CN108265016A

CN108265016A - 一种乳酸菌添加剂及其应用、制备方法

Info

Publication number: CN108265016A
Application number: CN201810104006.1A
Authority: CN
Inventors: 闫艳红; 关皓; 张新全; 李小铃; 帅杨; 李小梅; 黄琳凯; 聂刚; 汪霞; 黄婷
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-01-29
Filing date: 2018-01-29
Publication date: 2018-07-10
Anticipated expiration: 2038-01-29
Also published as: CN108265016B

Abstract

本发明公开一种乳酸菌添加剂，所述乳酸菌添加剂组分包括：组分A和组分B，所述组分A和所述组分B容积比为(1～2):(1～2)；所述组分A选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分B选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分A和所述组分B不相同；所述乳酸菌添加剂作为牧草青贮添加剂，提升牧草青贮饲料的品质，具有广泛的应用前景。

Description

一种乳酸菌添加剂及其应用、制备方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种乳酸菌添加剂其应用、制备方法。

背景技术

青贮是通过乳酸菌的增殖，将原料中的发酵底物转化成乳酸等酸性物质，维持酸性厌氧环境，以利于青贮作物长期保存的一种贮藏方式。青贮饲料颜色黄绿、气味酸香、柔软多汁、适口性好，在畜牧业生产中广泛应用，尤其在反刍动物饲养中，已成为重要的优质粗饲料来源。

乳酸菌是近年来正在推广的青贮微生物添加剂，其主要作用是调节青贮物料内微生物组成，迅速成为优势菌群，竞争抑制有害微生物生长转化有限的糖分，降低青贮pH值，从而提高青贮饲料的质量，不同的青贮物料其发酵特性存在不同，而目前适用于青贮的乳酸菌品种单一，不能满足市场需求。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了一种乳酸菌添加剂，所述乳酸菌添加剂作为牧草青贮添加剂，能快速降低牧草青贮pH值，使乳酸菌成为优势菌群，加快发酵成熟，增减少了氨态氮的产生以及增加了有机酸含量，提高了青贮饲料的发酵品质，从而提高牧草青贮饲料干物质含量，干物质回收率、粗蛋白含量，提升牧草青贮饲料的质量，具有广泛的应用前景。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种乳酸菌添加剂，其特征在于，所述乳酸菌添加剂组分包括：组分A和组分B，所述组分A和所述组分B容积比为(1～2):(1～2)；所述组分A选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分B选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分A和所述组分B不相同；所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.15074，保藏日期为2017年12月18日；所述食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15075，保藏日期为2017年12月18日；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15073，保藏日期为2017年12月18日。

上述戊糖片球菌的16s rDNA如SEQ ID NO.1所示，上述食窦魏斯氏菌的16s rDNA如SEQ ID NO.2所示，上述植物乳杆菌的16s rDNA如SEQ ID NO.3所示。

所述组分A和所述组分B容积比为2:1，或所述组分A为食窦魏斯氏菌，所述组分B为植物乳杆菌。

优选的，所述乳酸菌添加剂组分还包括：组分C，所述组分A、所述组分B和所述组分C容积比为(1～2):(1～2):(1～2)；所述组分C选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分A、所述组分B和所述组分C不相同。

本发明还提供了上述的乳酸菌添加剂的应用，所述乳酸菌添加剂在制备牧草青贮添加剂中的应用。

优选的，所述组分A、所述组分B和所述组分C容积比为1:2:2，所述组分A为戊糖片球菌，所述组分B为食窦魏斯氏菌，所述组分C为植物乳杆菌。优选的，所述乳酸菌添加剂在制备狼尾草属牧草青贮添加剂中的应用。

优选的，所述狼尾草属牧草为狼尾草属牧草为桂牧1号杂交狼尾草、桂闽引象草。

优选的，将乳酸菌添加剂接种到MRS液体培养基中，得到菌株添加液；将所述菌株添加液均匀喷洒到牧草样品中，混合均匀，袋装青贮，抽真空，于27～37℃发酵60天。

本发明还提供了一种上述的乳酸菌添加剂的制备方法，包括：取所述乳酸菌添加剂组分混合既得；所述乳酸菌添加剂组分包括：组分A和组分B，所述组分A和所述组分B容积比为(1～2):(1～2)；所述组分A选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分B选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分A和所述组分B不相同；所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15074；所述食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15075；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15073。

优选的，所述制备方法还包括以下步骤：

1)取牧草样品，稀释后吸取涂布至MRS固体培养基培养，挑出单菌落继续培养后，连续传代培养不少于2次，得到纯化的菌落；

2)将步骤1)得到的所述纯化的菌落在乳酸菌固体培养基上恒温厌氧条件下培养后，通过革兰氏染色和过氧化氢酶接触反应，进行乳酸菌的鉴定，将鉴定后的乳酸菌加入含灭菌甘油的液体营养培养基中，并储存，得到分离纯化的乳酸菌；

3)将步骤2)得到的所述分离纯化的乳酸菌进行菌种活化后，接种到MRS液体培养基中培养，得到菌液；测定所述菌液pH与OD值，根据测定结果进行筛选；筛选pH＝3.76，OD值＝1.641的菌液，得到初步筛选后的菌株A；筛选pH＝3.76，OD值＝1.641的菌液，得到初步筛选后的菌株B；筛选pH＝3.64，OD值＝1.732的菌液，得到初步筛选后的菌株C；

4)将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株A进行厌氧培养后，进行单株菌的DNA提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为所述食戊糖片球菌；

将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株B进行厌氧培养后，进行单株菌的DNA提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为所述食窦魏斯氏菌；

将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株C进行厌氧培养后，进行单株菌的DNA提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为所述植物乳杆菌。

优选的，所述以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物过程具体为：以上游引物：5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游引物：5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min后，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次，再72℃延长5min。

优选的，所述制备方法还包括：将步骤4)得到的所述戊糖片球菌、所述食窦魏斯氏菌和所述植物乳杆菌通过生理生化测定、耐盐试验、不同温度试验、耐酸试验和糖发酵试验评价试验进行分析。

优选的，所述制备方法还包括：将步骤4)得到的所述戊糖片球菌、所述食窦魏斯氏菌和所述植物乳杆菌进行16S rDNA序列分析。

优选的，所述步骤还具体包括：

1)取牧草样品，加入无菌蒸馏水，稀释成10^-1，10^-3和10^-5三个稀释度的样品稀释液；吸取样品稀释液涂布至MRS固体培养基培养，连续传代培养2次，得到纯化的菌落；

2)将步骤1)得到的所述纯化的菌落在乳酸菌固体培养基上37℃恒温厌氧条件下培养24h后，通过革兰氏染色和过氧化氢酶接触反应，进行乳酸菌的鉴定，将鉴定后的乳酸菌加入含灭菌甘油的液体营养培养基中，并以-80℃储存，得到分离纯化的乳酸菌；

3)将步骤2)得到的所述分离纯化的乳酸菌进行菌种活化后，以3％的接种量接种到10ml MRS液体培养基中，以温度40～45℃，湿度85％～98％培养12h，得到菌液；测定所述菌液pH与OD值，根据测定结果进行筛选；筛选pH＝3.76，OD值＝1.641的菌液，得到初步筛选后的菌株A；筛选pH＝3.76，OD值＝1.641的菌液，得到初步筛选后的菌株B；筛选pH＝3.64，OD值＝1.732的菌液，得到初步筛选后的菌株C；

4)将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株A在温度37℃条件下厌氧培养48h后，进行单株菌的DNA提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为所述食戊糖片球菌；

将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株B在温度37℃条件下厌氧培养48h后，进行单株菌的DNA提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为所述食窦魏斯氏菌；

将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株C在温度37℃条件下厌氧培养48h后进行单株菌的DNA提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为所述植物乳杆菌。

优选的，所述牧草样品为狼尾草属牧草样品。

优选的，所述狼尾草属牧草样品为桂牧1号杂交狼尾草鲜草、桂闽引象草鲜草、桂牧1号杂交狼尾草青贮样或桂闽引象草青贮样。

本申请与现有技术相比，其详细说明如下：

本发明提供的乳酸菌添加剂应用于牧草青贮用时，能快速转化有限的糖分，显著地降低青贮pH值，有效提高青贮饲料的质量，具有较大潜力和广阔的发展前景。进一步的，在牧草中，狼尾草属牧草的可溶性碳水化合物含量相对较低，水分含量较高，缓冲度较大，其茎秆中空存有大量空气，所以狼尾草属牧草青贮的发酵慢，导致青贮失败。本发明提供的乳酸菌添加剂作为牧草青贮添加剂，能快速降低狼尾草属牧草青贮pH值，使乳酸菌成为优势菌群，加快发酵成熟，减少氨态氮的产生以及增加了有机酸含量，提高了青贮饲料的发酵品质，从而提高牧草青贮饲料干物质含量，干物质回收率，提升牧草青贮饲料的质量，具有广泛的应用前景。

本发明提供了乳酸菌添加剂制备方法采用牧草样品经分离纯化得到分离纯化的乳酸菌，离纯化的乳酸菌菌种活化培养，得到菌液；按照菌液pH，OD值的进行筛选，得到初步筛选后的菌株，初步筛选后的菌株进行厌氧培养后，进行单株菌的DNA提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌，方法简单便捷，具有广泛的应用前景。

本发明提供的制备方法通过对所PCR扩增得到的微生物的鉴定，来确定得到了所预筛选的微生物为本发明提供的戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌，并可重复实施，具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供戊糖片球菌的光学显微镜图；

图2为本发明提供食窦魏斯氏菌的光学显微镜图；

图3为本发明提供植物乳杆菌的光学显微镜图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

一种戊糖片球菌，所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15074，保藏日期为2017年12月18日；

上述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)的16s rDNA核苷酸如SEQ ID NO.1所示。

一种食窦魏斯氏菌，所述食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15075，保藏日期为2017年12月18日；

上述食窦魏斯氏菌的16s rDNA如SEQ ID NO.2所示。

一种植物乳杆菌，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15073，保藏日期为2017年12月18日；

上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的16s rDNA核苷酸如SEQ ID NO.3所示。

图1为上述戊糖片球菌的光学显微镜图；图2为上述食窦魏斯氏菌的光学显微镜图；图3为上述植物乳杆菌的光学显微镜图。

一种乳酸菌添加剂，包括：所述乳酸菌添加剂组分见表2。

上述的乳酸菌添加剂的制备方法，取所述乳酸菌添加剂组分混合既得。

上述的乳酸菌添加剂的制备方法还包括：1)取牧草样品，加入无菌蒸馏水，稀释成10^-1，10^-3和10^-5三个稀释度的样品稀释液；吸取样品稀释液涂布至MRS固体培养基培养，连续传代培养2次，得到纯化的菌落；

3)将步骤2)得到的所述分离纯化的乳酸菌进行菌种活化后，以3％的接种量接种到10ml MRS液体培养基中，以温度40～45℃，湿度85％～98％培养12h，得到菌液；测定所述菌液pH与OD值，测定结果见表1，根据测定结果进行筛选；筛选pH＝3.76，OD值＝1.641的菌液，得到初步筛选后的菌株A；筛选pH＝3.76，OD值＝1.641的菌液，得到初步筛选后的菌株B；筛选pH＝3.64，OD值＝1.732的菌液，得到初步筛选后的菌株C；

4)将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株A进行在温度37℃条件下厌氧培养48h后，进行单株菌的DNA提取，以上游引物：27F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)，下游引物：1492R(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)，为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为上述戊糖片球菌；所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min后，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次，再72℃延长5min；

将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株B进行在温度37℃条件下厌氧培养48h后，进行单株菌的DNA提取，以上游引物：27F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)，下游引物：1492R(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)，为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为上述食窦魏斯氏菌；所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min后，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次，再72℃延长5min；

将步骤3)得到的所述初步筛选后的菌株C进行在温度37℃条件下厌氧培养48h后，进行单株菌的DNA提取，以上游引物：27F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)，下游引物：1492R(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)，为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述扩增产物即为上述植物乳杆菌；所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min后，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次，再72℃延长5min；

其中，所述牧草样品为狼尾草属牧草样品；所述狼尾草属牧草样品为桂牧1号杂交狼尾草鲜草、桂闽引象草鲜草、桂牧1号杂交狼尾草青贮样或桂闽引象草青贮样。

表1菌液pH与OD值

表2

由表1、表2可知菌株编号F04的微生物为本专利初步筛选后的菌株，由该初步筛选后的菌株经厌氧培养、DNA提取、以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到的本发明提供的戊糖片球菌，其生长速率快，产酸效率高；菌株编号F10的微生物为本专利初步筛选后的菌株，由该初步筛选后的菌株经厌氧培养、DNA提取、以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到的本发明提供的食窦魏斯氏菌，其生长速率快，产酸效率高；菌株编号S694的微生物为本专利初步筛选后的菌株，由该初步筛选后的菌株经厌氧培养、DNA提取、以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到的本发明提供的植物乳杆菌，其生长速率快，产酸效率高。由上述戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌复配得到的乳酸菌添加剂生长速率快，产酸效率高。

实施例2

生理生化测定：分别分析实施例1中的戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌生理生化特征，结果见表3。

不同温度试验：将实施例1中的戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌分别以3％的接种量接种到MRS液体培养基中，在表2的温度条件下进行培养，观察其生长状况，结果见表3。

耐盐试验：将实施例1中的戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌分别以含有NaCl浓度3.0％(w/v)和6.5％(w/v)的MRS液体培养基中，30℃下培养2天后，测定其耐盐性，结果见表3。

耐酸试验：将实施例1中的戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌分别在为表2pH值条件的MRS液体培养基中30℃下培养7天后，测定其耐酸性，结果见表2。

糖发酵试验：通过糖发酵试验分析实施例1中的戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌糖发酵特征，结果见表3。

16S rDNA序列分析：将实施例1中的戊糖片球菌进行16S rDNA序列分析，其16srDNA如SEQ ID NO.1所示；与其他戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)16S rDNA分析序列的相似性达到100％和99％；将实施例1中的食窦魏斯氏菌进行16S rDNA序列分析，其16srDNA如SEQ ID NO.2所示；与其他食窦魏斯氏菌(Lactobacillus plantarum)16S rDNA分析序列的相似性达到100％和99％；将实施例1中的植物乳杆菌进行16S rDNA序列分析，其16srDNA如SEQ ID NO.3所示；与其他植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)16S rDNA分析序列的相似性达到100％和99％。

表3生理生化测定、不同温度试验、耐盐试验和耐酸试验结果

表3中，+：生长Positive；－:不生长Negative；W:微弱生长Weakly positive.

由表3可知，本发明提供的戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌耐盐性和耐酸性好。

表4糖发酵试验结果

表4中，+：生长Positive；－:不生长Negative；W:微弱生长Weakly positive.

由表4可知，本发明提供的戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌利用碳源范围较广，可较好的利用不同青贮原料中不同类型的碳源进行发酵。进一步的本发明的乳酸菌添加剂，可更好的利用不同青贮原料中不同类型的碳源进行发酵。

实施例4

将本发明的乳酸菌添加剂作为牧草青贮添加剂

在四川农业大学崇州基地取高度1.5～2m的牧草，切成长度约为20mm，得到鲜样，每个处理各取鲜样500g装进塑料袋(25×35cm；Aodeju,China)，将实施例1得到的乳酸菌添加剂接种到MRS液体培养基中，以灭菌蒸馏水为空白对照，得菌株活菌数定为1×10⁶CFU/gFW，到菌株添加液；将所述菌株添加液均匀喷洒到牧草样品中，混合均匀，袋装青贮，抽真空封口，置于室温(27～37℃)中发酵60天后开封，得到青贮样。

1、感官评定：

1)青贮样根据德国牧业协会(DLG)1899年编订的感官青贮评分标准及等级评定对青贮饲料的气味、结构和色泽分别进行感官评分。

表5青贮饲料感官评定标准(DLG)

2)感官评定结果见表6。

表6感官评定结果

由表6可知，本发明提供的乳酸菌添加剂作为牧草青贮添加剂与不添加任何添加剂的对照组相比以及与戊糖片球菌单剂、与食窦魏斯氏菌单剂、与植物乳杆菌单剂相比，在气味方面，臭味等弱，芳香性更佳，茎叶结构保持更佳，60d即可得到感官佳的狼尾草属牧草青贮饲料。

2、发酵品质分析：

1)取20g青贮样加入180mL去离子水放入小型搅拌机中搅拌1min，过8层滤布，用苯酚-次氯酸纳比色法测定滤液pH值，用苯酚-次氯酸纳比色法测定滤液氨态氮(NH₃-N)

取20g青贮样与180ml灭菌蒸馏水混合震荡，用四层纱布过滤，采用高效液相色谱法测定有机酸含量。

2)牧草为狼尾草属牧草，狼尾草属牧草，发酵品质分析见表7、青贮微生物计数结果见表8。

表7狼尾草属牧草发酵品质分析

表8狼尾草属牧草青贮微生物计数结果

ND:未检出。

由表7～8可知，本发明提供的乳酸菌添加剂作为牧草青贮添加剂与不添加任何添加剂的对照组相比，能快速降低牧草青贮pH值，青贮品质更好，本发明提供的戊糖片球菌作为牧草青贮添加剂NH₃-N/％TN显著低于不添加任何添加剂的对照组。本发明提供的乳酸菌添加剂作为牧草青贮添加剂可显著增加乳酸含量，可提升乳酸菌数量，并显著降低酵母菌和肠杆菌数量，是乳酸菌成为优势菌群，抑制青贮饲料中的有害菌，提高牧草的青贮品质。本发明提供的乳酸菌添加剂作为狼尾草属牧草青贮添加剂，青贮60d，可显著提高有机酸含量，提高狼尾草属牧草青贮的发酵速率，从而提高青贮成功率，改善狼尾草属牧草的青贮品质。

3、营养成分分析：

1)取青贮样置于鼓风干燥箱中，105℃杀青0.5h，随后在65℃烘72h左右直至恒重，烘干样品用小型植物样粉碎机粉碎后过40目筛。采用常规烘干法测定干物质(Dry Matter,DM)，采用FOSS 8400型全自动凯氏定氮仪蒸馏测定粗蛋白(Crude Protein,CP)，采用范氏洗涤纤维法测定中性洗涤纤维(Neutral Detergent Fiber,NDF)与酸性洗涤纤维(AcidDetergent Fiber,ADF)，采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性碳水化合物(Water SolubleCarbohydrates,WSC)；

2)牧草为狼尾草属牧草，狼尾草属牧草营养成分分析结果见表9。

表9狼尾草属牧草营养成分

由表9可知，本发明提供的乳酸菌添加剂作为牧草青贮添加剂与不添加任何添加剂的对照组相比，能提高牧草青贮饲料干物质含量，干物质回收率、粗蛋白含量，提升牧草青贮饲料的质量。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种乳酸菌添加剂及其应用、制备方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1468

<212> DNA

<213> 戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)

<400> 1

atctgtcact tagacggcta gctcctaaaa ggttacccca ccggctttgg gtgttacaaa 60

ctctcatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct 120

gatccgcgat tactagcgat tccgacttcg tgtaggcgag ttgcagccta cagtccgaac 180

tgagaatggt tttaagagat tagcttaacc tcgcggtctc gcgactcgtt gtaccatcca 240

ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc gtccccacct 300

tcctccggtt tgtcaccggc agtctcacta gagtgcccaa cttaatgctg gcaactagta 360

ataagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa 420

ccatgcacca cctgtcattc tgtccccgaa gggaacctct aatctcttag actgtcagaa 480

gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt agcttcgaat taaaccacat gctccaccgc 540

ttgtgcgggc ccccgtcaat tcttttgagt ttcaaccttg cggtcgtact ccccaggcgg 600

attacttaat gcgttagctg cagcactgaa gggcggaaac cctccaacac ttagtaatca 660

tcgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttc gctacccatg ctttcgagcc 720

tcagcgtcag ttgcagacca gacagccgcc ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac 780

gcatttcacc gctacacatg gagttccact gtcctcttct gcactcaagt ctcccagttt 840

ccaatgcact tcttcggttg agccgaaggc tttcacatta gacttaaaag accgcctgcg 900

ctcgctttac gcccaataaa tccggataac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct 960

ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta aataccgtca ctgggtaaac agttactctt 1020

acccacgttc ttctttaaca acagagcttt acgagccgaa acccttcttc actcacgcgg 1080

cgttgctcca tcagacttgc gtccattgtg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga 1140

gtctgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc cgattaccct ctcaggtcgg ctacgtatca 1200

ctgccttggt gagcctttgc ctcaccaact agctaatacg ccgcgggtcc atccagaagt 1260

gatagcagag ccatctttta aaagaaaacc atgcggtttt ctctgttata cggtattagc 1320

atctgtttcc aggtgttatc ccctgcttct gggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt 1380

tcgccactca cttcgtgtta aaatctcaat cagtacaagt acgtcataat caattaacgg 1440

aagttcgttc gactgcatgt atagcacg 1468

<210> 2

<211> 1390

<212> DNA

<213> 食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)

<400> 2

ggctttgggt gttacaaact ctcatggtgt gacgggcggt gtgtacaaga cccgggaacg 60

tattcaccgc ggcgtgctga tccgcgatta ctagcgattc cgacttcatg taggcgagtt 120

gcagcctaca atccgaactg agacgtactt taagagatta gctcaccctc gcgggttggc 180

aactcgttgt atacgccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat 240

ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tctcactaga gtgcccaact 300

aaatgctggc aactagtaat aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac 360

gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtcaccttg tccccgaagg gaacgctcca 420

tctctggagt tgtcaaggga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta 480

aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggtcc ccgtcaattc ctttgagttt caaccttgcg 540

gtcgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgcg gcacttaagg gcggaaaccc 600

tcaaacacct agcactcatc gtttacggtg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc 660

tacccacact ttcgagcctc aacgtcagtt acagtccaga aagccgcctt cgccactggt 720

gttcttccat atatctacgc atttcaccgc tacacatgga gttccacttt cctctactgc 780

actcaagtca tccagtttcc aaagcaattc ctcagttgag ctgagggctt tcacttcaga 840

cttaaataac cgtctgcgct cgctttacgc ccaataaatc cggataacgc ttggaacata 900

cgtattaccg cggctgctgg cacgtattta gccgttcctt tctggtaaga taccgtcaca 960

cattgaacag ttactctcaa tgtcattctt ctcttacaac agtgttttac gagccgaaac 1020

ccttcatcac acacgcggcg ttgctccatc aggctttcgc ccattgtgga agattcccta 1080

ctgctgcctc ccgtaggagt atgggccgtg tctcagtccc attgtggccg atcagtctct 1140

caactcggct atgcatcatc gtcttggtga gccattacct caccaactaa ctaatgcacc 1200

gcgggaccat ctcttagtga tagcagaacc atcttttaag tagcaaccat gcggttgcta 1260

ttgttatacg gtattagcat ctgtttccaa atgttatccc ctgctaagag gtaggtttcc 1320

cacgtgttac tcacccgttc gccactcttt gcaatgtcca tcgtcatatc tgagcaagct 1380

cttcaaatca 1390

<210> 3

<211> 1390

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 3

ttaccccacc gactttgggt gttacaaact ctcatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg 60

cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc cgacttcatg 120

taggcgagtt gcagcctaca atccgaactg agaatggctt taagagatta gcttactctc 180

gcgagttcgc aactcgttgt accatccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg 240

gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tctcaccaga 300

gtgcccaact taatgctggc aactgataat aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc 360

aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtatccatg tccccgaagg 420

gaacgtctaa tctcttagat ttgcatagta tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgtag 480

cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt 540

cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggaa tgcttaatgc gttagctgca gcactgaagg 600

gcggaaaccc tccaacactt agcattcatc gtttacggta tggactacca gggtatctaa 660

tcctgtttgc tacccatact ttcgagcctc agcgtcagtt acagaccaga cagccgcctt 720

cgccactggt gttcttccat atatctacgc atttcaccgc tacacatgga gttccactgt 780

cctcttctgc actcaagttt cccagtttcc gatgcacttc ttcggttgag ccgaaggctt 840

tcacatcaga cttaaaaaac cgcctgcgct cgctttacgc ccaataaatc cggacaacgc 900

ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttaaa 960

taccgtcaat acctgaacag ttactctcag atatgttctt ctttaacaac agagttttac 1020

gagccgaaac ccttcttcac tcacgcggcg ttgctccatc agactttcgt ccattgtgga 1080

agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg tctcagtccc aatgtggccg 1140

attaccctct caggtcggct acgtatcatt gccatggtga gccgttaccc caccatctag 1200

ctaatacgcc gcgggaccat ccaaaagtga tagccgaagc catctttcaa actcggacca 1260

tgcggtccaa gttgttatgc ggtattagca tctgtttcca ggtgttatcc cccgcttctg 1320

ggcaggtttc ccacgtgtta ctcaccagtt cgccactcac tcaaatgtaa atcatgatgc 1380

aagcaccaat 1390

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 4

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 5

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一种乳酸菌添加剂，其特征在于，所述乳酸菌添加剂组分包括：组分A和组分B，所述组分A和所述组分B容积比为(1～2):(1～2)；所述组分A选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分B选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分A和所述组分B不相同；所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15074；所述食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15075；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15073。

2.权利要求1所述的乳酸菌添加剂，其特征在于，所述乳酸菌添加剂组分还包括：组分C，所述组分A、所述组分B和所述组分C容积比为(1～2):(1～2):(1～2)；所述组分C选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分A、所述组分B和所述组分C不相同。

3.权利要求1所述的乳酸菌添加剂的应用，其特征在于，所述乳酸菌添加剂在制备牧草青贮添加剂中的应用。

4.权利要求1所述的乳酸菌添加剂的应用，特征在于，所述乳酸菌添加剂在制备狼尾草属牧草青贮添加剂中的应用。

5.权利要求1所述的乳酸菌添加剂的应用，其特征在于，将乳酸菌添加剂接种到MRS液体培养基中，得到菌株添加液；将所述菌株添加液均匀喷洒到牧草样品中，混合均匀，袋装青贮，抽真空，于27～37℃发酵60天。

6.一种权利要求1所述的乳酸菌添加剂的制备方法，其特征在于，包括：取所述乳酸菌添加剂组分混合既得；所述乳酸菌添加剂组分包括：组分A和组分B，所述组分A和所述组分B容积比为(1～2):(1～2)；所述组分A选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分B选自戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌和植物乳杆菌中的一种，所述组分A和所述组分B不相同；所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15074；所述食窦魏斯氏菌(Weissellacibaria)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15075；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15073。

7.权利要求6所述的乳酸菌添加剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述以提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物过程具体为：以上游引物：5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游引物：5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min后，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次，再72℃延长5min。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：将步骤4)得到的所述戊糖片球菌、所述食窦魏斯氏菌和所述植物乳杆菌通过生理生化测定、耐盐试验、不同温度试验、耐酸试验和糖发酵试验评价试验进行分析。

10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括还包括：将步骤4)得到的所述戊糖片球菌、所述食窦魏斯氏菌和所述植物乳杆菌进行16S rDNA序列分析。