CN113453556A

CN113453556A - 增强微生物生长和存活率的方法

Info

Publication number: CN113453556A
Application number: CN201980091746.9A
Authority: CN
Inventors: 麦克·怀廷; 泰勒·博阿
Original assignee: Danstar Ferment AG
Current assignee: Danstar Ferment AG
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2021-09-28
Also published as: WO2020121219A1; AU2019395919A1; BR112021011024A2; US20210329925A1; CA3121607A1; EP3893648A1

Abstract

本公开涉及一种用于增强或促进或增加微生物群的发酵潜力和/或微生物的生长速率的方法。本公开还提出了一种用于改善微生物产品、悬浮液中的微生物或微生物接种物在储存期间的存活、生存能力和/或稳定性的方法。

Description

增强微生物生长和存活率的方法

相关申请的引用

本申请要求于2018年12月11日提交的美国临时申请序列号62/778,1675的优先权，并且将其以其全文结合在此。

技术领域

本公开涉及用于增强、促进或增加微生物群的发酵潜力和/或微生物的生长速率的方法。本公开还提出了用于改善微生物悬浮液中的微生物以及当作为颗粒或种子施用到固体载体时的微生物的存活、生存能力和/或稳定性的方法。

背景技术

众所周知，微生物具有遍及所有生命方面的用途和益处，并且被实施用于不同的工业应用。应用领域涵盖涉及例如食品工业、医学、农业、化学工业、能源工业、生物质转化领域和其他领域的工业过程。这些过程中的大多数利用微生物产生细胞生物质、蛋白质和/或初级代谢物和/或次级代谢物的能力。

例如，对于在农业中使用有益微生物作为合成肥料和化学杀有害生物剂的替代品越来越感兴趣。例如，越来越关注在农业中将有益微生物用作合成肥料和化学杀虫剂的替代品。更具体地，微生物用于植物生长促进和疾病控制的用途是公认的。分离微生物、筛选所需特征、选择有效菌株和产生接种物是利用该基于微生物的技术的重要步骤。有益微生物可通过使用液体悬浮液引入，液体悬浮液可直接施用于植物种子或颗粒载体上或可施用于幼苗、叶或土壤(在种植种子之前或之后)。

为了生产用于微生物悬浮液(例如接种制剂)中的每种微生物剂的大的、稳定的并且有效的生物质，需要深入研究以鉴定细胞生物质的最佳生产方法(固态或深层发酵)和培养基组分、生产参数和收获后处理(例如温度、氧转移速率、收获时间和方法)(Hynes和Boyetchko，2006)。例如，通常通过使生物体作为无菌液体培养物生长、收获制备在植物生长制剂中使用的大多数细菌，并且稀释细菌悬浮液以得到所需浓度的活细菌/ml(通常≥10⁸cfu/ml)。

众所周知，发酵中使用的营养产物不一定显著增加细胞数目或增加细胞生存能力和活力。此外，在发酵结束时，通常难以在所有的下游制造工艺、包装和储存期间维持足够的微生物群和生存能力。在将微生物施用于种子、土壤、植物或食品后保持其生存能力也与在储存期和/或产品保存期限中保持生存能力一样重要。

因此，需要提供在发酵期间增加微生物细胞生物质和生存能力产量的新方法。还需要在储存期间提高悬浮液中微生物的存活率和稳定性并且置于固体载体诸如颗粒、种子、肥料或植物组织上改善微生物的存活率和稳定性的方法。

发明内容

本公开涉及在发酵过程中增强或促进微生物生长的方法，该方法基于以下发现：可能在发酵微生物的步骤过程中通过使用保护剂(例如生物炭颗粒、活性炭和/或木炭)来获得生物质产量和微生物生存能力的显著增强。本公开进一步涉及制备液体接种物或微生物悬浮液的方法，该方法包括在微生物已经生长(在保护剂存在或不存在的情况下)并且进入稳定期之后将保护剂添加至液体接种物或微生物悬浮液。当将接种物或微生物悬浮液储存或包装时，即容纳在包装中和/或作为颗粒或种子施用于固体载体时，该方法可以提供微生物的增加的生存能力和稳定性和增强的保存期限。

根据第一方面，本公开涉及用于增加微生物群的产量、生长、生长速率、存活率和/或生存能力的方法。该方法包括使包含生物炭颗粒、活性炭和/或木炭的保护剂与微生物群接触以获得混合物。在一个实施方式中，保护剂包含生物炭颗粒或基本上由其组成。在另一个实施方式中，保护剂包含活性炭或基本上由其组成。在又一个实施方式中，以混合物的0.01％至50％、0.05％至20％、0.1％至15％、0.1％至10％或0.1％至5％重量/体积(weight/volume，重容比)的浓度添加保护剂。在另外的实施方式中，混合物进一步包含培养基(medium)。在一个实施方式中，培养基是液体培养基。在培养基是液体培养基的具体实施方式中，混合物可以是液体接种物(inoculant)。在另一个实施方式中，培养基是固体培养基，例如固体底物。在培养基是固体底物的具体实施方式中，混合物可以是固定在固体底物中的微生物接种物。在一个实施方式中，方法进一步包括储存混合物。在一些具体实施方式中，方法进一步包括包装混合物(例如在包装中)。在又一个实施方式中，微生物群在不存在保护剂的情况下生长。在另一个实施方式中，微生物群在存在保护剂的情况下生长。在一个具体的实施方式中，当与不包含保护剂的对照混合物中的相应微生物群比较时，保护剂的存在使微生物种群储存期间的损失减少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％或100％或不超过0.1logCFU、0.2log CFU、0.3log CFU、0.4log CFU、0.5log CFU、0.6log CFU，0.7log CFU、0.8logCFU、0.9log CFU、1log CFU、1.1log CFU、1.2log CFU、1.3log CFU、1.4log CFU、1.5logCFU、1.6log CFU、1.7log CFU、1.8log CFU、1.9log CFU或2log CFU。在一个实施方式中，培养基能够支持微生物群的生长。在一些实施方式中，方法进一步包括发酵微生物群。在一个实施方式中，在发酵步骤之前或开始时将保护剂添加至培养基。可替代地或组合地，可以在发酵步骤的早对数生长期(early-log growth phase)与晚对数生长期(late-log growthphase)之间将保护剂添加到培养基中。可替代地或组合地，可以在发酵步骤的稳定期之前将保护剂添加到培养基中。可替代地或组合地，可以在发酵步骤的稳定期将保护剂添加到培养基中。在一个实施方式中，方法进一步包括在发酵步骤之后，将保护剂添加到微生物群中。在一些实施方式中，方法进一步包括储存包含保护剂的微生物群。在一些实施方式中，当与不存在保护剂的情况下发酵的相应微生物群相比时，发酵期间微生物群的产量增加了10、15、20、25、30、35、40、45、50、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300％。在一些实施方式中，保护剂包含具有小于1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50微米的尺寸的颗粒。在另外的实施方式中，颗粒的尺寸小于350、300、250、200或150微米。在实施方式中，微生物群包含细菌细胞或真菌细胞。在一些实施方式中，细菌细胞或真菌细胞来自以下属：无色杆菌(Achromobacter)、放线菌(Actimomycetes)、土壤杆菌(Agrobacterium)、节杆菌(Arthrobacter)、固氮螺菌(Azospirillum)、固氮菌(Azotobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、色杆菌(Chromobacterium)、蓝细菌(Cyanobacteria)、戴尔福特菌(Delftia)、肠杆菌(Enterobacter)、草螺菌(Herbaspirillum)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、溶杆菌(Lysobacter)、甲基杆菌(Methylobacterium)、松江菌(Mitsuaria)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、巴斯德氏牙菌(Pasteuria)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Rhizobium)、沙雷氏菌(Serratia)、中华根瘤菌(Sinorhizobium)、链球菌(Streptococcus)、链霉菌(Streptomyces)、白僵菌(Beauveria)、绿僵菌(Metarhizium)、棒束孢(Isaria)、青霉菌(Penicillium)、木霉(Trichoderma)、毛壳菌(Chaetomium)、梨形孢(Piriformospora)、伏革菌(Phlebiopsis)或螺旋聚孢霉(Clonostachys)。在其他实施方式中，细菌细胞或真菌细胞来自以下属：固氮螺菌、慢生根瘤菌、戴尔福特菌、草螺菌、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)、根瘤菌、中华根瘤菌、梨形孢或链霉菌。在一些另外的实施方式中，细菌细胞或真菌细胞包括埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、高效固氮慢生根瘤菌(Bradyrhizobium diazoefficiens)、食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brazilense)、赫氏草螺菌(Herbaspirillum huttiense)、灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)、印度梨形孢菌(Piriformospora indica)或苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)。在另外的实施方式中，细菌细胞包括埃氏慢生根瘤菌、食酸戴尔福特菌、大豆慢生根瘤菌、赫氏草螺菌、豌豆根瘤菌或巴西固氮螺菌。

根据第二方面，本公开提供了微生物组合物，该微生物组合物包含(i)微生物群和(ii)保护剂，该保护剂包含生物炭颗粒、活性炭和/或木炭。在一些实施方式中，保护剂包含生物炭颗粒或基本上由其组成。在另外的实施方式中，保护剂包含或基本上由活性炭组成。在一些实施方式中，微生物组合物进一步包含(iii)培养基。在一个实施方式中，培养基是液体培养基。在其中培养基是液体培养基的实施方式中，微生物组合物可以是液体接种物。在另一个实施方式中，培养基是固体培养基，例如固体底物。在其中培养基是固体底物的实施方式中，微生物组合物可以是固定在固体底物中的微生物接种物。在另一个实施方式中，培养基能够支持微生物群的生长。在实施方式中，保护剂以微生物组合物的0.01％至50％、0.05％至20％、0.1％至15％、0.1％至10％或0.1％至5％的重量/体积浓度存在。在另一个实施方式中，保护剂包括具有小于1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50微米的尺寸的颗粒。在又一个实施方式中，颗粒的尺寸小于350、300、250、200或150微米。在另外的实施方式中，微生物群包含细菌细胞或真菌细胞。在一个实施方式中，细菌细胞或真菌细胞来自以下属：无色杆菌、放线菌、土壤杆菌、节杆菌、固氮螺菌、固氮菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、慢生根瘤菌、色杆菌、蓝细菌、戴尔福特菌、肠杆菌、草螺菌、克雷伯氏菌、乳杆菌、乳球菌、溶杆菌、甲基杆菌、松江菌、类芽孢杆菌、巴斯德氏牙菌、假单胞菌、根瘤菌、沙雷氏菌、中华根瘤菌、链球菌、链霉菌、白僵菌、绿僵菌、棒束孢、青霉菌、木霉、毛壳菌、梨形孢、伏革菌或螺旋聚孢霉。在又一个实施方式中，细菌细胞或真菌细胞来自以下属：固氮螺菌属、慢生根瘤菌属、戴尔福特菌属、草螺菌属、中慢生根瘤菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、梨形孢属或链霉菌属。在另外的实施方式中，细菌细胞或真菌细胞包括埃氏慢生根瘤菌、高效固氮慢生根瘤菌、食酸戴尔福特菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌、热带根瘤菌、百脉根中慢生根瘤菌、巴西固氮螺菌、赫氏草螺菌、灰绿链霉菌、印度梨形孢菌或苜蓿中华根瘤菌。在再一个实施方式中，细菌细胞包括埃氏慢生根瘤菌、食酸戴尔福特菌、赫氏草螺菌、豌豆根瘤菌或巴西固氮螺菌。

根据第三方面，本公开提供了用于增加微生物悬浮液中微生物群的产量、生长、生长速率和/或生存能力的方法，该方法包括(a)使微生物群与能够支持微生物群生长的液体培养基接触；和(b)向液体培养基提供生物炭颗粒，并培养微生物群以产生微生物悬浮液，其中与在不存在生物炭的情况下培养的微生物群的产量、生长、生长速率和/或生存能力相比，生物炭颗粒增加微生物悬浮液中的微生物群的产量、生长、生长速率和/或生存能力。在一个实施方式中，按重量/体积计，以液体培养基的0.01％至50％、0.05％至20％、0.1％至25％、约0.1％至约10％或约0.1％至5％的浓度提供生物炭颗粒。在一个实施方式中，在发酵开始时将生物炭颗粒添加到液体培养基中。在另一个具体实施方式中，在早对数生长期与晚对数生长期之间将生物炭颗粒添加到液体培养基中。在另一个具体实施方式中，在稳定期之前将生物炭颗粒添加到液体培养基中。在另一个具体实施方式中，在稳定期将生物炭颗粒添加到液体培养基中。在又一个实施方式中，在步骤(b)之后，方法进一步包括(c)将生物炭颗粒添加到微生物悬浮液中以增强储存过程中微生物群的存活率和/或减少其损失。在一个实施方式中，生物炭颗粒具有小于1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50微米的粒度。例如，生物炭颗粒具有小于350、300、250、200或150微米的粒度。在一个实施方式中，微生物来自以下属：无色杆菌、放线菌、土壤杆菌、节杆菌、固氮螺菌、固氮菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、慢生根瘤菌、色杆菌、蓝细菌、戴尔福特菌、肠杆菌、草螺菌、克雷伯氏菌、乳杆菌、乳球菌、溶杆菌、甲基杆菌、松江菌、类芽孢杆菌、巴斯德氏牙菌、假单胞菌、根瘤菌、沙雷氏菌、中华根瘤菌、链球菌和链霉菌、白僵菌、绿僵菌、青霉菌、木霉、毛壳菌、梨形孢、伏革菌或螺旋聚孢霉。在一个具体实施方式中，微生物来自以下属：固氮螺菌属、慢生根瘤菌属、戴尔福特菌属、草螺菌属、中慢生根瘤菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属或链霉菌属。例如，微生物包括埃氏慢生根瘤菌、高效固氮慢生根瘤菌、食酸戴尔福特菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌、热带根瘤菌、百脉根中慢生根瘤菌、巴西固氮螺菌、赫氏草螺菌、灰绿链霉菌、印度梨形孢菌或苜蓿中华根瘤菌。在一个实施方式中，当与在不存在生物炭的情况下培养的微生物群的产量、生长、生长速率和/或生存能力相比时，生物炭颗粒使微生物群的产量、生长、生长速率和/或生存能力增加至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300％。在另一个具体实施方式中，当与在不存在生物炭的情况下培养的微生物群的产量相比时，微生物群的产量增加至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300％。在一个实施方式中，本公开提供了包含本文描述的微生物组合物的植物种子、颗粒或肥料。

根据第四方面，本公开提供了用于增加液体接种物或微生物悬浮液中微生物群的存活率的方法，该方法包括(a)提供包含生长至基本上稳定期的微生物群的液体接种物或微生物悬浮液；以及(b)向液体接种物或微生物悬浮液中添加生物炭颗粒，以与不包含生物炭颗粒的液体接种物或微生物悬浮液中的微生物群的存活率相比，增强储存期间微生物群的存活率和/或减少储存期间微生物群的损失。在一个实施方式中，按重量/体积计，生物炭颗粒以液体接种物或微生物悬浮液的0.01％至50％、0.05％至20％、0.1％至15％、约0.1％至约10％或约0.1％至5％的浓度添加。在一个实施方式中，该液体接种物或微生物悬浮液的微生物群在不存在生物炭颗粒的情况下生长。在另一个实施方式中，在生物炭颗粒存在的情况下使液体接种物或微生物悬浮液的微生物群生长。在又一个实施方式中，生物炭颗粒具有小于1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50微米的粒度。例如，生物炭颗粒具有小于350、300、250、200或150微米的粒度。在一个实施方式中，微生物来自以下属：无色杆菌、放线菌、土壤杆菌、节杆菌、固氮螺菌、固氮菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、慢生根瘤菌、色杆菌、蓝细菌、戴尔福特菌、肠杆菌、草螺菌、克雷伯氏菌、乳杆菌、乳球菌、溶杆菌、甲基杆菌、松江菌、类芽孢杆菌、巴斯德氏牙菌、假单胞菌、根瘤菌、沙雷氏菌、中华根瘤菌、链球菌和链霉菌、白僵菌、绿僵菌、青霉菌、木霉、毛壳菌或螺旋聚孢霉。在另一个实施方式中，微生物来自以下属：固氮螺菌属、慢生根瘤菌属、戴尔福特菌属、草螺菌属、中慢生根瘤菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属或链霉菌属。例如，微生物包括埃氏慢生根瘤菌、高效固氮慢生根瘤菌、食酸戴尔福特菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌、热带根瘤菌、百脉根中慢生根瘤菌、巴西固氮螺菌、赫氏草螺菌、灰绿链霉菌或苜蓿中华根瘤菌。在一个实施方式中，当与对不包含生物炭颗粒的液体接种物或微生物悬浮液中的微生物群观察到的减少相比时，添加生物炭颗粒使微生物群的损失减少至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％或100％。在又另一个实施方式中，当与对不包含生物炭颗粒的液体接种物或微生物悬浮液中的微生物群观察到的减少相比时，微生物群经历小于0.1log cfu、0.2logcfu、0.3log cfu、0.4log cfu、0.5log cfu、0.6log cfu、0.7log cfu、0.8log cfu、0.9logcfu，1log cfu、1.1log cfu、1.2log cfu、1.3log cfu、1.4log cfu、1.5log cfu、1.6logcfu、1.7log cfu，1.8log 25cfu、1.9log cfu或2log cfu的种群减少。

根据第五方面，本公开涉及生物炭用于获得与不存在生物炭的情况下发酵的微生物培养物的产量相比在液体培养基中发酵的微生物培养物的增加产量的用途，其中将生物炭添加到能够支持微生物生长的液体培养基中。在一个实施方式中，按重量/体积计，以液体培养基的0.01％至50％、0.05％至20％、0.1％至15％、约0.1％至约10％或约0.1％至5％的浓度提供生物炭。在一个实施方式中，在发酵开始将生物炭添加到液体培养基中。在另一个实施方式中，在早对数生长期与晚对数生长期之间将生物炭添加到液体培养基中。在又一个实施方式中，在稳定期之前将生物炭添加到液体培养基中。在再一个实施方式中，在稳定期将生物炭添加到液体培养基中。在一个实施方式中，生物炭具有小于1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50微米的粒度。例如，生物炭具有小于350、300、250、200或150微米的粒度。在一个实施方式中，微生物来自以下属：无色杆菌、放线菌、土壤杆菌、节杆菌、固氮螺菌、固氮菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、慢生根瘤菌、色杆菌、蓝细菌、戴尔福特菌、肠杆菌、草螺菌、克雷伯氏菌、乳杆菌、乳球菌、溶杆菌、甲基杆菌、松江菌、类芽孢杆菌、巴斯德氏牙菌、假单胞菌、根瘤菌、沙雷氏菌、中华根瘤菌、链球菌和链霉菌、白僵菌、绿僵菌、青霉菌、木霉、毛壳菌或螺旋聚孢霉。在另一个实施方式中，微生物来自以下属：固氮螺菌属、慢生根瘤菌属、戴尔福特菌属、草螺菌属、中慢生根瘤菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属或链霉菌属。例如，微生物包括埃氏慢生根瘤菌、高效固氮慢生根瘤菌、食酸戴尔福特菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌、热带根瘤菌、百脉根中慢生根瘤菌、巴西固氮螺菌、赫氏草螺菌、灰绿链霉菌或苜蓿中华根瘤菌。在一个实施方式中，当与在不存在生物炭的情况下培养相同时间段的微生物群相比时，产量增加至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300％。

根据第六方面，本公开涉及生物炭用于与不包含生物炭颗粒的液体接种物或微生物悬浮液中的微生物群的存活率相比增加液体接种物或微生物悬浮液中的微生物群的存活率的用途，其中将生物炭添加到包含生长至基本上稳定期的微生物群的液体接种物或微生物悬浮液中。在一个实施方式中，按重量/体积计，以液体接种物或微生物悬浮液的0.01％至50％、0.05％至20％、0.1％至15％、约0.1％至约10％或约0.1％至5％的浓度添加生物炭。在一个实施方式中，液体接种物或微生物悬浮液的微生物群在不存在生物炭的情况下生长。在另一个实施方式中，在生物炭存在的情况下培养液体接种物或微生物悬浮液的微生物群。在又一个实施方式中，生物炭具有小于1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、35、100或50微米的粒度。例如，生物炭具有小于350、300、250、200或150微米的粒径。在一个实施方式中，微生物来自以下属：无色杆菌、放线菌、土壤杆菌、节杆菌、固氮螺菌、固氮菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、慢生根瘤菌、色杆菌、蓝细菌、戴尔福特菌、肠杆菌、草螺菌、克雷伯氏菌、乳杆菌、乳球菌、溶杆菌、甲基杆菌、松江菌、类芽孢杆菌、巴斯德氏牙菌、假单胞菌、根瘤菌、沙雷氏菌、中华根瘤菌、链球菌和链霉菌、白僵菌、绿僵菌、青霉菌、木霉、毛壳菌或螺旋聚孢霉。在另一个实施方式中，微生物来自以下属：固氮螺菌属、慢生根瘤菌属、戴尔福特菌属、草螺菌属、中慢生根瘤菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属或链霉菌属。例如，微生物包括埃氏慢生根瘤菌、高效固氮慢生根瘤菌、食酸戴尔福特菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌、热带根瘤菌、百脉根中慢生根瘤菌、巴西固氮螺菌、赫氏草螺菌、灰绿链霉菌或苜蓿中华根瘤菌。在一个实施方式中，与不包含生物炭颗粒的液体接种物或微生物悬浮液中的微生物群的存活率相比，微生物群经历小于0.1logCFU、0.2log CFU、0.3log CFU、0.4log CFU、0.5log CFU、0.6log CFU、0.7log CFU、0.8logCFU、0.9log CFU，1log CFU、1.1log CFU、1.2log CFU、1.3log CFU、1.4log 15CFU、1.5logCFU、1.6log CFU、1.7log CFU、1.8log CFU、1.9log CFU或2log CFU的群体减少。

附图说明

因此，已经总体上描述了本发明的本质，现在将参考附图以说明的方式示出其优选实施方式，并且其中：

图1示出了在M1和M2液体培养基以及补充有生物炭的M1和M2液体培养基中培养后埃氏慢生根瘤菌菌株SEMIA 587和SEMIA5019细胞的量。

图2示出了在不同时间段不同的保护剂对豌豆根瘤菌菌株INRAP221和INRAP1NP1J的生存能力的影响：(◆)仅豌豆根瘤菌菌株(阴性对照)；(■)以1：1的细菌：聚合物保护剂比率包含0.6％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂；以及(▲)以1：1的细菌：生物炭比率包含1％的生物炭(粒度70目)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂。

图3示出了在不同时间段不同的保护剂和储存培养基的pH下的储存间隔对豌豆根瘤菌菌株INRA P221和菌株INRAP1NP1J的生存能力的影响：(◆)仅豌豆根瘤菌菌株(阴性对照)；(■)以1：1的细菌：聚合物保护剂比率包含0.6％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂；以及(▲)以1：1的细菌：生物炭比率包含1％的生物炭(粒度70目)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂。

图4示出了在不同时间段不同的保护剂结合标准培养基(F1)对食酸戴尔福特菌菌株Ray 209的生存能力的影响：(◆)以1：3的细菌：保护剂比率包含0.15％羧甲基纤维素钠(CMC)和9％海藻糖的保护剂；(■)以1：3的细菌：聚合物保护剂比率包含0.45％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂，以及(▲)以1：3的细菌：保护剂比率包含0.5％生物炭(粒度70目)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂。

图5示出了在不同时间段不同的保护剂结合补充有生物炭的培养基(F2)对食酸戴尔福特菌菌株Ray 209的生存能力的影响：(◆)以1：3的细菌：保护剂比率包含0.15％羧甲基纤维素钠(CMC)和9％海藻糖的保护剂；(■)以1：3的细菌：聚合物保护剂比率包含0.45％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂，以及(▲)以1：3的细菌：保护剂比率包含0.5％生物炭(粒度70目)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂。

图6示出了在不同时间段不同的保护剂结合补充有磷酸盐缓冲液的培养基(F3)对食酸戴尔福特菌菌株Ray 209的生存能力的影响：(◆)以1：3的细菌：保护剂比率包含0.15％羧甲基纤维素钠(CMC)和9％海藻糖的保护剂；(■)以1：3的细菌：聚合物保护剂比率包含0.45％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂，以及(▲)以1：3的细菌：保护剂比率包含0.5％生物炭(粒度70目)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂。

图7示出了在不同时间段不同的保护剂结合补充有磷酸盐缓冲液和生物炭的培养基(F4)对食酸戴尔福特菌菌株Ray 209的生存能力的影响：(◆)以1：3的细菌：保护剂比率包含0.15％羧甲基纤维素钠(CMC)和9％海藻糖的保护剂；(■)以1：3的细菌：聚合物保护剂比率包含0.45％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂，以及(▲)以1：3的细菌：保护剂比率包含0.5％生物炭(粒度70目)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂。

图8示出了在没有(纯培养物，点虚线)或补充有生物炭(实线)的标准液体培养基中培养后巴西固氮螺菌(AZOS；Lallemand Plant Care)的生存能力计数(CFU/ml)。

图9示出了不同稀释剂在不同储存时间对在标准培养基(ENDORICE；LallemandPlant Care)上生长的赫氏草螺菌菌株悬浮液的生存能力(CFU/ml)的影响：(实线)仅赫氏草螺菌悬浮液(对照)；(短划线)添加1体积的pH 7的0.1％磷酸盐缓冲液；以及(点虚线)添加1体积的1％生物炭(粒度70目)在pH 7的0.1％磷酸盐缓冲液中的悬浮液。

图10示出了不同稀释剂在不同储存时间对在标准培养基中生长的食酸戴尔福特菌菌株Ray 209的悬浮液的生存能力(CFU/ml)的影响：仅悬浮液(对照，点虚线)；添加3体积的pH 7的0.1％磷酸盐缓冲液(短划线)；以及添加3体积的0.75％生物炭(粒度70目)在pH 7的0.1％磷酸盐缓冲液中的悬浮液(实线)。

图11示出了不同的生物炭浓度在不同储存时间对在标准培养基中生长的豌豆根瘤菌菌株INRA P221和INRA P1NP1J的生存能力(表示为初始生存能力的百分比)的影响：仅悬浮液(对照，点虚线)；1g/L的生物炭(实线)；5g/L的生物炭(短划线，小)；以及10g/L的生物炭(短划线，小)。

图12示出了在补充有1g/L(实线)或5g/L(短划线)的生物炭的标准液体培养基或对照液体培养基(纯培养物，点虚线)中培养之后豌豆根瘤菌菌株INRAP221和INRA P1NP1J的生存能力计数(以CFU/ml计)。

图13示出了在补充有5g/L(实线)的活性炭的标准液体培养基或对照液体培养基(纯培养物，点虚线)中培养之后埃氏慢生根瘤菌菌株SEMIA5019的生存能力计数(以CFU/ml计)。

图14示出了在不同储存时间下补充有一定浓度的活性炭的标准培养基中培养之后埃氏慢生根瘤菌菌株SEMIA 587和5019的生存能力的影响(以CFU/ml计)：仅悬浮液(纯培养物，点虚线)；活性炭0.5g/L(短划线)或活性炭5g/L(实线)。

具体实施方式

本公开涉及在发酵过程中添加保护剂(生物炭颗粒或生物炭、活性炭和/或木炭)或将其添加到微生物培养物(或接种物组合物)中以(1)在发酵过程中刺激或促进微生物的生长，(2)在随后的步骤诸如包装和储存中储存微生物时增强或增加保存期限或存活率和稳定性，和/或(3)在随后的步骤中提高微生物的稳定性和存活，例如，在种子上、肥料上和/或犁沟内施用。

如在此使用的“刺激、增加、增强或促进产量或生长”或“刺激、增加、增强或促进生长速率”是指在保护剂存在的情况下生长的微生物的生长或微生物群的生长比在不存在保护剂的情况下获得的生长增强。在本公开的上下文中，微生物或微生物群的生长速率比正常预期来自通常用于在不存在保护剂的情况下生长的该类型微生物的培养基的生长增强。在一个具体实施例中，相对于在不存在保护剂的情况下培养或发酵细胞时获得的相应微生物培养物的活性，例如生长、群体、生物质产量、繁殖、增殖、存活率、代谢、活力、稳健性、作用和/或功能，保护剂增加微生物的活性，诸如使得微生物的生长、群体、生物质产量、繁殖、增殖、存活率、代谢、活力、稳健性、作用和/或功能增加或增强至少约10％、20％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％或大于300％。在另一个实施例中，相对于在不存在保护剂的情况下培养或发酵时获得的相应微生物的发酵效率或培养效率，保护剂使得微生物的发酵效率或培养效率增加或增强如至少约10％、20％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、25％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％或大于300％。可以使用本领域已知的任何方法测量这种增加。在本上下文中，术语“产量”是指在给定体积的发酵中产生的活微生物细胞或微生物生物质的量。

如在此使用的，术语“增强或改善生存能力”是指与未接触或暴露于保护剂(例如在不存在保护剂的情况下)的微生物的存活可能性相比，增强或增加在发酵和/或储存期间已经接触或暴露于保护剂的微生物的存活可能性。

术语细胞的“生存能力”表示它们存活的状态。该状态可以通过存活、生长和增殖细胞来表达，并且用于许多可通过阳性可培养性验证的问题。如本领域已知的，可以通过许多不同的方式来测量生存能力。

如在此所使用的术语“稳定性”涉及在某个时间段内或在加工(加工包括将微生物加工成微生物产品组合物)之后(如挤出、冻干、冷冻、干燥、储存和/或当施用至种子时、颗粒上或犁沟内)维持生存能力的能力。

如在此所使用的术语“增加或增强存活率”是指在确定的储存期期间在确定的温度下将活微生物的浓度保持为尽可能接近恰好在制造液体悬浮液或微生物悬浮液或将保护剂添加至培养基(固体或液体)之后的浓度，超过在不存在保护剂的情况下将获得的存活率。

如在此所使用的术语“增加稳定性”尤其是指微生物群在储存期间或施用到固体载体、颗粒、种子、幼苗、叶或土壤上之后保持足够的生存能力和存活率。在一个实施方式中，与未与保护剂接触的相应的微生物群中观察到的减少率相比(例如在不存在保护剂的对照混合物中)，添加保护剂使微生物损失减少至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％或100％。可替代地，在保护剂存在下，与未与保护剂接触的相应的微生物群中观察到的减少率相比(例如在不存在保护剂的对照混合物中)，微生物经历的群体减少小于0.1log CFU、0.2log CFU、0.3log CFU、0.4log CFU、0.5log CFU、0.6log CFU、0.7log CFU、0.8log CFU、0.9log CFU、1log CFU、1.1log CFU、1.2log CFU、1.3log CFU、1.4log CFU、1.5log CFU、1.6log CFU、1.7log CFU、1.8log CFU、1.9log CFU或2log CFU。

在本公开的上下文中，微生物群可以包含细菌、酵母或真菌。在一个具体实施方式中，微生物群可以包含细菌或基本上由其组成。在一个具体实施方式中，微生物群可以包含酵母或真菌或基本上由其组成。在一些实施方式中，微生物可以来自以下属：无色杆菌、放线菌、土壤杆菌、节杆菌、固氮螺菌、固氮菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、慢生根瘤菌、色杆菌、蓝细菌、戴尔福特菌、肠杆菌、草螺菌、克雷伯氏菌、乳杆菌、乳球菌、溶杆菌、甲基杆菌、中慢生根瘤菌、松江菌、类芽孢杆菌、巴斯德氏牙菌、假单胞菌、根瘤菌、沙雷氏菌、中华根瘤菌、链球菌或链霉菌。在其他实施方式中，微生物可以是白僵菌、绿僵菌、棒束孢、青霉菌、木霉、毛壳菌、螺旋聚孢霉、梨形孢、伏革菌或菌根真菌。在一个实施方式中，微生物可以来自固氮螺菌、慢生根瘤菌、戴尔福特菌、草螺菌、中慢生根瘤菌、中华根瘤菌属或根瘤菌。在一些实施方式中，微生物是豌豆根瘤菌、热带根瘤菌、百脉根中慢生根瘤菌、大豆慢生根瘤菌、埃氏慢生根瘤菌、高效固氮慢生根瘤菌、食酸戴尔福特菌、巴西固氮螺菌、赫氏草螺菌、灰绿链霉菌、印度梨形孢菌或苜蓿根瘤菌。可以组合使用不同属、种或菌株的多种微生物。

本公开的保护剂是富含碳的混合物(例如包含大于50％的碳)，该混合物由热处理生物质或另一种含碳混合物获得。例如，保护剂可以指由生物质或另一种含碳混合物的热解、焙烧、气化或任何其他热和/或化学转化获得的固体材料。保护剂可以包含生物炭颗粒或基本上由其组成。保护剂可以包含活性炭或基本上由其组成。保护剂可以包含木炭或基本上由其组成。如在本公开的上下文中使用的，当与术语“保护剂”组合使用时，术语“基本上由……组成”指后者可以包含另外的组分，但是那些另外的组分不是含碳材料。

如本领域中已知的，“生物炭”是植物源材料(即源自纤维素生物质或植物)的碳化形式，该碳化形式专门生产用于非燃料应用。可以衍生生物炭的生物质材料的一些具体实例包括例如玉米秸秆(例如玉米植物的叶、壳、茎或穗)、草(例如柳枝稷、芒属、麦秸、稻秸、大麦秸、苜蓿、竹子、大麻)、甘蔗、壳或壳材料(例如花生水稻和核桃壳)、木屑、锯屑、椰子壳、纸或木浆、食物废物、农业废物和森林废物。在一个实施方式中，可以由软木(例如松木)或硬木(例如和橡树)获得生物质(或起始材料)。生物炭通常由生物质的受控热解产生，其中基体材料的粒度范围为几毫米至几厘米，尽管其也可使用生物质的水热、高压和高温水加工来制造。生物炭是多孔的，主要由碳(约30％至100％或约60％至100％)组成，但是也可以包含氮、钾和钙。生物炭的组成取决于所用的原料和热解的持续时间和温度。分子结构和元素组成使得生物炭高度抗微生物分解。初级生物炭应用被称为能量产生副产物资源；用于碳封存；用作土壤改良剂；以及用作用于水处理的含碳底物。

在一个实施方式中，可以对本公开的保护剂进行处理。当保护剂被“处理”或经历“处理”时，它应当是指已经通过本领域中任何熟知的方法经历了另外的物理、生物和/或化学加工的粗制的、热解的富含碳的混合物。

本公开的保护剂可以具有约5至1500微米、或约10至约1000微米、或约10至500、10至200、10至100、100至500、200至500、50至500或50至300微米的平均粒径，例如至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000微米。在一个实施方式中，平均粒度是在10至300微米之间。本领域技术人员将根据具体情况中的具体需要选择合适的粒度。

在一个实施方式中，本公开的保护剂具有不大于按重量计约30％、按重量计约25％、按重量计约20％、按重量计约15％或按重量计约10％的挥发含量物质。在一个实施方式中，本公开的保护剂具有按重量计不大于20％的挥发含量物质。

在一个实施方式中，本公开的保护剂具有小于按重量计约10％、按重量计小于约9％、按重量计小于约8％、按重量计小于约7％，按重量计小于约6％、按重量计小于约5％、按重量计小于约4％、按重量计小于约3％、按重量计小于约2％或按重量计小于约1％的灰分含量。在一个实施方式中，本公开的保护剂具有按重量计小于约8％的灰分含量。

可以将保护剂添加到培养基中，培养基可以为液体或固体底物。在一个具体的实施方式中，可以将保护剂添加到液体培养基(例如液体接种物或液体发酵培养基)中。在一些实施方式中，可以将保护剂(直接)添加到能够支持微生物群生长的培养基中，例如发酵混合物中(例如直接添加到液体营养培养基或固体底物)或发酵培养物中。在其他实施方式中，可以将保护剂(直接)添加到液体接种物中，例如添加到旨在接触待生长的微生物的种子或块状起始物的液体中。在保护剂补充能够支持微生物群的生长的培养基的实施方式中，在发酵/培养过程期间的任何阶段，例如在发酵之前、在发酵开始时、对数早期、对数中期、对数晚期或稳定期，可以包括向发酵培养基(例如培养基或液体营养培养基)供给用于促进产量、生长或增加微生物的生长速率的保护剂。在一个实施方式中，可以在发酵开始时、在对数早期和对数晚期之间或在稳定期将保护剂添加到发酵/培养基中。如此处使用的术语“发酵”是指在好氧或厌氧条件下增殖或培养微生物的过程。引入微生物的发酵培养基可以是固体或液体。在一些实施方式中，发酵培养基可以是本领域技术人员已知的与所选择的微生物相容的任何液体营养培养基。可替代地，发酵培养基可以是本领域技术人员已知的与所选择的微生物相容的任何固体培养基或固体底物。“稳定期”被定义为发生在对数期之后的阶段，并且被定义为其中细菌生长已经基本上停止的阶段。如在此所使用，含有温育至基本上稳定期的微生物的物质被称为“液体接种物”、“接种物”、“固定在固体底物上的微生物接种物”或“微生物悬浮液”。

通常，可以将微生物温育、发酵或培养约1天至约10天之间的时间。更具体地，温育/发酵/培养期可以在约1天至约5天之间。在温育/发酵/培养期间，培养基和微生物群可以被充气并且维持在适合于生长的温度和pH下。温育/发酵/培养的精确条件取决于所用微生物的类型和液体营养培养基或固体底物的类型，并且是本领域技术人员熟知的。例如，可以将埃氏慢生根瘤菌在摇动培养箱中的营养培养基上在从约20℃至约28℃的温度下温育约4-5天。优选地，将埃氏慢生根瘤菌在约28℃下温育约3-4天以允许细菌生长。稳定期的微生物存活计数根据微生物而变化。例如，液体接种物中的细胞计数可以是约1×10⁸CFU/ml至约1x10¹¹ CFU/ml。更具体地，液体接种物可以包含约1x10¹⁰ CFU/ml。作为示例性的量提供这些量，并且因此其他量预期在本公开的范围内。如所提及的，可以在发酵过程的任何步骤直接添加用于促进或增加微生物的生长、生长速率和/或存活率的试剂。

在另一个实施例中，在本公开的上下文中可以考虑固体底物或固体生长培养基。可以在固体生长培养基上培养和接种的真菌的实例包括以下属的物种：梨形孢、伏革菌、螺旋聚孢霉、丛赤壳(Nectria)、软韧革菌(Chondrostereum)、酵母(Pseudozyma)、盾壳霉(Coniothyrium)、木霉、绿僵菌、轮枝菌(Verticillium)、青霉菌、曲霉菌(Aspergillus)、棒束孢或白僵菌。在一个实施方式中，真菌是印度梨形孢菌、大伏革菌(Phlebiopsisgigantea)、Clonostachys sp.、Nectria pityrodes、紫韧革菌(Chondrostereumpurpureum)、Pseudozyma flocculosa、盾壳霉(Coniothyrium minitans)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum,sp.)、绿僵菌(Metarhizium sp.)，轮枝菌(Verticillium sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、曲霉菌(Aspergillus sp)或球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。如本领域已知的，细菌也可以在固体生长培养基上生长，并且可以是例如链霉菌、芽孢杆菌或假单胞菌的物种。本领域已知可以使用包含各种有机或无机载体的固体生长培养基。例如，可以使用无机载体诸如蛭石、珍珠岩、无定形二氧化硅或颗粒状粘土。通常使用这些类型的材料，因为它们形成具有高表面积的松散的、空气状的颗粒结构。可以使用的有机载体的实例是谷物、麸皮、玉米芯、锯屑、泥炭或木片。此外，固体生长培养基可以含有微生物的补充营养物。通常，这些包括碳源诸如碳水化合物(糖、淀粉)、蛋白质或脂肪、有机形式的氮源(蛋白质、氨基酸)或无机氮盐(铵和硝酸盐、脲)、痕量元素或其他生长因子(维生素、pH调节剂)。固体生长培养基可以含有用于结构组成的助剂，诸如吸附剂，例如聚丙烯酰胺。在用液体或固体形式的接种物接种之后，在约20℃至约35℃的温度下将接种的固体生长培养基温育约4至15天。温育/发酵/培养的精确条件取决于微生物的类型和所使用的固体底物的类型，并且是本领域技术人员熟知的。如所提及的，可以在该过程的任何步骤直接添加用于促进或增加微生物的生长、生长速率和/或存活率的试剂。

在另一个实施方式中，在达到稳定期后，可以将保护剂引入培养基、液体接种物或微生物悬浮液中，以在最终包装之前和之后在微生物储存期间维持和/或增加微生物的生存能力和稳定性。可以将保护剂添加至培养基、液体接种物或微生物悬浮液，同时其仍在发酵或温育期间使用的容器(例如发酵反应器或摇动培养箱)中。可替代地，可以在包装之前或直接在包装期间将保护剂添加至单独的培养基、液体接种物或微生物悬浮液中。包装后，可以储存培养基、接种物组合物或微生物悬浮液。储存条件可以包括冷藏至环境温度和低至中等或高相对湿度。优选地，储存条件包括低于约35℃的温度和低于约80％的相对湿度。

也可以将培养基、液体接种物或微生物悬浮液连同保护剂一起施用于多种种子。例如，可以将液体接种物或微生物悬浮液连同生物炭一起施用于豆科植物诸如大豆、苜蓿(alfalfa，lucerne)、花生、豌豆、小扁豆、豆、三叶草等的种子。也可以将培养基、液体接种物或微生物悬浮液连同保护剂一起施用于非豆科作物，包括但不限于大田作物诸如玉米、谷类(诸如小麦、大麦、黑麦、高粱、粟或水稻)、棉花，并且还可适当处理油菜籽、以及水果和蔬菜作物诸如马铃薯、西红柿、葫芦、洋葱、甜菜、莴苣、萝卜等。可以根据本领域已知的任何合适的方法单独或与任何已知的农业上可接受的、非干扰性载体组合将培养基、液体接种物或微生物悬浮液连同保护剂一起施用或涂覆到植物的种子表面上。在另一个实施方式中，可以将“液体接种物”、“接种物”、“固定在固体底物上的微生物接种物”或“微生物悬浮液”涂覆在肥料或任何农业上可接受的添加剂上。

按重量/体积计，可以以约营养培养基(在发酵的任何阶段)的约0.01％至约50％的浓度将保护剂添加到营养培养基(在发酵的任何阶段)、固体底物、液体接种物或微生物悬浮液，添加到液体接种物或微生物悬浮液。例如，可以使用按重量/体积计约0.05％至20％、约0.1％至15％、约0.5％至10％或约1％至5％的保护剂。在另一种实施方式中，按重量/体积计，可以以营养培养基的至少约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、25％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％(在发酵的任何阶段)的浓度将保护剂添加到液体接种物或微生物悬浮液中。在一个实施方式中，按重量/体积计，可以将保护剂以约0.01％至约10％的浓度添加到营养培养基中(在发酵的任何阶段)、添加到固体底物、添加到液体接种物或添加到微生物悬浮液中。

也可以将任何合适的农业上可接受的载体与包含保护剂的培养基、液体接种物或微生物悬浮液结合使用。例如，也可以将固体载体、半固体载体、水基液体载体、非水基液体载体、悬浮液、乳液或可乳化浓缩物与包含保护剂的培养基、液体接种物或微生物悬浮液结合。农业上可接受的载体可以包括例如佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂、稳定剂和/或聚合物。还可以将其他添加剂与本公开结合使用。此类添加剂包括但不限于UV保护剂、着色剂、增白剂、颜料、染料、增量剂、分散剂、赋形剂、防冻剂、除草安全剂、种子安全剂、种子调理剂、微量营养素、肥料、表面活性剂、螯合剂、增塑剂、聚合物、乳化剂、流动剂、聚结剂、消泡剂、保湿剂、增稠剂和蜡。此类添加剂是可商购的并且在本领域中是已知的。

可替代地，在另一个实施方式中，生理学上可接受的载体可以与包含保护剂的培养基、液体接种物或微生物悬浮液结合使用。生理学上可接受的载体可以是本领域熟知的食品或药物载体。

根据专利法中的标准实践，权利要求中的词语“包含”可以被“基本上由……组成”或被“由……组成”替换。

通过参考以下实施方式将更容易理解本发明，所述实施方式用于说明本发明而不是限制其范围。

实施例1-生物炭对埃氏慢生根瘤菌的生长的影响

该研究旨在确定发酵期间生物炭对细菌产量的影响。本实验使用埃氏慢生根瘤菌菌株SEMIA 587和SEMIA 5019(FEPAGRO-

Estadual de Pesquisa Agropecuária,Rua

Dias,570,Bairro Menino Deus,Porto Alegre/RS,Brazil)进行。在具有以下组成的四种不同培养基中分别培养埃氏慢生根瘤菌的菌株：

表1.发酵培养基组成(g/L)

为了制备培养物，将100ml的每种培养基用3ml的每种菌株的甘油储备培养物接种并且在28℃下在180rpm的搅拌速度下温育96小时。在生长48h、72h和96小时后，从没有生物炭的培养基中取出等分试样以测量600nm下的光密度、活细菌的数目和最终pH。对于包含生物炭的培养基，将每个样品的每个时间点的等分试样用于制备一组稀释管10^-1至10^-8。然后将一百μl的最高2稀释液涂布在适当的培养基上，并在计数前于28℃温育2-5天。

如图1中所示，这些结果证明当在生物炭存在的情况下培养埃氏慢生根瘤菌菌株SEMIA587和SEMIA 5019时，实现更大的生物质和细胞稳定性。更具体地，观察到与在不存在生物炭颗粒的情况下生长的相同菌株的生长速率相比，生物炭的存在使得埃氏慢生根瘤菌菌株SEMIA 587和SEMIA 5019的生长速率分别增加了至少237％和248％。

实施例2-生物炭对豌豆根瘤菌的稳定性行为和保存期限的影响

该实验的目的是研究在室温下储存期间生物炭对豌豆根瘤菌的细胞稳定性行为和存活率的影响。使用商业的豌豆根瘤菌菌株INRAP221和菌株INRA P1NP1J(InstitutNational de la Recherche Agronomique，France)进行本实验。在具有以下组成的培养基中培养豌豆根瘤菌菌株INRA P221和菌株INRA P1NP1J：

表2.发酵培养基组成

组分	g/L
		甘露醇	10
酵母提取物	1
		MgSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O	0.2
NaCl	0.1
		K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	0.87
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.31

为了制备预培养物，将100ml的培养基用3ml的甘油储备培养物接种，并且在28℃下在180rpm的搅拌速度下温育24小时。

在2L发酵罐中进行菌株的共发酵，在28℃下通气，使用3％(w/w)的上述培养物作为接种物。搅拌是180rpm。通过控制加入2N H₂SO₄或IN NaOH将pH保持在7.0。通过获得的细菌生物质来指定发酵的产量，该细菌生物质是在600nm下光密度测量的。发酵结果代表四个平行样品的平均值。

为了改善菌株在储存期间的存活，在包装前加入保护剂。在储存开始时在添加保护剂之前确定细菌计数，其为约3.70×10⁹CFU/ml。

选择下列处理用于本研究：(a)仅豌豆根瘤菌菌株(阴性对照)；(b)以1：1(体积：体积)的细菌：聚合物保护剂的比率包含0.6％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂；和(c)以1：1(体积：体积)的细菌：生物炭的比率包含1％生物炭(粒度210微米＝70目；起始材料：软木/松木；1％灰分(基于干重)；19.1％挥发性物质(VM))和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂。

对于每次制备(即每次处理)，将豌豆根瘤菌的培养物以上述比率添加到保护剂(即包含聚合物(PVP)的保护剂和包含生物炭的保护剂)中。将所得产物在黑暗中在室温(即22℃)下储存131天。在第0、35、60、91和131天确定活细胞计数和pH水平。在每个具体的时间点，将每个样品的一个等分试样用于制备一组稀释管10^-1至10^-8。然后将一百μl的最高2稀释液涂布在适当的培养基上，并在计数前于28℃温育2-5天。

豌豆根瘤菌菌株在与保护剂组合的室温下储存之后的生存能力示于图2中。结果示出在储存期间生物炭对豌豆根瘤菌的存活的特别显著的影响。实际上，对于长期保存，结果证明包含生物炭的保护剂在维持微生物生存能力方面是最有效的。储存一百三十一天后，在补充有生物炭的储存培养基中，豌豆根瘤菌的生存能力计数比对照产品中的高8.7倍。该研究的结果还表明，生物炭比包含聚合物的保护剂更有效地保护豌豆根瘤菌菌株。已知这种包含PVP的保护剂允许豌豆根瘤菌菌株的保存期限增加。

如图3中所示，pH值根据储存培养基以不同的曲线演变。可以注意到，当细菌细胞是在生物炭存在的情况下时，pH变化不大并且在约7.0的值附近保持稳定。相比之下，在细菌细胞的纯培养物的情况下，pH显著更低。

实施例3-生物炭对食酸戴尔福特菌的稳定性行为和保存期限的影响

该研究评估了生物炭对在发酵和室温下储存期间食酸戴尔福特菌的生长和存活率的影响。本实验使用食酸戴尔福特菌菌株Ray 209(以编号PTA-4249保藏在ATCC)进行。为了制备预培养物，将100ml的培养基TSB用2ml的甘油储备培养物接种并且在28℃下在180rpm的搅拌速度下温育24小时。在具有以下组成的四种不同培养基中培养食酸戴尔福特菌菌株Ray 209：

表3.发酵培养基组成(g/L)

在2L发酵罐中使用培养基F1、F2、F3和F4进行四次不同的发酵，在28℃下曝气，使用2％(w/w)的上述培养物作为接种物。搅拌是180rpm。仅对于培养基F1和F3，通过控制添加2N H₂SO₄或1N NaOH将pH维持在7.0。通过在600nm下的光密度测量的获得的生物质来指定发酵的产量。

为了改善菌株在储存期间的存活，在包装前加入保护剂。在储存开始时在添加保护剂之前确定细菌计数。选择以下处理/储存培养基用于这项研究：(a)以1：3(体积：体积)细菌：保护剂比率包含0.15％羧甲基纤维素钠(CMC)和9％海藻糖的保护剂；(b)以1：3(体积：体积)的细菌：聚合物保护剂比率包含0.45％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂，以及(c)以1：3(体积：体积)的细菌：保护剂比率包含0.5％生物炭(粒度210μm＝70目))和0.1％磷酸盐缓冲液的保护剂。

对于每次制备(即每次处理)，将食酸戴尔福特菌的0.87L培养肉汤添加到1.73L的每种储存培养基(比率1：3)中。将所得产物在黑暗中在室温(即21℃)下储存124天。在第0、35、75和124天确定活细胞计数和pH水平。在每个具体的时间点，将每个样品的一个等分试样用于制备一组稀释管10^-1至10^-8。然后将一百μl的最高2稀释液涂布在适当的培养基上，并在计数前于28℃温育2-5天。

如表4所示，观察到生物炭的存在使生长24小时后的食酸戴尔福特菌菌株增加。

表4.在存在或不存在生物炭的情况下培养后，将生长表示为CFU/ml的食酸戴尔福特菌的生存能力计数。

如图4至7所示，此研究的结果揭示食酸戴尔福特菌的存活率随着生物炭的存在而增加。即使在发酵培养基中不存在生物炭的情况下培养细菌，也观察到这种增加的生存能力(图4和7)。

实施例4-生物炭对巴西固氮螺菌的生长的影响

本研究旨在确定在发酵过程中生物炭对细菌产量的影响。本实验使用巴西固氮螺菌的商业菌株(

Lallemand Plant Care)进行。将巴西固氮螺菌的菌株培养在具有以下组成的两种不同培养基中：

表5.巴西固氮螺菌的发酵培养基组成(g/L)

在加气的250ml烧瓶中，在28℃下，在不存在或存在生物炭的情况下，使巴西固氮螺菌菌株在培养基中生长。生长24小时后，从培养基中取出等分试样以测量600nm下的光密度和活细菌数目。将每个样品的等分试样用于如实施例1中所述的计数。如图8中所示，当在生物炭存在的情况下培养巴西固氮螺菌菌株时，实现了更多的生物质。

实施例5-生物炭对草螺菌属的稳定性和保存期限的影响

这项研究评估了生物炭对发酵和室温下储存期间草螺菌属的细胞稳定性和存活率的影响。本实验使用赫氏草螺菌的商业菌株(Endo-Rice，Lallemand Plant Care)进行。在具有以下组成的培养基中培养赫氏草螺菌的菌株：

表6.用于草螺菌属(Herbaspirillum spp.)的发酵培养基组成(g/L)。

组分	赫氏草螺菌
		磷酸盐缓冲液	1
酵母提取物	5
		甘油	8
痕量元素	1ml

在28℃下使用3％(w/w)的预培养物作为接种物(浓度2.05×10⁹CFU/ml)伴随通气使草螺菌属在2L发酵罐中的培养基中生长。通过控制添加2N H₂SO₄或1N NaOH将pH维持在7.0。通过在600nm下的光密度测量的获得的生物质来指定发酵产量。

为了改善草螺菌属的商业菌株在储存期间的存活，在包装前添加包含生物炭的保护剂。在储存开始时在添加保护剂之前确定细菌计数(8.1×10⁸CFU/ml)。将以下处理选择用于这项研究：(a)仅菌株(阴性对照)；(b)以1：1(体积：体积)的细菌：磷酸盐缓冲液的比率的0.1％磷酸盐缓冲液(pH 7)；以及(c)以1：3(体积：体积)的细菌：生物炭悬浮液的比率包含1％生物炭(起始材料：松木；7％VM；4.5％灰分；D50：30.3μm)在0.1％磷酸盐缓冲液(pH7)的保护剂。

将所得产物在室温(即21℃)下储存在黑暗中。在第0、11和45天确定活细胞计数和pH水平。在每个具体时间点，将每个样品的一个等分试样用于如实施例1所述的计数。

如图9中所示，此研究的结果揭示随着生物炭的存在，草螺菌属的存活率显著增加。

实施例6-生物炭对食酸戴尔福特菌的稳定性和保存期限的影响

本实验的目的是研究生物炭对在储存期间在室温下食酸戴尔福特菌菌株的细胞稳定性行为和存活率的影响。本实验使用食酸戴尔福特菌菌株RAY209(以编号PTA-4249保藏在ATCC)进行。使食酸戴尔福特菌在具有以下组成的培养基中生长：

表7.用于食酸戴尔福特菌的发酵培养基组成(g/L)

组分	培养基
		酵母提取物	3
胰蛋白胨	6
		甘油	15
痕量元素	1ml

在28℃下伴随通气使用3％(w/w)的预培养物作为接种物(浓度2.0×10⁹CFU/ml)，使食酸戴尔福特菌在2L发酵罐中生长。通过控制添加2NH₂SO₄或1N NaOH将pH维持在6.8。通过在600nm光密度测量的获得的生物质来指定发酵产量。为了改善在储存期间食酸戴尔福特菌的生存能力和稳定性，在包装之前添加保护剂。在储存开始时在添加保护剂之前确定细菌计数。

选择下列处理用于本研究：(a)仅纯培养物；(b)以1：3(体积：体积)的细菌：磷酸盐缓冲液的比率的包含0.1％磷酸盐缓冲液(pH7)的保护剂；以及(c)以1：3(体积：体积)的细菌：生物炭的比率的包含0.1％磷酸盐缓冲液中的0.75％生物炭(起始材料：松木；7％VM；4.5％灰分；D50：30.3μm))的保护剂。在储存开始时在添加保护剂之前确定的细菌计数分别为5.9×10⁸CFU/ml、7.3×10⁸CFU/ml和5.8×10⁸CFU/ml。将所得产物储存在室温下(即21℃)在黑暗中。在第1、48、93、135和185天确定活细胞计数。在每个具体时间点，将每个样品的一个等分试样用于如实施例1所述的计数。

图10中示出了在室温下与生物炭组合储存之后食酸戴尔福特菌的生存能力。结果示出生物炭在储存期间对食酸戴尔福特菌的存活的显著影响。实际上，对于长期储存，结果证明包含生物炭的保护剂在维持微生物生存能力方面是最有效的。

实施例7-不同浓度的生物炭对豌豆根瘤菌的稳定性和保存期限的影响

这个实验的目的是研究不同浓度的生物炭对在室温下储存期间的豌豆根瘤菌菌株INRA P221和菌株INRA P1NP1J的细胞稳定性行为和存活率的影响。如实施例2所述进行菌株的发酵。为了测试菌株在储存期间的存活，在包装前添加不同浓度的生物炭。研究中包括的生物炭具有以下特征：起始材料：松木；4％VM(挥发性物质)；4％灰分；D50：11.1μm。以下处理包括在该研究中：(a)仅豌豆根瘤菌菌株(对照)；(b)生物炭1g/L；(c)生物炭5g/L；以及(d)生物炭10g/L。在储存开始时在添加保护剂之前确定的细菌计数为3.6×10⁹CFU/ml(处理(a))和1.4×10⁹CFU/ml(处理(b)至(d))。将所得产物在黑暗中于室温(即21℃)下储存133天。在第0、20、95和133天确定活细胞计数。在每个具体时间点，将每个样品的一个等分试样用于如实施例1所述的计数。

图11中示出了在室温下与不同浓度的生物炭组合储存之后的豌豆根瘤菌的生存能力。结果示出当在储存过程中包含生物炭时，豌豆根瘤菌的百分比回收率、生存能力或稳定性更大。

实施例8-生物炭对豌豆根瘤菌的生长的作用

该研究旨在确定发酵期间生物炭对细菌产量的影响。本实验使用豌豆根瘤菌菌株INRAP221和菌株INRA P1NP1J进行。在具有以下组成的三种不同培养基中分别培养菌株：

表8.发酵培养基组成(g/L)

为了制备培养物，将100ml每种培养基用3ml每种菌株的甘油储备培养物接种，并在28℃下通气温育96小时。48h、72h和96小时后，从具有和不具有生物炭的培养基中取出等分试样以测量600nm下的光密度和如实施例1中所述的活细菌数目。

如图12所示，这些结果证明当在生物炭存在的情况下培养豌豆根瘤菌时实现了更多的生物质。

实施例9-生物炭对埃氏慢生根瘤菌的生长的影响

该研究旨在确定发酵期间活性炭对细菌产量的影响。本实验使用埃氏慢生根瘤菌菌株SEMIA587和SEMIA5019进行。如实施例1中所述培养埃氏慢生根瘤菌菌株(不存在生物炭)。以5g/L的浓度包含活性炭(Sigma：Cat#161551CAS：7440-44-0；100目)。如图13所示，结果证明当在活性炭存在的情况下培养埃氏慢生根瘤菌时实现了更大的生存能力。

实施例10-活性炭的不同浓度对埃氏慢生根瘤菌的稳定性和保存期限的影响

本研究旨在确定活性炭在储存期间对细菌稳定性的影响。本实验使用埃氏慢生根瘤菌菌株SEMIA587和SEMIA5019进行。在具有以下组成的三种不同培养基中分别培养菌株：

表9.发酵培养基组成(g/L)

发酵之后，在包装之前，将包含或不包含活性炭的微生物悬浮液与0.1％磷酸盐缓冲液(pH 7)混合。在储存开始时在添加保护剂之前确定的细菌计数是8.5×10⁹CFU/ml(T1和T3)；和9.8×10⁹CFU/ml(T2)。将所得产物在室温下(即21℃)储存在黑暗中。在第0、8、44、93和226天确定活细胞计数。在每个具体时间点，将每个样品的一个等分试样用于如实施例1所述的计数。

图14示出活性炭在储存期间对埃氏慢生根瘤菌的存活的显著影响。实际上，对于长期储存，结果证明包含活性炭的保护剂在维持微生物生存能力方面是有效的。

实施例11-生物炭对梨形孢属的生长的影响

根据以下组成制备适合于印度梨形孢生长的固体培养基。

表10：用于固态发酵的培养基组成

将每个培养基的组分在玻璃烧杯中混合，并且在高压釜中在121℃下灭菌30分钟。高压灭菌后，使反应器冷却。将梨形孢属菌种的接种物在摇瓶中在麦芽提取物溶液中在22-20℃下以170rpm培养4天。用3ml接种物接种两种固体生长培养基，并用无菌勺无菌混合。将接种的培养基在30℃下温育7天。

真菌在整个培养基中生长并且孢子形成后，将定殖的生长培养基置于薄页纸上，在室温下干燥。将干燥培养基的活孢子计数量化为CFU/g。重复五次，并且将存在生物炭的结果与不存在生物炭的对照进行比较。

表11.在存在或不存在生物炭的情况下通过固态发酵培养后，将生长表示为CFU/g印度梨形孢菌的生存能力计数

培养基A(不存在生物炭)	培养基B(存在生物炭)
		1.42×10<sup>6</sup>	4.37×10<sup>6</sup>

如表11所示，与不存在生物炭的相同固体培养基相比，当在包含生物炭的固体培养基中培养印度梨形孢菌时，活孢子计数增加3倍。

虽然已结合其具体实施方式描述了本发明，但将理解，权利要求书的范围不应受实施例中所陈述的优选实施方式限制，而是应给予与作为整体的描述一致的最广泛解释。

参考文献

Hynes RK,Boyetchko SM.Research initiatives in the art and science ofbiopesticide formulations.Soil Biol Biochem.2006；38:845-849。

Claims

1.一种用于增加微生物群的产量、生长、生长速率、存活率和/或生存能力的方法，所述方法包括使包含生物炭颗粒、活性炭和/或木炭的保护剂与所述微生物群接触以获得混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述保护剂包含生物炭颗粒或基本上由其组成。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述保护剂包含活性炭或基本上由其组成。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中以混合物的0.01％至50％、0.05％至20％、0.1％至15％、0.1％至10％或0.1％至5％重量/体积的浓度添加所述保护剂。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述混合物进一步包含培养基。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述培养基是液体培养基。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述混合物是液体接种物。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述培养基是固体底物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述混合物是固定在所述固体底物中的微生物接种物。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，进一步包括储存所述混合物。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述微生物群在不存在所述保护剂的情况下生长。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述微生物群在存在所述保护剂的情况下生长。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中当与不包含所述保护剂的对照混合物中的微生物群相比时，存在所述保护剂使微生物群在储存期间的损失减少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％或100％或不超过0.1log CFU、0.2log CFU、0.3log CFU、0.4log CFU、0.5logCFU、0.6log CFU、0.7log CFU、0.8log CFU、0.9log CFU、1log CFU、1.1log CFU、1.2logCFU、1.3log CFU、1.4log CFU、1.5log CFU、1.6log CFU、1.7log CFU、1.8log CFU，1.9logCFU或2log CFU。

14.根据权利要求5至13中任一项所述的方法，其中所述培养基能够支持所述微生物群的生长。

15.根据权利要求14所述的方法，进一步包括发酵所述微生物群。

16.根据权利要求15所述的方法，其中在发酵步骤之前或开始时将所述保护剂添加到所述培养基中。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中在发酵步骤的早对数生长期与晚对数生长期之间将所述保护剂添加到所述培养基中。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中在发酵步骤的稳定期之前将所述保护剂添加到所述培养基中。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中在发酵步骤的稳定期将所述保护剂添加到所述培养基中。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，进一步包括在发酵步骤之后，将所述保护剂添加到所述微生物群中。

21.根据权利要求20所述的方法，进一步包括储存包含所述保护剂的所述微生物群。

22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中当与不存在所述保护剂的情况下发酵的对应的微生物群相比时，在发酵过程中，所述微生物群的产量增加了10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300％。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述保护剂包括具有小于1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10微米的尺寸的颗粒。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述颗粒的尺寸小于350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述微生物群包含细菌细胞或真菌细胞。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细菌细胞或真菌细胞来自以下属：无色杆菌(Achromobacter)、放线菌(Actimomycetes)、土壤杆菌(Agrobacterium)、节杆菌(Arthrobacter)、固氮螺菌(Azospirillum)、固氮菌(Azotobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、色杆菌(Chromobacterium)、蓝细菌(Cyanobacteria)、戴尔福特菌(Delftia)、肠杆菌(Enterobacter)、草螺菌(Herbaspirillum)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、溶杆菌(Lysobacter)、甲基杆菌(Methylobacterium)、松江菌(Mitsuaria)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、巴斯德氏牙菌(Pasteuria)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Rhizobium)、沙雷氏菌(Serratia)、中华根瘤菌(Sinorhizobium)、链球菌(Streptococcus)、链霉菌(Streptomyces)、白僵菌(Beauveria)、绿僵菌(Metarhizium)、棒束孢(Isaria)、青霉菌(Penicillium)、木霉(Trichoderma)、毛壳菌(Chaetomium)、梨形孢(Piriformospora)、伏革菌(Phlebiopsis)或螺旋聚孢霉(Clonostachys)。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述细菌细胞或真菌细胞来自以下属：固氮螺菌、慢生根瘤菌、戴尔福特菌、草螺菌、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)、根瘤菌、中华根瘤菌、梨形孢或链霉菌。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述细菌细胞或真菌细胞包括埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、高效固氮慢生根瘤菌(Bradyrhizobium diazoefficiens)、食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brazilense)、赫氏草螺菌(Herbaspirillum huttiense)、灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)、印度梨形孢菌(Piriformospora indica)或苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。

29.权利要求25的方法，其中所述细菌细胞包括埃氏慢生根瘤菌、食酸戴尔福特菌、赫氏草螺菌、豌豆根瘤菌或巴西固氮螺菌。

30.一种微生物组合物，包含(i)微生物群和(ii)保护剂，所述保护剂包含生物炭颗粒、活性炭和/或木炭。

31.根据权利要求30所述的微生物组合物，其中所述保护剂包含生物炭颗粒或基本上由其组成。

32.根据权利要求30所述的微生物组合物，其中所述保护剂包含活性炭或基本上由其组成。

33.根据权利要求30至32中任一项所述的微生物组合物，进一步包含(iii)培养基。

34.根据权利要求33所述的微生物组合物，其中所述培养基是液体培养基或固体底物。

35.根据权利要求34所述的微生物组合物，所述微生物组合物是液体接种物。

36.根据权利要求33所述的微生物组合物，其中所述培养基是固体底物。

37.根据权利要求36所述的微生物组合物，所述微生物组合物是固定在所述固体底物中的微生物接种物。

38.根据权利要求33至37中任一项所述的微生物组合物，其中所述培养基能够支持所述微生物群的生长。

39.根据权利要求30至38中任一项所述的微生物组合物，其中所述保护剂以所述微生物组合物的0.01％至50％、0.05％至20％、0.1％至15％、0.1％至10％或0.1％至5％重量/体积浓度存在。

40.根据权利要求30至39中任一项所述的微生物组合物，其中所述保护剂包含具有小于1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10的尺寸的颗粒。

41.根据权利要求30至40中任一项所述的微生物组合物，其中所述颗粒的尺寸小于350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10。

42.根据权利要求30至41中任一项所述的微生物组合物，其中所述微生物群包含细菌细胞或真菌细胞。

43.根据权利要求42所述的微生物组合物，其中所述细菌细胞或真菌细胞来自以下属：无色杆菌、放线菌、土壤杆菌、节杆菌、固氮螺菌、固氮菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、慢生根瘤菌、色杆菌、蓝细菌、戴尔福特菌、肠杆菌、草螺菌、克雷伯氏菌、乳杆菌、乳球菌、溶杆菌、甲基杆菌、松江菌、类芽孢杆菌、巴斯德氏牙菌、假单胞菌、根瘤菌、沙雷氏菌、中华根瘤菌、链球菌、链霉菌、白僵菌、绿僵菌、棒束孢、青霉菌、木霉、毛壳菌、梨形孢、伏革菌或螺旋聚孢霉。

44.根据权利要求42所述的微生物组合物，其中细菌细胞或真菌细胞来自以下属：固氮螺菌属、慢生根瘤菌属、戴尔福特菌属、草螺菌属、中慢生根瘤菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、梨形孢属或链霉菌属。

45.根据权利要求42所述的微生物组合物，其中细菌细胞或真菌细胞包括埃氏慢生根瘤菌、高效固氮慢生根瘤菌、食酸戴尔福特菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌、热带根瘤菌、百脉根中慢生根瘤菌、巴西固氮螺菌、赫氏草螺菌、灰绿链霉菌、印度梨形孢菌或苜蓿中华根瘤菌。

46.根据权利要求42所述的微生物组合物，其中所述细菌细胞包括埃氏慢生根瘤菌、食酸戴尔福特菌、赫氏草螺菌、豌豆根瘤菌或巴西固氮螺菌。