WO2015053285A1 - 微生物を植菌してなる種菌及びそれを使用する抗生物質の生産方法 - Google Patents

微生物を植菌してなる種菌及びそれを使用する抗生物質の生産方法 Download PDF

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WO2015053285A1
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antibiotic
streptomyces
inoculum
medium
producing
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育子 南條
裕康 古賀
俊哉 恒光
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日本農薬株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism, specifically an inoculum formed by inoculating an antibiotic-producing bacterium on a solid carrier, and an antibiotic production method using the inoculum.
  • Nosiheptide is a sulfur-containing polypeptide antibiotic and is commercially available as an animal feed additive because it has an effect of promoting animal growth and improving feed efficiency.
  • a method for producing such nociheptide there is known a method of producing it by culturing Streptomyces actusus NRRL2954, U-227 (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
  • antibiotic-producing bacteria are first cultured on a solid medium, and a certain amount of bacteria is inoculated and cultured in a small-scale liquid medium (seed culture medium). A seed culture is prepared. Next, this seed culture solution is inoculated into a larger-scale production liquid medium (main culture medium) and cultured to produce antibiotics.
  • main culture medium main culture medium
  • the present inventors once inoculated an antibiotic-producing bacterium used for preculture on a solid carrier in the production of the antibiotic.
  • By inoculating the seed 1. It is possible to omit culturing on a solid medium every time antibiotics are produced; Finding that seed cultures can be easily and efficiently prepared by automatically inoculating and cultivating inoculum (several) inoculated with a certain amount of antibiotic-producing bacteria, and improving the efficiency of antibiotic production succeeded in. It was also found that the antibiotic-producing bacteria can be stably frozen and stored for a long period of time by using the inoculum, and the present invention has been completed.
  • the present invention [1] An inoculum of an antibiotic-producing bacterium, inoculated with an antibiotic-producing bacterium on a solid carrier, [2] The inoculum according to the above [1], wherein the solid carrier is a plant-derived solid substance, [3] The inoculum according to the above [1] or [2], wherein the solid carrier is one or more selected from the group consisting of rice grain, wheat bran and soybean seeds, [4] The inoculum according to any one of [1] to [3] above, wherein the antibiotic-producing bacterium is an actinomycete belonging to the genus Streptomyces sp.
  • the present invention it is possible to provide a long-term storable inoculum in which a certain amount of antibiotic-producing bacteria has been inoculated.
  • the inoculum of the present invention it is possible to omit culturing in a solid medium that requires about 1 to 2 weeks, which had to be performed as a pre-culture step every time actual production is performed. It is possible to simply and reliably inoculate a certain amount of cells for preparation of a seed culture solution that has relied on feeling.
  • the simple seed culture solution preparation method and antibiotic production method of the present invention the working time can be shortened, the production cost can be reduced, and the productivity can be improved.
  • the present invention is particularly suitable for the production of nociheptide.
  • the inoculum of the present invention is obtained by inoculating an antibiotic-producing bacterium on a solid carrier.
  • Antibiotic-producing bacteria mainly include actinomycetes.
  • Examples of the antibiotic-producing actinomycetes include Streptomyces sp., Amycolatopsis sp., Saccharopolyspora sp. And the like.
  • actinomycetes belonging to the genus Streptomyces are preferably used.
  • actinomycetes belonging to the genus Streptomyces for example, Streptomyces actiusus, Streptomyces antibiotics (Streptomyces avermitiris Streptomyces streptomyces) galilaeus), Streptomyces glaucogriseus, Streptomyces griseius, Streptomyces hygroscopicus varieto Limonius (Streptomyce groscopicus var.
  • Streptomyces Kana My Seti mouse Streptomyces kanamycetius
  • Streptomyces Parubarusu Streptomyces parvulus
  • Streptomyces Peusetikusu Streptomyces peuceticus
  • Streptomyces Berti Sils Streptomyces verticillus
  • Streptomyces tsukubaensis Streptomyces tsukubaensis and the like.
  • Streptomyces actiosus Streptomyces antibiotics, and Streptomyces glucocogresseus that are nociheptide-producing bacteria are used. More preferably, Streptomyces actusus is used. As Streptomyces actusus, NRRL2954, U-227 or a strain having properties equivalent to those is preferable, and U-227 and a strain having properties equivalent to this are particularly preferably used.
  • U-227 was deposited domestically as FERM P-7705, and internationally deposited as NITE BP-01698 to the Patent Biological Depositary Center (NPMD), National Institute of Technology and Evaluation (Kazusa-Kama, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) 2-5-8 feet (original deposit date: August 28, 2013).
  • NPMD Patent Biological Depositary Center
  • Kanazusa-Kama Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan
  • 2-5-8 feet original deposit date: August 28, 2013.
  • strain having properties equivalent to those refers to a strain passaged from NRRL2954 or U-227.
  • one type selected from the above-mentioned antibiotic-producing bacteria may be used alone, or two or more types may be selected and used in combination.
  • the solid carrier for inoculating antibiotic-producing bacteria used in the present invention is a solid substance that itself becomes a nutrient source for survival of the antibiotic-producing bacteria, and antibiotic production. Those that do not adversely affect the survival of the fungus, or do not directly affect the survival of the antibiotic-producing bacteria, but can maintain the survival, solid matter derived from animals and plants, biodegradable resin Synthetic biodegradable substances such as synthetic partially degradable substances such as a mixture of biodegradable resin and non-degradable resin. Among these, for the purpose of the present invention, animal and plant-derived solid substances are preferably used, and plant-derived solid substances are more preferably used.
  • solid substances derived from animals and plants include rice grains, wheat bran, soybean seeds, rice husk, rice bran, malt root, corn stalk, bacus, etc., gramineous plants, legumes, etc., seeds, stems, roots , Seed coat, pericarp etc. or ground product thereof; nut shell such as walnut, fruit core or ground product thereof; wood flour such as sawdust, wood chip, wood bark; fish meal; waste paper; cellulose, starch, dextrin, agar, etc.
  • Polysaccharides or powders or granular materials thereof; proteins such as gelatin or powders or granular materials thereof may be used, and one or more of these may be selected and used.
  • fruits such as gramineous plants, leguminous plants, seeds, etc., pulverized products thereof, plant-derived polysaccharides such as cellulose, agar, etc., or plant-derived solid substances such as powders or granules thereof Is more preferably used.
  • plant-derived polysaccharides such as cellulose, agar, etc.
  • plant-derived solid substances such as powders or granules thereof
  • rice grains, wheat bran, or soybean seeds are more preferably used, and rice grains are particularly preferably used.
  • the solid carrier used in the present invention is preferably sterilized. Sterilization may be performed according to a known method such as autoclaving after washing and autoclaving.
  • inoculation of an antibiotic-producing bacterium into a solid carrier can be performed by a known method.
  • one or more solid carriers selected from the above are coated with antibiotic-producing bacteria themselves such as cell pellets collected from the culture solution, or freeze-dried cells of antibiotic-producing bacteria Or a suspension obtained by suspending the microbial cells in physiological saline, phosphate buffered saline, or the like, or a culture solution when cultivating antibiotic-producing bacteria is added to and mixed with a solid carrier, or By impregnating the solid support with a suspension of bacterial cells or a culture solution, the antibiotic-producing bacteria are attached to the solid support.
  • antibiotic-producing bacteria may be cultured on a solid carrier.
  • the antibiotic-producing bacteria are used individually or in combination of two or more, and the growth of the antibiotic-producing bacteria used by various methods known in the art such as liquid culture method and solid phase culture method.
  • a common actinomycete medium such as Yeast extract-Malt extract (YMG) agar medium, Bennett's agar medium, Yeast-Starch agar Bacteria obtained by culturing in a medium, albumin medium, etc., usually at 20 ° C. to 35 ° C., preferably 25 ° C. to 30 ° C. for about 1 week to 2 weeks can be used. Further, a culture solution obtained by culturing actinomycetes belonging to the genus Streptomyces in a YMG liquid medium or the like can also be used.
  • YMG Yeast extract-Malt extract
  • the cells separated from the agar medium are 30 mL of liquid medium such as YMG liquid medium. It is possible to use pellets of cells obtained by seeding in 50 mL and culturing at 20 ° C. to 35 ° C., preferably 25 ° C. to 30 ° C. for 37 hours to 48 hours, and then collected by centrifugation or the like. .
  • the solid carrier When culturing actinomycetes belonging to the genus Streptomyces on a solid carrier, for example, the solid carrier is inoculated and used directly or in the liquid medium or on the agar medium at 20 ° C. to 35 ° C. for 7 days to Shake culture or static culture for about 10 days.
  • the solid carrier to which the antibiotic-producing bacteria are adhered may be optionally dried.
  • inoculum refers to an antibiotic-producing bacterium inoculated, that is, attached to a solid carrier by the above-described method.
  • examples of the inoculum of the present invention include rice grains, wheat bran, soybean seeds, rice husks, rice bran, malt root, corn stalk, bacus, etc., gramineous plants, legumes, etc., seeds, stems, roots, seed coats, peels Or pulverized products thereof; nut shells such as walnuts, fruit cores or pulverized products thereof; wood flour such as sawdust, wood chips, wood bark; fish meal; waste paper; polysaccharides such as cellulose, starch, dextrin, agar or the like
  • an antibiotic-producing bacterium inoculated into a solid substance derived from animals and plants, such as proteins such as gelatin, or proteins such as gelatin, and fruits such as gramineous plants and legumes More preferred are antibiotic-producing bacteria inoculated in plant-derived
  • Rice grain, one or antibiotic productivity bacteria was inoculated into 2 or more selected from the group consisting of wheat bran and soybean seeds are more preferred.
  • the antibiotic-producing bacteria adhere so that the surface of the solid carrier is colored gray, and about 10 5 to 10 10 antibiotic-producing bacteria are inoculated per solid carrier. It is preferable that
  • a method suitable for preserving bacteria, particularly antibiotic-producing bacteria can be appropriately employed, and a method in which the solid carrier is not denatured is preferable.
  • a method of shutting off the supply of microorganisms a cryopreservation method, an L-drying method (Sakane et al .; Microbiol. Cult. Coll. Vol. 12 91-97 (1996)), etc.
  • save by the cryopreservation method preserve
  • the present invention also provides a method for preparing a seed culture solution, which includes a step of adding and culturing the inoculum of the present invention to a growth medium.
  • a step of adding and culturing the inoculum of the present invention to a growth medium in particular, in the case of the inoculum of the present invention using a plant-derived solid substance as a solid carrier, 1 to 3 inoculums can be added to the growth medium and cultured for a certain period to obtain a seed culture solution.
  • a known medium suitable for the growth of antibiotic-producing bacteria inoculated on a solid carrier can be appropriately used as the growth medium, and can be cultured according to known culture conditions.
  • the present invention comprises adding a seed culture solution of the present invention to an antibiotic production medium and culturing, or adding a seed culture solution prepared by the seed culture solution preparation method of the present invention to an antibiotic production medium.
  • a method for producing antibiotics comprising the step of culturing.
  • the antibiotic produced by bacteria belonging to the genus Streptomyces Examples include nosiheptide, oleandomycin, aclacinomycin, streptomycin, kanamycin, phenoxazone antitumor antibiotic, bleomycin, daunomycin, validamycin and the like.
  • Antibiotics produced by actinomycetes belonging to a genus other than the genus Streptomyces, such as the genus Amycolatopsis, include rifamycin, and as antibiotics produced by actinomycetes belonging to the genus Saccharopolyspora, Erythromycin is mentioned.
  • the antibiotic production medium to which the seed fungus or seed culture solution of the present invention is added a known medium suitable for the production of the antibiotic can be used, and the seed fungus or seed culture solution is added.
  • the subsequent culture can be performed by a known method under known culture conditions.
  • When cultivating the inoculum of the present invention by adding it to an antibiotic production medium it is sufficient to add about 1 to 3 inoculations if the inoculum is inoculated on a plant-derived solid substance.
  • the amount of antibiotic production is reproducible.
  • Antibiotics produced by the production method of the present invention can be separated and collected from the medium by known methods suitable for each antibiotic, such as recrystallization using a solvent and column chromatography.
  • the method for producing an antibiotic of the present invention can be preferably used particularly in the production of nociheptide.
  • Nosyheptide is produced from Streptomyces actiosus, Streptomyces antibiotics and Streptomyces glaucolisid species Species from a group of Streptomyces glaucolis species
  • the inoculum of the inoculated bacterium may be directly added to the nosyheptide production medium and cultured, and the seed culture solution prepared by adding the inoculum to the growth medium and culturing is added to the nosyheptide production medium. It may be added to and cultured.
  • the inoculum used for the production of nociheptide those inoculated with Streptomyces actusus as the nociheptide-producing fungus are preferred.
  • Streptomyces actusus (Streptomyces actusus) NRRL2954, Streptomyces actusus, Streptomyces actusus -227, and those inoculated with one or more selected from the group consisting of strains having the same properties, Streptomyces actusus U-227 or equivalent What inoculated the bacteria which has a property is especially preferable.
  • nociheptide production medium for example, known nosyheptide production media described in JP-A-61-25495 (the above-mentioned Patent Document 2), JP-A-62-179395 and the like can be used.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-25495 (Patent Document 2) and the like also describe the culture after adding a seed culture inoculated with a productive bacterium or a seed culture solution prepared using the seed bacterium to a nociheptide production medium. It can be carried out under the known conditions described.
  • the nociheptide produced by the production method of the present invention can be obtained by a known method such as extraction with an organic solvent described in Japanese Patent Publication No. 40-880 (the above Patent Document 1), a method in which precipitation is combined with column chromatography, and the like. Can be separated and recovered.
  • the above-mentioned culture medium used for the preparation of the inoculum of the present invention may be prepared and used according to each known composition, and Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan BD Commercial products provided by companies and the like can also be used.
  • Example 1 Preparation of inoculum Yeast extract-Malt extract (YMG) on agar medium, Streptomyces actusus (Accession number: NITE BP-01698, National Institute of Technology and Technology, Japan (Deposited with the center (NPMD)) was cultured (about 1-2 weeks).
  • One platinum loop of the precultured strain was collected, seeded in a flask containing 40 mL of YMG liquid medium, and cultured with shaking at 27 ° C. (25-30 ° C.). After 37 to 48 hours, the bacterial cell pellets were collected, 1 mL of the pellets were collected, and added to the rice (flask) and mixed. Culturing was carried out at 27 ° C. (25 to 30 ° C.) for 7 to 10 days to obtain an inoculum inoculated on the rice grain.
  • Example 2 Production of nosyheptide using inoculum The nociheptide was obtained by culturing in a 30 L fermentor using one or two of the inoculum prepared in Example 1 above. Such nociheptide production is shown in Table 1.
  • nosiheptide As shown in Table 1, the production performed three times showed almost the same amount of nosyheptide.
  • nosiheptide is produced by culturing using the inoculum of the present invention, a certain amount of cells are obtained in the production medium, so that nociheptide can be produced with excellent reproducibility by the inoculum of the present invention. It has been shown.
  • the nociheptide concentration in the medium was obtained by quantifying nosiheptide in the extract obtained using an organic solvent by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the product titer was obtained by quantifying nociheptide in the extract obtained using an organic solvent after drying the medium.
  • the nosyheptide was produced three times. In each, the concentration of nosiheptide in the medium and the amount of nociheptide contained in the final dried product (also referred to as “product titer”) were measured.
  • Example 3 Production of nosiheptide using inoculum stored for a long time Nosiheptide was produced in the same manner as in Example 2 using an inoculum that had been stored frozen for a long time. Table 2 shows the product titers when various bacteria are used.
  • Example 4 Preparation of inoculum and production of nosiheptide Streptomyces actusus U-481-232-21 was used as an antibiotic-producing bacterium, and the actinomycetes were inoculated in the same manner as in Example 1. Rice grains (inoculum) were obtained. When the inoculum of Example 4 was used, nosyheptide could be produced as in Example 2. In addition, as in Example 3, no significant reduction in product titer was observed after long-term freezing storage.
  • U-481-32-21 is a production strain that has been passaged through Streptomyces actusus NRRL2954.
  • antibiotic-producing bacteria are cultured on a solid medium for about 1 to 2 weeks in the pre-culture step, and a certain amount of this is collected with a platinum loop and inoculated into a liquid medium. It was necessary to prepare.
  • the pre-culture step in a solid medium is not necessary, and the inoculum of the present invention has a certain amount (number of bacteria) attached to it, so that a conventional worker Instead of collecting and inoculating a certain amount of cells with platinum ears, which has been relied on the experience and feeling of culturing, the culture can be started easily by adding the inoculum directly to the medium, and the operation is very Simplified and excellent in operability.
  • the inoculum can be stored frozen for a long period of time and is highly convenient because of its excellent storage stability.
  • this invention can be suitably utilized for the production of nosiheptide by inoculating actinomycetes belonging to the genus Streptomyces, which is a nociheptide-producing bacterium, as an antibiotic-producing bacterium and using it as an inoculum.

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Abstract

　本発明は、より効率化された抗生物質の生産方法、特にノシヘプタイドの生産において前培養工程を省略し、一定量の菌体の採取及び接種を簡便かつ確実に行うことで、抗生物質の生産の効率化を図ることを本発明の課題とする。本発明は、ノシヘプタイド等抗生物質の製造に際し、前培養に用いるストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）に属する放線菌等の抗生物質生産性菌を、一旦固体担体に植菌して得られる種菌とすることを特徴とする。

Description

微生物を植菌してなる種菌及びそれを使用する抗生物質の生産方法
　本発明は、微生物、詳しくは抗生物質生産性菌を固体担体に植菌してなる種菌、及びそれを使用する抗生物質の生産方法に関する。
　ノシヘプタイドは含硫ポリペプチド系抗生物質であって動物の生長促進効果及び飼料効率の改善効果等を有しているため、動物用飼料添加物として市販されている。かかるノシヘプタイドの生産方法としては、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）ＮＲＲＬ２９５４、Ｕ－２２７を培養することにより生産する方法が知られている（例えば、特許文献１及び２参照）。
特公昭４０－８８０号公報 特開昭６１－２５４９５号公報
　抗生物質の実生産場面では、先ず前培養工程として、固形培地上で抗生物質生産性菌を培養し、その一定量の菌数を小スケールの液体培地（種培養培地）に接種、培養して種培養液が調製される。次にこの種培養液を更に大きなスケールの生産用液体培地（本培養培地）に接種、培養して抗生物質を生産する。かかる生産工程の前培養工程では、１～２週間程度を要する固形培地上での培養と、一定量の菌体を接種することによる種培養液の調製が重要であり、それがその後の抗生物質の生産性にも影響する。特に、一定量の菌体の採取は、従来１白金耳を基準としてなされてきたが、該操作は煩雑で作業者の経験と感に頼るところも大きく、操作の簡便化が望まれていた。
　本発明者等は、前記課題を解決すべく抗生物質生産性の効率化について鋭意研究を重ねた結果、抗生物質の生産において、前培養に用いる抗生物質生産性菌を一旦固体担体に植菌して種菌とすることにより、１．抗生物質生産の度に行われる固形培地上での培養を省略することができ、また、２．一定量の抗生物質生産性菌が植菌された種菌（数個）を自動的に接種、培養すれば、種培養液を簡便かつ効率よく調製することができることを見出し、抗生物質生産の効率化に成功した。併せて当該種菌とすることで、抗生物質生産性菌を長期にわたり安定に冷凍保存できることも見出し、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、
［１］抗生物質生産性菌を固体担体に植菌してなる、抗生物質生産性菌の種菌、
［２］固体担体が植物由来の固体状物質である、上記［１］に記載の種菌、
［３］固体担体が、米粒、小麦ふすまおよび大豆種子からなる群より選択される１種または２種以上である、上記［１］又は［２］に記載の種菌、
［４］抗生物質生産性菌が、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）に属する放線菌である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の種菌、
［５］ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）に属する放線菌が、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）の１種または２種以上である、上記［４］に記載の種菌、
［６］ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）の１種または２種以上が、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）ＮＲＲＬ２９５４、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）Ｕ－２２７、およびそれらと同等の性質を持つ菌株からなる群より選択される、上記［５］に記載の種菌、
［７］上記［１］乃至［６］のいずれかに記載の種菌を発育培地に添加し、培養する工程を含む、種培養液の調製方法、
［８］上記［１］乃至［６］のいずれかに記載の種菌を抗生物質生産用培地に添加し、培養する工程、又は上記［７］に記載の方法で調製される種培養液を抗生物質生産用培地に添加し、培養する工程を含む、抗生物質の生産方法、
［９］上記［５］又は［６］に記載の種菌をノシヘプタイド生産用培地に添加して、培養する工程を含む、ノシヘプタイドの生産方法、に関する。
　本発明により、一定量の抗生物質生産性菌が植菌された長期間保存可能な種菌を提供することができる。
　本発明の種菌を用いることにより、実生産をするたびに前培養工程として行う必要のあった１～２週間程度を要する固形培地での培養を省略することができ、かつ従来作業者の経験と感に頼ってきた種培養液調製のための一定量の菌体の接種を簡便かつ確実に行うことができる。
　また、本発明の簡便な種培養液の調製方法、および抗生物質の生産方法により、作業時間を短縮し、生産コストを低減して、生産性の効率化を実現することができる。本発明は、特にノシヘプタイドの生産に適する。
　本発明の種菌は、抗生物質生産性菌を固体担体に植菌してなる。抗生物質生産性菌としては、主として放線菌が挙げられる。
　抗生物質生産性の放線菌としては、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｓｐ．）、サッカロポリスポラ属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐ．）等が挙げられる。
　本発明においては、ストレプトマイセス属に属する放線菌が好ましく用いられる。
　ストレプトマイセス属に属する放線菌としては、例えば、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス　アンティバイオティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス　アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス　ガリラエウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇａｌｉｌａｅｕｓ）、ストレプトマイセス　グラウコグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌａｕｃｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス　グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス　ヒグロスコピクス　バリエント　リモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｖａｒ．　ｌｉｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトマイセス　カナマイセティウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｕｓ）、ストレプトマイセス　パルバルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｒｖｕｌｕｓ）、ストレプトマイセス　ペウセティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｅｕｃｅｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス　ベルティシルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス　ツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）などが挙げられる。
　本発明のより好ましい態様としては、ノシヘプタイド生産性菌であるストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス　アンティバイオティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス　グラウコグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌａｕｃｏｇｒｉｓｅｕｓ）を用いる。さらに好ましくは、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）が用いられる。ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）としては、ＮＲＲＬ２９５４、又はＵ－２２７もしくはそれらと同等の性質を持つ菌株が好ましく、Ｕ－２２７およびこれと同等の性質を持つ菌株が特に好ましく用いられる。Ｕ－２２７は、ＦＥＲＭ Ｐ－７７０５として国内寄託され、ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９８として、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国際寄託されている（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）（原寄託日：２０１３年８月２８日）。ここで、「それらと同等の性質を持つ菌株」とは、ＮＲＲＬ２９５４あるいはＵ－２２７を継代した菌株を示す。
　本発明においては、上記の抗生物質生産性菌より選択した１種を単独で使用してもよく、又は２種以上を選択し、組み合わせて使用することもできる。
　本発明において使用する、抗生物質生産性菌を植菌するための固体担体は、かかる担体自体が、抗生物質生産性菌生存のための栄養源となる固体状の物質であり、かつ抗生物質生産性菌の生存に対して悪影響を与えないもの、あるいは抗生物質生産性菌の生存には直接影響を与えないが、生存を維持し得るものであり、動植物由来の固体状物質、生分解性樹脂等の合成の生分解性物質、生分解性樹脂と非分解性樹脂の混合物等の合成の部分分解性物質等が挙げられる。これらのうち、本発明の目的には、動植物由来の固体状物質が好ましく用いられ、植物由来の固体状物質がより好ましく用いられる。
　動植物由来の固体状物質としては、例えば、米粒、小麦ふすま、大豆種子、もみ殻、米ぬか、麦芽根、トウモロコシ茎、バカス等、イネ科植物、マメ科植物等の頴果、種子、茎、根、種皮、果皮等又はこれらの粉砕物；クルミ等堅果の殻、果実核又はこれらの粉砕物；おが屑、木材チップ、木材バーク等の木質粉；魚粉；古紙；セルロース、デンプン、デキストリン、寒天等の多糖類又はこれらの粉末もしくは粒状物；ゼラチン等のタンパク質又はこれらの粉末もしくは粒状物等が挙げられ、これらより１種又は２種以上を選択して用いることができる。
　本発明においては、イネ科植物、マメ科植物等の頴果、種子等又はこれらの粉砕物、セルロース、寒天等の植物由来の多糖類又はこれらの粉末もしくは粒状物等の植物由来の固体状物質がより好ましく用いられる。これらのうち、さらに好ましくは、米粒、小麦ふすま、又は大豆種子が用いられ、特に好ましくは、米粒が用いられる。
　本発明で使用する固体担体は、滅菌して使用する方が好ましい。滅菌は、洗浄後、オートクレーブで高圧蒸気滅菌する等、公知の方法に従って行えばよい。
　本発明において抗生物質生産性菌の固体担体への植菌は、公知の方法で行うことができる。例えば、上記より選択した１種または２種以上の固体担体に、培養液より集菌した菌体ペレット等の抗生物質生産性菌自体を塗布する、あるいは抗生物質生産性菌の菌体の凍結乾燥物や、該菌体を生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等に懸濁した懸濁液、もしくは抗生物質生産性菌を培養した際の培養液を固体担体に添加、混合する、又は前記菌体の懸濁液や培養液を固体担体に含浸させることにより、抗生物質生産性菌を固体担体に付着させる。また、固体担体上で抗生物質生産性菌を培養してもよい。この際、抗生物質生産性菌は、個々に又は２種以上を併存させて、液体培養法、固相培養法等の当該分野で公知の種々の方法により、使用する抗生物質生産性菌の生育に適する液体培地又は固体培地を用い、好気的又は嫌気的条件下で、用いる抗生物質生産性菌の増殖に適した条件下で培養することができる。
　たとえば、抗生物質生産性菌としてストレプトマイセス属に属する放線菌を用いる場合、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ－Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＹＭＧ）寒天培地等の一般的な放線菌用培地、Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓ　寒天培地、Ｙｅａｓｔ－Ｓｔａｒｃｈ寒天培地、アルブミン培地等で、通常２０℃～３５℃、好ましくは２５℃～３０℃で１週間～２週間程度培養して得た菌体を用いることができる。
　また、ストレプトマイセス属に属する放線菌を、ＹＭＧ液体培地等で培養して得た培養液を用いることもできる。
　より好ましくは、ＹＭＧ寒天培地等の放線菌用寒天培地にて、２０℃～３５℃で１週間～２週間培養した後、前記寒天培地から分取した菌体をＹＭＧ液体培地等の液体培地３０ｍＬ～５０ｍＬに播種し、２０℃～３５℃、好ましくは２５℃～３０℃で３７時間～４８時間振とう培養した後、遠心分離等により集菌して得た菌体のペレットを用いることができる。
　ストレプトマイセス属に属する放線菌を固体担体上で培養する場合は、たとえば、固体担体に接種し、そのまま、または上記液体培地中もしくは上記寒天培地上にて、２０℃～３５℃で７日～１０日程度振とう培養または静置培養を行う。
　上記した菌体の塗布、添加、含浸等の処理後に、抗生物質生産性菌が付着した固体担体に対し、任意に乾燥を行ってもよい。
　本発明において、「種菌」とは、上記した方法により、固体担体に植菌、すなわち付着させた状態の抗生物質生産性菌をいう。本発明の種菌としては、米粒、小麦ふすま、大豆種子、もみ殻、米ぬか、麦芽根、トウモロコシ茎、バカス等、イネ科植物、マメ科植物等の頴果、種子、茎、根、種皮、果皮等又はこれらの粉砕物；クルミ等堅果の殻、果実核又はこれらの粉砕物；おが屑、木材チップ、木材バーク等の木質粉；魚粉；古紙；セルロース、デンプン、デキストリン、寒天等の多糖類又はこれらの粉末もしくは粒状物；ゼラチン等のタンパク質又はこれらの粉末もしくは粒状物等、動植物由来の固体状物質に植菌された抗生物質生産性菌が好ましく、イネ科植物、マメ科植物等の頴果、種子等又はこれらの粉砕物、セルロース、寒天等の植物由来の多糖類又はこれらの粉末もしくは粒状物等、植物由来の固体状物質に植菌された抗生物質生産性菌がより好ましく、米粒、小麦ふすまおよび大豆種子からなる群より選択される１種または２種以上に植菌された抗生物質生産性菌がさらに好ましい。
　本発明の種菌においては、固体担体表面が灰色に着色するように抗生物質生産性菌が付着し、固体担体1個あたりとして、１０5個～１０１０個程度の抗生物質生産性菌が植菌されていることが好ましい。
　本発明の種菌の保存方法としては、菌の保存、特に抗生物質生産性菌の保存に適切な保存方法を適宜採用することができ、且つ固体担体が変性しないような方法が好ましい。
　たとえば、ストレプトマイセス属等の放線菌を植物由来の固体状物質に植菌した種菌の場合は、滅菌蒸留水でシールする水保存法、流動パラフィン重層法等、滅菌水や流動パラフィン等で酸素の供給を遮断する方法、凍結保存法、Ｌ－乾燥法（坂根ら；Microbiol. Cult. Coll. Vol. 12 91-97 (1996)）等、凍結・乾燥により微生物の代謝活性を停止する方法等を採用することができるが、冷凍庫で保存する凍結保存法により保存することが好ましい。
　本発明はまた、本発明の種菌を発育培地に添加し、培養する工程を含む種培養液の調製方法を提供する。特に、固体担体として植物由来の固体状物質を用いた本発明の種菌の場合は、発育培地に１～３個の種菌を添加し、一定期間培養して、種培養液を得ることができる。
　本発明の種培養液の調製方法においては、固体担体に植菌された抗生物質生産性菌の発育に適する公知の培地を適宜発育培地として用い、公知の培養条件に従って培養することができる。たとえば、ストレプトマイセス属に属する放線菌を植菌した種菌を用いる場合は、発育培地として特許文献２の実施例に記載された培地を３０ｍＬ～４０ｍＬ程度用い、２０℃～３５℃で３０時間～４８時間振とう培養することが好ましい。
　さらに本発明は、本発明の種菌を抗生物質生産用培地に添加し、培養する工程、又は、本発明の種培養液の調製方法により調製される種培養液を抗生物質生産用培地に添加し、培養する工程を含む、抗生物質の生産方法を提供する。
　本発明の生産方法により生産される抗生物質としては、当然のことながら種菌に植菌された抗生物質生産性菌の種類によって異なるが、ストレプトマイセス属に属する細菌により生産される抗生物質としては、例えば、ノシヘプタイド、オレアンドマイシン、アクラシノマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、フェノキサゾン系抗腫瘍性抗生物質、ブレオマイシン、ダウノマイシン、バリダマイシン等が挙げられる。
　ストレプトマイセス属以外の属、たとえばアミコラトプシス属に属する放線菌により生産される抗生物質としては、リファマイシンが挙げられ、サッカロポリスポラ属に属する放線菌により生産される抗生物質としては、エリスロマイシンが挙げられる。
　本発明の生産方法において、本発明の種菌又は種培養液を添加する抗生物質生産用培地としては、上記抗生物質の生産に適する公知の培地を用いることができ、種菌又は種培養液を添加した後の培養は、公知の培養条件下に公知の方法で行うことができる。
　なお、本発明の種菌を抗生物質生産用培地に添加して培養する場合は、植物由来の固体状物質に植菌された種菌であれば、１～３個程度を添加することにより、十分な量の抗生物質の生産が再現性よく得られる。
　本発明の生産方法により生産された抗生物質は、溶媒による再結晶法やカラムクロマトグラフィー法等、各抗生物質に適する公知の方法により、培地より分離、回収することができる。
　本発明の抗生物質の生産方法は、特にノシヘプタイドの生産において好適に用いることができる。
　ノシヘプタイドの生産は、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス　アンティバイオティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）およびストレプトマイセス　グラウコグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌａｕｃｏｇｒｉｓｅｕｓ）からなる群より選択した１種又は２種以上のノシヘプタイド生産性菌を植菌した種菌を、直接ノシヘプタイド生産用培地に添加して培養して行ってもよく、前記種菌を発育用培地に添加し、培養して調製した種培養液を、ノシヘプタイド生産用培地に添加して培養してもよい。
　ノシヘプタイドの生産に用いる種菌としては、ノシヘプタイド生産性菌として、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）を植菌したものが好ましく、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）　ＮＲＲＬ２９５４、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）　Ｕ－２２７、およびそれらと同等の性質を持つ菌株からなる群より選択される１種又は２種以上を植菌したものがより好ましく、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）　Ｕ－２２７またはこれと同等の性質を持つ細菌を植菌したものが特に好ましい。
　ノシヘプタイド生産用培地としては、たとえば、特開昭６１－２５４９５号公報（上記特許文献２）、特開昭６２－１７９３９５号公報等に記載された公知のノシヘプタイド生産用培地を用いることができ、ノシヘプタイド生産性菌を植菌した種菌又は当該種菌を用いて調製される種培養液をノシヘプタイド生産用培地に添加した後の培養についても、特開昭６１－２５４９５号公報（上記特許文献２）等に記載された公知の条件にて行うことができる。
　本発明の生産方法により生産されたノシヘプタイドは、特公昭４０－８８０号公報（上記特許文献１）に記載された有機溶媒による抽出、沈殿とカラムクロマトグラフィーを組み合わせた方法等、公知の方法で培地から分離、回収することができる。
　なお、本発明の種菌の調製、種培養液の調製およびノシヘプタイド等の生産に用いる上記の培地は、それぞれ公知の組成に従って調製して用いてもよく、また、和光純薬工業株式会社、日本ＢＤ社等より提供されている市販製品を用いることもできる。
　以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　［参考例１］固体担体（米粒）の調製
　米(５０ｇ)を水洗して一晩水浴中にて静置した。室温で適度に乾燥後、１８ｇをフラスコに分注し、木灰(０.１５ｇ)を均一に塗付し、オートクレーブにて高圧蒸気滅菌（１２０℃×２０分間）した。
　［実施例１］種菌の調製
　Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ－Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＹＭＧ）寒天培地上で、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９８として、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託された。）を培養した（約１～２週間）。かかる前培養菌株を１白金耳分取し、ＹＭＧ液体培地４０ｍＬを入れたフラスコに播種して２７℃（２５～３０℃）で振とう培養した。３７時間～４８時間後、菌体のペレットを集め、ペレットを１ｍＬ採取し、これを上記の米（フラスコ）に添加し、混合した。２７℃（２５～３０℃）で７日～１０日間培養し、米粒に植菌した種菌を得た。
［実施例２］種菌を用いたノシヘプタイドの生産
　前記実施例１で調製した種菌の１粒もしくは２粒を用いて３０Ｌ発酵槽で培養しノシヘプタイドを得た。かかるノシヘプタイド産生量を第１表に示す。
　第１表に示されるように、３回行った生産では、ほぼ同程度のノシヘプタイド量を示した。本発明の種菌を用いて培養し、ノシヘプタイドを生産させた場合、生産用培地に一定量の菌体が得られることから、本発明の種菌により再現性に優れたノシヘプタイドの生産が可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（培養方法）
　３０Ｌ発酵槽で大豆粉８７．５ｇ／Ｌ、大豆蛋白１７．５ｇ／Ｌ、グリシン０．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．６２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．６２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物４０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛７水和物４０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水和物２０ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト５水和物１０ｍｇ／Ｌ、消泡剤ＣＡ３３０（日油株式会社製）適量、消泡剤ＫＭ－７０（信越化学工業株式会社製）適量に水を加えて１７．５Ｌとした培地に、グルコース及び硫酸アンモニウムをそれぞれ７０ｇ／Ｌ及び２ｇ／Ｌとなるよう必要に応じて添加し、１４日間～１６日間培養した。必要に応じて種培養を行う。
（ノシヘプタイド産生量の測定）
　培地中のノシヘプタイド濃度は、有機溶媒を用いて得られた抽出液中ノシヘプタイドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により定量することにより得た。製品力価は、培地を乾燥させた後、有機溶媒を用いて得られた抽出液中のノシヘプタイドをバイオアッセイ法により定量することにより得た。前記ノシヘプタイドの生産は３回行った。それぞれにおいて、培地中のノシヘプタイド濃度および最終乾燥品に含まれるノシヘプタイド量（「製品力価」とも表記する）を測定した。
［実施例３］長期間保存した種菌を用いたノシヘプタイドの生産
　長期間冷凍保存した種菌を使用し、前記実施例２と同様に、ノシヘプタイドを生産した。各種菌を用いた場合の製品力価を第２表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　第２表に示されるように、調製後１年～６年と長期間冷凍保存した種菌を用いてノシヘプタイドを生産した場合においても、新たに調製した種菌を用いた場合と比べて、製品力価の大きな低下は見られなかった。
［実施例４］種菌の調製及びノシヘプタイドの生産
　抗生物質生産性菌として、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）Ｕ－４８１－３２－２１を用い、実施例１と同様に、前記放線菌が植菌された米粒（種菌）を得た。
　実施例４の種菌を用いた場合も、実施例２と同様にノシヘプタイドの生産が可能であった。また、実施例３と同様に、長期間冷凍保存した後にも、製品力価に大きな低下は認められなかった。
　ここで、Ｕ－４８１－３２－２１は、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）ＮＲＲＬ２９５４を継代した生産菌である。
　従来は抗生物質の生産にあたって、前培養工程で抗生物質生産性菌を固形培地上で約１～２週間培養し、この一定量を白金耳で採取して液体培地に接種し、種培養液を調製する必要があった。本発明の種菌を使用することで、固形培地での前記前培養工程が不要となり、しかも本発明の種菌には一定の菌量（菌数）の菌体が付着しているため、従来作業者の経験と感に頼って行ってきた白金耳による一定量の菌体の採取および接種操作の代わりに、直接種菌をそのまま培地に添加することで容易に培養を開始できるようになり、操作が非常に簡略化され、操作性に優れる。また種菌は長期間冷凍保存することが可能であり、保存安定性に優れていることから利便性も高い。
　なお、本発明は、抗生物質生産性菌として、ノシヘプタイド生産性菌であるストレプトマイセス属に属する放線菌を植菌し、種菌とすることにより、ノシヘプタイドの生産に好適に利用することができる。
　本出願は、日本国で出願された出願（特願２０１３－２１０８７８；出願日：２０１３年１０月８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (9)

  1. 　抗生物質生産性菌を固体担体に植菌してなる、抗生物質生産性菌の種菌。
  2. 　固体担体が植物由来の固体状物質である、請求項１に記載の種菌。
  3. 　固体担体が、米粒、小麦ふすまおよび大豆種子からなる群より選択される１種または２種以上である、請求項１又は２に記載の種菌。
  4. 　抗生物質生産性菌が、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）に属する放線菌である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の種菌。
  5. ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）に属する放線菌が、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）の１種または２種以上である、請求項４に記載の種菌。
  6. 　ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）の１種または２種以上が、ストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）ＮＲＲＬ２９５４およびストレプトマイセス　アクツオスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｔｕｏｓｕｓ）Ｕ－２２７、およびそれらと同等の性質を持つ菌株からなる群より選択される、請求項５に記載の種菌。
  7. 　請求項１乃至６のいずれか１項に記載の種菌を発育培地に添加し、培養する工程を含む、種培養液の調製方法。
  8. 　請求項１乃至６のいずれか１項に記載の種菌を抗生物質生産用培地に添加し、培養する工程、又は請求項７に記載の方法で調製される種培養液を抗生物質生産用培地に添加し、培養する工程を含む、抗生物質の生産方法。
  9. 　請求項５又は６に記載の種菌をノシヘプタイド生産用培地に添加して、培養する工程を含む、ノシヘプタイドの生産方法。
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