JPH0746996B2

JPH0746996B2 - 抗生物質１０３８１ｂ、その製法、および該抗生物質を含有する動物成長促進用組成物

Info

Publication number: JPH0746996B2
Application number: JP62504099A
Authority: JP
Inventors: アーゴデリス，アレキサンダー・デイ; シリデイ，フランクリン・ビー; ラボード，アリス・エル; ツルースデル，スコット・イー
Original assignee: ジ・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1986-07-03
Filing date: 1987-06-25
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2010-05-24
Also published as: FI890009A0; HK165995A; ATE81341T1; WO1988000200A3; JPH0775587A; WO1988000200A2; EP0316313A1; AU605495B2; JPH07110226B2; FI890009A; JPH06233674A; JPH01503115A; EP0316313B1; DE3782169D1; KR880701727A; FI100337B; KR950001704B1; DE3782169T2; AU7641787A; JP2506568B2

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景発明の分野本発明は抗生物質10381bの新規な製法に関する。

該抗生物質はストレプトミセス（Streptomyces）属の新
種、ストレプトミセス・アルギネンシス（Streptomyces
arginensis）を用いる栄養培地の発酵により得られ
る。抗生物質10381bは主としてグラム陽性生物に抗する
少なくとも５種の抗菌剤の群によりなる。抗生物質1038
1bはスルホマイシン抗生物質群について報告されたのに
同様の物理特性を有するが、２種の群成分の同定はまだ
確立されていない。

情報の開示アルギノマイシン（抗生物質10381a₁）の製造および特
性は1986年12月３日出願の米国特許出願035678号に記載
されている。

ストレプトミセス・アルギネンシス（培地（10381）は
「耐性」スタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloco
ccus aureus）を包含するグラム陽性生物に対する抗生
物質として有用な溶媒可溶化合物の混合物を産生する。
これらの抗生物質は10381b抗生物質と命名された。本発
明は抗生物質10381bの産生、単離ならびに物理および生
物学的特性を記載する。

化学的には、抗生物質10381bは構造未知のペプチドであ
ると報告されているスルホマイシンに関連するようであ
る。ワイ・エガワら（Y.Egawa et al.）、「スルホマイ
シン、新しい硫黄含有抗生物質のシリーズ、I:単離、精
製および特性」、ジャーナル・オブ・アンティバイオテ
ィックス（J.Antibiotics）、22:12〜17（1969）参照。

抗生物質10381bとスルホマイシン間の関係を明確にする
努力の一部として、抗生物質10381bの産生用に開発され
た発酵条件下で、エス・アルギネンシス（S.arginensi
s）および２種のスルホマイシンを産生する培地の産生
様式を比較した。抗生物質10381bで用いた方法によって
分析した場合、実質的に同一であるように見える活性を
３種の培地が与える。しかし、エス・アルギネンシスの
みが殺菌活性（抗生物質10381a₁）／アルギノマイシ
ン）を与える。

ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces
viridochromogenes）（亜種スルホミチニ（sulfomycin
i）ATCC29776;UC8410）によって産生されたスルホマイ
シンは、抗生物質10381b複合体の単離に用いた手順によ
り単離した。得られた物質は赤外スペクトル（IR）、紫
外スペクトル（UV）、ペーパークロマトグラフィー、薄
層クロマトグラフィー（TLC）、高速液体クロマトグラ
フィー（HPLC）および抗菌スペクトルによって抗生物質
10381b複合体と比較した。抗生物質10381bは、同一では
ないにせよ、スルホマイシンに非常に似ているようであ
る。抗生物質10381b₂、主たる抗生物質、はスルホマイ
シン産生生物によって得られる主活性とほとんど同一で
ある。しかし、産生生物は明らかに異なる。エス・アル
ギネンシス（培地10381）はアルギノマイシンを産生す
るが、２種のスルホマイシン産生培地はアルギノマイシ
ンまたは他のいずれの殺菌活性も生じない。

米国特許第4007090号は微生物ストレプトミセス・シネ
ロビリディス（Streptomyces cineroviridis）からのス
ルホマイシンの調製についての新規な発酵方法を開示
し、特許請求している。

スルホマイシンＩは日本国特許第45−6880号に記載され
ている公知のグラム陽性抗生物質である（ダーウェント
・アブストラクト（Derwent Abstract）、受入番号1844
5R）。また、スルホマイシンIIおよびIIIは日本国特許
公告公報17599/1970におけるグラム陽性抗生物質として
文献に記載されている（ダーウェント・アブストラクト
（Derwent Abstract、受入番号42550R）。すべての３種
のスルホマイシン抗生物質は微生物ストレプトミセス・
ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogene
s）株の発酵によって調製された。

発明の要約本発明は特に：ブリンクマン（Brinkman）のシリカゲルを展開担体と
し、クロロホルム−メタノール（95:5（v/v））を展開
溶媒とし、エム・ルテウス・センズ（M.luteus sens）
についてのバイオオートグラフィーで検出する薄層クロ
マトグラフィーにより0.8、0.6、0.5、0.2および０のRf
値を有する抗生物質10381b; 好気性条件下、同化可能な炭素源および同化可能な窒素
源を含有する水性栄養培地を、ストレプトミセス・アル
ギネンシス（Streptomyces arginensis）株、NRRL15941
またはその突然変異体で発酵させることを特徴とする、
ブリンクマン（Brinkman）のシリカゲルを展開担体と
し、クロロホルム−メタノール（95:5（v/v））を展開
溶媒とし、エム・ルテウス・センズ（M.luteus sens）
についてのバイオオートグラフィーで検出する薄層クロ
マトグラフィーにより0.8、0.6、0.5、0.2および０のRf
値を有する抗生物質10381bの製法；およびブリンクマン（Brinkman）のシリカゲルを展開担体と
し、クロロホルム−メタノール（95:5（v/v））を展開
溶媒とし、エム・ルテウス・センズ（M.luteus sens）
についてのバイオオートグラフィーで検出する薄層クロ
マトグラフィーにより0.8、0.6、0.5、0.2および０のRf
値を有する抗生物質10381bおよび動物飼料用担体よりな
るブタおよび家禽の成長促進用組成物を提供するものである。

従って、本明細書中に記載する抗生物質は単独でまたは
他の抗菌剤と組合せて用いて種々の環境において多数の
微生物の増殖を防止しまたは減じることができる。例え
ば、該化合物は表面を消毒したりあるいは添加剤として
塗布して微生物の過剰増殖を防止することができる。

詳細な記載本発明の抗生物質はエス・アルギネンシス（S.arginens
is）の培養から得られる。該生物の分類法は以下に示
す。

微生物抗生物質10381bの産生に用いる微生物はストレプトミセ
ス（streptomyces）属の新種、ストレプトミセス・アル
ギネンシス・ディエツ（Streptomyces arginensis Diet
z）種、NRRL−15941である。該生物はジ・アップジョン
（The Upjohn）社によって行われた土壌スクリーニング
から単離され、ジ・アップジョン社のアルマ・ディエツ
（Alma Dietz）によって分類学的に特徴づけられた。該
生物の継代培養物はブダペスト条約の規定により1985年
３月８日にノーザン・リージョン・リサーチ・センター
（Northern Region Research Center）、ARS;合衆国農
務省；ペーオリア（Peoria）、イリノイ州、米国に永久
寄託した。その受託番号はNRRL−15941である。

色彩の特徴気生菌糸体は顕著に青色である；メラニン陽性。エクタ
クロム（Ektachrome）上の色彩パターンを第１表に掲げ
る。参照色彩特性を第２表に掲げる。培地はトレスナー
（Tresner）およびバッカス（Backus）の青色（Ｂ）の
色彩系列中に置くことができる。（アプライド・ミクロ
バイオロジー（Appl.Microbiology）、11:335〜338、19
63）顕微鏡的特徴胞子は若干曲がったあるいは先端またはその近くに単純
コイルを有する短い鎖状である。該胞子には短いとげが
備わっており、場合によっては微細な毛髪構造が備わっ
ている。該胞子は楕円状であって、寸法は1.2×0.8μで
ある。

炭素化合物上での増殖シャーリングおよびゴットリーブ（Shirling and Gottl
ieb）の合成培地（インターナショナル・ジャーナル・
オブ・システマティック・バクテリオロジー（Int.J.Sy
st.Bacteriol.）、16:313〜340、1966）をこの測定のた
めに用いた。増殖は陽性対照（Ｄ−グルコース）、Ｌ−
アラビノース、スクロース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マン
ニトール、Ｄ−フルクトース、およびラムノース上で良
好であり；およびイノシトールおよびラフィノース上で
相当であった。セルロースまたは炭素化合物を加えない
陰性対象（合成培地ISP−９）上では増殖しなかった。

全細胞の分析Ｌ−ジアミノピメリン酸が全細胞加水分解物中で検出さ
れた。

培養物の特徴一般的な培養物の特徴を第３表に示す。

温度ベネット（Bennett）の寒天、ツァペック（zapek）のス
クロース寒天、およびマルトース・トリプトン寒天上の
増殖は24℃〜32℃で良好であった。最適な増殖（良好な
青色空中増殖）がベネットの寒天およびマルトース−ト
リプトン寒天上で見られた。増殖は18℃で相当であり、
37℃で普通であった。ベネットの寒天およびツァペック
のスクロース寒天上で増殖型増殖が、およびマルトース
・トリプトン寒天上で空中増殖が45℃にて見られた。55
℃では増殖がなかった。

ストレプトミセス・アルギネンシスをエス・シネロビリ
ディス（S.cineroviridis）ATCC29776およびエス・ビリ
ドクロモゲネス・亜種・スルホミチニ（S.viridochromo
genes ss.sulfomycini）ATCC14920と比較した。生物分
類的比較の要約を第４表に示す。

抗生物質10381bの発酵および回収エス・アルギネンシスが深部好気的条件下、水性栄養培
地中で増殖するとき、抗生物質10381bが産生される。典
型的には、該微生物は炭素源および同化可能な窒素化合
物または蛋白質物質を含有する栄養培地中で増殖する。
好ましい炭素源はグルコース、赤砂糖、スクロース、グ
リセロール、澱粉、コーンスターチ、ラクトース、デキ
ストリン、糖蜜などを包含する。好ましい窒素源はコー
ン浸出液、酵母、ミルク固形物を含む自己分解した醸造
酵母、大豆ミール、綿実ミール、コーンミール、ミルク
固形物、カゼインのパンクレアチン消化物、ディスティ
ラーズソリッド、動物のペプトン液、肉片および骨片な
どを包含する。有利には、これらの炭素源および窒素源
の組合せを用いることができる。常水および未精製の成
分が培地成分として用いられるので、微量金属、例えば
亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト、鉄などは発
酵培地に加える必要がない。

抗生物質10381bの産生は該微生物の満足できる増殖に導
くいずれの温度にても、好ましくは約20°と32℃間にて
誘導できる。通常、該化合物の最適な産生は約２ないし
10日間のうちに得られる。通常、培地は発酵の間、弱塩
基性（pH7.4〜9.0）に保持する。最終のpHは一つには緩
衝液の存在に依存し、もしあれば、一つには、滅菌に先
立ち有利には約7.2に調整される培地の初期pHに依存す
る。

増殖を大きな容器およびタンク中で行う場合、接種用に
は該微生物の胞子型よりはむしろ増殖型を用いて該新し
い化合物の産生における顕著な遅延およびそれに伴う装
置の非効率的な利用を回避するのが好ましい。従って栄
養ブロス培地を土壌もしくは斜面培養からの一部で接種
することによって、このブロス培地中で増殖型接種物を
産生するのが望ましい。かくして、若い増殖型接種物が
確保されると、それを無菌的に大きな容器またはタンク
に移す。その中で増殖型接種物が産生される培地は、該
微生物の適当な増殖が得られるようなものである限り、
該新しい化合物の産生に用いるものと同一または異なる
ものであってよい。

抗生物質10381bは発酵ブロスから単離し精製する。以下
の実施例により詳しく記載する如く、メタノールでの抽
出によって発酵ブロスの菌糸体ケーキから抗生物質1038
1bを単離する。小規模の発酵（振盪フラスコ）において
は、メタノール抽出物を濃縮乾固し、向流二重分配法
（CDCD）単独によって、またはひき続いてのシリカゲル
クロマトグラフィーによって残渣を精製する。大規模の
発酵（5000lファーメンター）から得られたケーキの菌
糸体抽出物は濃縮して水性溶液とし、次いでこれを酢酸
エチルで抽出する。抗生物質10381bを含有する酢酸エチ
ル抽出物を濃縮乾固する。得られた油状残渣をエーテル
でトリチュレートして抗生物質10381bのアモルファス状
混合物を得、これを高速液体クロマトグラフィー（HPL
C）によってさらに精製する。

10381複合体の主要成分を10381b₂および10381b₃と命名
した。これらを２種の化合物のうち抗生物質10381b₂を
生物学的および化学的特性測定が可能となるのに十分な
量および純度で単離した。

抗生物質10381b₂はグラム陽性菌および嫌気菌（クロス
トリジウム・ペルフリゲンス（Clostridium perfrigen
s）、バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragi
lis））に対して活性である。それは他の抗生物質に対
して耐性のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylo
coccus aureus）（スタフィロコッカス・アウレウスUC3
665、スタフィロコッカス・アウレウスUC6685）に対し
ても活性である（UCはジ・アップジョン社の登録商標で
ある）。従って、本発明の化合物はヒトを包含する哺乳
動物において細菌感染を治療するのに有効である。

本発明の抗生物質10381bの各種組成物は適量の抗生物質
を含有する錠剤、カプセル、丸剤、粉末、顆粒剤、滅菌
非経口溶液もしくは懸濁液、点眼剤、経口溶液もしくは
懸濁液、油中水型エマルジョンの如き単位投与形態でヒ
トおよび動物への投与に供される。

経口投与用には、固体または流体いずれかの単位投与形
態が調製できる。錠剤の如き固体組成物を調製するに
は、抗生物質をタルク、ステアリン酸マグネシウム、リ
ン酸二カルシウム、マグネシウムアルミニウムシリケー
ト、硫酸カルシウム、澱粉、ラクトース、アカシア、メ
チルセルロース、および医薬希釈剤または担体として機
能的に同様の物質の如き通常成分と混合する。カプセル
は抗生物質を不活性な医薬希釈剤と混合し次いで該混合
物を適当なサイズのハードゼラチンカプセルに充填する
ことによって調製される。ソフトゼラチンカプセルは抗
生物質のスラリーを許容される植物油、軽質液状ワセリ
ンまたは他の不活性油と共に機械カプセル化することに
より調製される。

シロップ、エリキシル剤、および懸濁液の如き経口投与
用の流体単位投与形態が調製できる。水溶性形態を砂
糖、芳香性フレーバー剤および保存剤と一緒に水性ビヒ
クル中に溶解してシロップを得ることができる。エリキ
シル剤は芳香性フレーバー剤と一緒に砂糖およびサッカ
リンの如き適当な甘味料と共にヒドロアルコール性（エ
タノール）ビヒクルを用いることにより調製される。

懸濁液はアカシア、トラガカント、メチルセルロースな
どの如き懸濁剤の補助作用により水性ビヒクルで調製で
きる。

非経口用投与には、抗生物質および水が好ましい滅菌ビ
ヒクルを用いて流体単位投与形態が調製される。用いる
ビヒクルおよび濃度に応じて、抗生物質をビヒクル中に
懸濁できるかまたは溶解できる。溶液の調製において、
抗生物質を注射用水に溶解し、次いで滅菌濾過した後、
適当なバイアルまたはアンプル中に充填し、次いでシー
ルすることができる。有利には、局所麻酔剤、保存剤お
よび緩衝剤の如きアジュバントを該ビヒクル中に溶解で
きる。安定性を増大させるためには、バイアルに充填し
た後、該組成物を凍結し、次いで真空下で水分を除去で
きる。次いで凍結乾燥粉末をバイアル中にシールし、次
いで注射用水の付属バイアルを供して使用に先立って該
液体を復元する。非経口用懸濁液は抗生物質を該ビヒク
ル中に溶解させる代わりに懸濁させかつ滅菌が濾過によ
って達成できない以外は実質的に同一の方法で調製でき
る。抗生物質は滅菌ビヒクル中に懸濁する前にエチレン
オキシドに暴露することにより滅菌できる。有利には、
表面活性剤または湿潤剤を組成物中に包含させて化合物
の均一な分布を容易とする。

さらに、直腸座薬を用いて抗生物質を投与できる。この
投与形態は小さな子供または衰弱した人の場合のよう
に、哺乳動物が経口でまたは吹入によるような他の投与
形態によって便宜には治療できない場合に特に注目され
るものである。抗生物質は当該分野で公知の方法によっ
ていずれの公知座薬ベース中に処方することもできる。
かかるベースの例には融点または溶液速度を調節する他
の適合物質と共にカカオバター、ポリエチレングリコー
ル（カーボワックス）、ポリエチレンソルビタン・１ス
テアリン酸塩およびこれらの混合物が包含される。これ
らの直腸座薬は約１ないし2.5gの重さとすることができ
る。

本明細書中にて用いる「単位投与形態」なる語はヒトの
患者および動物用の単位投与量として適当な物理的に区
分された単位を言い、各単位は必要な医薬希釈剤、担体
またはビヒクルと協同して所望の医薬効果を生じるよう
に計算された所定量の活性物質を含有する。本発明の新
規な単位投与形態についての仕様は本明細書で詳しく開
示する如く(a)活性物質の独自の特徴および達成される
べき特定の効果および(b)ヒトおよび動物で用いる活性
物質を調合する技術に固有の制限によって指示され、か
つ直接にそれらに依存し、これらは本発明の特徴であ
る。本発明に関する適当な単位投与形態の例には、錠
剤、カプセル、丸剤、座薬、粉末パケット、ウェハー、
顆粒剤、カシェ剤、茶さじ１杯分、食さじ１杯分、滴び
ん１杯分、アンプル、バイアル、計量放出されるエアロ
ゾル、前記のいずれかの分離集合体、および本明細書中
に記載したような他の形態がある。

有効量の抗生物質を治療で用いる。治療用の抗生物質の
投与量は当業者によく知られた多くの要因に依存する。
それらは、たとえば投与経路および抗生物質の効能を包
含する。非経口的にまたは本発明の組成物で投与される
単一投与量中の抗生物質約１〜2gのヒトに対する投与法
が細菌感染を治療するのに有効である。さらに好ましく
は、単一投与量は抗生物質約2gである。経口および直腸
投与量は単一投与量中に約１〜2gである。さらに好まし
くは、単一投与量は抗生物質約2gである。

本発明の抗生物質はブロイラーのひな、ブタおよびウシ
の如き肉生産動物における発育を促進するのに用いるこ
ともできる。例えば、該抗生物質をブロイラーひなの飼
料（NRC認可ダイエット）と混合して約11ppm（すなわち
11mg/kg）の投与量濃度とした。２週間にわたり、各ひ
な（１日令）に１日当たり約20gの飼料を自由に摂取さ
せた。従って、各ひなは１日当たり抗生物質約220mcgを
摂取し、該抗生物質の平均発育指標は３以上であって０
よりも有意に大きいと計算された。（平均発育指標は対
照（薬剤の添加なくして飼料を与えたひな）以上の発育
における改善度を測定したものである。）ブタにおいて
発育を促進する本発明の抗生物質の使用例は後記する。

肉生産動物において発育を促進する本発明の抗生物質の
使用についての前記の量および手順の変法は当業者に公
知であろう。ブロイラーのひなについては、好ましい抗
生物質10381bの濃度は約0.5〜約11mg/飼料kgである。ブ
タについては好ましい抗生物質10381bの濃度は約10〜約
55mg/飼料kgである。

好ましい具体例の記載当業者ならばさらに工夫をこらすことなくこれまでの記
載を用いて本発明を最大限に実施することができると考
える。以下の詳細な実施例は種々の化合物を調製しおよ
び／または本発明の種々の方法を実行する仕方を記載す
るものであり、それは単に例示的なものであって前記の
開示を何ら限定するものではないと解釈されるべきであ
る。当業者ならば反応体についての、ならびに反応条件
および反応技術についての方法から適当な変法を即座に
認識するであろう。

以下の実施例において、抗生物質の産生および精製はア
ッセイ生物としてミクロコッカス・ルテウス（Micrococ
cus luteus）およびストレプトコッカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes）を用いる微生物学ディスク
・プレート・アッセイ法により測定した。クロロホルム
・メタノール（95:5または100:10v/v）を移動相として
用いてセルロース（ブリンクマン・セル（Brinkman Cel
l）300）;pH7.0、0.1Mリン酸緩衝液またはシリカゲル
（ブリンクマンのポリグラム（Polygram）SIL−Ｎ−H
R）プレート上で薄層クロマトグラフィーを行う。バイ
オオートグラフィーをエム・ルテウス（M.luteus）また
はエス・ピオゲネス（S.pyogenes）について行う。

実施例１ A.発酵ストレプトミセス・アルギネンシス、NRRL−15941の土
壌株をヒックネイ−トレスナー（Hickney−Tresner）寒
天上で培養し、４℃で貯蔵する。試料を水中でホモジネ
ートし、再びヒックネイ−トレスナー寒天上に置く。28
℃の７日間のインキュベーションの後、増殖は種培養接
種物用として十分である。

種培養体は常水１当たり：廃糖蜜5.8g、ディフコ（Di
fco）ペプトン10g、ディフコ酵母エキス4g、デキストリ
ン4g、Ｌ−アスパラギン0.2g、COCl₂・6H₂Olmgを含有す
る種培地（SSM.1）中で増殖させ；該培地は滅菌前にKOH
でpH7.2に調製する。該SSM.1を100ml/フラスコで（２個
のミルクフィルターで蓋をした）無地の500ml広口エル
レンマイヤーフラスコ中に分注し、121℃、15psiにて30
分間オートクレーブ処理する。フラスコをホモジネート
した寒天プラグで0.5〜１プラグ／フラスコの割合で接
種し、28℃にて３日間振盪する（250rpm、2.5"ストロー
ク）。収集時のpHは8.3である。

常水１当たり：大豆ミール20g、醸造酵母2g、セレロ
ース20g（オートクレーブ処理後、50％溶液として加え
る）を含有する培地中で種培養物を発酵させる；該培地
を滅菌前にpH7.2に調製する。該培地を分注し、滅菌
し、次いで前記の如く振盪する。接種率は5ml/種培地10
0mlである。発酵条件は28℃における３日間である。

B.振盪フラスコまたは10lタンクの発酵からの抗生物質1
0381bの単離要すれば濾過助剤を用いて発酵物を濾過し、発酵物容量
の1/10の水で固形分ケーキを洗浄する。清澄な濾液およ
び洗液を合する。

該ケーキをメタノール1.5lづつで４回トリチュレートす
る。メタノール抽出物についてアッセイを行う（第５
表）。活性画分を合し、濃縮乾固して調製物Ａを得、こ
れを抗生物質10381bの単離および精製用の出発物質とし
て用いる。

実施例２向流二重分配法およびシリカゲルクロマトグ
ラフィーによる調製物Ａからの抗生物質10381bの単離 A.向流二重分配法：調製物Ａの２ロット分を合し（26.7
gおよび18.6g）、溶媒系シクロヘキサン−酢酸エチル−
95％エタノール−水（1:1:1:1v/v）の両相（各相125m
l）に溶解する。向流二重分配装置の上側（下層が該機
械に入る側）の試験管20−25に該溶液を添加する。以下
の移行を行う：１）25回の移行（画分を収集せず）；２）45回の移行（上相を収集する）；および３）100回の移行（両相を収集する）。

バイオ活性測定により、および抗生物質−感受性微生物
についての展開したTLCプレート（バイオ−TLC）のバイ
オオートグラフィーにより画分を分析する。以下のプー
ルを作製する。各プールにおける溶液を濃縮して水性と
し、凍結乾燥して以下の調製物を得る：プールI:（画分：下側コレクター５〜25）調製物84.1
（28.48g）；プールII:（画分：下側コレクター25〜79）調製物84.2
（1.85g）；およびプールIII:（画分：下側コレクター80〜100;下側機械50
〜0;上側機械１〜20）調製物84.3（0.25g）。

薄層クロマトグラフィー分析（ブリンクマン（Brinkma
n）のシリカゲル；クロロホルム−メタノール95:5（v/
v）；エム・ルテウス・センズ（M.luteus sens）につい
てのバイオオートグラフィー）は以下のRf値を与えた:
0.8（10381b₅）;0.6（10381b₄）;0.5（10381b₃）;0.2
（10381b₂）；および０（10381b₁）。

エム・ルテウス・センズ（M.luteus sens）に対する調
製物の能力値（Bu/mg）は次のとおりである:2（調製物8
4.1）;64（調製物84.2）；および256（調製物84.3）。

B.シリカゲルクロマトグラフィークロロホルム−メタノール（97:3v/v）中のシリカゲル6
00gよりカラムを調製する。前記の如くして得た調製物8
4.2および84.3を合し、無水メタノール31mlでトリチュ
レートする。濾過により不溶性のバイオ活性物質を分離
する（600mg）。濾液を濾過助剤60gおよびクロロホルム
970mlと混合する。混合物を濃縮して乾燥粉末とする。
この残渣を該カラムの頂部に加え、これを以下の如く溶
出する。20mlずつの画分を収集する。

１）クロロホルム−メタノール（97:3v/v）：画分１〜8
37; ２）クロロホルム−メタノール（94:6v/v）：画分838〜
1285;および３）クロロホルム−メタノール（90:10v/v）：画分1286
〜1600。

バイオ活性およびバイオ−TLCによって画分を分析す
る。以下のプールを作製する。各プールを濃縮乾固して
以下の調製物を得る：プールI:（画分230〜299）調製物106.1（30mg）；プールII:（画分300〜500）調製物106.2（40mg）；プールIII:（画分855〜930）調製物106.3（40mg）およ
びプールIV:（画分931〜1000）調製物106.4（40mg）。

薄層クロマトグラフィー分析（シリカゲル；クロロホル
ム−メタノール（95:5）；エム・ルテウス（M.luteus）
についてのバイオオートグラフィー）は以下のRf値を与
える:0.5（10381b₃）および0.2（10381b₂）。

エス・ピオゲネス（S.pyogenes）に対する調製物の能力
値（Bu/mg）は次のとおりである:128（調製物106.1）;1
00（調製物106.2）；＞1024（調製物106.3）；および38
0（調製物106.4）。エム・ルテウス・センズ（M.luteus
sens）に対する調製物の能力値（Bu/mg）は次のとおり
である:96（調製物106.1）;64（調製物106.2）;384（調
製物106.3）；および（調製物106.4）。

実施例３向流分配法（溶媒：シクロヘキサン−酢酸エ
チル−アセトン−水（1:2:2:1v/v））による調製物Ａの
精製調製物Ａの３ロットを合し（20.5g、21.1gおよび20.8
g）、前記の系の両相（各相155ml）に溶解する。向流二
重分配装置の上側（下相が機械に入る側）の試験管18〜
25に該溶液を添加する。以下の移行を行う：１）68回の移行（上相を収集する）；および２）100回の移行（両相を収集する）。

バイオ活性測定およびバイオ−TLCによって分配物を分
析する。以下のプールを作製する。各プールを濃縮して
水性とし、凍結乾燥して以下の調製物を得る：プールI:（画分：下側コレクター１〜30）調製物91.1
（34.8g）；プールII:（画分：下側機械30〜0;上側機械１〜30）調
製物91.2（240mg）；プールIII:（画分：上側機械35〜50;上側コレクター170
〜80）調製物91.3（300mg）；およびプールIV:（画分：上側コレクター79〜27）調製物91.
4。

薄層クロマトグラフィー分析（シリカゲル；クロロホル
ム−メタノール95:5;エム・ルテウス（M.luteus）につ
いてのバイオオートグラフィー）は次のRf値を与える:
0.2（10381b₂）。前記TLCは、調製物91.3が主として103
81b₂および痕跡量の10381b₁を含有し、約3000Bu/mgの対
エス・ピオゲネス（S.pyogenes）能力を有することを示
す。

実施例４ 5000l発酵からの抗生物質10381bの単離 A.セラトム（CELATOM）FW40を濾過助剤として用いて全
発酵物（収集pH6.9）を濾過する。ケーキを水5000lで洗
浄し、次いで各回メタノール600lで４回トリチュレート
する。４回のメタノール抽出物をプールし、濃縮して容
量90lとする。次いで等容量の酢酸エチルで水性濃縮物
（pH7.0）を３回抽出する。３回の酢酸エチル抽出物を
合し、濃縮して容量15.5l（アッセイ：約1000Bu/ml、エ
ス・ピオゲネス（S.pyogenes）として調製物Ｂを得る。

調製物Ｂをスケリソルブ（Skellysolve）B60lと混合す
る。混合物を室温にて20時間放置する。濾過助剤を含有
するフィルター上での濾過によって不溶性物質（抗生物
質10381b）を単離する。濾液を捨てる。抗生物質10381b
を含有するケーキをスケリソルブ（Skellysolve）Ｂで
洗浄し、次いでメタノール4lずつで４回スラリー化す
る。４回のメタノール抽出物を合し、溶液を濃縮乾固し
て調製物Ｃを得る。

エーテル（約2l）で調製物Ｃをトリチュレートする。濾
過によって不溶性物質を単離し、乾燥し（47.3g）、ア
ッセイを行い約2000Bu/mgを得る。

B.高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（装置：ウォー
ターズ（Waters）プレプ（PreP）500A;支持体：ウォー
ターズ（Waters）Ｃ−18逆相シリカ充填カラム；移動
相：アセトニトリル−水（40:60v/v）；および液速:150
ml/分）による調製物Ｃの精製前記の如くして得た調製物C1.0gをアセトニトリル100ml
および水150mlと共に２時間撹拌する。濾過によって不
溶性物質を分離する（258mg）。濾液をカラム中に注入
する。UVディテクターによりクロマトグラフィーを追跡
する。さらに、選択した画分（各150ml）をバイオ活性
についてテストしTLCにより分析する（シリカゲル；ク
ロロホルム−メタノール100:10v/v;ミクロコッカス・ル
テウス（Micrococcus luteus）についてバイオオートグ
ラフィー）。10381b₂のみを含有する画分63〜96を合
し、濃縮して水性溶液1600mlとする。この溶液を各回酢
酸エチル600mlずつで３回抽出する。酢酸エチル抽出物
を合し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮乾固して生成
物129mgを得る。該生成物をジメチルスルホキシド2.5ml
およびメタノール2.5mlに溶解する。次いでこの溶液を
エーテル200mlと混合する。沈殿した物質61mgを特性測
定する。結果は後記にて報告する。

C.物理特性:10381b₂の物理特性は第６表に示す。10381b
₂の抗菌活性のスペクトルは第７表に示す。

実施例５ブタにおいて発育を促進させるための抗生物
質10381bの使用設備：加熱および換気装置が所望の養殖環境を維持する
のに適当な設備中で各試行を行った。各小屋には自動給
餌器および乳首タイプの飲料供給器を備え付けた。排泄
物除去用の、小屋の一端の流水溝上のエキスパンデッド
メタル薄板0.74m²以外は、各小屋の床は固体コンクリー
トである。

動物：同数の健康な雌および去勢雄のハンプシャー×ヨ
ークシャー交雑の５〜６週令離乳ブタを各試行で用い
た。実験単位は４頭のブタ、雌２頭および雄２頭の小屋
よりなるものであった。各試行において、体重群により
小屋のブロックにブタを割り当て、ブロック内の個々の
小屋にランダムに割り当てた（両性につき同一手順）。
小屋のブロックは養殖ができる位置にランダムに割り当
て、処置はブロック内のブタの小屋にランダムに割り当
てた。

食物および処置：約18％の生蛋白質を含むコーン大豆ミ
ールベースの食物が処置を施すために薬剤を添加する基
本食物であった。

適当量の10381bを大豆ミール飼料中に予め混合してプレ
ミックス1kg当たり44gの濃度とした。次いで該プレミッ
クスを該食物と混合して食物1kg当たり薬剤55mg活性の
最終試料レベルを得た。

データの解析：注目する変数は平均日体重増加（ADG）
で表わした体重増加、消費飼料を体重増加で除して表わ
した飼料効率（F/G）、および各々が等しい体重である
場合のADGおよびF/Gにおけるブロック内改善値を合計す
ることによって計算した発育指標（GI）である。

各変数についての薬剤からの応答を対照に対する各体重
ブロック内で計算した。例えば：ｔ−テストを用いて偶然差異の確率を評価した。試行お
よび試行内ブロックに関するモデルを用いて変動の解析
から変動の評価を得た。

ブタ実行ふるい分け法により、薬剤を含有しないかまた
は55mg/kgで10381bを含有する食料を256頭のヨークシャ
ー×ハンプシャー交雑ブタに21日間摂取させた。薬材処
置は８ケ月間にわたって行った４回の試行において試行
当たり８のブロック（小屋当たり４頭のブタ）において
表わした。ブロック内比較から発育指標（GI）を計算し
て化合物についての体重増加および飼料効率における改
善を見積もった。このふるい分けにパスするには、化合
物は少なくとも7.5のGIを有さなければならず、Ｐ＜0.1
0において有意に０から異なっていなければならない。

10381bはＰ＝0.004でGIが29.52に等しく許容された。

第８表より、10381bについての発育指標は正であって7.
5の最小基準を越えていることがわかる。第９表より、
この応答が偶然に帰される確率は0.10以下であることが
わかる。

試験管中の培地上の増殖¹は28℃における７日間のイン
キュベーションの後に写真にとった。色彩はNBSの色票
との比較によって決定した（ケリー、ケイ・エル、およ
びディー・ビー、ジュド（Kelley、K.L.、and D.B.Jud
d.）。1976年。カラー。ユニヴァーサル、ラングイッジ
・アンド・ディクショナリー・オブ・ネイムズ。NBSス
ピシィフィケイション・パブリケイション440.スーパー
インテンデント・オブ・ドキュメンツ、U.S.ガバンメン
ト・プリンティング・オフィス・ワシントン、ディーシ
ー20942;およびSRM2016。1958年ISCC−NBCセントロイド
・カラー・チャーツ。オフィス・オブ・スタンダード・
レファレンス・マティアリアル、ルームB311、ケミスト
リー・ビルディング、ナショナル・ブュロー・オブ・ス
タンダーズ、ワシントン、ディーシー20234）。² ディエツ、エイおよびサイエル、ディー・ダブリュー
（Dietz、A.and Thayer、D.W.）（編）1980年。SIMスペ
シャル・パブリケイションNo.6。ソサイエイィ・フォー
・インダストリアル・マイクロバイオロジー、アーリン
トン、バージニア州。

¹色彩の決定は28℃で14日間インキュベートしたプレー
ト上の増殖体について行った。色彩はNBSの色票と比較
することによって決定した。（ケーリー、ケイ・エルお
よびディー・ビー、ジュド（Kelly、K.L.、and D.B.Jud
d.）、1976年、カラー、ユニバーサル、ラングイッジ・
アンド・ディクショナリ・オブ・ネイムズ。NBSスピシ
フィケイション・パブリケイション440。スーパーイン
テンデント・オブ・ドキュメンツ、U.S.ガバンメント・
プリンティング・オフィス・ワシントン、ディーシー20
942;およびSRM2106.1958.ISCC−NBCセントロイド・カラ
ー・チャーツ。オフィス・オブ・スタンダード・レファ
レンス・マティアリアル、ルームB311、ケミストリー・
ビルディング、ナショナル・ビューロー、オブ・スタン
ダーズ、ワシントン、ディーシー20234） ¹ディエッツ、エイおよびサイヤー（Dietz、A.and Thay
er）、ディー・ダブリュー（D.W.）（編）1980年。エス
アイエム・スペシャル・パブリケーション（SIM Specia
l Publ.）No.6。ソサイエティ・フォー・インダストリ
アル・ミクロバイオロジー（Soc.for Ind.Microbio
l.）、アーリントン（Arlington）、バージニア州。² 試験管内の培地上の増殖は28℃における７日間のイン
キュベーションの後、写真をとった。色彩はNBS色票と
比較して決定した。（ケーリー、ケイ、エル、およびデ
ィー・ビー・ジュド（Kelly、K.L.、and D.B.Judd.）。
1976年。カラー。ユニバーサル、ラングイッジ・アンド
・ディクショナリ・オブ・ネイムズ。NBSスピシフィケ
イション・パプリケーション440。スーパーインテンデ
ント・オブ・ドキュメンツ、U.S.ガバンメント・プリン
ティング・オフィス・ワシントン、ディーシー20942;お
よびSRM2106.1958.ISCC−NBCセントロイド・カラー・チ
ャーツ。オフィス・オブ・スタンダード・レファレンス
・マティアリアル、ルームB311、ケミストリー・ビルデ
ィング、ナショナル・ビューロー・オブ・スタンダー
ズ、ワシントン、ディーシー20234） ¹ディエッツ、エイ・アンド・サイヤー（Dietz、A.and
Thayer）、ディー・ダブリュー（D.W.）（編）、1980。
エスアイエム・スペシャル・パプリケーション（SIM Sp
ecial Publ.）No.6。ソサイエティ・フォー・インダス
トリアル・ミクロバイオロジー（Soc.for Ind,Microbio
l.）、アーリントン（Arlington）、バージニア州。

第６表抗生物質10381b₂の特性測定外観：アモルファス状着色固体溶解性：ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
および低級アルコールに溶解。酢酸エチル、アセトンお
よびアセトニトリルにあまり溶解せず。エーテルおよび
飽和炭化水素溶媒に不溶。

元素分析値データ（％）:C,48.33;H,4.58;N,15.14;S,5.
16;O（引算により、26.79）実験式：元素分析値よりC_25.5H_28.5〜₂₉N_6.5O_10.5Sの式
が導かれる。分子が２個の硫黄原子を含有すると仮定す
ると、10381b₂についての分子式はC₅₁H₅₇N₁₃O₂₁S₂（分
子量1225）となる。

融点：約195℃にて、該物質はガス発生を伴って分解し
始める。

紫外スペクトル（λmax、メタノール）:243、316 赤外スペクトル（cm¹、鉱油マル）:2965.5、2851.6、14
65.7、1495.6、1377.0、1663.5、1526.5、1633.6、333
7.7、1368.3、1341.3、721.2、1197.6、1082.0、1307.
6、1021.2、1039.5、749.2、1291.2、1249.7、1122.5、
1102.2、889.0、1147.5、997.0 抗菌スペクトル：抗生物質10381b₂は主としてグラム陽
性菌および嫌気菌に対して活性である（クロストリジウ
ム・ペリフリゲンス（Clostridium perfrigens）；バク
テロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis））。
それは他の抗生物質に対して耐性のスタフィロコッカス
・アウレウス（Staphylococcus aureus）（スタフィロ
コッカス・アウレウスUC3665;スタフィロコッカス・ア
ウレウスUC6685）に対しても活性である。

抗菌in vitroテスト：グラム陽性およびグラム陰性菌に
対する抗生物質10381b₂のin vitroテスト結果は第７表
に示す。

ペーパークロマトグラフィー:Rf（溶媒系）;0.5〜0.9
（ストリークをひく）（１−ブタノール／水84/16）;0.
5〜.09（ストリークをひく）（１−ブタノール／水84/1
6＋0.25％ｐ−トルエンスルホン酸）;0.9（１−ブタノ
ール／酢酸／水/2/1/1）;0.9（１−ブタノール／水84/1
6＋２％ピペリジン）;0.1〜0.5（ストリークをひく）
（１−ブタノール／水4/96）;0.1〜0.5（ストリークを
ひく）（１−ブタノール／水4/96＋0.25％ｐ−トルエン
スルホン酸）;0.1〜0.5Mリン酸カリウムpH7.4）;0.1〜
0.3（水／メチルイソブチルケトン／アンモニウム200/2
0/1）;0.9（トルエン／メタノール／水1/1/2）;0.9（１
−ブタノール／水84/16＋2.0％ｐ−トルエンスルホン
酸）;0.9（メタノール/15％Nacl(H₂O)4/1）抗生物質10381b₂のin vivoテスト：抗生物質10381b₂をストレプトコッカス・ピオゲネス（S
treptococcus pyogenes）およびスタフィロコッカス・
アウレウス（Staphylococcus aureus）誘発マウス乳腺
炎に対しin vivoテストを行った。皮下投与した場合、
該抗生物質はエス・ピオゲネス感染マウスを保護し、CD
₅₀は1.25mg/kgであった。それはエス・アウレウス誘発
マウス乳腺炎テストにおいて活性であり、PD₅₀は1.8
（対乳腺炎）および6.2（対エス・アウレウス）mg/kgで
あった。

発育促進についての抗生物質10381b₂複合体のテスト：ブロイラーにおいて抗生物質10381b₂複合体を発育促進
および／または飼料変換指示についてテストした。抗生
物質10381bの平均発育指標（体重増加/3＋飼料変換）は
３以上であって有意に（Ｐ≦0.20）０より大であった。
かくして第１次ふるい分けの基準により、抗生物質1038
1bはパスした。（平均発育指標は対照（薬剤添加なくし
て摂食させたひよこ）に対する発育の改善を測定するも
のである。）第９表統計量およびｔ−テスト０〜21日 10381b 平均発育指標 29.52 ｔ 6.62 確率平均は＜＝0.0 0.0004 変動成分：試行 −12.435ブロック（試行） 734.783 合計 734.783

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者ツルースデル，スコット・イーアメリカ合衆国ミシガン州49008、カラマズー、ウィットコウム・ストリート715- デイ番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも５種の抗菌剤の混合物よりなる
抗生物質10381bであって、該抗生物質10381bは、ブリン
クマン（Brinkman）のシリカゲルを展開担体とし、クロ
ロホルム−メタノール（95:5（v/v））を展開溶媒と
し、エム・ルテウス・センズ（M.luteus sens）につい
てのバイオオートグラフィーで検出する薄層クロマトグ
ラフィーにより0.8、0.6、0.5、0.2および０のRf値を有
し、該少なくとも５種の抗菌剤のうち１の抗菌剤である
抗生物質10381b₂が以下の物理化学的特性を有する該抗
生物質10381b。ブリンクマン（Brinkman）のシリカゲルを展開担体とす
る前記と同条件の薄層クロマトグラフィーによるRf値:
0.2 元素分析値データ（％）:C,48.33;H,4.58;N,15.14;S,5.
16;O,26.79 赤外スペクトル（cm^-1、鉱油マル）:2965.5、2851.6、1
465.7、1495.6、1377.0、1663.5、1526.5、1633.6、 3337.7、1368.3、1341.3、721.2、1197.6、 1082.0、1307.6、1021.2、1039.5、749.2、 1291.2、1249.7、1122.5、1102.2、889.0、 1147.5、997.0
【請求項２】好気性条件下、同化可能な炭素源および同
化可能な窒素源を含有する水性栄養培地を、ストレプト
ミセス・アルギネンシス（Streptomyces arginensis）
株、NRRL15941またはその突然変異体で発酵させること
を特徴とする抗生物質10381bの製法であって、該抗生物
質10381bは、少なくとも５種の抗菌剤の混合物よりな
り、該抗生物質10381bは、ブリンクマン（Brinkman）の
シリカゲルを展開担体とし、クロロホルム−メタノール
（95:5（v/v））を展開溶媒とし、エム・ルテウス・セ
ンズ（M.luteus sens）についてのバイオオートグラフ
ィーで検出する薄層クロマトグラフィーにより0.8、0.
6、0.5、0.2および０のRf値を有し、該少なくとも５種
の抗菌剤のうち１の抗菌剤である抗生物質10381b₂が以
下の物理化学的特性を有する該抗生物質10831bの製法。ブリンクマン（Brinkman）のシリカゲルを展開担体とす
る前記と同条件の薄層クロマトグラフィーによるRf値:
0.2 元素分析値データ（％）:C,48.33;H,4.58;N,15.14;S,5.
16;O,26.79 赤外スペクトル（cm^-1、鉱油マル）:2965.5、2851.6、1
465.7、1495.6、1377.0、1663.5、1526.5、1633.6、 3337.7、1368.3、1341.3、721.2、1197.6、 1082.0、1307.6、1021.2、1039.5、749.2、 1291.2、1249.7、1122.5、1102.2、889.0、 1147.5、997.0
【請求項３】抗生物質10381bおよび動物飼料用担体より
なるブタおよび家禽の成長促進用組成物であって、該抗
生物質10381bは少なくとも５種の抗菌剤の混合物よりな
り、該抗生物質10381bは、ブリンクマン（Brinkman）の
シリカゲルを展開担体とし、クロロホルム−メタノール
（95:5（v/v））を展開溶媒とし、エム・ルテウス・セ
ンズ（M.luteus sens）についてのバイオオートグラフ
ィーで検出する薄層クロマトグラフィーにより0.8、0.
6、0.5、0.2および０のRf値を有し、該少なくとも５種
の抗菌剤のうちの１の抗菌剤である抗生物質10381b₂が
以下の物理化学的特性を有する該ブタおよび家禽の成長
促進用組成物。ブリンクマン（Brinkman）のシリカゲルを展開担体とす
る前記と同条件の薄層クロマトグラフィーによるRf値:
0.2 元素分析値データ（％）:C,48.33;H,4.58;N,15.14;S,5.
16;O,26.79 赤外スペクトル（cm^-1、鉱油マル）:2965.5、2851.6、1
465.7、1495.6、1377.0、1663.5、1526.5、1633.6、 3337.7、1368.3、1341.3、721.2、1197.6、 1082.0、1307.6、1021.2、1039.5、749.2、 1291.2、1249.7、1122.5、1102.2、889.0、 1147.5、997.0