DE2040440B2

DE2040440B2 - Enzym, mit der faehigkeit zur lyse der zellen von zahnkaries erzeugenden mikroorganismen, verfahren zur herstellung desselben und dasselbe enthaltende praeparat zur verhuetung und behandlung von zahnkaries

Info

Publication number: DE2040440B2
Application number: DE19702040440
Authority: DE
Inventors: Yoshio Nishinomiya Hyogo Yokogawa Kanae Nara Kawata Shigeo Kobe Hyogo Yoshimura, (Japan)
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1970-05-28
Filing date: 1970-08-14
Publication date: 1977-07-14
Also published as: CA983869A; JPS4916956B1; GB1294767A; DE2040440C3; FR2090333B2; DE2040440A1; FR2090333A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym, mit der Fähigkeit zur Lyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen (d. h. die Fähigkeit zum Auflösen des Mikroorganismus unter Zerstörung der Zellwände) sowie ein Verfahren zur herstellung dieses Enityms. Die Erfindung betrifft außerdem neue Präparate 2:ur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries.

Bei dem erfindungsgemäßen Enzym handelt es sich um ein Enzym, welches die Fähigkeit zur Lyolyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen wie kariogenen Streptokokken und Lactobacillus aufweist. Dieses Enzym ist dadurch gekennzeichnet, daß es durch Züchten des Streptomyces-Stammes, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hai, in einem Nährmedium nach konventionellen Methoden und durch anschließende in üblicher Weise durchgeführte Isolierung aus der Fermentationsflüssi.gkeit erhalten worden ist.

Seit von Miller 1890 darauf hingewiesen worden ist, daß Zahnkaries von Bakterien hervorgerufen wird, sind die Ursachen der Zahnkaries aus mikrobiologischer Sicht von vielen Forschern untersucht worden. 1960 hat Fitzgerald berichtet, daß Karies bei Hamstern exjDerimentell durch Streptokokken hervorgerufen werden kann (The Journal of the American Dental Association, Bd. 61, S. 9-19, 1960). In jüngster Zeit wurde berichtet, daß Zahnsteinbildung und Entwicklung von Karies vermieden werden können, indem man mikrobiell gebildetes Dextran abbaut und den Zahnstein entfernt unter Verwendung eines Enzyms »Dextranase« (Fitzgerald et al.; Archives Oral Biology, Bd. 13, S. 125-128, 1968 und Journal of the American Dental Association, Bd. 76, S. 301-304, 1968). Weiterhin hat man versucht, das Wachstum von Karies erzeugenden Bakterien mit Hilfe verschiedener Medikamente zu unterdrücken und so die Zahnkaries zu verhüten oder zu behandeln. Es ist jedoch bisher nicht versucht worden, durch Verwendung eines Enzyms die Bakterien zu zerstören und abzutöten.

₄o

45

50

₅₅ Es wurde festgestellt, daß die Karies erzeugenden Mikroorganismen wie kariogene Streptokokken und Lactobacillus zu den Mikroorganismen gehören, die nur schwer der Lyolyse zugänglich sind. Sie lassen sich weder durch Eiweiß-Lysozym noch durch Enzyme, die von den Kulturen verschiedener Arten von Mikroorganismen, z. B. von Kulturen von Streptomyces albus, Streotomyces griseus oder Stämmen der Art Flavobacterium, erzeugt werden, lyolysieren, obwohl das Eiweiß-Lysozym ebenso wie die von den genannten Mikroorganismen produzierten Enzyme bekannte, die Zellwände der Bakterien angreifende Enzyme sind.

Als Ergebnis der Prüfung vieler Arten von Mikroorganismen, die im Boden und in Abwässern auftreten, zum Zweck der Entdeckung eines Enzyms, welches zur Lyolyse der Zellen von Karies erzeugenden Mikroorganismen befähigt ist, wurde bereits gefunden, daß bestimmte Stämme der Gattung Streptomyces ein Enzym erzeugen, welches auf Karies erzeugende Mikrooirganismen stark lyolysierend einwirkt (DT-PS 20 11 935). Die Suche nach weiteren, zur Lyolyse von Karies erzeugenden Mikroorganismen geeigneten Stämmen wurde dann fortgesetzt, und es wurde nun gefunden, daß ein zur Gattung Streptomyces gehörender Stumm zur Bildung eines Enzyms, welches die Lyolyse von Karies erzeugenden Mikroorganismen bewirkt, verbessert befähigt ist.

Dieser Stamm B-1829, der erstmalig isoliert wurde, ist sowohl in der American Type Culture Collection, USA wie auch im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan mit den Hinterlegungsnummern ATCC Nr. 21 553 und FERM-P Nr. 5% hinterlegt worden.

Die morphologischen Eigenschaften sowie Eigenschaften der Kulturen des Stammes werden nachstehendaufgeführt:

A) Morphologische Eigenschaften·

Luftmycel und Sporen: Luftmycel gerade oder wellig, keine Spiralungen, keine Windungen; Sporen sphärisch, Größe 0,4-0,6 μ.

B) Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien:

Czapek's Agar: Schwaches Wachstum, Luftmycel hellbraun, kein lösliches Pigment;
Glucose-Asparagin-Agar: Sehr starkes Wachstum, hellelfenbeinfarben; pulveriges, cremefarbenes Luftmycel; lösliches Pigment schwachgelblich-braun;
Calcium-malat-Agar: Sehr starkes Wachstum, cremefarbig; pulveriges, cremfarbiges Luftmycel; lösliches Pigment schwach braun;

Nähr-Agar: Sehr starkes Wachstum, cremefarbig; schwaches weißes Luftmycel; lösliches Pigment schwach braun;

Glucose-Nähr-Agar: Sehr starkes Wachstum, senfartig goldfarben; dickes, pulveriges cremefarbenes Luftmycel; lösliches Pigment schwach braun;
Kartoffel: Dickes, moosiges Wachstum, schrumpelig; moosiges, hellgraues Luftmycel; braunes lösliches Pigment;

Glucose-Pepton-Agar: Dickes Wachstum, blaßgolden; schwaches, weißes Luftmycel; blaßbraunes, lösliches Pigment;

Stärke-Agar: Mäßiges Wachstum, schwach kakaobraun; dickes, weißes Luftmycel; schwach braunes lösliches Pigment;

Gelatine: Sehr schwaches V/achstum, spärliches weißes Luftmycel; kein lösliches Pigment;

Tyrosin-Agar: Starkes Wachstum, blaßorange; pulveriges cremefarbenes Luftmycel; blaßgelbes lösliches Pigment;

Lackmus-Milch: Wachstum mit Oberflächenring oder dünner Membran, hellgelb; weißes Luftmycel; kein lösliches Pigment;

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar: Sehr starkes Wachstum, klargolden; dickes, cremefarbiges Luftmycel; hellbraunes lösliches Pigment;

Hafermehl-Agar: Mäßiges Wachstum, schwach gelb lich-braun; dickes weißes Luftmycel; hellbraunes lösliches Pigment;

Glycerin-Asparagin-Agar: Sehr starkes Wachstum, schwach gelblich-braun; dickes pulveriges cremefarbe nes Luftmycel; blaßgelbes lösliches Pigment.

C) Physiologische Eigenschaften:

Gelatine-Verflüssigung	positiv	4-
Stärke-Hydrolyse	positiv	+
Tyrosinase-Reaktion	negativ
Lackmusmilch	Peptonisierung	+
Nitratreduktion	positiv	+
Pigment-bildende
Reaktion	negativ	+
Saccharid-Verwertung:		±
Arabinose	±
Xylose	±
Glucose	±
Mannose
Fructose
Lactose
Saccharose
Inosit
Rhamnose
Raffinose
Salicin
Mannit

Aufgrund der obigen Eigenschaften wurde der Stamm nach Waksman »The Actinomycetes« klassifiziert. Es hat den Anschein, daß der Stamm B-1829 zur Klasse Streptomyces gehört.

Das erfindungsgemäße Enzym wird dadurch hergestellt, daß man den Streptomyces-Stamm, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, in einem Nährmedium nach konventionellen Methoden züchtet und anschließend aus der Fermentationsflüssigkeit in üblicher Weise isoliert.

Gemäß vorliegender Erfindung wird der zur Art Streptomyces Orientalis gehörende Mikroorganismus, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, in einem geeigneten Medium gezüchtet, das beispielsweise die entsprechenden Saccharide, Stickstoffquellen, anorganische Salze und gegebenenfalls organische Stimulantien enthält, so daß sich das gewünschte Enzym in dem Medium anreichern kann,

Geeignete Saccharide, die zur Züchtung verwendet werden können, sind beispielsweise Glucose, Maltose, Malzextrakt, Dextrin, Stärke und dgl. Die Stickstoffquelle kann beispielsweise anorganisch sein und aus Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnilrat, Natriumnitrat, Kaliumnitrat oder dgl. bestehen, oder sie kann in Form organischer Verbindungen, wie beispielsweise Harnstoff, Pepton, Sojabohnenextrakt, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, Fleischextrakt und dgl. vorliegen. Als anorganische Salze können beispielsweise Natriumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat, Kaliumdih\

drogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Ferrisulfat, Zinksulfat, Calciumchlorid und dgl. vorhanden sein. Als organische Stimulantien kommen z- B. Vitamine, wie Vitamin Bi und Vitamin B* Pepton. Fleischextrakt, Maisweichwasser und dgl. in Frage.

Der pH-Wert wird durch Zusatz von Säuren, wie Salzsäure oder Essigsäure, oder Basen, wie Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd oder Ammoniumhydroxyd vorzugsweise zwischen 6 und 9 und insbesondere zwischen 7 und 8 gehalten.

Die Züchtung kann nach konventionellen Methoden, z. B. mit ruhender Kultur, Schüttelkultur oder submersen Kulturen, vorzugsweise mit Schüttelkultur, bei 20 bis 40⁰C und vorzugsweise 25 bis 37°C erfolgen. Die Dauer der Züchtung liegt zwischen mehreren Stunden und 10 Tagen, und vorzugsweise zwischen 1 und 3 Tagen.

Aus der auf diese Weise gewonnenen Gärbrühe kann das gewünschte Enzym in üblicher Weise isoliert, aufgearbeitet und gereinigt werden. Beispielsweise kann die Gärbrühe zentrifugiert werden; der überstehenden Flüssigkeit kann Wasser oder eine Pufferlösung, z. B. Acetatpuffer, Phosphatpuffer, Tris-maleatpuffer, Tris-HCI-Puffer und dgl. zugesetzt werden, wobei man eine Enzymlösung erhält, die nachstehend als Gärbrühen-Enzymlösung bezeichnet wird. Die überstehende Flüssigkeit kann auch in üblicher Weise durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ausfällen mit Aceton, Dialyse und/ oder Chromatographie über Phosphorsäuregel, Carboxymethylcellulose oder Dextrangel gereinigt werden, worauf sich dann die Zugabe des Wassers oder der Pufferlösung anschließt, so daß man eine gereinigte Enzymlösung erhält, die nachstehend auch als solche, d. h. als gereinigte Enzymlösung, bezeichnet wird. Diese Enzymlösungen können auch der Gefriertrocknung unterworfen werden, wobei man ein trockenes Enzymprodukt erhält. Beide Enzymlösungen wie auch das trockene Enzymprodukt können zur Herstellung von Präparaten zur Verhütung und Behandlung von Karies gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden.

In der Fig. 1 wird die Beziehung zwischen pH-Wert und lyolytischer Wirkung des Enzyms bei Anwendung der Enzymlösung auf kariesbildende Streptokokken wiedergegeben. F i g. 2 zeigt die Beziehung zwischen Temperatur und Wirkung der Enzymlösung.

Das erfindungsgemäß produzierte Enzym besitzt die Fähigkeit zur Lyolyse von Mikroorganismen innerhalb eines breiten pH-Bereichs, z. B. bei pH 5 bis 9, wie aus F i g. 1 zu ersehen. Die optimale Temperatur liegt bei nahezu 50 bis 60°C, wie aus Fig.2 ersichtlich. Im übrigen ist das erfindungsgemäße Enzym in der Hitze unbeständig, und es verliert beispielsweise fast die gesamte Aktivität, wenn es 20 Minuten lang bei 8O⁰C konserviert wird.

Die Einheit der lyolytischen Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms und das Ausmaß der Verringerung der Bakterienzellen durch das Enzym wurden nach folgender Methode ermittelt: 0,4 ml einer Suspension von intakten Zellen oder erhitzten Zellen des zu lyolysierenden Mikroorganismus, 2 ml einer auf die entsprechende Konzentration verdünnten Enzymlösung und 1,6 ml 0,025 M-tris-HCl-Puffer (pH 7,0) wurden unter Bildung eines Gesamtvolumens von 4,0 m! vermischt. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 37° C gehalten. Dann wurde die optische Dichte des Gemischs bei 600 Γημ in einem photoelektrischen Colorimeter gemessen und die Einheit der lyolytischen Wirkung des erfindungsgemäßen Enzyms und die Verminderung der

Bakterienzellen wurden nach folgenden Gleichungen berechnet. Eine Einheit ist definiert als diejenige Enzymmenge, die einen anfänglichen linearen Abfall der optischen Dichte von 0,001 pro Minute erzeugt. Zum Vergleich wurden 2 ml Wasser anstelle von 2 ml der Enzymlösung verwendet.

Einhcit/ml -

0,001

a: Optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 600 m bei der Reaktionszeit 0

b: Optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 600 ιημ nach der Zeit /

C-. Optische Dichte der Vergleichslösung bei 600 mn nach der Zeit ί

/: Reaktionszeit (Minuten)

v: Volumen der ursprünglichen, unverdünnten Enzymlösung

Vcrminderunu =

Optische Dichte der Veigleielislosung nach der Reaktionszeit Optische Dichte der Vergleichslösung nach der Reaktionszeit

Optische Dichte der Hnzymlösimg
nach der Reaktionszeit

100,

Das erfindungsgemäße Enzym kann spezifisch verschiedene Arten von Karies erzeugenden Mikroorganismen angreifen und besitzt gegen diese eine überlegene lyolysierende Wirkung. Das erfindungsgemäße Enzym kann infolgedessen zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries bei Menschen verwendet werden.

Das Enzym kann auch zur Verhütung und Beseitigung von Zahnstein verwendet werden. Letzterer wird ebenfalls durch Karies hervorrufende Mikroorganismen herbeigeführt und ruft seinerseits Zahnkarics hervor. Die Entwicklung von Zahnstein wird als Ergebnis der Kariesbehandlung durch das erfindungsgemäße Enzym mit ausgeschaltet.

Das erfindungsgemäßc Präparat zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries ist dadurch gekennzeichnet, daß es das Enzym nach Anspruch I als Wirkstoff in Mischung mit einem üblichen Trägermaterial enthält. Übliche Trägcrmaterialicn sind beispielsweise Wasser. Zahnpulver. Zahnpasten, Kaugummi, Salben und dgl.

Bei der Herstellung von Zahnpasten und Zahnpulvern, die das erfindiingsgemäße Enzym enthalten, können übliche Trägermaterialien verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie keine unerwünschte Wirkung auf die Aktivität des Enzyms ausüben. Es können übliche wasserunlösliche Poliermittel darin vorhanden sein. AK Poliermittel kommen beispielsweise Dicalciumphosphat, Triealciumphosphat, Magnesiumcarbonal und dgl. in Frage. Diese Poliermittel machen im allgemeinen die Hauptmenge der festen Bestandteile aus. Der Gehalt an Policrmiticln soll bei Zahnpasten vorzugsweise etwa 30 bis 60 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gcsamtpraparat, und bei Zahnpulvern 85 bis 95 Gewichtsprozent ausmachen. Das erfindungsgemäße Enzym soll in Mengen von etwa 1 bis 5000 Einheiten pro Gramm enthalten sein.

Bei der Herstellung von Zahnpasten können Weichmacher in die Mischung aus pulverförmigem Trägermaterial eingearbeitet werden, so daß man eine Paste erhält. Geeignete Weichmacher sind beispielsweise Wasser, Glycerin, Sorbit und/oder Propylenglycol. Monoglycerin-Stearat. Weiße Vaseline, Ketylalkohol und dgl., oder Gemische davon. Es kann vorteilhaft sein, dem Präparat ein gelblldcndes Mittel, wie Natriumcarboxymethylcellulosc, Hydroxyäthylcellulose. Polyvinylpyrrolidon, Traganth oder dgl. zuzusetzen. Gegebenen-Falls kann man auch noch weitere Komponenten, z. B. Aromastoffe, Süßstoffe und Farbstoffe zusetzen. Bei der Reinigung der Zähne mit einer Zahnbürste oder dem Pinger, auf welchen Zahnpasta oder Zahnpulver mit dem erfindungsgemäßen Enzym verteilt Ist, werden die auf den Zähnen befindlichen, Karies erzeugenden Mikroorganismen durch das Enzym lyolysiert und Zahnbelag wird entfernt; die Zähne werden vollständig sauber.

Eine entsprechende Wirkung kann erzielt werden, wenn man einen Kaugummi benutzt, der das erfindungs-

;o gemäße Enzym enthält.

Zur Herstellung von Kaugummi, der das erfindungsgemäß hergestellte Enzym enthält, kann man übliche Kautschukrohstoffe wie Chicle-Harz, Polyvinylacetat oder dgl. verwenden. Es können auch noch andere

;s Substanzen, wie Weichmacher, Zucker, Aromasioffe und Farbstoffe zugesetzt werden. Der Gehalt an Enzym soll 1 bis 5000 Einheiten pro Gramm des Präparats ausmachen.

Eine weitere Verwendungsform für das erfindungsge-

u> mäße Enzym ist der Zusatz zu Salben.

Eine solche Salbe mit dem erfindungsgemäßen Enzym wird auf die Zähne aufgebracht, die dann anschließend mit dem Finger oder mit einer Zahnbürste gerieben werden kann. Zur Herstellung der Salben kann

.vs man Trägermatcrialien verwenden, die üblicherweise für solche Mundsalben herangezogen werden, vorausgesetzt, daß sie keine nachteilige Wirkung auf das erfindungsgemäße Enzym ausüben Als Grundstoff einhalten diese Produkte beispielsweise Glycerin oder

.io Natrmmcarboxymcthylcellulosc, mit denen geleeartige oder cremige Salben erhalten werden. Der Gehalt an erfindungsgemäßem Enzym kann bei 2 bis JOOO Einheiten pro Gramm liegen.

Das erfindungsgemäße Enzym kann auch mit Hilfe

.ι-, eines Mundspülmitlcls auf wäßriger Basis eingesetzt werden. Derartige Mittel sollten das Enzym in Mengen von etwa 0,1 bis 50 Einheiten pro Milliliter enthalten. Das Mundspülmittel kann außerdem Antibiotika oder andere sterilisierend wirkende Substanzen aufweisen.

Es kann auch in Form eines Sprays vorliegen.

In Fällen der Verwendung eines MundspUlmiticls kann es günstig sein, den Mund anschließend nicht mit klarem Wasser auszuspülen, weil en zweckmäßig dus Enzym möglichst lange auf die Zähne einwirken soll.

5S Das erfindungsgemäßc Enzym kann ferner in Form einer Kautablette zur Anwendung kommen. Durch Kauen der Tablette oder Liegenlassen im Mund kommt das Enzym eine ausreichend lange Zeil mit den Zähnen in Berührung. Zur Herstellung der Kaulabletten kann

do man übliche Trägermaterialien, wie Mannit oder Sorbit, übliche Gleitmittel, Süßstoffe, Farbstoffe und dgl.

verwenden. Der Gehalt an Enzym beträgt in einer

Dosierungseinheit I bis 3000 Einheiten. Das erfindungsgemäße Enzym kann auch Backwaren,

wie Keksen, Kuchen und dgl. zugesetzt werden.

Schließlich ist es auch möglich, da» erflndungsgomäße Enzym Nahrungsmitteln oder Getränken zuzusetzen. Die Zugabe des Enzyms zu Nahrungsmitteln oder

Getränken kann in beliebigen Stufen des Herstellverfahrens erfolgen.

Für die Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms zur Verhütung und Behandlung von Karies kommen auch noch andere als die beschriebenen Methoden in Frage. Bei der Herstellung von Präparaten, die das erfindungsgemäße Enzym enthalten sollen, ist jedoch zu beachten, daß dieselben nicht erhitzt werden dürfen, weil das Enzym in der Wärme instabil ist. Gegebenenfalls muß das Enzym nach einer Wärmebehandlung bzw. dem Erhitzen zugesetzt werden. Das Enzym kann mit Hilfe geeigneter Stabilisatoren, wie nichtionischen Detergentien, Polysacchariden, Zuckeralkoholen, Aminosäuren und dgl. stabilisiert werden. Beispiele für besonders geeignete Stabilisatoren sind Saccharose, Mannose, Sorbit und Prolin.

Die Menge des erfindungsgemäßen Enzyms, die bei der Herstellung der genannten Präparate zur Anwendung kommt, hängt von der Art des Präparats ab. Im allgemeinen werden die Mengen so sein, daß zu einer einzigen Verwendung 1 bis 500 Einheiten und vorzugsweise 10 bis 3000 Einheiten des Enzyms vorliegen.

Das erfindungsgemäße Enzym zeigt keinerlei Toxizitat oder unerwünschte Nebenwirkungen, selbst dann nicht, wenn es über eine sehr lange Zeit benutzt wird. Wird das erfindungsgemäßc Enzym geschluckt, so wird es im Magen desaktivicrt oder zersetzt und verwandelt sich in unschädliche Aminosäuren. Im Gegensatz dazu haben fast alle Antibiotika, die üblicherweise zur Bekämpfung der verschiedenen Arten von Mikroorganismen eingesetzt werden, schädliche Wirkungen auf die Flora des Magen-Darm-Traktes.

Das erfindungsgemäße Enzym zeichnet sich ferner dadurch aus, daß es unter den Karies erzeugenden Mikroorganismen keine Stämme gibt, die g«:gen das Enzym rcsistenl sind, wogegen die Mikroorganismen gegen fast alle Antibiotika resistent sind.

Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen En/yms werden nicht nur Zellen der Karies erzeugenden Mikroorganismen lyolysiert und damit die Karies verhütet, sondern durch die Anwendung worden die /ahne selbst sehr weiß, obgleich für diesen Effekt keine Begründung bekannt ist. Das erfindungsgemäße Enzym kann nicht nur die Zellen von Karies erzeugenden Mikroorganismen lyolysicren, sondern auUmlcm die Zellen verschiedener anderer Arten von Mikroorganismen, insbesondere von gram-positiven Bakterien. besonders solchen der Art Bacillus und Lactobacillus.

In den folgenden Beispielen bedeuten Prozcntnnga bcn Oewichtsproitent pro Volumen, falls nichts anderes angegeben.

Beispiel 1

Mm Säuagnahrbodcn-Agar-Mcdium, welches 1% Glucose. 0.2% Peplon. 0.1% Hefeextrakt. 0,1% Fleischextrakt und 1,3% Agar enthielt, wurde mit dem Streplomyccs-Stamm der bei der ATCC die Hintcrle· gungsnummer 21 553 erhalten hat, inokuliert und bei 30⁰C 7 Tage lang gezüchtet. Die Sporen wurden in einen 300-ml-Sakaguchl·Kolben überführt, der 30 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,3) enthielt, welches 2% Dextrin, 0.3% Sojabohnenpulver, 0,23% F'cpton, 0,3% Dlnntrlumphosphat, 0,1% Kaliumphosphat, 0,1% Magnesiumsulfat und 0,5% Natriumchlorid enthielt. Der Kolbeninhalt wurde 3 Tage lang unter Schütteln bei 30°C gehalten. Die so erhaltene Gärbrühe wurde abfiltriert, und das resultierende Filtrat wurde mit destilliertem Wasser auf das 20fache Volumen verdünnt, dann wurde der Gehalt (Einheiten) berechnet.

In getrennten Versuchen wurden mehrere Arten von Karies bildenden Streptokokken lyolysiert. 200-ml-Kolben mit 190 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,4), welches 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Fleischextrakt, 0.5% Natriumchlorid, 0,2% Hefeextrakt, 1% Natriumacetat und 1 χ 10 ⁴M-Mangansulfat enthielt, wurden mit 3 bis 4 Platinschleifen der jeweiligen Bakterien inokuliert und 2 Tage lang bei 37°C in ruhender Kultur gehalten. Die dabei produzierten Zellen wurden abzentrifugiert, zweimal mit Wasser gewaschen, zentrifugiert und gefriergetrocknet.

Zu 400 ml einer Lösung, die durch Auflösen von 100 mg der gefriergetrockneten Zellen in 25 ml destillierten Wassers erhalten worden war. wurden unter Erzielung eines Gesamtvolumens von 4 ml 2 ml der obigen Enzymlösung und 1,6 ml 0,025 M-tris-HCI-Puffer (pH 7,0) zugesetzt. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 37°C gehalten. Die optische Dichte bei 600 ηιμ wurde im photoelektrischen Colorimeter gemessen und dann wurde die Verminderung der zu lyolysierenden Mikroorganismen nach der obigen Gleichung berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Mikroorganismen.	Verminderung	l^:inh,/n
die lyolysiert werden
sollen	5 Minuten
Karies bildender	M)	24 S
Streplokokkus (AMT)
Karies bildender	54	452
Slreptokokkus (BMT)
Karies bildender	57	475
Streplokokkus (MSR-M
Karies bildender	2d	221
Streplokokkus (MS-M
Karies bildender	}\	2()2
Streptokokkus (K-I-R)
Karies bildender	45	37')
Slrcntukokkus (I Λ-D

Beispiel 2

Der StreptomyeeS'Stnmm, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 353 erhalten hat, wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Bildung einer Enzymlö· sung gezüchtet. Ferner wurden Intakte Zellen von Karies bildendem Streptokokkus (BHT) In gleicher Weise wie In Beispiel I kultiviert, und die gefriergetrockneten Zellen wurden zwecks Herstellung der Testprobe In destilliertem Wasser gelost.

Die Lyolyse wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, und auf die dort bezeichnete Weise wurde auch die Verminderung der Mikroorganismen berechnet. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 11 zu ersehen.

700626/511

Tabelle II

Volumen der linzymlosung /u 4 ml des
Reaktionsgemisehes
/ugeset/t

Verminderung %

5 Minuten

10 Minuten

6
29

37
58

12
55
73
98

Beispiel 3

Der Slreptomyces-Stamm, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Mit der dabei erhaltenen Enzymlösung wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, verschiedenen Mikroorganismen lyolysiert, und die jeweiligen Einheiten wurden berechnet:

Tabelle III

Zu Kolvsierende Mikroorganismen liinheiien/nil

(1) gram-positive Bakterien
Karies bildender

Strcptokokkus (BHT) 455

Streptokokkussalivarius 272

Streptokokkus lactis 66

Streptokokkusbovis 456

Streptokokkus faecalis 40

Mikrokokkus lysodeikticus 30

Sarcina lutea 24

Sarcina marcescens 4

Staphylokokkusalbus 218

Siaphylokokkusaureus 18

Bacillus subtilis 1040 Bacillus sphericus . 7M Brevibactcrium

ammoniagencs 50

Lactobacillus acidophilus Jb

Lactobacillus 116

Lactobacillus brcvis 500

Lactobacillus bulgaricus 23b

Lactobacillus casei 60 Leuconostoc mcsentcroides 434 Tetrakokkus soyae 90

(2) gram-negative Bakterien Aerobactor aerogenes 658 Aeromonas hydrophilia 86 Acromobacter liquidum 40 Alcaligenes faecalis 68 Cellulomonas flovlgena 706 Escherichia coli 40 Flavobacterium

esteroaromaticum 168

Pseudomonas fragi 208 Pseudomonas aeruginosa 56 Pseudomonas fluorescens 56

(3) sonstige Mikroorganismen Mycobacterium phlel 224 Candida albicans 32 Saccharomyces cerevisiac 60 Candida utilis Ib

Beispiel 4

Mit den Sporen des Streptomyces-Stammes, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, wurden 500-ml-Sakaguchi-Kolben inokuliert, die 50 ml des flüssigen Mediums gemäß Beispiel 1 enthielten. Die Kolben wurden 24 Stunden bei 30° C geschüttelt.

Drei 3-l-Kolben mit jeweils I I des gleichen Mediums wurden mit jeweils 50 ml der so erhaltenen Gärbrühe inokuliert und dann wurde 24 Stunden lang bei 30° C geschüttelt. Die so erhaltenen Gärbrühen wurden als Impfkultur verwendet. Damit wurden 100-l-Gärtanks inokuliert, die 70 ml des obigen Mediums enthielten. Es erfolgte dann submerse Züchtung bei 30⁰C, bei einem Luftdruck von 0,5 kg pro cm-, einer Belüftungsfcschwindigkeit von 701 pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U. p. M. Die Einheiten an Enzym nach jeder Züchtungsperiode sind aus Tabelle IV ersichtlich:

Tabelle IV

Züchningsdauer
(Std.)

pH

6,92
7,08
7,20
7,38

Hinheiien/ml

80
348
534
840

Beispiel 5

101 der nach der Vorschrift von Beispiel I hergestellten Gärbrühe wurden filtriert, und das Filtrai

u wurde auf 400 g eines kationischen Ionenaustauscherharzes gegeben. Das Gemisch wurde mit konzentrier lern wäßrigem Ammoniak auf pH 5,2 bis 5,5 eingestellt und unter Kühlen I Stunde lang gerührt, dann filtriert Das auf dem Harz, absorbierte Enzym wurde mit einei

i<> 0,2 M-wäßrigen Dinatriumhydrogcnpho.sphailösunt! (pH 7,5 i/s Volumen) eluiert. Das Elual wurde durch 60%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat (455 g Ammoniumsulfat pro 1 Eluat) ausgesal/.cn. Der resultierende Niederschlag wurde in 200 ml 0,05 M-Phosphatpuffet

i> (pH 7,0) gelöst und gegen 3 I der gleichen Pufferlösung in einem Cellophanrohr 24 Stunden lang dialysiert wobei 200 ml Lösung erhalten wurden. Dieser Lösung wurden '/to ihres Volumens Diathylaminoäthyleellulose zugesetzt, dann wurde das Gemisch filtriert unc

gefriergetrocknet, wobei 2,5 g Enzympulver mit einei Aktivität von 400000 Einheiten pro Gramm crhaltcr wurden.

Beispiel 6

ss Eine Zahnpasta wurde mit folgender Formulierung hergestellt:

Glycerin

Natriumcarboxymethyl·

cellulose

Dost. Wasser Dicalciumphosphat Caldumcarbonat

Aroma

Saccharin

Ezymlösung gem. Beispiel !,unverdünnt

Gesamt

25.70%

0,95%

20,15%

46,00%

6,20%

0,25%

0,30% 100.00%

11

Beispiel 7	J¹Vi)	Beispiel ^l)	Komponcnl
	1 %	Eine Kautablette wurde aus folgenden
Ein Zahnpulver folgender Formulierung wurde	2%	hergestellt:
rgestellt:	0.2%	Enzymlösung gem. Beispiel 1.	0,1%
Natriumlauroylsarcosid	1,0%	unverdünnt	10¹Vo
Natriumcarboxymethylcellulose		Maisstärke	2%
Dinatriumphosphat	0,5%	Talk	0,5%
Saccharin	Rest	Saccharin	0.2%
Aroma	Aroma	Rest
Enzymlösung gem. Beispiel 1.	Sorbit
unverdünnt
Diacalciumphosphai

Beispiel 8

Ein flüssiges Zahnbchandlungsmiiiel mit folgender Formulierung wurde hergestellt:

Kaliumlaiiroylsarcosid	5,0¹Vo
Äthylalkohol	8.0⁰Ai
Saccharin	0,J%
Aroma	1,0"/(I
Enzymlösung gem. Beispiel I,
unverdünnt	OJ'i'o
Destilliertes Wasser	Rest

Beispiel 10

Das durch Gefriertrocknung erhaltene Produkt aus 2 ml der Enzymlösung gemäß Beispiel I (nicht durch Wasser verdünnt), 10 g Sorbit, 3b0 g Dinatriumhydrogenphospha; (Na.HPO. 12II.O), HOg Kaliumdihydro· genphosphat (KH>P()j), 1 g Saccharin und 0,5 g Aroma wurden zu einem Pulvergemisch vereinigt. Das Gemisch kann mit der 200fachen Menge destillierten Wasser; verdünnt und dann als Mundspülmittel verwende sv erden.

I liet/u 2 HI;ill Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Enzym mit der Fähigkeit zur Lyse der Zellen von Zahnkarieis erzeugenden Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Züchten des Streptomyces-Stammes, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, in einem Nährmedium nach konventionellen Methoden und durch anschließende in üblicher ίο Weise durchgeführte Isolierung aus der Fermentationsflüssigkeit erhalten worden ist.

2. Verfahren zur Herstellung des Enzyms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Strep tomyces-Stamm, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, in einem Nährmedium nach konventionellen Methoden züchtet und anschließend aus der Fermentationsflüssigkeit in üblicher Weise isoliert.

3. Präparat 2ur Verhütung und Behandlung von zo Zahnkaries, dadurch gekennzeichnet, daß es das Enzym nach Anspruch 1 als Wirkstoff in Mischung mit einem üblichen Trägermaterial enthält.