DE2812343A1

DE2812343A1 - Immunostimulatorischer wirkstoff, verfahren zu seiner gewinnung und arzneimittel

Info

Publication number: DE2812343A1
Application number: DE19782812343
Authority: DE
Inventors: Geb Marshall Monica Jo Gardner; Gordon William Ross; Walter Wolff
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1977-03-22
Filing date: 1978-03-21
Publication date: 1978-10-12
Also published as: GB1598457A; FR2384501A1; JPS53118593A; NL7803034A; US4157278A

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KlNZEBACH

BAUERSTRASSE 22. D-BOOO MÜNCHEN 4O ■ FERNRUF .089- 37 65 83 - TELEX SZ1S2OS ISAR POSTANSCHRIFT: POSTFACH 7βΟ. D-8000 MÜNCHEN 43

München, 21. März 1978 M/19 066

GLAXO LABORATORIES LIMITED Greenford, Middlesex England

Immunostimulatorischer Wirkstoff, Verfahren zu seiner Gewinnung und Arzneimittel

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Die Erfindung betrifft einen immunostimul atorischen Wirkstoffs, ein Verfahren zur Gewinnung des Wirkstoffs, sowie ein Arznei-

mittel. j

In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche Präparationen aus I Mikroorganismen zur Verwendung als immunostimulatorische Mittel,

vorgeschlagen, wobei auch an eine Verwendung zur Behandlung 1

maligner Tumoren gedacht war. Insbesondere werden seit vielen j

Jahren ganze Mycobakterienzellen aufgrund ihres Adjuvans- !

effekts zur Verstärkung der Bildung von Antikörpern auf ein :

bestimmtes Antigen verwendet. Es ist wohlbekannt, daß Myco- j bakterienzellwände und Wachsfraktionen aus derartigen Zellwän-

den Adjuvansaktivität besitzen. Aus BCG hergestellte Vaccine j

(Mycobacterium bovis var. BCG) werden in weitem Umfang als ι

immunostimulatorische Mittel eingesetzt. Derzeit laufen Ver- j

therapie zu bestimmen.

suche mit dem Ziel, die Wirksamkeit von BCG bei der Krebs- '

Die Verwendung wiederholter Dosen aus ganzen Mycobakterienzellen kann jedoch beim Patienten zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Hier sind beispielsweise zu nennen Pyrexie, Abgespanntheit, erhöhte EmDfindlichkeit gegenüber beispielsweise Tuberkulin oder Endotoxin, Hypertrophie der Lymphorgane oder Bildung lokaler Granulome. Aus diesem Grunde wurden vielfältige Anstrengungen unternommen, aktive Fraktionen aus Mycobakterien und anderen Mikroorganismen zu isol ieren und zu identifizieren, bei denen keine signifikante toxische Aktivität vorliegt. Im allgemeinen ist es bevorzugt, daß derartige immunostimulatorische Fraktionen wasserlöslich sind, weil hier die Wahrscheinlichkeit einer Verminderung lokaler Reaktionen gegeben ist und darüber hinaus die Reinigung der Fraktionen leichter erfolgen kann. Es wurde eine große Zahl von Fraktio-

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nen aus Mycobakterien isoliert, und es wurde berichtet, daß

diese eins immunostimulatorische Aktivität besäßen, ohne daß

signifikante toxische Eigenschaften vorlägen. Es wurden auch einige andere Mikroorganismen untersucht.

Ein Nachteil des Gebrauchs von Mycobakterien besteht darin, daß Mycobakterienkulturen ein relativ langsames Wachstum besitzen und somit die für eine industrielle Produktion erforderlichen großen Ausbeuten schwierig zu erzielen sind. Darüber hinaus ist die tatsächliche Ausbeute an immunostimulatorischem Material aus jeder Zelle nur gering, und man benötigt große Mengen an Zellmaterial, um die gewünschte Komponente aus der Zellwand zu isolieren.

Erfindungsgemäß wurden eine große Zahl von Mikroorganismen auf immunostimul atorische Fraktionen untersucht, die den obigen Anforderungen genügen sollten, überraschend wurde festgestellt, daß wasserlösliche Fraktionen mit imnmnostimulatorischer Wirksamkeit aus Streptomyces griseus-Mycel in überraschend hoher Ausbeute extrahiert werden können. Diese Fraktionen erweisen sich wirksam, wenn es um die Stimulierung der humoralen und ze!1-vermittelten Immunität geht. Sie weisen keine Zeichen unerwünschter toxischer Wirkungen auf.

Es wurde vorgeschlagen, aus dem Protoplasmamaterial des Mycels von Streptomyces-Spezien bestimmte 01igonucleotide zu isolieren, die angeblich therapeutisch wirksam sein sollen. Erfindungsgemäß wird hingegen bevorzugt, Nucleinsäurematerial aus den erfindungsgemäßen immunostimulatorischen Fraktionen zu entfernen, weil Nucleinsäurematerialien eine inhärente Toxizität aufweisen können. Es wurde ferner vorgeschlagen, ein Anti-Tumormaterial zu gewinnen, indem man die Zellwände von Streptomyces-Mycel mit Wasser wäscht. Die er-

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findungsgemäß erhaltene, wasserlösliche Fraktion bleibt im Gegensatz hierzu in der Zellwand gebunden und zwar trotz erschöpfender Extraktion und Waschungen, bis sie solubi1isiert ist. Dies kann beispielsweise durch enzymatische Einwirkung erfolgen.

Erfindungsgemäß wird somit ein Verfahren zur Gewinnung eines immunostimulatorischen Wirkstoffs, bei dem es sich um eine wasserlösliche Fraktion handelt, die Peptidoglycanmaterial mit immunostimulatorischer Wirksamkeit enthält, vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Mycel eines Stamms von Streptomyces griseus zur Solubilisierung der gebundenen Peptidoglycankomponenten der Zellwände behandelt, um eine Fraktion zu erhalten, welche die gewünschte immunostimulatorisehe Aktivität besitzt, und wobei man bei diesem Verfahren das Nucleinsäurematerial aus der Peptidoglycanfraktion abtrennt.

Der hier verwendete Begriff "wasserlösliche Fraktion¹¹ ist als eine Fraktion definiert, die beim Zentrifugieren unter 23 000 g während 1 Stunde nicht zur Sedimentbildung aus einem wässerigen | Medium führt. i

Die Definition der erfindungsgemäß verwendeten Spezies Strepto- j myces griseus findet sich in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1974) auf den Seiten 795 und 799.

Im allgemeinen umfaßt die Gewinnung der gewünschten immunostimu latorisch wirksamen Fraktion einige oder sämtliche der folgenj den Stufen:

1) Zerstörung der Mycelzellen;

2) Abtrennung der zerstörten Zellwände vom Mycelprotoplasma;

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3) Entlipidierung der Zellwände;

4) Solubilisierung der Peptidoglycane in den Zellwänden;

5) Entfernung der Nucleinsäurematerialien;

6) Entfernung von unerwünschten Protein- und Kohlehydratmateri alien.

Obgleich es bevorzugt ist, als anfängliche Stufe vor der Solubilisierung der Peptidoglycane die Mycelzellen zu zerstören und das Protoplasma aus dem unlöslichen Zellwandmaterial auszuwaschen, kann man auch die Solubi1isierungsbehandlung direkt auf die ganzen Zellen anwenden, die gegebenenfalls zuvor entlipidiert wurden. Hierbei erhält man eine wässerige Mischung, in der die wasserlöslichen Peptidoglycane mit Zeilbestandtei-Ien vermischt sind. Hierbei ist eine Auftrennung durch Fraktionierungstechniken erforderlich, die zur Entfernung von Proteinen, Nucleinsäuren, und dergleichen , geeignet sind.

Die wesentliche Stufe der Entfernung des Nucleinsäurematerials wird einfach dadurch bewirkt, daß man die Zellen zerstört und die Zellwände vor der Solubilisierung wäscht, um sämtliche ZeI1bestandteiIe, einschließlich der Hauptmenge des Nucleinsäurematerials zu entfernen. Weiteres Nucleinsäurematerial kann vor oder nach der Solubilisierung aus den Peptidoglycanen abgetrennt werden. Auf gleiche Weise wird die Hauptmenge des Protein- und Kohlehydratgehalts der Zellen einfach dadurch entfernt, daß man die Zellwände vor der Solubilisierung des Peptidoglycans wäscht; es ist auch möglich, das Protein und das Kohlehydrat vor oder nach der Solubilisierung des Peptidoglycans in getrennten Stufen zu entfernen. Das Entlipidieren wird vorzugsweise vor der Solubilisierung des Peptidoglycans durchgeführt, am bevorzugtesten nach der Zerstörung der Zelle. Man kann die Entlipidierung aber auch in einem späteren Ab-

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schnitt durchführen. ^:

Im allgemeinen ist es bevorzugt, die Solubilisierung der
Peptidoglycane durchzuführen, nachdem die Zellen zerstört , und die vorstehend beschriebenen Reinigungsstufen beim Zeil- _:

wandmaterial durchgeführt worden sind. !

Nachstehend sind die einzelnen Verfahrensstufen noch ausführ- ; Ii eher beschrieben. j

Solubilisierung des Peptidoglycans

Um die gebundenen Peptidoglycankomponenten der Mycelreste
zu so!ubi1isieren, kann man die Zellwände oder die ganzen
Zellen mit mindestens einem bakteriolytischen Enzym behandeln. Dieses Enzym weist vorzugsweise Endoacetylmuramidaseaktivifät auf. Das bevorzugte Enzym ist Eiweißlysozym. Eine derartige
Behandlung mit Eiweißlysozym kann bei einem pH im Bereich
von 5 bis 8, vorzugsweise bei pH 6,0 bis 6,5, z.B. ungefähr
pH 6,2, und bei einer Temperatur im Bereich von 15⁰C bis 45⁰C, J vorteilhafterweise bei erhöhter Temperatur, beispielsweise
ungefähr 37⁰C, während eines längeren Zeitraums_s beispielsweise ungefähr 18 Stunden₅ durchgeführt werden. Unlösliche
Rückstände können von der überstehenden Flüssigkeit beispielsweise durch Zentrifugieren entfernt werden. Man behandelt sie vorzugsweise ein zweites Mal mit einem murolytische'n Enzym,
trennt wiederum die überstehende Flüssigkeit ab und vereinigt sie mit der ersten Flüssigkeit.

Vorzugsweise arbeitet man in Gegenwart eines Bakteriostatikums beispielsweise in Gegenwart von Toluol.

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Zerstörung der Zellen

Die Zerstörung der Zellen kann beispielsweise durch Schallbehandlung, oder mit Hilfe mechanischer Hilfsmittel erfolgen, beispielsweise indem man gefrorenes Material in einer Hughes-Extrusionspresse durch einen engen Schlitz durchdrückt, oder in einer DYNO-Mühle zermahlt, indem man mehrmals gefriert und wieder auftaut, oder indem nan mit einem wässerigen Benetzungs-I mittel, vorzugsweise einem langkettigen anionischen Benetzungs-| ! mittel, beispielsweise Natriumdodecylsulfat, behandelt. Eine j ] bevorzugte Methode zur Zerstörung der Zellen besteht darin, j j daß man sie in Gegenwart eines Puffers, beispielsweise mit ί 0,15 M Natri umchl ori d/0,015 M Trinatriumcitratpuffer bei pH 7 \ mit Glaskugeln schüttelt.

Waschen der Zellwände

ι Nach der Zerstörung der Zellen wird das Zeilwandmaterial vorzugsweise erschöpfend gewaschen, um Mycelprotoplasma zu entfernen. Dies erfolgt beispielsweise durch Aufschlämmen in einem'

wässerigen Medium, wie einer Citratpufferlösung. Wenn man ein ! : langkettiges anionisches Benetzungsmittel zur Zellenzerstörung ■

oder der nachstehend erwähnten Entlioidierung verwendet hat, ι ; ist es wünschenswert, dieses MHtel unter Verwendung wässerigen! [ Harnstoffs aus dem Zellwandmaterial auszuwaschen.

ι Entlipidierung

Die ganzen Zellen oder das Zeilwandmaterial wird vorzugsweise ; vor der Solubilisierung der Peptidoglycane entlipidiert. Dies j erfolgt beispielsweise durch Extraktion mit heißen organischen Lösungsmitteln oder mit einem kochenden wässerigen Detergens. Erschöpfende Behandlung mit einer Abfolge organischer Lösungsmittel, beispielsweise Aceton, Methanol, Äthanol und Chloroform führt dazu, daß die verschiedenen Lipidkomponenten zuverlässig

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von den Zellwänden entfernt werden. Der Einsatz einer kochenden, wässerigen Lösung eines Detergens, vorzugsweise eines langkettigen anionischen Benetzungsmittels, beispielsweise Natriumdodecylsulfat, erweist sich als besonders wirksam. Diese Behandlung besitzt den zusätzlichen Vorteil, daß das Nucleinsäurematerial aus dem ZeI1wandmaterial entfernt wird. Die Behandlung von Mycelze!1wandmaterial entweder in Form J ganzer Zellen oder zerstörter Zellen mit einem langkettigen, j anionischen Benetzungsmittel ist somit zur Herstellung einer . Zwischenfraktion besonders brauchbar, die das Peptidoglycan | mit immunostimulatorischer Aktivität enthält. Diese Behandlung! stellt ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung dar. Alternativ kann man jedoch das Peptidoglycanmaterial durch ί organische Lösungsmittelextraktionen entlipidieren. ι

ι Es sei bemerkt, daß man langkettige, anionische Benetzungs- | mittel, wie Natriumdodecylsulfat, in einer einzigen Stufe :

zur Zerstörung der ganzen Zellen, zur Entlipidierung des Zeil-;

wandmaterials und zur Unterstützung der Entfernung der Zellbestandteile, einschließlich des Nucleinsäurematerials , verwenden kann. '

Entfernung des Nucl einsäurematerials

Das Nucleinsäurematerial kann mindestens teilweise durch die zuvor beschriebenen Wasch- und Entlipidierungsstufen entfernt werden. Man kann auch das Nucleinsäurematerial aus dem Zellwandmaterial entfernen, indem man mit mindestens einem geeigneten Enzym, beispielsweise einer Ribonuclease oder einer Desoxyribonuclease behandelt und anschließend die so hergestellten Nucleotide durch Waschen entfernt. Eine derartige Enzymbehandlung kann bei der von der Solubilisierung des Peptidoglycans herrührenden wässerigen Mischung durchgeführt werden, jedoch müssen in diesem Falle die Nucleotide durch

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Fraktionieren entfernt werden. Dies erfolgt beispielsweise durch Anwendung von Molekularsiebtechniken, wie Ultrafiltration, oder durch Behandlung mit vernetzten Dextranen, wie Sephadex oder mit Hilfe von Ionenaustauscherchromatographie.

Alternativ kann man die wässerige Mischung mit einem selektiven Ausfällungsmittel für Nucleinsäuren behandeln.

Entfernung der Proteine und Kohlehydrate

Die Entfernung der unerwünschten Proteine und/oder Kohlehydrate kann durch Behandlung mit proteolytisehen und/oder glycolytischen Enzymen erfolgen. Zu geeiqneten proteolytisehen Enzymen gehören beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin und Pronase, wobei die Enzyme alleine oder in Mischung und nötigenfalls aufeinander folgend eingesetzt werden. Zu geeigneten glycolytischen Enzymen gehört beispielsweise ooAmylase. Wenn man die ^; Enzyme zur Anwendung auf das Zellwandmaterial bringt, kann man die abgebauten Proteine und Kohlehydrate durch Waschen ent- >

fernen. Bringt man die Enzyme auf das so!ubi1isierte Peptido- ! glycan zur Anwendung, ist eine Fraktionierung erforderlich, wie bei der Entfernung der Nucleotide. i

Die das aktive Peptidoglycanmaterial enthaltende wässerige ' Lösung kann gewünschtenfal1s konzentriert werden. Gegebenenfalls kann man mit einem nicht solubilisierten proteolytischen Enzym, beispielsweise Trypsin oder Pepsin, behandeln, um eventuell übriggebliebene murolytische Enzyme oder andere Enzyme zu entfernen. Wie zuvor gesagt, können kleine Moleküle, einschließlich Salze oder Enzymabbauprodukte durch molekulare Fraktionierung, beispielsweise durch Anwendung von Molekularsiebtechniken, wie Ultrafiltration, oder durch Fraktionierung auf vernetzten Dextranen oder Polyamiden in neutralen oder sauren wässerigen Lösungen, entfernt werden. Gefriertrocknen

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der Lösung führt zu einem stabilen, flockigen Pulver, welches j das aktive Material enthält. Dieses ist in Wasser oder in j Pufferlösungen leicht löslich. !

Das als Ausgangsmaterial verwendete Mycel kann erhalten wer- ; den, indem man S. griseus in oder auf einem Kulturmedium hier-!

für kultiviert und vorzugsweise vor der weiteren Behandlung '

von den Nährstoffen abtrennt. S. griseus wird in großer Menge \ in der Antibiotika-Industrie erzeugt und zwar insbesondere

als Nebenprodukt der Streptomycinherstellung. S. griseus ist j

in großem Maßstab leichter zu züchten als beispielsweise ;

Mycobakterien. \

i Zu Stämmen von S. griseus, die man verwenden kann, gehören ι beispielsweise die Streptomycin-produzierenden Stämme mit ί

den nachfolgenden Sammelstellen-Hinterlegungsnummern:

ATCC 15395

ATCC 23345

ATCC 12475

CMI 50967

NCIB 8136

NCIB 8506

NCIB 9001

CBS 16145

CBS 47948

CBS 48148

CBS 90568

Sämtliche erfindungsgemäß untersuchten Stämme von S. griseus liefern eine wasserlösliche Fraktion, die ein Peptidoglycan

mit immunostimulatorischer Aktivität enthält. j

Das Wachstum des S. griseus kann nach üblichen Methoden erfolgen. So sollte das zur Kultivierung des Organismus ver-

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wendete Nährmedium Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthalten. Bei der Stickstoffquel1e kann es sich beispielsweise um üblichen Fleisch- oder Hefeextrakt, um Pepton, Trypton oder eine Präparation, wie Tryptose, Kaseinhydrolysat, aus Soja oder anderen vegetablen Bohnen hergestelltes Mehl, um Molkepulver, um lösliche Brennerei sch!empen oder um Maismaischflüssigkeit, handeln. Die komplexe Stickstoffquelle kann auch , eine Quelle für Kohlenstoff und andere nützliche Nährstoffe _; sein. Die Kohlenstoffquelle kann auch beispielsweise eine Kohlehydratquelle, wie Glucose, Glycerin, Stärke oder eines ; deren Abbauprodukte, oder andere Zucker, Zuckeralkohole, ι organische Säuren oder Paraffine, sein. Vorteilhafterweise ^; können Quellen für Schwefel, Phosphat, Magnesium, Calcium, Kalium, Natrium, Eisen und Spuren anderer Metalle und Salze vorliegen. Abhängig von den vorliegenden Stickstoff- und · Kohlenstoffquellen kann es günstig sein, Salze, beispielsweise^ Nitrate und Natrium- oder Kaliumchlorid zuzusetzen. Der opti- j male pH des Kulturmediums und die optimale Wachstumstempera- , tür hängen von der Art des verwendeten Organismus ab. Ein wünschenswerter pH liegt üblicherweise im Bereich von pH 4 bis 9. Die Temperatur liegt im allgemeinen im Bereich von 1O⁰C bis 4O⁰C. Die Kultivierung des Organismus wird üblicherweise unter submersen Bedingungen unter Rühren oder Schütteln und Belüften durchgeführt. Zu bevorzugten Kulturbedingungen gehören im allgemeinen Temperaturen von 25⁰C bis 29⁰C, sowie ein pH im Bereich von 6 bis 8, wobei das Wachstum unter belüfteten, submersen Bedingungen während 12 Stunden bis 16 Tagen, vorzugsweise während 2 bis 14 Tagen, durchgeführt wird.

Man kann die Zellen des S. griseus aus dem Kulturmedium beispielsweise durch Zentrifugieren isolieren. Es ist bevorzugt zu waschen, beispielsweise mit destilliertem Wasser oder mit einer verdünnten Natriumchloridlösung, die Citratpuffer

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enthalten kann, um verunreinigende Komponenten aus der liber- ^! stehenden KuIturfTüssigkeit zu entfernen. :

Dann kann man die Zellen unmittelbar weiter verarbeiten oder i beispielsweise in gefrorener Form, z.B. bei -20 C₉ oder in j Form eines mit Aceton getrockneten Pulvers, lagern. ;

Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die als aktives
Wirkprinzip eine erfindungsgemäß hergestellte, wasserlösliche j Fraktion enthalten. Die Mittel können in einer Form vorliegen, ' die zur Injektion geeignet ist, z.B. in physiologischer, j wässeriger Lösung, in Form einer Emulsion oder in Form eines ι Liposoms. Derartige Formulierungen können nach üblichen Arbeitsweisen hergestellt werden. Vorteilhafterweise liegen die ; Formulierungen in Form von Dosiseinheiten, beispielsweise '

: in Form von Ampullen vor, wobei jede Einheit so ausgelegt ist, daß sie eine bestimmte Dosis an aktivem Bestandteil liefert.

j Die Formulierungen sind in erster Linie zur Anwendung beim '■.

j Menschen vorgesehen. Bevorzugte Dosiseinheiten enthalten ι 0,1 bis 2 mg/kg Körpergewicht. Vorzugsweise werden derartige '■ Formulierungen durch subkutane Injektion an den Menschen verab-j

reicht. |

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne sie zu beschränken.

B e i s ρ i e

Man gibt eine Saatkultur von Streptomyces griseus ATCC 15395
in einer Menge von 3 % in ein Kulturmedium (2 Liter), das
! 6 g Oxoidhefeextrakt L21, 0,6 g Oxoidpepton L37, 1 g wasser- ! freies Kaiiumhydrogenphosphat, 0,05 g Magnesiumsulfat · 7H₂O, 20 g Glycerin und 1 Liter Wasser umfaßt, wobei der pH auf 7_s0

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eingestellt ist. Man verteilt die Kulturen in Mengen von
50 ml auf 250 ml konische Kolben und läßt 3 Tage bei 28⁰I
auf einer Schüttelvorrichtung mit 220 Upm wachsen.

Die Kulturen werden durch 30-minütiges Zentrifugieren bei '

2000 g geerntet und der erhaltene Zellkuchen wird zweimal '■

mit SSC-Puffer (0,15 M Natriumchlorid/O ,015 M Trinatrium- <

citrat, pH 7) und einmal mit destilliertem Wasser gewaschen. : 1-stündiges Zentrifugieren bei 23 000 g ergibt einen festen

Kuchen aus feuchtem filzartigem Material (42 g, Trockenge- i

wicht 6,9 g). j

Ein Anteil dieses filzartigen Materials (30,5 g Naßgewicht,
5 g Trockengewicht) wird in SSC-Puffer mit einem Gehalt von . 4 % 'iatriumdodecyl sulfat (2,5 Liter) suspendiert und 1 Stun- ' de am Rückfluß gehalten. Anschließend läßt man die Suspension : über Nacht unter kontinuierlichem Rühren in einem Wasserbad
bei 25⁰C abkühlen. Man erntet den My eel rückstand durch Zentri-j fugieren bei 23 000 g. Die Mycelaufschlämmung wird in 1,2 Li- j ter SSC-Puffer suspendiert, 30 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt und dann 1 Stunde bei 23 000 g zentrifugiert, wobei
man die Temperatur bei 25⁰C hält. Diese Waschstufe wird j zweimal wiederholt, worauf man den Mycel rückstand in 8 M Harn-j

i stofflösung (1 Liter) suspendiert, über Nacht rührt und dann ; wiederholt mit SSC-Puffer wäscht, bis die Flüssigkeit nach
dem Zentrifugieren <*5 ug/ml Natri umdodecyl sulfat, gemessen ! nach der Methode von Hayashi (Anal. Biochem. (1975) 6_7, 503) | enthält. Dann suspendiert man den Mycelrückstand in 0,02 M I Phosphatpuffer von pH 7,0 (250 ml) und gibt tf-Amyl ase /'Sigma,
Bacillus subtilis, 50 mg, die 500 bis 1000 Einheiten/mg ent- j halten/ zusammen mit einigen Tropfen Toluol zu, Die erhaltene
Mischung v/i rd über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, 1 Stunde; bei 23 000 g zentrifugiert, und das erhaltene Pellet wird
in SSC-Puffer (250 ml) wieder suspendiert. Man verdaut die

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so erhaltene Suspension über Nacht in Gegenwart einiger Tropfen' Toluol bei 37⁰C mit Trypsin /Sigma, Rinderpankreas, 50 mg, die 10 000 bis 13 000 Einheiten/mg enthaltenj. Das nach 1-stlindigem Zentrifugieren bei 23 000 g erhaltene Pellet wird dann einmal in SSC-Puffer (200 ml) und einmal in Wasser gewaschen.

Diesen Rückstand suspendiert man in 0,05 M Ammoniumacetat von pH 6,2 (250 ml), das Eiweißlysozym /Sigma, 25 mg, die 25 000 [ Einheiten/mg enthalten^ und einige Tropfen Toluol enthält. Nach Inkubieren über Nacht bei 37⁰C unter Rühren entfernt man !

das unlösliche Material durch 1-stündiges Zentrifugieren bei j 23 000 g und extrahiert von neuem mit 125 ml des das Lysozym i enthaltenden Puffers. Die beiden Lysozymextrakte werden ver- j

einigt und durch Diafiltration in einer 400 ml Amicon-Ultra- j filtrationsvorrichtung, die mit einer UM 05 Membran versehen I ist, entsalzt. Durch Verdünnen des Retentats und zweimaliges j Rekonzentrieren entfernt man über 97 % der gelösten Stoffe mit niedrigem Molekulargewicht. Das zurückgehaltene .Produkt wird dann gefriergetrocknet, wobei man ein festes Produkt erhält (2,1 g, Ausbeute 42 %, bezogen auf das Trockengewicht der ZeIlen).

Die Analyse des Produkts zeigt an, daß es Aminosäuren, hauptsächlich Alanin, Glutaminsäure, Diaminopimelinsäure und Glycin ' zusammen mit etwas Arginin und Asparaginsäure, die Aminozuckerglucosamin und Muraminsäure, sowie Glucose, enthält.

Die immunostimulatorische Aktivität des Produkts wurde bei Meerschweinchen gezeigt. Diesen wurde subkutan zweimal 0,25 ml einer Wasser-in-öl-Emulsion.(phosphatgepufferte Kochsalzlösung/Freund 'sches unvollständiges Adjuvans), die insgesamt 100 μg Ovalbumin als Antigen und 100 ug des Produkts enthielt, verabreicht. Es wurde in Gegenwart der genannten immunostimulatorischen Fraktion aus S. griseus eine erhöhte Anti-

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körperbildung und das Auftreten von zellenvermittelter Immunität festgestellt.

B e i s ρ i e 1 2 ;

Man suspendiert das gewaschene, filzartige Material aus Streptomyces griseus ATCC 15395 (44 g Naßgewicht, 4 g Trockengewicht), das wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, in Wasser (200 ml), und man gibt Aceton (600 ml) langsam unter heftigem Rühren zu. Die erhaltene Mischung wird filtriert (Whatman Nr. 54 Filterpapier), und der Rückstand wird mit Aceton gewaschen. Das acetonfeuchte Filzmaterial wird in einer Extraktionshülse aus Papier eingefüllt ί

und unter Rückfluß in einer Soxhlet-Vorrichtung mit jedem der nachfolgenden Lösungsmittel extrahiert: Aceton (16 Stunden), Äthanol (8 Stunden), Chloroform (16 Stunden), Chloroform:Methanol 87:13 (8 Stunden). Dann wäscht man das extrahierte filzartige Material nacheinander einmal mit Diäthyläther und schließlich mit Aceton.

Das acetonfeuchte, ent!ipidierte, filzartige Material wird in Wasser (800 ml) suspendiert. Man rührt die erhaltene Suspension eine halbe Stunde lang und zentrifugiert dann eine halbe· Stunde lang bei 23 000 g. Der Rückstand wird zweimal mit 0,05 M Ammoniumacetat von pH 6,2 (800 ml) gewaschen und dann in demselben Puffer (600 ml), der Eiweißlysozym (Sigma, 60 mg, die 25 000 Einheiten/mg enthalten) und einigen Tropfen Toluol suspendiert. Man inkubiert die erhaltene Mischung 18 Stunden bei 37⁰C und zentrifugiert dann 1 Stunde bei 23 000 g. Das Sediment wird wie zuvor beschrieben nochmals mit Lysozym verdaut und nochmals zentrifugiert. Die Lysozym-solubi1isierten Extrakte werden durch Ultrafiltration durch eine Flachbettmembran mit einer nominalen Durchlaßgrenze bei einem Molekular-

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gewicht von 500 auf angenähert ein Zehntel konzentriert. Das so erhaltene Konzentrat verdünnt man. mit Wasser und konzentrieret

wiederum, wodurch man eine mindestens 98 %-ige Entfernung von i Material mit niedrigem Molekulargewicht erzielt. Das verbliebene Retentat wird gefriergetrocknet. Hierbei erhält man ein festes Produkt (1,8 g).

Die Analyse des Produkts zeigt an, daß es Aminosäuren., hauptsächlich Alanin, Glutaminsäure, Diaminopimelinsäure und Glycin, zusammen mit etwas Arginin und Asparaginsäure, sowie die Aminozucker Glucosamin und Muraminsäure und ferner etwas Glucose, enthält.

Durch Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Methode wurde festgestellt, daß das Produkt immunostimulatorisch wirksam ist.

Beispiel

Man züchtet und erntet Streptomyces griseus NCIB 11398 nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode. Die Ausbeute an gewaschenem, filzartigem Material beträgt 46 g Naßgewicht und | 9,6 g Trockengewicht. j

Ein Anteil dieses filzartigen Materials (24 g Naßgewicht, 5 g Trockengewicht) wird dann nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 behandelt. Nach der Ultrafiltration wird das Retentat gefriergetrocknet, wodurch man ein festes Produkt (0,72 g) erhält.

Die Analyse des Produkts zeigt, daß es sich bei den hauptsächlich vorliegenden Aminosäuren um Alanin, Diaminopimelinsäure, Glutaminsäure und Glycin handelt. Es enthält auch Glucosamin, Muraminsäure und Glucose.

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ι Anhand der in Beispiel 1 beschriebenen Technik wurde gezeigt, daß durch Gegenwart des Produkts die Antikörperbildung erhöht wird und eine zellenvermittelte Immunität auftritt.

Beispiel

Man züchtet und erntet Streptomyces griseus NCIB 11397 nach der Arbeitsweise des Beispiels 1. Die Ausbeute an gewaschenem, filzartigem Material beträgt 54 g Naßgewicht und 7,5 g Trockengewi cht.

Man beiandelt einen Anteil dieses filzartigen Materials (36 g Naßgewicht, 5 g Trockengewicht) nach der Arbeitsweise des Beispiele 3. Hierbei erhält man 2,17 g festes Produkt,

Die Analyse des Produkts zeigt an, daß es dieselben Aminosäuren und Zucker wie das Produkt des Beispiels 3 enthält. Die immunostimulatorische Wirksamkeit ist ebenfalls dieselbe.

21/V.

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Claims

Pat entansprüche

Wasserlöslicher, immunostimulatorischer Wirkstoff auf der Grundlage von Peptidoglycan-Material, erhältlich durch Behandlung des Mycels eines Stamms von Streptomyces griseus zur Solubilisierung der gebundenen Peptidoglycankomponenten der Zeil wände, und Abtrennung des Nucleinsäure-Materi als aus -.der Peptidoglycan-Fraktion.

Verfahren zur Herstellung des Wirkstoffs nach Anspruch I₅ dadurch gekennzeichnet, daß man das Mycel eines Stamms von Streptomyces griseus zur Solubilisierung der gebundenen Peptidoglycankomponenten der Zellwände behandelt, wobei man eine Fraktion erhält, die die gewünschte immunostimul atorische Aktivität aufweist, und das Nucleinsäure-Material aus der Peptidoglycanfraktion abtrennt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß j

man die Mycelzellen zerstört, und vor der SoIu- j

bilisierung der Peptidoglycankomponenten das Protoplasma 1

vom unlöslichen Zeilwandmaterial abwäscht. 1

4. Verfahren gemäß Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Solubilisierung des Peptidoglycans eine Ent!ipidierung der Zellwände vornimmt-

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ent!ipidierung durch Extraktion mit heißen organischen Lösungsmitteln oder mit einem kochenden , wässerigen Detergens vornimmt.

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ORiGlNAL INSPECTED

6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ganze Mycelzellen vor der Solubilisierung des Peptidoglycans mit einem wässerigen, langkettigen anionischen Benetzungsmittel behandelt, um die ganzen Zellen zu zerstören, das Zellwandmaterial entlipidiert und die Zellenbestandteile einschließlich des Nucleinsäure-Materials entfernt.

7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Solubilisierung der Peptidoglycankomponenten durch Behandlung der Zellwände oder der ganzen Zellen mit mindestens einem bakteriolytisehen Enzym durchführt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein bakteriolytisches Enzym einsetzt, das Endoacetyl-

muramidaseaktivitat besitzt. j

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß \ man als bakteriolytisches Enzym Eiweißlysozym einsetzt.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit dem bakterio- Ϊ lytischen Enzym in Gegenwart eines Bakteriostatikums durchführt.

11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das ZeI1wandmaterial zur Entfernung des Nucleinsäure-Materials vor der Solubilisierung des Peptidoglycans, oder das bereits solubilisierte Peptidoglycan-Material mit mindestens einem Enzym behände!t.

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12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß . man das so!ubilisierte Peptidoglycanmaterial mit einer
Ribonuclease und/oder einer Desoxyribonuclease behandelt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeich- \ net, daß man die Behandlung zur Entfernung des Nuclein- ■ Säurematerials mit dem Zellwandmaterial vor der Solubilisierung des Peptidoglycans durchführt. j

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14. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß man das Zellwandmaterial

vor der Solubilisierung des Peptidoglycans, oder das bereits solubi1isierte Peptidogiycanmaterial zur Entfernung von
Proteinen und/oder Kohlehydraten mit einem oder mehreren _: proteolytischen und/oder glycolytischen Enzymen behandelt.!

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, ι daß man das Zeilwandmaterial oder das solubi1isierte
Peptidogiycanmaterial mit Trypsin, Chymotrypsin, Pronase und/oder oi-Amyl ase behandelt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung zur Entfernung von Proteinen und/oder Kohlehydraten am Zellwandmaterial vor der
Solubilisierung des Peptidoglycans durchführt.

17. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Entfernung verbliebener; Enzyme das wässerige, solubilisierte Peptidogiycanmaterial mit einem nicht-solubilisierten proteolytischen
Enzym behandelt.

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18. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das so!ubi1isierte Peptidoglycanmaterial einer molekularen Fraktionierung unterwirft.

19. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das wässerige, solubilisierte Peptidoglycanmaterial gefriertrocknet.

20. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Streptomycin-produzierenden Stamm von Streptomyces griseus verwendet.

21. Verfahren zur Herstellung eines immunostimulatorisehen Wirkstoffs auf der Grundlage von Peptidoglycanmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mycel eines Stamms von Streptomyces griseus zerstört und entlipidiert und die Zellenbestandteile entfernt.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die zerstörten Zellwände des Mycels mit einem langkettigen anionischen Benetzungsmittel behandelt.

23. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man ganze Zellen des Mycels mit einem 1angkettigen, anionischen Benetzungsmittel behandelt.

24. Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benetzungsmittel Natriumdodecylsulfat verwendet.

25. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet,

daß es mindestens einen Wirkstoff, erhältlich nach einem der Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 20, zusammen mit

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pharmazeutischen Formulierungsmitteln, sowie gegebenenfalls anderen Adjuvantien, enthält.

26. Arzneimittel gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es den Wirkstoff in einem injizierbaren Träger oder Liposom enthält.

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