなりすぎると、液体培養に近くなり、放線菌の抗生物質産生能が液体培養時における状態に近くなり、該放線菌の抗生物質産生能の改善・向上を十分に図ることができないことがあり、一方、前記水の量が少なすぎると、放線菌の抗生物質産生能に劣ることがある。

前記他の培地成分としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の培地成分の中から適宜選択することができ、例えば、ポリペプトン、牛肉エキス、細菌エキス、酵母エキス、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの他の培地成分は、前記水に溶解して使用してもよいし、あるいは前記穀物の破砕片を直接混合して使用してもよい。

本発明の放線菌培養培地は、放線菌の培養前に、オートクレーブ等の滅菌処理等の各種処理を行うことができ、また、三角フラスコ、シャーレ、坂口フラスコなどに入れて使用することができる。
本発明の放線菌培養培地を用いた放線菌の培養は、静置培養が好ましく、その条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、温度としては２０〜４０℃が好ましく、室温がより好ましく、時間としては、通常、２週間以内であれば充分であり、１週間程度が好ましい。

本発明の放線菌培養培地を用いて培養することができる放線菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌をはじめとして、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ属、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ属、Ｋｉｂｄｅｌｏｓｏｒａｎｇｉｕｍ属、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ属等のレアな各種放線菌、などが挙げられる。これらの中でも、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌から選択される少なくとも１種であるのが好ましい。

前記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｎｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓから選択されるものが好ましい。

本発明の放線菌培養培地は、放線菌の培養等に使用することができ、例えば、放線菌による抗生物質の生産、放線菌の抗生物質産生能の改善、抗生物質産生菌のスクリーニング、などに好適に使用することができ、本発明の放線菌による抗生物質の製造方法、本発明の放線菌の抗生物質産生能改善方法、及び本発明の抗生物質のスクリーニング方法に特に好適に使用することができる。

本発明の放線菌培養培地を用いて前記放線菌を培養すると、他の公知の液体培養、平板培養等を用いて前記放線菌を培養した場合に産生される抗生物質とは異なる抗生物質を効率的に生産することができ、該放線菌が産生する抗生物質の種類や量を変更乃至変化させることができ、新規な抗生物質の産生能を発現させることができる。

（放線菌による抗生物質の製造方法）
本発明の放線菌による抗生物質の製造方法は、本発明の前記放線菌培養培地を用いて放線菌を培養することを含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の処理等を含む。

前記放線菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌をはじめとして、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ属、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ属、Ｋｉｂｄｅｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ属、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ属等のレアな各種放線菌、などが挙げられる。これらの中でも、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌から選択される少なくとも１種であるのが好ましい。

前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、静置培養が好ましく、その条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、温度としては２０〜４０℃が好ましく、室温がより好ましく、時間としては、通常、２週間以内であれば充分であり、１週間程度が好ましい。

前記培養には、本発明の前記放線菌培養培地を用いることが必要であり、その際、三角フラスコ等の公知の培養容器中に、上述した小麦フスマ等の前記穀物の破砕片に少量の水を添加し、該穀物の破砕片が該水に浸る程度に調製したものに、炭酸カルシウム等の前記ｐＨ調整剤を添加することによりｐＨ調整し、オートクレーブして得た本発明の前記放線菌培養培地を使用するのが好ましい。
前記培養の際における前記放線菌の接種の方法としては、特に制限は無く、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記放線菌の前培養液滴を接種する方法、などが好ましい。また、前記接種の量としては、特に制限は無く、目的に応じて適宜選択することができる。

前記その他の処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養後に産生された抗生物質を分離する抗生物質分離処理、などが好適に挙げられる。

前記抗生物質分離処理としては、特に制限はなく、公知の方法の中から適宜選択することができるが、例えば、前記培養後の前記放線菌培養培地を溶媒に浸漬させ、該溶媒を該放線菌培養培地から分離することにより行うことができる。

前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸エチル等のエステル溶媒、エタノール、ブタノール等のアルコール溶媒、水、などが挙げられ、これらの中でも、水、ブタノール、酢酸エチルなどが好ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。該溶媒に前記浸漬させる際の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて、温度、時間等を適宜選択することができる。
前記分離の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、遠心分離、フィルターやろ紙等によるろ過、などが好適に挙げられる。

本発明の放線菌による抗生物質の製造方法によると、他の公知の液体培養、平板培養等により放線菌が産生した抗生物質とは異なる各種抗生物質を効率よく製造することができ、また、抗真菌性物質を効率よく製造することができる。放線菌が産生する抗生物質として現在知られているものの数は限られているが、本発明の放線菌による抗生物質の製造方法によると、従来は有していないと考えられていた抗生物質の産生能を放線菌に新たに発現させることができる。したがって、放線菌の遺伝子組換え、菌株改良等を行うことなく、容易にかつ簡便にしかも効率的に抗生物質の製造を行うことができ、新規な抗真菌性物質をも提供することができる。

（放線菌の抗生物質産生能改善方法）
本発明の放線菌の抗生物質産生能改善方法は、平板培養及び液体培養の少なくともいずれかで培養された放線菌を、本発明の前記放線菌培養培地を用いて培養することを含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の処理等を含む。
前記平板培養としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の寒天培地（プレート）等を用いた培養などが挙げられる。
前記液体培養としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、公知の液体培地等を用いた培養などが挙げられる。
なお、これらの培養の条件、放線菌の接種量、接種方法、培地の種類等については、特に制限はなく、目的に応じて公知の条件の中から適宜選択することができる。

前記本発明の放線菌培養培地を用いた培養は、上述した本発明の放線菌による抗生物質の製造方法と同様にして行うことができる。
なお、前記放線菌としては、上述の通りであり、上述のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌から選択されるものが好ましい。
前記その他の処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、上述の放線菌による抗生物質の製造方法における前記その他の処理と同様である。

本発明の放線菌の抗生物質産生能改善方法によると、公知の液体培養、平板培養等を利用して放線菌に産生させていた抗生物質の種類や量を変化乃至改善させることができ、該放線菌にそれまで発現していなかった抗生物質産生能を新たに発現させることができ、該放線菌の抗生物質産生能を顕著に変化乃至改善させることができ、従来では産生が容易ではなかった抗真菌性物質等の抗生物質をも効率的にかつ簡便に製造することができる。

（抗生物質のスクリーニング方法）
本発明の放線菌培養培地を用いて微生物を培養する培養工程、及び培養後に抗生物質の存在を確認する抗生物質確認工程を少なくとも含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の工程を含む。

前記培養工程は、本発明の前記放線菌培養培地を用いて微生物を培養する工程である。詳細は上述の通りである。
前記微生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記放線菌をはじめとして、酵母、細菌、かび、などが挙げられる。これらの中でも放線菌が好ましい。
前記培養は、上述した本発明の放線菌による抗生物質の製造方法（詳細は上述の通り）と同様にして好適に行うことができる。

前記抗生物質確認工程は、前記培養の後に抗生物質の存在を確認する工程である。
該抗生物質の存在の確認の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、各種微生物の培養における阻止円形成の有無を利用した方法、などが挙げられる。これらの方法は、１種単独で利用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

前記その他の処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、抗生物質を産生した微生物を同定する同定工程、などが挙げられる。
前記同定工程としては、特に制限はなく、公知の微生物の同定方法が挙げられる。

本発明の抗生物質のスクリーニング方法によると、従来において行われていたような、新種放線菌等の抗生物質産生菌の分離及び該新種の抗生物質産生菌による新規抗生物質の分離・同定に主眼が置かれていた抗生物質のスクリーニング方法とは全く異なり、公知の放線菌等を利用しながら新たな抗真菌性物質等の抗生物質及びその産生菌を容易にかつ簡便にスクリーニングすることができ、産業上極めて有益な、抗生物質のスクリーニング方法を提供することができる。

以下、本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

（実験１）
以下示す放線菌を、本発明の放線菌培養培地又は比較のための培地を用いて培養し、抗生物質産生の有無等について評価した。
実施例１で用いた放線菌を表１に、実施例１で用いた放線菌培養培地又は他の培地を表２〜１０に、それぞれ示した。
なお、表２に示すオートミール寒天（Ｏａｔｍｅａｌａｇａｒ）−ＹＧＧ−ＳＥ培地は、放線菌の菌株の保存及び胞子形成用培地として用いた。表３〜１０は、抗生物質生産性試験用の培地であり、表３は、ベネット培地（Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓｍｅｄｉｕｍ）を表し、表４は、ニュートリエント（栄養）培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔｍｅｄｉｕｍ）を表し、表５は、ツァペックドックス培地（Ｃｚａｐｅｋｄｏｘｍｅｄｉｕｍ）を表し、表６は、小麦フスマ培地（Ｗｈｅａｔｂｒａｎｍｅｄｉｕｍ）を表し、表７は、小麦フスマ懸濁液培地（Ｗｈｅａｔｂｒａｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｍｅｄｉｕｍ）を表し、表８は、小麦フスマ抽出培地（Ｗｈｅａｔｂｒａｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ）を表し、表９は、大麦フスマ培地（Ｂａｒｌｅｙｂｒａｎ）を表す。なお、表６に示す小麦フスマ培地及び表９に示す大麦フスマ培地が、本発明の放線菌培養培地に該当する。表１０は、ＹＥＰＤ寒天培地（ＹＥＰＤａｇａｒ）を表す。前培養用培地としては、細菌についてはニュートリエント（栄養）寒天培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔａｇａｒ）を用い、酵母及び糸状菌についてはＹＥＰＤ寒天培地（ＹＥＰＤａｇａｒ）を用いた。前記小麦フスマ及び前記大麦フスマは、株式会社はくばく製のものを用いた。

Ｔ：基準株（ＴｙｐｅＳｔｒａｉｎ）
ＩＦＯ:発酵研究所、大阪、日本

* オートミール２０ｇを１０００ｍｌの蒸留水で２０分間調製した後、チーズクロスでろ過したものを更に蒸留水を加え１０００ｍｌにしたもの
** ５００ｇの土壌物を５００ｍｌの水に加えたものを１２１℃で３０分間オートクレーブにかけフィルターしたもの

*５０ｍｌ容フラスコに小麦フスマ２ｇ、ＣａＣＯ_３０．２ｇ、及び水道水３ｍｌを入れ、均一になるようよく攪拌した後に、オートクレーブで１２１℃、１５分間殺菌したものを小麦フスマ培地として用いた。

*坂口フラスコに小麦フスマ４．２ｇ、ＣａＣＯ₃０．４ｇ、及び水道水８０ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、１５分間殺菌したものを小麦フスマ懸濁液培地として用いた。

^＊水道水１０００ｍｌに小麦フスマ１００ｇを加え、オートクレーブで１００℃で３０分間煮沸した後、ろ紙で濾過された液を小麦フスマ抽出培地として用いた。

*５０ｍｌ容フラスコに小麦フスマ２ｇ、ＣａＣＯ_３０．２ｇ、及び水道水３ｍｌを入れ、均一になるようよく攪拌した後に、オートクレーブで１２１℃、１５分間殺菌したものを大麦フスマ培地として用いた。

表１に示す各放線菌の菌体懸濁液の調製を以下のようにして行った。即ち、表１に示す各放線菌を３０℃で２週間培養した斜面培養又は平板培養（Ｏａｔｍｅａｌａｇａｒ−ＹＧＧ−ＳＥ）から菌体を２ｌｏｏｐｓ取り、殺菌水１．５ｍｌとガラスビーズ（径３ｍｍ、約８０個）の入った試験管に入れ、ミキサー（ＴＭ−１００：ＴｈｅｒｍｏｎｉｃｓＣｏ．Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ）上で約３分間激しく攪拌した。以上により得たものを放線菌の菌体懸濁液とした。

次に、前記各放線菌の菌体懸濁液を、上記各培地に接種し、各放線菌の培養を行い、培養終了後に抗生物質産生の有無を阻止円の有無により観察した。具体的には、以下の通りである。即ち、平板培養法は、各プレートに前記菌体懸濁液を、パスツールピペットを用いて１滴点接種し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓについては３０℃で５日間培養し、レアな放線菌（Ｒａｒｅａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）については３０℃で７日間培養した。
一方、定法により平板上の培養をクロロホルム蒸気で約２時間殺菌した後、１時間放置してクロロホルムを蒸発除去した。これに被試験菌懸濁液を接種したＳｌｏｐｐｙａｇａｒを流し込み重層した。そして、この重層平板を３０℃で一晩培養し阻止円の有無を観察した。

なお、被試験菌としては、ＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｅｕｓＩＦＯ１２７０８（グラム陽性細菌）、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＩＦＯ３０６１（グラム陽性細菌）、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓＩＦＯ１４５５４（グラム陰性細菌）、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＩＦＯ２４１６０（グラム陰性細菌）、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＩＦＯ３０４４（グラム陰性細菌）、Ｃａｎｄｉｄａｋｕｒｕｓｅｉ（酵母）、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒＡＴＣＣ９６４２（糸状菌）、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ（糸状菌）を用いた。なお、「ＡＴＣＣ」は、米国基準株コレクション、米国メリーランド州ロックビルを意味する。

これらの内、細菌は、Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓｌａｎｔに接種し、酵母は、ＹＥＰＤｓｌａｎｔに接種し、糸状菌は、ＹＥＰＤｐｌａｔｅに接種し、細菌・酵母については３日間、糸状菌については５日間、それぞれ３０℃で培養した。これらの培養から採った菌体（３〜５ｌｏｏｐｓ）を試験管中でガラスーズ入り殺菌水に懸濁して、Ｓｌｏｏｐｙａｇａｒ（２００ｍｌ）に接種した。なお、Ｓｌｏｐｐｙａｇａｒ（寒天濃度０．７％）としては、前記細菌については表４に示すニュートリエント（栄養）寒天培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔａｇａｒ）、酵母及び糸状菌にはＹＥＰＤａｇａｒ（Ｔａｂｌｅ１０）をそれぞれ用いた。

本発明の前記放線菌培養培地としての前記小麦フスマ培地又は前記大麦フスマ培地を用いたフスマ培養法では、表６に示す前記小麦フスマ培地又は表９に示す前記大麦フスマ培地を用い、放線菌の菌体懸濁液を１ｍｌ接種し、均一になるように殺菌済みガラス棒で攪拌した後、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）については５日間、レアな放線菌（Ｒａｒｅａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）については７日間、それぞれ３０℃で培養した。培養後、殺菌蒸留水１０ｍｌを加えガラス棒でよく攪拌した後、ロータリーシェーカー（ＮＲ−２：タイテック（株））で２００ｒｐｍ、３０分間振盪させた。２時間静置させた後、エッペンドルフチューブに上澄みの１．０ｍｌを採った。次いで遠心分離処理（１０，０００ｒｐｍ、１５分間）をし、上澄み５０μｌをピペットマンを用いてペーパーデスク（Ｔｏｋｙｏｒｏｓｈｉｎｏ．１、直径８ｍｍ）に浸した。これをピンセットを用いて寒天重層平板上に置いた。この重層平板を３０℃で一晩培養し、阻止円の有無を観察した。

なお、寒天重層平板は、細菌では、前記ニュートリエント（栄養）寒天培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔａｇａｒ）、酵母及び糸状菌では、前記ＹＥＰＤ寒天培地（ＹＥＰＤａｇａｒ）をそれぞれ用い、１０ｍｌの基層寒天培地（寒天濃度１．５％）に前述のように被試験菌を接種したＳｌｏｐｐｙａｇａｒ５ｍｌを重層して作製した。

また、液体培養法では、それぞれの培地を坂口フラスコに８０ｍｌ調製し、菌体懸濁液を１ｍｌ接種し、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）については５日間、レアな放線菌（Ｒａｒｅａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）については７日間、それぞれ３０℃で振盪（１２０ｒｅｃ／ｍｉｎ、６０ｍｍ）培養した。培養後は、エッペンドルフチューブに培養液を１ｍｌ採った。前述のように遠心分離処理（１０，０００ｒｐｍ、１５分間）をし、上澄みを５０μｌペーパーデスクに浸し、これを重層寒天培地上に置いた。平板を３０℃で一晩培養して阻止円の有無を観察した。

各放線菌を種々の培地で固体培養（Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓｐｌａｔｅ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔｐｌａｔｅ、Ｃｚａｐｅｋｄｏｘｐｌａｔｅ、Ｗｈｅａｔｂｒａｎ、Ｂａｒｌｅｙｂｒａｎ）及び液体培養（Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓｂｒｏｔｈ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔｂｒｏｔｈ、Ｃｚａｐｅｋｄｏｘｂｒｏｔｈ、Ｗｈｅａｔｂｒａｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ、Ｗｈｅａｔｂｒａｎｅｘｔｒａｃｔ）させた時の抗菌活性を調べた結果を、表１１〜１５に示した。なお、以上の手順を図１に示した。

Ｍ.ｌｕ:Ｍｉｃｕｒｏｃｃｏｕｓｌｕｔｅｕｓ,
Ｓ.ａｕ:Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ,
Ｐ.ｆｌ:Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ,
Ａ.ｒｈ:Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ,
Ｅ.ｃｏ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ,
Ｃ.ｋｒ:Ｃａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉ,
Ａ.ｎｉ:Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ,
Ａ.ｏｒ:Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ
阻止円の直径：固形培地；＋＋＋＞４４ｍｍ；＋＋＞２４ｍｍ；＋＞１３ｍｍ、
：液体培地；＋＋＋＞３９ｍｍ；＋＋＞１９ｍｍ；＋＞８ｍｍ

表１１は、Ｓ．ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓの結果であるが、前記小麦フスマ培地又は前記大麦フスマ培地を用いた場合には、他の培地では抗菌活性を示さなかったＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のグラム陰性細菌に対して抗菌活性を示し、抗生物質の産生が確認された。

表１２は、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓの結果であるが、前記小麦フスマ培地又は前記大麦フスマ培地を用いた場合には、他の培地では抗菌活性を示さなかったＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のグラム陰性細菌に対して抗菌活性を示し、抗生物質の産生が確認された。

表１３は、Ｓ．ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓの結果であるが、前記小麦フスマ培地又は前記大麦フスマ培地を用いた場合には、広範な抗菌活性を示し、他の培地では抗菌活性を殆ど示さなかったグラム陰性細菌に対して抗菌活性を示し、抗生物質の産生が確認された。

表１４は、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓの結果であるが、前記小麦フスマ培地又は前記大麦フスマ培地を用いた場合には、広範な抗菌活性を示し、他の培地では抗菌活性を殆ど示さなかったグラム陰性細菌に対して抗菌活性を示し、抗生物質の産生が確認された。

表１５は、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓの結果であるが、前記小麦フスマ培地又は前記大麦フスマ培地を用いた場合には、広範な抗菌活性を示し、抗生物質の産生が確認された。

（実験２）
本発明の前記放線菌培養培地としての前記小麦フスマ培地（表１８）を用い、表１６及び表１７に示した放線菌を培養し、抗生物質産生試験を行った。なお、被試験菌として用いた細菌、酵母及びカビについては表２２に示した。

＊吉田幸弘「抗菌活性を有する特定Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ群放線菌の選択分離に関する研究」山梨大学大学院工学研究科修士論文（２０００）
＊＊太田知洋「南極大陸由来の放線菌低温性株の分離、分類及び生物学的特性に関する研究」山梨大学大学院工学研究科修士論文（２００３）

抗菌活性試験の１次スクリーニングには、表１８に示す小麦フスマ培地（Ｗｈｅａｔ−ｂｒａｎｍｅｄｉｕｍ）を用いた。また、ＨＰＬＣ分析用には、表１９に示す小麦フスマ培地ＬＳ（Ｗｈｅａｔ−ｂｒａｎｍｅｄｉｕｍ−ＬＳ）を用いた。また、前記小麦フスマ培養との比較のため、表２０に示す抗菌性生産物Ｂ培地（ＭｅｄｉｕｍｆｏｒａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＢ）、表７に示す小麦フスマ懸濁液培地（Ｗｈｅａｔ−ｂｒａｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｍｅｄｉｕｍ）、及び、表３に示すベネット培地（Ｂｅｎｎｅｔｔ‘ｓｍｅｄｉｕｍ）の３種類の培地を用いた。そして、液体培養又は平板培養を行い、抗菌活性試験を行った。なお、前記小麦フスマ培地（Ｗｈｅａｔ−ｂｒａｎ）における小麦フスマは、株式会社はくばく製のものを使用した。この小麦フスマは、乳鉢ですり潰した後、ふるい（φ２ｍｍ）にかけたものを実験に用いた。

抗菌活性試験の被試験菌の前培養培地としては、細菌については表４に示すニュートリエント（栄養）培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔｍｅｄｉｕｍ）、酵母については表１０に示すＹＥＰＤ培地（ＹＥＰＤｍｅｄｉｕｍ）、カビについては表２に示すオートミール寒天培地−ＹＧＧ培地（Ｏａｔｍｅａｌａｇａｒ−ＹＧＧｍｅｄｉｕｍ）をそれぞれ用いた。重層寒天平板には、細菌についてはニュートリエント（栄養）培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔｍｅｄｉｕｍ）を用い、酵母及びカビについてはＹＥＰＤ培地（ＹＥＰＤｍｅｄｉｕｍ）を用いた。
なお、培地のｐＨは、ＣＯＭＰＡＣＴｐＨＭＥＴＥＲＢ−２１２（ＨＯＲＩＢＡ，Ｋｙｏｔｏ）により調整した。

実験１と同様にして調製した菌体懸濁液（１ｍｌ）を前記小麦フスマ培地に接種し、スパチュラで均一になるよう撹拌した後、２８℃で６日間培養した。培養後、溶媒（滅菌水、n-ブタノール、酢酸エチル）をそれぞれ１０ｍｌずつ添加し、スパチュラで撹拌した。ロータリーシェーカー（ＮＲ−２；タイテック、埼玉）で振盪（２００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）した後、約1時間静置した。抽出液をエッペンドルフチューブに移し、遠心分離機（H-1500F；コクサン、東京）により遠心処理（１０，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）後、上清を得た。この上清（５０μl）を１５０℃、１時間乾熱殺菌処理済みのペーパーディスク（φ８ｍｍ, 厚手；ＡＤＶＡＮＴＥＣ，Ｔｏｋｙｏ）に染み込ませ、滅菌水抽出に関してはそのまま、n-ブタノールと酢酸エチル抽出に関しては、真空乾燥（Ｖ−３０Ｄ；ＡＤＶＡＮＴＥＣ，Ｔｏｋｙｏ）後、前記寒天重層平板上に乗せた。３０℃で一晩培養後、形成した阻止円を観察した。以上の手順を図２に示した。

実験１と同様にして液体培養を行い、実験１と同様に調製した菌体懸濁液（２〜３滴）を駒込ピペットを用いて各液体培地（５ｍｌ／ｔｅｓｔｔｕｂｅ）に接種した。３０℃で振盪培養（１２０ｒｅｃ／ｍｉｎ、６０ｍｍ）した。培養日数は、表１６に示す既知の放線菌に関しては４日間とし、表１７に示すＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ分離株に関しては３日間及び６日間とした。培養液をスピッツ管（黒キャップ付き）に移し、等量のn-ブタノールを加えた。シェーカー（ＭＫ１００；ＹＡＭＡＴＯＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣＣＯ., ＬＴＤ, Ｔｏｋｙｏ）によって室温にて１時間撹拌した後、大容量遠心管用ＣＥＮＴＲＩＦＵＧＥ（０５Ｐ−２１；ＨＩＴＡＣＨＩ，Ｔｏｋｙｏ）により遠心処理（３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）し上清を得た。上清（５０μl）をペーパーディスクに染み込ませ真空乾燥後、前記寒天重層平板上に乗せ、３０℃で一晩培養後、形成した阻止円を観察した。

実験１と同様にして平板培養を行い、実験１と同様に調製した菌体懸濁液をＢｅｎｎｅｔｔ‘ｓｐｌａｔｅ（１５ｍｌ／ｐｌａｔｅ）に1点接種し３０℃で５日間培養した。定法によりクロロホルム蒸気で殺菌した後、被試験菌を接種したＳｌｏｐｐｙａｇａｒ（寒天濃度０．７％(ｗ／ｖ)）を流し込んだ。３０℃で一晩培養後、形成した阻止円の有無を観察した。なお、使用した被試験菌は、細菌ではＮｕｔｒｉｅｎｔｓｌａｎｔに１ｌｏｏｐ接種し、３０℃で２日間培養した。酵母は、ＹＥＰＤｓｌａｎｔに１ｌｏｏｐ接種し、３０℃で２日間培養した。また、カビに関しては、Ｏａｔｍｅａｌａｇａｒ−ＹＧＧｐｌａｔｅに接種し十分胞子形成が観られるまで３０℃で１週間以上培養した。また、Ｓｌｏｐｐｙａｇａｒとしては、細菌ではＮｕｔｒｉｅｎｔｍｅｄｉｕｍを用い、酵母及びカビについてはＹＥＰＤｍｅｄｉｕｍを用いた。

ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓＩＦＯ１３４１４^T、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓＩＦＯ１３６８６、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓＩＦＯ１３８５１^Tについて、以下のようにしてＨＰＬＣ分析を行った。
即ち、実験２で調製した前記菌体懸濁液(３ｍｌ)を前記小麦フスマ培地に接種し、スパチュラで均一になるよう撹拌し、２８℃で６日間培養した。培養後、溶媒（n-ブタノール、酢酸エチル）をそれぞれ６０ｍｌずつ添加し、スパチュラで撹拌した。ロータリーシェーカーで振盪(２００ｒｐｍ，６０ｍｉｎ)した後、約１時間静置した。抽出液を２ｍｌ容エッペンドルフチューブに移し、遠心処理(１０，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ)後、上清を得た。この上清(１．５ｍｌ)を２ｍｌ容エッペンドルフチューブに移し、エバポレーター（ＣＶＥ−１００;ＥＹＥＬＡ，Ｔｏｋｙｏ）によって減圧乾固した。
また、以上のようにして得た上清(５０〜１５０μｌ)をペーパーディスクに染み込ませ、滅菌水抽出に関してはそのまま、n-ブタノールと酢酸エチル抽出に関しては真空乾燥後、前記寒天重層平板上に乗せた。３０℃で一晩培養後形成した阻止円を観察した。また、小麦フスマ培養のコントロールとして、前記菌体懸濁液に代わり滅菌水(３ｍｌ)を添加し、同様に試験を行った。

前記ＨＰＬＣの分析条件については、以下の通りである。即ち、減圧乾固した培養物サンプルは、Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（以下ＤＭＳＯ）に溶解後、Ｄ．Ｊ．Ｈｏｏｋ, Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｒｅ，Ｃ．Ｆ．，Ｙａｃｏｂｕｃｃｉ，Ｊ．Ｊ．,Ｄｕｂａｙ，Ｇ．ａｎｄＯ‘ｃｏｎｎｅｏｒ, Ｓ．：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｓｙｓｔｅｍｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｔｕｍｏｒｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｓ. Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ. ３８５，９９−１０８（１９８７）に記載の方法に従い、ＨＰ１０９０ＨＰＬＣｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって分析を行った。ＨＰＬＣの分析条件については、表２１に示した。また、移動相のグラディエントは、図３に示した。また、HPLCの溶出時間により分取したサンプル（ＦｒａｃｔｉｏｎＮｏ．１〜３１）は、乾固後、ＤＭＳＯに溶解し抗菌活性試験を行い、形成した阻止円の有無を＋（プラス）又は−（マイナス）で示した。抗菌活性試験に使用した被試験菌は、表２２に示した。

ＡＪ；実験用菌株（味の素株式会社）
ＡＴＣＣ；米国基準株コレクション、米国メリーランド州ロックビル

本発明の放線菌培養培地としての前記小麦フスマ培地を用いた培養による抗菌活性試験の結果は、以下の通りである。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属既知株６株の結果を表２３〜２６に示した。また、分離株２４株の結果を表２７〜４４に示した。

ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓＩＦＯ１３３５０は、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して有効なストレプトマイシンを生産する株である。また、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＡ３（２）は、グラム陽性菌に有効なアクチノロージンを生産する株として知られている。抗菌活性試験の結果、平板培養では両株とも抗細菌活性が観られたことからストレプトマイシンやアクチノロージンが生産されたと推測された。しかし、前記小麦フスマ培地を用いた小麦フスマ培養の場合、前記グラム陽性細菌及び前記グラム陰性細菌に対して抗細菌活性を示さず、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒやＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの真菌類に対して阻止円の形成が観られた。
また、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓＴＫ２１に関しては、平板培養では供試した被試験菌10株の全てに対して抗菌活性は示さなかったが、前記小麦フスマ培地を用いた前記小麦フスマ培養の場合、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓＩＦＯ１３３５０、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＡ３（２）と同様にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの真菌類に対して阻止円の形成が観られた。液体培養と比較すると小麦フスマ懸濁液培地（Ｗｈｅａｔ−ｂｒａｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ培地）による結果でも抗菌スペクトラムは同様であることから、固体としての小麦フスマが抗生物質生産に適していることが推測された。

一方、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓＩＦＯ１３４１４^T、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓＩＦＯ１３６８６及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓＩＦＯ１３８５１^Tの場合、前記平板培養や前記液体培養とは異なる抗菌スペクトルを有することが示され、前述のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓＩＦＯ１３３５０、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓＴＫ２１、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＡ３（２）とは異なり、細菌や真菌に対して殺菌的かつ大きな阻止円の形成が同時に観られた。このことから、前記小麦フスマ培地を用いた小麦フスマ培養により、複数の抗生物質が生産されたと推測された。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ分離株については、前記小麦フスマ培地を用いた小麦フスマ培養の場合、カビ（真菌類）に対してのみ阻止円の形成が観察され、抗真菌性物質の産生能が発現している菌株があり、ＹＵ９１４−Ｃ１やＹＵ９１４−Ｐ３では、液体培養とは異なる抗菌スペクトラムが観察され、抗生物質産生能が変化していた。

前記抗菌活性試験に供試したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌３５株より、小麦フスマ培養により良好な結果の得られたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓＩＦＯ１３４１４^T、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓＩＦＯ１３６８６及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓＩＦＯ１３８５１^Tの３株を選択した。その小麦フスマ培地の小麦フスマ培養抽出物についてＨＰＬＣ分析を行い、以下の結果を得た。なお、ＨＰＬＣ分析に当たりスケールアップして培養を行った。

ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓＩＦＯ１３４１４^Tのn-ブタノール抽出物をＨＰＬＣにより分析した結果を図４に示した。各フラクションサンプルの抗菌活性試験の結果を図４Ｂに示した。ＦｒａｃｔｉｏｎＮｏ．（以下Ｆｒ.）２１及び２３にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒに対する阻止円の形成が観られた。Ｆｒ．２３に存在する２２．５Ｍｉｎ及び２２．７ｍｉｎのピークは、図４Ｃ２〜３に示したように、２８０ｎｍの単一吸収の波形を示した。これは、Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ系物質に多く観られる特徴的な波形である。なお、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓＩＦＯ１３４１４^Tの酢酸エチル抽出物のクロマトグラムはn-ブタノールの結果と類似していた。
以上より、抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ活性は、Ｆｒ２１に存在する物質及びＭａｃｒｏｌｉｄｅ系物質に類似した構造を有する物質によると推測された。

ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓＩＦＯ１３６８６のn-ブタノール抽出物の分析結果を図５に、また、酢酸エチル抽出物の分析結果を図６に示した。図５Ｂに示した抗菌活性試験の結果より、Ｆｒ９及び１１に抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ活性及び抗Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ活性が観られた。Ｆｒ９（８．２ｍｉｎ、８．９ｍｉｎ）及び１１（１０．３ｍｉｎ）に存在する物質は、図５Ｃ１〜３に示したＵＶｓｐｅｃｔｒｕｍを有しており、これは、抗真菌物質であるＰｅｎｔａｅｎｅ系物質に特徴的な波形であることから抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ活性は、Ｐｅｎｔａｅｎｅ系物質によると推測された。
図６より、酢酸エチル抽出ではＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒに対する活性が観られず、細菌に対してのみ活性を示したことから酢酸エチル抽出物についてＨＰＬＣ分析を行ったところ、図６１〜２に示したようにＦｒ．９にＰｅｎｔａｅｎｅ系物質のピークは観られなかったことから、抗細菌物質は、Ｐｅｎｔａｅｎｅ系物質とは別物質であると推測された。以上の点からＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓＩＦＯ１３６８６の小麦フスマ培地の小麦フスマ培養により抗真菌性物質及び抗細菌性物質が生産されることが確認された。抗真菌性物質は、Ｐｅｎｔａｅｎｅ系物質であり、滅菌水やn-ブタノールに移行することから比較的親水性の物質であると推測された。

ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓＩＦＯ１３８５１^Tのn-ブタノール抽出物のＨＰＬＣ分析結果を図７に示した。抗菌活性試験の結果を図７Ｂに示した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓに対する阻止円の形成が観られた。また、保持時間７．７ｍｉｎにＰｅｎｔａｅｎｅ系物質に特徴的なピークが観られた（図７Ｃ２）。更に１１．５ｍｉｎに小麦フスマ培地のＨＰＬＣ分析では観られない、代謝産物のピークが確認できた。このＰｅｎｔａｅｎｅ系物質と１１．５ｍｉｎの物質はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓＩＦＯ１３８５１^Tの平板培養及び液体培養でも存在することから、培養方法に関係なく生産される物質であると推測された。一方、抽出溶媒は異なるが、平板培養及び液体培養と、小麦フスマ培地を用いた培養との３種類の培養によるクロマトグラムは、非常に類似していた。n-ブタノールとアセトンが水溶性、脂溶性どちらの物質も抽出可能な性質を考慮すると、平板培養ではＦｒ．２４〜２６に抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ活性物質が存在するのに対して、小麦フスマ培地を用いた培養ではＦｒ．４〜７に活性物質が存在したことから、小麦フスマ培地を用いた培養により、平板培養とは異なる抗生物質の生産がされた可能性が推測された。

なお、小麦フスマ培地自体のＨＰＬＣ分析結果を図８に示した。図８Ｂに示したように、小麦フスマ培地自体にも阻止円の形成が観られ抗菌物質を有すると考えられるが、図４〜７のデータとの比較において、放線菌の培養により、新たな抗菌物質が生産されることが確認された。また、他の分析結果と比較すると、小麦フスマ培地で高含量に存在する２２．５ｍｉｎのピークは減少していることから放線菌の増殖に従って分解されたと推測された。

以上の結果から、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓＩＦＯ 1３４１４^T、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓＩＦＯ１３６８６及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓＩＦＯ１３８５１^Tの３株が生産する抗生物質は、既知の抗生物質とは異なることが示され、小麦フスマ培地を用いた培養が放線菌の抗生物質産生能を変化させ、新たな抗生物質産生能を発現させることができ、更には新規な抗生物質が産生される可能性があることが明らかとなった。前記小麦フスマ培地を用いて放線菌の培養を行うと、これまで抗生物質生産方法として工業的に行われている液体培養又は固体表面での平板培養とは異なる抗菌スペクトラムが得られ、新規抗生物質生産に有効であることが示された。また、異なる抗菌スペクトラムが観られた既知株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓＩＦＯ１３４１４^T、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓＩＦＯ１３６８６、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓＩＦＯ１３８５１^Tは既に実用化されている抗生物質の生産菌であるが、小麦フスマ培地を用いた培養抽出物のＨＰＬＣ分析により、既知物質とは異なる抗菌物質を生産することが明らかとなった。したがって、前記小麦フスマ培地を用いた培養により、抗生物質産生能が変化したことが確認された。
本発明の放線菌培養培地である前記小麦フスマ培地又は前記大麦フスマ培地を用いて行った培養、即ち本発明の放線菌による抗生物質の製造方法による場合にのみ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｉｂｉｃａｎｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｏｒｙｚａｅなどの真菌類に対しても抗菌活性を有する抗生物質の産生が確認された。現在、真菌類に効果を示す抗生物質は少ないが、本発明の放線菌培養培地を用いて本発明の放線菌による抗生物質の製造方法を行うと、従来の培養法では得られなかった抗生物質産生能が放線菌に新たに発現される可能性が示された。

本発明によると、他の公知の液体培養、平板培養等を用いて前記放線菌を培養した場合に産生される抗生物質とは異なる抗生物質を効率的に生産することができ、該放線菌が産生する抗生物質の種類や量を変更乃至変化させることができ、新規な抗生物質の産生能を発現させることができる放線菌培養培地を提供することができる。
また、本発明によると、他の公知の液体培養、平板培養等により放線菌が産生した抗生物質とは異なる各種抗生物質を効率よく製造することができ、従来は有していないと考えられていた抗生物質の産生能を放線菌に新たに発現させることにより、放線菌の遺伝子組換え、菌株改良等を行うことなく、容易にかつ簡便にしかも効率的に抗生物質の製造を行うことができ、新規な抗真菌性物質をも製造可能な、放線菌による抗生物質の製造方法を提供することができる。
また、本発によると、公知の液体培養、平板培養等を利用して放線菌に産生させていた抗生物質の種類や量を変化乃至改善させることができ、該放線菌にそれまで発現していなかった抗生物質産生能を新たに発現させることができ、該放線菌の抗生物質産生能を顕著に変化乃至改善させることができ、従来では産生が容易ではなかった抗真菌性物質等の抗生物質をも効率的にかつ簡便に製造することが可能な、放線菌の抗生物質産生能改善方法を提供することができる。
また、本発明によると、従来において行われていたような、新種放線菌等の抗生物質産生菌の分離及び該新種の抗生物質産生菌による新規抗生物質の分離・同定に主眼が置かれていた抗生物質のスクリーニング方法とは全く異なり、公知の放線菌等を利用しながら新たな抗真菌性物質等の抗生物質を容易にかつ簡便にスクリーニングすることができ、産業上極めて有益な、抗生物質のスクリーニング方法を提供することができる。

図１は、本発明の放線菌による抗生物質の製造方法の工程並びに比較としての固体培養及び液体培養の工程を示す概略説明図である。図２は、小麦フスマ培地を用いた培養後に抗菌活性試験を行っている状態を説明するための概略図である。図３は、ＨＰＬＣ分析における移動層のグラディエントを示すグラフである。図４は、小麦フスマ培地上で培養されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓＩＦＯ１３４１４^T生産物のＨＰＬＣ分析結果のデータである。図５は、小麦フスマ培地上で培養されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓＩＦＯ１３６８６生産物のＨＰＬＣ分析結果(ｎ−ブタノール抽出)のデータである。図６は、小麦フスマ培地上で培養されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓＩＦＯ１３６８６生産物のＨＰＬＣ分析結果(酢酸エチル抽出)のデータである。図７は、小麦フスマ培地上で培養されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓＩＦＯ１３，８５１^T生産物のＨＰＬＣ分析結果(ｎ−ブタノール抽出)のデータである。図８は、小麦フスマ培地のＨＰＬＣ分析結果(ｎ−ブタノール抽出)のデータである。

Claims

穀物の破砕片を含むことを特徴とする放線菌培養培地。
穀物の破砕片が穀物未利用部分である請求項１に記載の放線菌培養培地。
穀物未利用部分が穀物殻である請求項１から２のいずれかに記載の放線菌培養培地。
穀物が、小麦、大麦、オーツ麦、米、粟、稗及び豆類から選択される少なくとも１種である請求項１から３のいずれかに記載の放線菌培養培地。
穀物未利用部分が小麦フスマ及び大麦フスマから選択される請求項２から３のいずれかに記載の放線菌培養培地。
使用時に穀物の破砕片に対し水を質量（ｇ）：体積（ｍｌ）（穀物の破砕片：水）で１：０．５〜１：２の割合で含有する請求項１から５のいずれかに記載の放線菌培養培地。
使用時に穀物の破砕片に対し水を質量（ｇ）：体積（ｍｌ）（穀物の破砕片：水）で１：０．７〜１：１．７の割合で含有する請求項１から５のいずれかに記載の放線菌培養培地。
放線菌による抗生物質の生産に用いられる請求項１から７のいずれかに記載の放線菌培養培地。
放線菌の抗生物質産生能の改善に用いられる請求項１から７のいずれかに記載の放線菌培養培地。
抗生物質のスクリーニングに用いられる請求項１から７のいずれかに記載の放線菌培養培地。
請求項１から１０のいずれかに記載の放線菌培養培地を用いて放線菌を培養することを特徴とする放線菌による抗生物質の製造方法。
抗生物質が抗真菌性物質である請求項１１に記載の放線菌による抗生物質の製造方法。
放線菌がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌から選択される少なくとも１種である請求項１１から１２のいずれかに記載の放線菌による抗生物質の製造方法。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｎｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓから選択される少なくとも１種である請求項１３に記載の放線菌による抗生物質の製造方法。
培養が、２０〜４０℃で２週間以内で行われる請求項１１から１４のいずれかに記載の放線菌による抗生物質の製造方法。
培養後に溶媒で抗生物質を抽出する請求項１１から１５のいずれかに記載の放線菌による抗生物質の製造方法。
平板培養及び液体培養の少なくともいずれかで培養された放線菌を、請求項１から１０のいずれかに記載の放線菌培養培地を用いて培養することを特徴とする放線菌の抗生物質産生能改善方法。
放線菌がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌から選択される少なくとも１種である請求項１７に記載の放線菌の抗生物質産生能改善方法。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｎｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓから選択される少なくとも１種である請求項１８に記載の放線菌の抗生物質産生能改善方法。
培養が、２０〜４０℃で２週間以内で行われる請求項１７から１９のいずれかに記載の放線菌の抗生物質産生能改善方法。
請求項１から１０のいずれかに記載の放線菌培養培地を用いて微生物を培養する培養工程、及び培養後に抗生物質の存在を確認する抗生物質確認工程を含む特徴とする抗生物質のスクリーニング方法。
抗生物質を産生した微生物を同定する同定工程を含む請求項２１に記載の抗生物質のスクリーニング方法。