CN102199552B - 罗伦隐球酵母专用培养基及其用途 - Google Patents

罗伦隐球酵母专用培养基及其用途 Download PDF

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本发明公开了一种罗伦隐球酵母专用培养基，每1L专用培养基中含有葡萄糖10~20g、硫酸铵3~6g、磷酸氢二钾1.5~3g、硫酸镁1~6g、硫酸亚铁0~0.02g、硫酸锰0~0.01g、硫酸锌0~0.02g、氯化钙0~0.5g/L、氯化钠0~1g、生物素0.4~0.5mg、L-天门冬氨酸0.2~0.5mg和维生素B10.2~1mg，其余为水，pH值3~8。本发明还同时公开了上述罗伦隐球酵母的专用培养基的用途：将罗伦隐球酵母按照体积比为0.2~4%接种量接入专用培养基后，在200rpm、25~28℃条件下培养24~120小时。

Description

罗伦隐球酵母专用培养基及其用途
技术领域
本发明涉及果实采后生防酵母的发酵培养的技术领域，特别是一种罗伦隐球酵母专用培养基及其用途。
背景技术
利用拈抗酵母控制采后果实病害的生物防治技术是当前国内外非常关注的新型采后病害控制方法之一。罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)是国内外较广泛研究的采后生物防治酵母菌株，其拈抗机理涉及营养和空间竞争、与病原菌粘合、分泌β-1，3-葡聚糖酶、抗氧化胁迫、诱导果实抗性或抗性相关反应、降解病原菌分泌的真菌毒素和降解果实与激发病原菌孢子萌发相关的挥发物等。中国发明专利(专利号ZL200510090063.1，一种酵母拈抗菌的培养方法及其专用培养基)公开了一种罗伦隐球酵母的培养基配方，该培养基的碳源选自柠檬酸、苹果酸或/和葡萄糖；氮源选自大豆蛋白胨、牛肉浸膏、肉蛋白胨或/和胰酶解蛋白胨；无机养分选自MgSO4、CaCl2或/和MgCl2中的一种或几种；中国发明专利申请号200310115336.4(一种生物拈抗菌及其应用)公开了一种利用罗伦隐球酵母和杀菌剂及氯化钙等防治甜樱桃、冬枣及苹果果实病害的方法；中国发明专利申请号200810128441.4(一种生物活性果蔬保鲜膜)公开了一种利用罗伦隐球酵母和海藻酸钠等保鲜苹果和圣女果等果实的方法；中国发明申请号200910078858.9(葡萄果实采后病害或果粒脱落的防治方法及其专用防治剂)公开一种利用罗伦隐球酵母和硼酸盐等防治葡萄果实病害或脱粒的方法。中国发明专利(专利号ZL200510090065.0，酵母拈抗菌C.laurentii的真空冷冻干燥制品及其制备方法)公开了一种罗伦隐球酵母冷冻干燥制品的制备方法；中国发明申请专利(申请号200910079774.7，一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法)公开了一种制备罗伦隐球酵母常温保存的胶囊剂制备方法。
但罗伦隐球酵母的液体培养基多为NYDB(nutrientyeast dextrose broth，营养酵母葡萄糖液体培养基)等天然培养基，其化学组成不明确，不但批次之间的平行性较差，而且不利于进一步对培养基进行改进和优化。
目前NYDB是目前最主要、也是最常用的NYDB培养基；其主要由牛肉浸膏，酵母粉，葡萄糖和水组成。其中牛肉浸膏，酵母粉作为氮源为天然物质，实际为大量不同成分的混合体，其组分及含量在不同批次间会有一定差异，表现在不同氮源批次间PH会有一定差异(PH值会在5～6之间波动)。中国发明专利(专利号ZL200510090063.1，一种酵母拈抗菌的培养方法及其专用培养基)公开了一种罗伦隐球酵母的培养基配方中氮源仍为大豆蛋白胨、牛肉浸膏、肉蛋白胨或/和胰酶解蛋白胨等天然物质。利用天然物质的好处是由于成分多样，对酵母培养比较有利(指收获菌体数量而言)。但也由于是天然混合物质，成分及浓度(含量)在不同厂家、不同批次间会有一定差异，给基于该培养基的理论研究会带来一定负面的影响。例如，当需要研究一种具体物质对酵母培养及活性的影响时，会由于原有培养基中成分及含量的不确定给最后的实验结果及判断造成不利的影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种适合罗伦隐球酵母发酵培养的组分明确、可重复验证的合成培养基配方，该培养基对酵母自身生长和生防活力没有显著负面影响。其包括碳源、氮源、无机盐和微量元素、生长因子种类和数量的优化。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种罗伦隐球酵母的专用培养基，培养基由葡萄糖、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、氯化钙、氯化钠、生物素、L-天门冬氨酸、维生素B1和水组成，每1L培养基中含有葡萄糖10～20g，硫酸铵3～6g，磷酸氢二钾1.5～3g，硫酸镁1～6g，硫酸亚铁0～0.02g，硫酸锰0～0.01g、硫酸锌0～0.02g、氯化钙0～0.5g/L、氯化钠0～1g，生物素0.4～0.5mg，L-天门冬氨酸0.2～0.5mg，维生素B1 0.2～1mg，其余为水，PH值3～8。
作为本发明的罗伦隐球酵母专用培养基的改进：每1L所述专用培养基中含葡萄糖10g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁3g，硫酸锌0.005g，生物素0.5mg，L-天门冬氨酸0.5mg和维生素B1 1mg，其余为水，PH值3～8(较优的PH值为6～8)。其制备方法为：将葡萄糖、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌和水事先采用常规的高压灭菌(121℃，灭菌20min)后备用，然后将生物素0.5mg，L-天门冬氨酸0.5mg和维生素B1 1mg以及上述灭菌后的葡萄糖10g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁3g，硫酸锌0.005g相混合，并用上述灭菌后的水定容至1L。
作为本发明的罗伦隐球酵母专用培养基的进一步改进：罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCC NO.3590的罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10。
本发明还同时提供了上述罗伦隐球酵母专用培养基的用途：将罗伦隐球酵母按照体积比为0.2～4％接种量接入所述专用培养基后，在200rpm、25～28℃条件下培养24～120小时。
罗伦隐球酵母的保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该罗伦隐球酵母在申请号为201010152108.4的专利中有明确告知。
本发明提供的罗伦隐球酵母专用培养基由合成原料组成，具有组分明确、可重复验证等突出优点，有利于研究罗伦隐球酵母代谢调节规律，从而对进一步利用、开发罗伦隐球酵母的拈抗活性、研制安全高效、环境友好的绿色生物保鲜剂等具有重要意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是不同培养基起始PH值对酵母生物量的影响。
图2是酵母在本发明提供的合成培养基中的生长动态图。
具体实施方式
以下所用的NYDA培养基为：牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20克，水定容至1000ml，常规高压(121℃，30分钟)灭菌。所用的NYDB种子培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，常规高压(121℃，30分钟)灭菌。
实施例1
1、罗伦隐球酵母菌种活化及种子液培养
取出在4℃冰箱内保存的罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590，用划线接种的方法接种于NYDA培养基中，在28℃生化培养箱中活化48h后再在同样条件下活化培养1次。
从活化好的罗伦隐球酵母斜面上挑取少许菌体接种于含有50mL NYDB培养基的250mL锥形瓶中，在28℃的摇床培养箱中培养24h，转速200rpm。
2、发酵培养基制备
在250mL锥形瓶中按正交试验法L16(215)加入各个培养基成分(见表1和表2，为每L中的重量g)，常规高压灭菌(121℃，灭菌20min)后备用(生物素、L-天门冬氨酸和维生素B1采取过滤灭菌后加入)，用水定容至50mL。
3、罗伦隐球酵母的发酵培养和生物量测定
在无菌条件下，吸取1mL种子液接种于250ml灭菌后的发酵培养基中，在28℃的摇床培养箱中培养24h，转速为200rpm。
测定生物量时先以5000转/分离心5min，弃去发酵上清液，然后用水清洗2次，最后在600nm波长下测定酵母悬浮液的吸光值。各个处理的实验结果为菌体培养液离心、稀释相同倍数后在600nm波长下所测的吸光值。
4、实验结果
从表2可知，处理7的配方所获得的酵母数量最大，此配方所含各个物质成分为葡萄糖10g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸镁3g/L、硫酸亚铁0.01g/L、生物素0.4mg/L、L-天门冬氨酸0.2mg/L、维生素B1 0.2mg/；而硫酸锰、硫酸锌、氯化钠、氯化钙均为0。
从表2的极差可以看出葡萄糖、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、氯化钠、维生素B1的极差大于0.1，表明该试验条件下这些成份对罗伦隐球酵母生物量有较强的影响。而从表2的均值1、均值2可以看出，葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸锰、硫酸锌、维生素B1的均值1大于均值2，表明该试验条件下低剂量的上述物质对罗伦隐球酵母培养更有利；而硫酸铵、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钠、氯化钙、生物素、L-天门冬氨酸的均值2大于均值1，表明该试验条件下高剂量的上述物质对罗伦隐球酵母培养更有利。综合极差和均值结果，理论上以下成分的各个较佳使用浓度为：葡萄糖10g/L，硫酸铵6g/L，硫酸镁3g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钙0.5g/L，生物素0.4mg/L，L-天门冬氨酸0.4mg/L；而磷酸氢二钾、硫酸锰、硫酸锌、维生素B1均为0。
表1 L16(215)正交试验表头
Figure BDA0000058782420000041
注：表1中单位生物素、L-天门冬氨酸、维生素B1为mg/L，其余均为g/L，表2同。
表2 L16(215)正交试验实际处理安排和试验结果
Figure BDA0000058782420000042
Figure BDA0000058782420000051
实施例2
1、罗伦隐球酵母菌种活化及种子液培养
同实施例1。
2、发酵培养基制备
在250mL锥形瓶中，每个处理中的葡萄糖均为10g/L，硫酸铵均为3g/L，其余成分按正交试验法L18(2×37)加入各个培养基成分(见表3和表4，为每L中的重量g)，高压灭菌(121℃，灭菌20min)后备用(维生素B1采取过滤灭菌后加入)，用水定容至50mL。
3、罗伦隐球酵母的发酵培养和生物量测定
在无菌条件下，吸取2mL种子液接种于250ml灭菌后的发酵培养基中，在25℃的摇床培养箱中培养24h，转速为200rpm。测定生物量时先以5000转/分离心5min，弃去发酵上清液，然后用水清洗2次，最后在600nm波长下测定酵母悬浮液的吸光值。各个处理的实验结果为菌体培养液离心、稀释相同倍数后在600nm波长下所测的吸光值。
4、实验结果
从表4可知，处理8的配方所获得的酵母数量最大，此配方所含各个物质成分为：葡萄糖10g/L，硫酸铵为3g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸镁3g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰0.005g/L，氯化钠1g/L；而硫酸锌和维生素B1均为0。
从表4的极差可以看出，硫酸镁、硫酸锌、维生素B1的极差值大于0.1，表明该试验条件下上述物质对罗伦隐球酵母生长的影响较强。而从均值栏可以看出，(1)磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钠的均值1、均值2、均值3均较接近，表明该试验条件下，磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钠浓度变化对罗伦隐球酵母的生物量的影响不明显；(2)硫酸镁的均值2大于均值1均值3，表明该试验条件下硫酸镁浓度在3g/L时对罗伦隐球酵母生长最有利；(3)硫酸锌的均值1大于均值2均值3，表明该试验条件下低浓度的硫酸锌更有利罗伦隐球酵母的生长。综合极差和均值结果，理论上以下成分的各个较佳使用浓度为：硫酸镁3g/L，硫酸亚铁0或0.02g/L，硫酸锰0.005g/L，氯化钠1g/L；而磷酸氢二钾、硫酸锌、维生素B1均为0。
表3 L18(2×37)正交试验表头
  K2HPO4   MgSO4   FeSO4   MnSO4   ZnSO4   NaCl   维生素B1
  水平1   0   0   0   0   0   0   0
  水平2   1.5   3   10   5   5   0.5   0.1
  水平3   3   6   20   10   10   1   0.2
注：表3中单位FeSO4、MnSO4、ZnSO4和维生素B1为mg/L，其余均为g/L，表4同。
表4 L18(2×37)正交试验实际处理安排和试验结果
Figure BDA0000058782420000061
实施例3
1、罗伦隐球酵母菌种活化及种子液培养
同实施例1。
2、发酵培养基制备
在250mL锥形瓶中，每个处理中的葡萄糖均为10g/L，硫酸铵均为3g/L，其余成分按正交试验法L9(34)加入各个培养基成分(见表5和表6，为每L中的重量g)，高压灭菌(121℃，灭菌20min)后备用，用水定容至50mL。
3、罗伦隐球酵母的发酵培养和生物量测定
在无菌条件下，吸取1mL种子液接种于250ml灭菌后的发酵培养基中，在25℃的摇床培养箱中培养24h，转速为200rpm。
测定生物量时先以5000转/分离心5min，弃去发酵上清液，然后用水清洗2次，最后在600nm波长下测定酵母悬浮液的吸光值。各个处理的实验结果为菌体培养液离心、稀释相同倍数后在600nm波长下所测的吸光值。
4、实验结果
从表6可知，处理5的配方所获得的酵母数量相对最大，此配方所含各个物质成分为：葡萄糖10g/L，硫酸铵3g/L、硫酸氢二钾1.5g/L，硫酸镁3g/L，硫酸亚铁0.02g/L，而硫酸锰为0g/L。
从表6的均值可以看出，磷酸氢二钾的均值2最大，硫酸镁的均值2最大，硫酸亚铁的均值1最大，硫酸锰的均值1最大，表明该试验条件下，磷酸氢二钾浓度在1.5g/L时对酵母生长最有利，硫酸镁浓度在3g/L时对酵母生长最有利。硫酸亚铁和硫酸锰在浓度为0时对酵母生长最有利。
表5 L9(34)正交试验表头
  K2HPO4   MgSO4   FeSO4   MnSO4
  水平1   0   0   0   0
  水平2   1.5   3   0.01   0.005
  水平3   3   6   0.02   0.01
注：表5中单位5均为g/L，表6同
表6 L9(34)正交试验实际处理安排和试验结果
Figure BDA0000058782420000081
实施例4
1、罗伦隐球酵母菌种活化及种子液培养
同实施例1。
2、发酵培养基制备
在250mL锥形瓶中，每个处理中的葡萄糖均为10g/L，硫酸铵均为3g/L，K2HPO4均为1.5g/L，MgSO4均为3g/L，FeSO4均为0.02g/L，MnSO4均为0.005g/L，生长因子成分按正交试验法L9(34)加入各个培养基成分(见表7和表8，为每L中的重量g)，高压灭菌(121℃，灭菌20min)后备用(生物素、L-天门冬氨酸和维生素B1采取过滤灭菌后加入)，用水定容至50mL。
3、罗伦隐球酵母的发酵培养和生物量测定
在无菌条件下，吸取1mL种子液接种于250ml灭菌后的发酵培养基中，在28℃的摇床培养箱中培养24h，转速为200rpm。
测定生物量时先以5000转/分离心5min，弃去发酵上清液，然后用水清洗2次，最后在600nm波长下测定酵母悬浮液的吸光值。各个处理的实验结果为菌体培养液离心、稀释相同倍数后在600nm波长下所测的吸光值。
4、实验结果
从表8可知，处理5的配方所获得的酵母数量相对最大，此配方所含各个物质成分为：葡萄糖10g/L，硫酸铵3g/L，K2HPO4 1.5g/L，MgSO4 3g/L，FeSO4为0.02g/L，MnSO4 0.005g/L，生物素0.5mg/L，L-天门冬氨酸0.5mg/L，维生素B11mg/L。
从表8的均值可以看出，生物素均值2最大，L-天门冬氨酸均值2最大，维生素B1均值3最大，表明该试验条件下，生物素在0.5mg/L、L-天门冬氨酸在0.5mg/L、维生素B1在1mg/L时对罗伦隐球酵母的生长最有利，且以上结果与处理5的实际结果相符。
表7 L9(34)正交试验表头
  生物素   L-天门冬氨酸   维生素B1
  水平1   0   0   0
  水平2   0.5   0.5   0.5
  水平3   1   1   1
注：表7中单位生物素、L-天门冬氨酸、维生素B1为mg/L，其余均为g/L，表8同。
表8 L9(34)正交试验实际处理安排和试验结果
Figure BDA0000058782420000091
Figure BDA0000058782420000101
实施例5
1、罗伦隐球酵母菌种活化及种子液培养
同实施例1。
2、发酵培养基制备
在250mL锥形瓶中，每个处理分别按表9加入各个成分(为每L中的重量g)，高压灭菌(121℃，灭菌20min)后备用(生物素、L-天门冬氨酸和维生素B1采取过滤灭菌后加入)，用水定容至50mL。
3、罗伦隐球酵母的发酵培养和生物量测定
在无菌条件下，吸取1mL种子液接种于250ml灭菌后的发酵培养基中，在28℃的摇床培养箱中培养24h，转速为200rpm。
测定生物量时先以5000转/分离心5min，弃去发酵上清液，然后用水清洗2次，最后在600nm波长下测定酵母悬浮液的吸光值。各个处理的实验结果为菌体培养液离心、稀释相同倍数后在600nm波长下所测的吸光值。
4、实验结果
从表9可知，处理5结果最好，该培养基中各个成分含量分别为：葡萄糖含量为10g/L，硫酸铵含量为5g/L，磷酸氢二钾含量为2g/L，硫酸镁含量为1g/L，硫酸亚铁含量为0.01g/L，硫酸锌含量为20mg/L，生物素含量为0.5mg/L，L-天门冬氨酸含量为0.5mg/L，维生素B1含量为1mg/L。
表9实际处理安排和试验结果
Figure BDA0000058782420000102
Figure BDA0000058782420000111
注：表9中的单位葡萄糖、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钠、氯化钙的单位为g/L；硫酸锌、生物素、L-天门冬氨酸、维生素B1的单位为mg/L。
实施例6
1、罗伦隐球酵母菌种活化及种子液培养
同实施例1。
2、发酵培养基制备
在250mL锥形瓶中，分别加入以下对比组的处理配方，高压灭菌(121℃，灭菌20min)后备用(生物素、L-天门冬氨酸和维生素B1采取过滤灭菌后加入)，用水定容至50mL。
2.1对比组一
处理1：葡萄糖10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁3g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.005g/L、硫酸锌0.005g/L、氯化钠0.5g/L、生物素0.5mg/L、L-天门冬氨酸0.5mg/L、维生素B1 1mg/L
处理2：葡萄糖10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁3g/L、硫酸锰0.005g/L、硫酸锌0.005g/L、氯化钠0.5g/L、生物素0.5mg/L、L-天门冬氨酸0.5mg/L、维生素B1 1mg/L(即硫酸亚铁不添加)
2.2对比组二
处理1：葡萄糖10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁3g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.005g/L、硫酸锌0.005g/L、氯化钠0.5g/L、生物素0.5mg/L、L-天门冬氨酸0.5mg/L、维生素B1 1mg/L
处理2：葡萄糖10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁3g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锌0.005g/L、氯化钠0.5g/L、生物素0.5mg/L、L-天门冬氨酸0.5mg/L、维生素B1 1mg/L(即硫酸锰不添加)
2.3对比组三
处理1：葡萄糖10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁3g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.005g/L、硫酸锌0.005g/L、氯化钠0.5g/L、生物素0.5mg/L、L-天门冬氨酸0.5mg/L、维生素B1 1mg/L
处理2：葡萄糖10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁3g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.005g/L、氯化钠0.5g/L、生物素0.5mg/L、L-天门冬氨酸0.5mg/L、维生素B1 1mg/L(即硫酸锌不添加)
2.3对比组四
处理1：葡萄糖10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁3g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.005g/L、硫酸锌0.005g/L、氯化钠0.5g/L、生物素0.5mg/L、L-天门冬氨酸0.5mg/L、维生素B1 1mg/L
处理2：葡萄糖10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁3g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.005g/L、硫酸锌0.005g/L、生物素0.5mg/L、L-天门冬氨酸0.5mg/L、维生素B1 1mg/L(即氯化钠不添加)
3、罗伦隐球酵母的发酵培养和生物量测定
在无菌条件下，吸取1mL种子液接种于250ml灭菌后的发酵培养基中，在28℃的摇床培养箱中培养24h，转速为200rpm。
测定生物量时先以5000转/分离心5min，弃去发酵上清液，然后用水清洗2次，最后在600nm波长下测定酵母悬浮液的吸光值。各个处理的实验结果为菌体培养液离心、稀释相同倍数后在600nm波长下所测的吸光值。
4、实验结果
从表10可知，对比组三即是否添加硫酸锌的2个处理之间存在显著性差异，而是否添加硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钠3个对比组之间不存在显著差异。
表10对比实验结果
实施例7
1、罗伦隐球酵母菌种活化及种子液培养
同实施例1。
2、发酵培养基制备
在250mL锥形瓶中制备50mL的罗伦隐球酵母专用培养基，所含发酵培养基组份及浓度为：葡萄糖10g/L，硫酸铵为5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 3g/L，硫酸锌0.005g/L，生物素0.5mg/L，L-天门冬氨酸0.5mg/L，维生素B1 1mg/L。即，每1L培养基中含葡萄糖10g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁3g，硫酸锌0.005g，生物素0.5mg，L-天门冬氨酸0.5mg和维生素B1 1mg，其余为水。
制备方法为：葡萄糖、硫酸铵、K2HPO4、MgSO4、硫酸锌和水事先采用常规高压灭菌(121℃，20min)，生物素、L-天门冬氨酸和维生素B1采取过滤灭菌后加入，用少量1mol/L盐酸或氢氧化钠将培养基PH值调整到所需要的数值(pH值3～8)。
处理1：NYDB培养基(作为对照，市购而得，实测PH是5.8)。
处理2：葡萄糖10g/L，硫酸铵为5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 3g/L，硫酸锌0.005g/L，生物素0.5mg/L，L-天门冬氨酸0.5mg/L，维生素B1 1mg/L，自然PH值(6.5)。
处理3：葡萄糖10g/L，硫酸铵为5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 3g/L，硫酸锌0.005g/L，生物素0.5mg/L，L-天门冬氨酸0.5mg/L，维生素B1 1mg/L，PH值＝3.0。
处理4：葡萄糖10g/L，硫酸铵为5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 3g/L，硫酸锌0.005g/L，生物素0.5mg/L，L-天门冬氨酸0.5mg/L，维生素B1 1mg/L，PH值＝4.0。
处理5：葡萄糖10g/L，硫酸铵为5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 3g/L，硫酸锌0.005g/L，生物素0.5mg/L，L-天门冬氨酸0.5mg/L，维生素B1 1mg/L，PH值＝5.0。
处理6：葡萄糖10g/L，硫酸铵为5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 3g/L，硫酸锌0.005g/L，生物素0.5mg/L，L-天门冬氨酸0.5mg/L，维生素B1 1mg/L，PH值＝6.0。
处理7：葡萄糖10g/L，硫酸铵为5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 3g/L，硫酸锌0.005g/L，生物素0.5mg/L，L-天门冬氨酸0.5mg/L，维生素B1 1mg/L，PH值＝7.0。
处理8：葡萄糖10g/L，硫酸铵为5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 3g/L，硫酸锌0.005g/L，生物素0.5mg/L，L-天门冬氨酸0.5mg/L，维生素B1 1mg/L，PH值＝8.0。
处理9：葡萄糖10g/L，硫酸铵为5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 3g/L，硫酸锌0.005g/L，生物素0.5mg/L，L-天门冬氨酸0.5mg/L，维生素B1 1mg/L，PH值＝9.0。
3、罗伦隐球酵母的发酵培养和生物量测定
在无菌条件下，吸取1mL种子液接种于250ml灭菌后的发酵培养基中，在28℃的摇床培养箱中培养24h，转速为200rpm。
测定生物量时先以5000转/分离心5min，弃去发酵上清液，然后用水清洗2次，最后在600nm波长下测定酵母悬浮液的吸光值。各个处理的实验结果为菌体培养液离心、稀释相同倍数后在600nm波长下所测的吸光值。
4、实验结果
结果如图1所示。本发明所获得的合成培养基培养获得罗伦隐球酵母的生物量已非常接近天然培养基(NYDB)所能获得的生物量。培养基的起始PH值对酵母的生物量有显著的影响，当较低(PH＝3)或较高(PH＝9)PH值时，酵母的生物量显著减少。培养基起始PH值在6～8之间时与自然PH的结果相近，无显著差异。
实施例8
1、罗伦隐球酵母菌种活化及种子液培养
同实施例1。
2、发酵培养基制备
在250mL锥形瓶中，所含发酵培养基为50ml的NYDB培养基(市购而得，实测PH是5.8)或本发明所提供的罗伦隐球酵母专用培养基。本发明所提供的罗伦隐球酵母专用培养基为：葡萄糖10g/L，硫酸铵为5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 3g/L，硫酸锌0.005g/L，生物素0.5mg/L，L-天门冬氨酸0.5mg/L，维生素B1 1mg/L。葡萄糖、硫酸铵、K2HPO4、MgSO4、硫酸锌这些组份采用常规高压灭菌(121℃，20min)，生物素、L-天门冬氨酸和维生素B1采取过滤灭菌后加入。pH值7。
3、罗伦隐球酵母的发酵培养和生物量测定
在无菌条件下，吸取1mL种子液接种于250ml灭菌后的发酵培养基中，在28℃的摇床培养箱中培养120h，转速为200rpm。
测定生物量时先以5000转/分离心5min，弃去发酵上清液，然后用水清洗2次，最后在600nm波长下测定酵母悬浮液的吸光值。各个处理的实验结果为菌体培养液离心、稀释相同倍数后在600nm波长下所测的吸光值。
4、实验结果
结果如图2所示。罗伦隐球酵母在本发明所提供的合成培养基中良好的生长。其前12小时为生长延滞期，随后的12～36小时即进入快速生长的对数生长阶段，36～96小时为稳定生长期，96小时生长数量降低，即进入衰退期。虽然与NYDB培养基相比，在菌体收集数量略低一些，但足以保证进一步研究的需要。
需要指出的是NYDB培养基是利用牛肉浸膏，酵母粉作为氮源(其为天然物质)，实际为大量不同成分的混合体，其组分及含量在不同批次间会有一定差异，表现在不同氮源批次间PH会有一定差异(PH值会在5～6之间波动)。利用天然物质的好处是由于成分多样，对酵母培养比较有利(指收获菌体数量而言)。但也由于是天然混合物质，成分及浓度(含量)不同厂家、批次间会有一定差异，给基于该培养基的理论研究会带来一定负面的影响，如需要研究一种具体物质对酵母培养及活性的影响时，会由于原有培养基中成分及含量不确定给最后的实验结果及判断造成不利的影响。而本发明正是为了解决这一问题而开展的。本发明提供的罗伦隐球酵母专用培养基能利用成分及含量非常确定的基础上收获较大量的酵母菌体，为进一步开展相关深入研究提供了基础(虽然与NYDB培养基相比在菌体收集数量略低一些，但足以保证进一步研究的需要。)因此本发明提供的罗伦隐球酵母专用培养基具有重要的理论研究意义。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.罗伦隐球酵母专用培养基，其特征是：每1L专用培养基中含有葡萄糖10~20 g、硫酸铵3~6 g、磷酸氢二钾1.5~3 g、硫酸镁1~6 g、硫酸亚铁0 ~0.02g、硫酸锰0~0.01 g、硫酸锌0~0.02 g、氯化钙0~0.5 g、氯化钠0~1 g、生物素0.4~0.5mg、L-天门冬氨酸0.2~0.5 mg和维生素B1 0.2~1mg，其余为水，pH值3~8；罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCC NO.3590的罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）ZJU 10。
2.根据权利要求1所述的罗伦隐球酵母专用培养基，其特征是：每1L所述专用培养基中含葡萄糖10 g，硫酸铵5 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁3 g，硫酸锌0.005 g，生物素0.5 mg，L-天门冬氨酸0.5 mg和维生素B11mg，其余为水。
3.如权利要求1或2所述的罗伦隐球酵母专用培养基的用途，其特征是：将所述罗伦隐球酵母按照体积比为0.2~4%接种量接入所述专用培养基后，在200rpm、25~28℃条件下培养24~120小时。 
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