DE2011935C3

DE2011935C3 - Enzym mit der Fähigkeit zur Lyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen, Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms sowie ein Präparat zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries

Info

Publication number: DE2011935C3
Application number: DE19702011935
Authority: DE
Inventors: Shigeo Kobe Kawata; Kanae Nara Yokogawa; Yoshio Nishinomiya Yoshimura
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-06-07
Filing date: 1970-03-13
Publication date: 1975-02-27
Also published as: JPS4916629B1; FR2047888A1; DE2011935B2; GB1248896A; FR2047888B1; DE2011935A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Enzym mit der Fähigkeit zur Lyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen, ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms sowie ein Präparat zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries.

Bei dem erfindungsgernäßen Enzym handelt es sich um ein Enzym, welches die Fähigkeit zur Lyolysc der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen (wie kariogene Streptokokken und Lactobacillen) aufweist. Dieses Enzym ist dadurch gekennzeichnet, daß es durch Züchten von Streptomyces diastatochromogenes ATCC 21 481. Streptomyces farinosus ATCC 21 482 oder von Streptomyces griseus ATCC 21 483 in einem Nährmedium und durch anschließende in üblicher V/eise durchgeführte Isolierung aus der Fermentationsflüssigkeit erhalten worden ist.

Seit von Miller 1890 darauf hingewiesen worden ist, daß Zahnkaries von Bakterien hervorgerufen wird, sind die Ursachen der Zahnkaries aus mikrobiologischer Sicht von vielen Forschern untersucht worden. 1960 hat F i t ζ g e r a 1 d berichtet, daß Karies bei Hamstern experimentell durch Streptokokken hervorgerufen werden kann (The Journal of the American Dental Association, Bd. 61, S. 9 bis 19,1960). Kürzlich ist berichtet worden, daß Zahnablagerungen oder die Entwicklung von Karies unterdrückt werden kann, wenn man das durch kariogene Streptokokken erzeugte Dextran mit Hilfe eines Enzyms »Dextranase« zersetzt und so Zahnablagerungen entfernt (Fitzgerald et al. Archives Oral Biology, Bd. 13, S. 125 bis 128, 1968). So ist aus der deutschen Offenlegungsschrift 1 955 956 bekannt. Dextranase herkömmlichen Zahnpulvern und -pasten und Mundwässern zuzusetzen.

Weiterhin hat man versucht, das Wachstum von Zahnkaries erzeugenden Bakterien mit Hilfe verschiedener Medikamente zu unterdrücken und so die Zahnkaries zu verhüten oder zu behandeln. Es ist jedoch bisher nicht versucht worden, durch Verwendung eines Enzyms dte Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen zu lysieren und abzutöten.

Es wurde jetzt eine Möglichkeit zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries durch direkten Angriff auf die die Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen und dadurch durch die Verminderung des Wachstums derselben untersucht. Dabei wurde gefunden, daß die Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen (wie kariogene Streptokokken und Lactobacillen) zu den Mikroorganismen gehören, die nur schwierig der Lyse zugänglich sind. Sie lassen sich weder durch Eiweiß-Lysozym noch durch Enzyme, die von den Kulturen verschiedener Arten von Mikroorganismen, z. B. von Kulturen von Streptomyces albus, Streptomyces griseus oder Stämmen der Art Flavobakterium. erzeugt werden, lysieren, obwohl das Eiweiß-Lysozym ebenso wie die von den genannten Mikroorganismen produzierten Enzyme bekannte, die Zellwände der Bakterien angreifende Enzyme sind.

Als Ergebnis der Prüfung vieler Arten von Mikroorganismen, die im Boden und in Gewässern existieren, zum Zweck der Entdeckung eines Enzyms, welches zur Lyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen befähigt ist, konnte jetzt festgestellt werden, daß drei bestimmte Stämme, die zur Art Streptomyces gehören, ein Enzym erzeugen, welches auf Zahnkaries erzeugende Mikroorganismen stark lysierend einwirkt.

Diese drei von den Erfindern isolierten Stämme, die ein Hnzym erzeugen, welches zur Lyolyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen befähigt ist, und die bei der American Type Culture Collection, USA (ATCC) und dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (FERM) hinterlegt worden sind, sind Streptomyces diastatochromogenesATCC 21 481 (= FERM-P Nr. 326), Streptomyces farinosus ATCC 21 482 (= FERM-P Nr. 327) und Streptomyces griseus var. ATCC 21 483 (= FERM-P Nr. 328).

Die morphologischen Eigenschaften sowie Kultureigenschaften dieser Stämme sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Mikroskopische Beobachtung des Luftmycels

Tabelle

Stamm S-I = ATCC 21 4SI

lang, gerade; keine Spiralen oder Ringe unter den Sporophoren; Sporen kugelförmig

Stumm H-191 = ATCC 21 482

Luftmycel pulvrig weiß;
Sporophoren gerade
oder wellig, keine Ringe;
Sporen zylindrisch

Stamm H-402 = ATCC 21 483

Luftmycel gebrochene
Zweige; Sporophoren
gerade, keine Spiralen,
keine Rir>ge; Sporen
kueelförmie

2011 S35

Fortsetzung

Lultureigenschaften
us verschiedenen
4edien
1. Czapek 's Agar

2. Glucose-Asparagin-
Agar

3. Stärke-Agar

4. Calciummalat-Glycerin-
Agar

5. Magermilch

6. Kartoffel

Stamm S-I = ATCC 21481

7. Gelatine

8. Tyrosin-Agar

9. Nähr-Agar

Physiologische
Eigenschaften

1. Gelatine-Verflüssigung

2. Starke-Hydrolyse

3. Reduktion von

Nitrat

Stamm H-191 = ATCC21482

sehr starkes braunes Wachstum; baumwollgraues Luftmycel; lösliches Pigment rötlichbraun

sehr starkes rötüichbraunes Wachstum; baumwollartiges Luftmycel; Veränderung des Mediums von Weiß nach Grau; lösliches Pigment rötlichbraun

sehr starkes braunes Wachstum; baumwollartiges Luftmycel

sehr starkes rötlichbraunes Wachstum; pulvriges grauweißes Luftmycel; lösl iches Pigment hellrötlichbraun

Oberflächenring; kein Luftmycel; Koagulation; keine Peptonisation; lösliches Pigment hellrot

starkes schrumpliges Wachstum; Farbenveränderung von Gelb nach Dunkelbraun; grauweißes Luftmycel; lösliches Pigment dunkelbraun

Wachstum an der Oberfläche dunkelbraun; kein Luftmycel; losliches Pigment dunkelbraun sehr starkes Wachstum

sehr starkes rötlichbraunes Wachstum; bauinwollfarbiiges grauei Luftmycel; lösliches Pigment rötlichbraun

Positiv

Positiv Positiv

Stamm H-402 = ATCC 21483

sehr starkes hellgrünes
Wachstum; pulvriges
grauweißes Luftmycel;
kein lösliches Pigment

mäßiges hellgrünes
Wachstum; pulvriges
weißes Luftmycel; kein
lösliches Pigment

mäßiges heügraugrünes
Wachstum; pulvrig
weißes Luftmycel; kein
lösliches Pigment

Oberflächenring; kein
Luftmycel; Koagulation:
keine Peptonisation;
kein lösliches Pigment

starkes schrumpliges
hellbraunes Wachstum;
grauweißes Luftmycel;
lösliches Pigment grauweiß

Wachstum an der Oberfläche; kein Luftmycel;
kein lösliches Pigment

mäßig starkes dunkelgrünes Wachstum;
pulvriges grauweißes
Luftmycel; kein lösliches
Pigment

Positiv

Positiv
Negativ

sehr schwaches dünnes Oberflächen wachstum; pulvrig weißes bis gelbes Luftmycel; kein lösliches Pigment

gutes Wachstum, gefaltet, ausgebreitet, olivgelblichbraun bis cremefarbig; dünnes, pulvriges cremeweißes bis grauolivgelblichbraunes Luftmycel; kein lösliches Pigment

sehr schwaches Wachstum; Unterseite dumpfgelb; dünnes, pulvriges graues Luftmycel; kein lösliches Pigment starkes Wachstum, ausgebreitet hellgelb; pulvriges weißes bis gelbes Luftmycel; lösliches Pigment schwachgelb

Oberflächenring; Luftmycel cremegrün; Koagulation mit rascher Peptonisation, wird alkalisch

ausgezeichnetes schrumpliges Wachstum, welches sich nach Braun verändert; Luftmycel grau bis olivgelblichbraun

schwach cremefarbig; rasche Verflüssigung; Luftmycel weiß bis grau; kein lösliches Pigment schwaches Wachstum; Unterseite gelb bis hellbraun : Luftmycel schwachbraun; kein lösliches Pigment sehr starkes Wachstum; Unterseite weiß bis braun; dünnes pulvriges hellgraues Luftmycel; Pigment hellbraun

Positiv

Positiv Positiv

	2 Oil	935 ^	6	Fortsetzung	Stamm H-191 = ATCC 21482	Stamm H-402 = ATCC
5		Stamm S-I = ATCC 21481	Negativ	Negativ
	Negativ
		20 bis 3O⁰C	20 bis 30° C
4. Zersetzung von	20 bis 30" C
Zellulose		6,5 bis 7,5	6,5 bis 7,5
5. Optimale	6,5 bis 7,5	aerob	aerob
Temperatur	aerob
6. Optimaler
pH-Wert		-	-
c) Verwendung der	-	±	+
Saccharide	±	i	+
Rhamnose	+ +	+
Xylose	+	+ +	+ +
Lactose	+ +	-	—
Saccharose	—	+ +	+
Arabinose	—	+ +	+ +
Raffinose	—	—	—
Fructose	—	+ +	+ +
Mannose	+ +	-	—
Inosit	—	+ +	+ +
Galactose	+ +		+ +
Sorbit
Glucose
Mannit

Auf der Basis der vorstehenden morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften konnte eine Klassifizierung der Stämme nach B e r g e y s »Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Ausgabe, und nach Waksmans »The Actinomycetes« vorgenommen werden. Die Stämme S-I und H-191 sind offensichtlich als Streptomyces diastalochromogenes bzw. Streptomyces farinosus einzuordnen. Der Stamm H 402 ist Streptomyces griseus analog, aber etwas von diesem unterschieden, und zwar hinsichtlich der Pigmentproduktion; so ist die Farbe des Pigmentes von H-402 eher gelb, orange oder graubraun als grün. Es handelt sich infolgedessen offensichtlich um eine neue Art der Streptomycesreihe, welche als Streptomyces griseus var. H-402 bezeichnet worden ist.

Das erfindungsgemäße Enzym wird dadurch hergestellt, daß man Streptomyces diastatochromogenes ATCC 21 481. Streptomyces farinosus ATCC 21 482 oder Streptomyces griseus var. ATCC 2148? in einem Nährmedium züchtet und anschließend das Enzym in üblicher Weise aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert.

Erfindungsgemäß wird einer der drei genannten Streptomyces-Stämme in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet, welches die geeigneten Saccharide. Stickstoffquellen, anorganischen Salze usw. sowie gegebenenfalls organische Stimulantien enthält, so daß sich das gewünschte Enzym in dem Medium anreichern kann.

Geeignete Saccharide, die verwendet werden können, sind beispielsweise Glucose, Maltose. Malzextrakt. Stärke u. ä. Als Stickstoffquelle kommen beispielsweise anorganische Stickstoffquelleii. w ie Ammoniumnitrat. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid. Natriumnitrat. Kaliumnitrat u. ä. sowie organische Stickstoffquellen wie Harnstoff. Pepton. Sojabohnenextrakt. Hefeextrakt. Fleischextrakt u. ä. in Frage. Geeignete anorganische Salze sind beispielsweise Natriumchlorid, Dikaliumphosphal, Dinatriumphosphat, Magnesiumsulfat, Ferrisulfal, Zinksulfat, Calciumchlorid u. ä. Als organische Stimulantien können beispielsweise Vitamine, wie Vitamin B₁ und Vitamin B₂, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit u. ä. eingesetzt werden.

Der pH-Wert des Mediums soll zwischen 6 und 9, noch besser zwischen 7 und 8 liegen und mit Hilfe von Säure wie Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure oder durch Basen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid eingestellt werden.

Die Züchtung kann unter Anwendung beliebiger bekannter Kulturmethoden (z. B. ruhende Kultur, Schüttelkultur oder Tauchkultur) bei 20 bis 40⁰C.

vorzugsweise 25 bis 37° C, durchgeführt werden. Die Züchtungsdauer kann mehrere Stunden bis zu einigen 10 Tagen, vorzugsweise 1 bis 10 Tage umfassen.

Die auf diese Weise gewonnene Kulturbrühe, die das gewünschte Enzym enthält, kann in üblicher Weise isoliert, aufgearbeitet und gereinigt werden Beispielsweise kann die Kulturbrühe mit Hilfe einei Zentrifuge abgetrennt werden; der überstehender Flüssigkeit kann Wasser oder eine Pufferlösung, ζ. Β Acetatpuffer. Phosphatpuffer, Tris(hydroxymethyl) aminomethan-maleat-Puffer, Tris(hydroxymethyl) aminomethan-Puffer, Tris(hydroxymethyl)amino methan-HCl-Puffer) u. ä. zugesetzt werden, so dat man eine Enzymlösung erhält, die im folgenden al· Brühenenzymlösung bezeichnet wird. Die überste hende Flüssigkeit kann auch in üblicher Weise durcl Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ausfällen mit Aceton Dialyse und oder Chromatographie über Phosphor säuregel. Carboxymethylcellulose oder Dextrangc gereinigt werden, worauf sich dann die Zugabe de

6s Wassers oder der Pufferlösung anschüelit. ■.o daß mai eine gereinigte Enzymlösung erhält, die im folgende auch als solche, d. h. als gereinigte EnzymlÖ!»ung, be zeichnet wird Diese Enzymlösungen können auch de

Gefriertrocknung unterworfen werden,^ daß man ein getrocknetes Enzymprodukl erhalt.JJe.de Enzjm lösungen wie auch das getrocknete ^,»trfuk können für die Herstellung von P^raP^a™ ^e" ^„ ^ hütung und Behandlung von Zahnkanes gemaU der

Erfindung verwendet werden ,„,«,.hen

In den F i g. 1 und 2 .st das Verhaltn.s z».sehen pH-Wert und lyolysierender W.rkung te Ezyrns Lf die Zellen von Mikroorganismen dargestellu und zwar bei Anwendung der erfindungsgemaßhergestel,

ten Enzymlösungen auf kanogene Strep^kken. InFig.l wurde als Enzymlösung eine Bruhenen/yτη lösung"verwendet; in F i g. 2 handelte es sich be. der Enzymlösung um gereinigte Enzymlosung. ^ ^d^ⁿ F ig 3 und 4 der Zeichnungen,erkenn man Htät der ernndungsgemäßhergesteUten ^

sungen, -und zwar wurden die Enzymwirkunge Falle der Konservierung der Enzymlosunge" Je. ver schiedenen pH-Werten in 24 Stunden bei 4 b/:w 37 L verglichen. Aus F i g. 5 der Zeichnung^^n ergibt sah das Verhältnis zwischen Temperatur und reUUiver Wirkung der erfindungsgemaß «^^f^/f^, lösungen, wobei die Wirkung der bei 37 L jm Reaktion gebrachten Enzymlosung als Standa.d (IUU) b wird.

.5

f , _seine Aktivität fast

S_{n es} bei 8°°^{C 2}° ^{MinUten Iang} ^ίοΐαα^ ^f Die Einheit und das Reduktionsverhaltms der

^.^ _{des erfindung}sgemäßen Enzyms wurden

nach der folgenden Methode bestimmt und berechnet, na« α g ^ .^^ ^_{n oder efhitzter}

W™en Mikroorganismen, die der Lyse unter- ^u ^^ ₂ ^ ^ _Enzym, _ng, _die

_entsprechende Konzentration verdünnt war, a _{ldnes(W)25 m}Acetatpuffers(pH 6,0 wurden

™^α _undergaben insgesamt 4,0 ml. Die Mischung

vermisch^ ^ J^ ^ _q _$ ^ ^ ^

_{s0 da}ß die zellenlysierende Reaktion eintreten konnte. JJ^ _{wurde die opüsche Dichte} des Reak-

An ^ ^. ^ ^ mit e.nern pholoelek-

s Colorimeter gemessen; die Einheit und das _Reduklionsverhältnis der Akt.v.tat wurden nach den erläuterten Gleichungen berechnet. Eine t _{bedeutet dabei den} ^_{1 dm d R}^„_k.

_{]tnis der oplischen} Dichte von 1 ml der _EnZymlösung nach der zellenlys.erenden Reaktion y ^^ ^^ _verg,_ichen mit dem Wert, υ μ ^ _Reafction _festgestellt wurde Zur Kontrolle _WUrden 2 ml Wasser an Stelle von 2 ml Enzymlosung

Ä ΐ"

B.nhe.t =

_aool

. _r

hn

SScn Enzymlösung mit der Zugabe de^ lösune mehr oder weniger verändert und z

Swa 5,4"nd etwa 7.5 liegt, wie man.aus I^ Der pH-Bereich, in welchem die wn

SS2^

_{ichte der Reaktionsmischung} bei ^J _{w d Reaklionsd}auer 0 = Konzentration der Zellen.

_fc = Optische Dichte der Reakt.onsm.schung be. _{nach der ZeU (}

-■

Dntkche Dichte der

Das erfindungsuemiiße Enzym kann ^ sch eine Arten von Zahnkar.es erzeugenden

^^ enthält.

_können beisp.elswe.se

Zannkanes hervor. Die

tika, die

Das erfindungsgemäße Enzym zeichnet sich auch
dadurch aus, daß es unter den Zahnkaries erzeugenden
Mikroorganismen keine Stämme gibt, die gegen das
Enzym resistent sind, wogegen die Mikroorganismen
gegen fast alle Antibiotika resistent sind.

Die nachfolgenden Daten zeigen, daß das erfindungsgemäße Enzym überlegene zellylische Wirksamkeit gegenüber Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen besitzt.

In Tabellen wird die Wirksamkeit von lytisch wirksamem Enzym gegenüber kariogenem Streptokokkus BHT an Hand von Standard Kulturen vor Strcptomyces Species und anderen gezeigt.

Tabelle Il

Species

Mycobacterium avium
Mycobacterium avium
Mycobacterium avium
Mycobacterium phlei

Nocardia asteroides
Nocardia asteroides
Nocardia asteroides
Nocardia gardneri
Nocardia carallina

Streptomyces albus (Rossi-Doria)
Streptomyces albus
Streptomyces albus
Streptomyces coelicolor

Streptomyces rimosus
Streptomyces rimosus
Streptomyces alni
Streptomyces olivochromogenes
Streptomyces antibioücus
Streptomyces aureus
Streptomyces lavendulae
Streptomyces flavus
Streptomyces ruber
Streptomyces griseus
Streptomyces griseus
Streptomyces griseus
Streptomyces griseus
Streptomycins olivaceus
Streptomyces fradiae
Streptomyces fradiae
Streptomyces fradiae
Streptomyces purpurascens
Streptomyces hygroscopicus
Streptomyces hygroscopicus
Streptomyces hygroscopicus
Streptomyces hygroscopicus
Streptomyces scabies
Streptomyces gougerotii Micromonospora chalces

Flavobacterium sp. Flavobacterium sp.

Streptomyces diastatochromogenes Streptomyces farir.osus Streptomyces griseus var.

IFO 3802 IFO 3153 IFO 3154 IFO 3158

IFO 4324 IFO 3423 IFO 3384 IFO 3385 IFO 3338

IFO 3418 IFO 3195 IFO 3176

IFO 3226 IFO 3441

IFO 3178 IFO 3117 IFO 3175 IFO 3145 IFO 3359 IFO 3110 IFO 3122 IFO 3430 IFO 3355 IFO 3356 IFO 3409 IFO 3360 IFO 3439 IFO 3123 IFO 3389 IFO 3195 IFO 3933 IFO 3934 IFO 3935 IFO 3111 IFO 3198

IFO 12 ATCX^- 21 ATCC 21 ATCC 21 ATCC^- 21 ATCC 21 l.ytische Wirksamkeit des Enzyms in der

Brühe, die durch Züchtung! der

Mikroorganismen erhalten worden ist

(Einheit ml)

1.5 1.8

1.5 1.2

1,4 0,2 1,2 1,3 O

0,6 0.6

1,4 0,3

0,4

1,4

0,6

0,8

2,0

1.8

2.0

1,2

0,4

1.0

0.8

1.2

1.0

1.4

1.0

0,4

O
0.4

40.0 32.0

2 Oil 935

Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich, sind alle anderen Species, die zur Gattung Streplomyces gehören, z. B. Streptomyces albus und Streptomyccs griseus, und Species, die zur Gattung Teavobacterium gehören, die als Mikroorganismen mit der Fähigkeit Bakterienzellen auflösende Enzyme zu bilden, bekannt sind, gegenüber Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen nicht wirksam, während demgegenüber die erfindungsgemäß eingesetzten drei Mikroorganismen-Stämme außerordentlich wirksam sind.

Weiterhin wurde die zellytische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Enzyme und von bekannten Enzymen (d. h. Eiweißlysozym und Dextranase) gegen den kariogenen Streptokokkus BHT geprüft. Bei diesen Tests wurden die Enzyme als eine wäßrige Lösung mit einer Korrenlration an Lysozym von 436 Gamma/ml, an Dextranase von 312Gamma/ml undanerfindungsgemäßem Enzym von404Gamma,ml verwendet.

Ein Gemisch einer Suspension von kanogenem Streptokokkus BHT und einer Lösung des zu testenden Enzyms wurde der zellytischen Reaktion unterworfen, indem es 120 Minuten bei 37 C gehalten wurde. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 111 und IV zusammengestellt. In Tabelle III werden die Daten durch die optische Dichte bei 600 mu und in Tabelle IV werden -die Daten durch die Uberlebenszahl des kariogenen Streptokokkus BHT wiedergegeben.

En/ym

Kontrollprobe
Lysozym
Dextranase
Erfindungsgemäßes; Enzym

Enzym

Kontrollprobe
Lysozym
Dextranase
Erfindungsgemäßes Enzym

Tabelle III

Optische Dichte bei W)O rrw
OMin 30 Min. 60Min 90 Min.|l20Min

0,538
0.526
0,553

0,585

0,538
0,585
0,569

0,281

0,533
0.564
0,553

0,120

0,538
0,556
0,569

0,066

0.538 0,556 0.569

0.011

Tabelle IV

Uberlebenszahl des
kariogenen Slreptokokkus BHTl 10")

OMin. M Min. 60 Min. 90 Min. 120 Min

H)O

105

134

109

70

24

119

82
10
95

Wie die in den Tabellen III und IV aufgeführten Ergebnisse zeigen, besitzt das eriindungsgemäße Enzym gegenüber dem kariogenen Streptokokkus BHI überlegene zellytische Wirksamkeit, während weder das Eiweiß-Lysozym, das als Bakterienzellen auflösendes Enzym bekannt ist, noch Dextranase, von der berichtet wird, daß sie zur Kontrolle von Zahnablagerungen oder der Entwicklung von Karies wirksam ist, zellytische Wirksamkeit gegen den kariogenen Streptokokkus BHT zeigen

Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Enzyms werden nicht nur Zellen der Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen lyolysiert und so Zahnkaries verhütet, sondern durch die Anwendung werden die Zähne selbst sehr weiß, obwohl hierfür keine Gründe angegeben werden können.

Das erfindungsgemüße Enzym kann nicht nur die Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen lyolysieren, sondern auch außerdem die Zellen verschiedener anderer Arten von Mikroorganismen, so insbesondere von grampositiven Bakterien, insbesondere solchen, die zur Art Bacillus und Lactobacillus

ίο gehören.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms sowie die Herstellung von Präparaten, die das Enzym enthalten, sind in den folgenden Beispielen dargestellt. Wenn nicht ausdrücklich anders angegeben ist, bedeuten die prozentualen Mengen (%) bei der Zusammensetzung des Mediums Gewichtsprozent pro Volumen

Beispiel 1

Ein Schrägboden-Agarmedium, welches 1% Glukose. 0,2% Pepton, 0,1% Hefeextrakt, 0,1% Fleischextrakt und 1,5% Agar enthielt, wurde mit dem Streptomyces farinosus ATCC 21 482 inokuliert und 7 Tage bei 30 C kultiviert. Die Agar-Schrägkultur wurde dann mit 5 ml sterilisiertem Wasser versetzt, wodurch die Sporen ausgewaschen wurden, so daß man eine Sporensuspension erhielt. 0.5 ml der so erhaltenen Suspension wurden als Impfmaterial für eine ruhende Kultur in einem 2(X) ml fassenden Roux-Külben verwendet, der 50 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,5) mit 0,5% Glukose. 0.5% Pepton, 0,5% Natriumchlorid, 0,2% Dikaliumphosphat.0,1% Magnesiumsulfat, 0,004% Calciumchlorid, 0,002% Ferrisulfat und 0,01% Zinksulfat enthielt: die Kultur wurde 7 Tage bei 30 C gehalten. Die danach vorliegende Kulturbrühe wurde abzentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wurde mit destilliertem Wasser verdünnt, so daß man eine Enzymlösung mit dem zehnfachen Volumen erhielt.

In getrennten Versuchen wurden verschiedene Arten von kariogenen Streptokokki, die der Lyolyse unterworfen werden sollten, jeweils in Mengen von 3 bis 4 Platinschleifen zum Impfen von ruhenden Kulturen in 200-ml-Kolben verwendet. Die Kolben enthielten 190 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,4) mn 2% Glukose, 1% Pepton, 1% Fleischextrakt. 0.5% Natriumchlorid, 0,2% Hefeextrakt, 1% Natriumacetat und 1 ■ 10"⁴m Mangansulfat: die Kulturen wurden 2 Tage bei 37 C belassen. Die erzeugten Zellen wurden mit Hilfe einer Zentrifuge geerntet und zweimal mil Wasser gewaschen. Die geernteten Zellen wurder dann in 10 ml destilliertem Wasser dispergiert um durch Erhitzen auf 100 C (20 Minuten) sterilisiert Die sterilisierte Dispersion wurde dann als zu prüfend« Probe verwendet.

Zu 0,4 ml einer zu prüfenden Probe wurden 2 m der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Enzym lösung sowie 1.6 ml einesO,025 m Acetatpuffers (pH 6,C zugesetzt, so daß man eine Gesamtmenge von 4 m erhielt. Man ließ die Reaktion mehrere U) Minuter bei 37 C in der Mischung ablaufen. Die optisch Dichte der Reaktionsmischung wurde dann auf einer photoelektrischen Colorimeter bei 600 m/ gemessen das Reduktionsverhältnis der zu lyolysierendcn Mikrc Organismen wurde nach der weiter vorn beschriebene Gleichung berechnet. Die Ergebnisse sind in de Tabelle V zusammengestellt.

Tabelle V

	Reduklionsverhällnis (%)	Reaktions
Mikroorganismen,		dauer
die lyolysiert werden sollen	Reakums-	20 Min.
	dauer
	10 Min.	68
Kariogener
Streptokokkus (AHT)	34	70
Kariogener
Streptokokkus (BHT)	36	70
Kariogenei"
Streptokokkus (HHT)	37	72
Kariogener
Streptokokkus (HS-6)	38	67
Kariogener
Streptokokkus (K-I-R)	32	7!
Kariogener
Streptokokkus (FA-I)	36

Beispiel 2

Der Streptomyces griseus ATCC 21 483 wurde in · der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, so daß man eine Enzymlösung erhielt. Daneben wurden unbeschädigte Zellen von kariogenem Streptokokkus (BHT) ebenfalls in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet so daß man eine Probe für die Prüfversuche erhielt.

Mit der Enzymlösung und der Prüfprobe wurde die Lyolyse der Zellen in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt; das Reduktionsverhältnis der zu lyolysierenden Mikroorganismen wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI enthalten.

Tabelle VI

Volumen der
Enzymlösüng. die

in 4 ml der

Reaktionsmischung

enthalten ist (ml)

Reduktionsverhältnis (%)

Reaktionsdauer	Reaklionsdaucr
5 Min	i0 Min.
5	10
16	34
37	73
58	98
Beispiel 3

Die danach überstehende Flüssigkeit wurde mit 10% einer wäßrigen Calciumchloridlösung versetzt; der entstandene Niederschlag wurde wieder entfernt. Die jetzt überstehende Flüssigkeit wurde als gereinigte Enzymlösung verwendet

Getrennt wurde der kariogene Streptokokkus BHT in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise kultiviert. Die gewonnenen Zellen wurden der Gefriertrocknung unterworfen und dann in destilliertem Wasser dispergiert, so daß man eine Probe Tür die Untersuchung erhielt.

0,4 ml der zu untersuchenden Probe wurden mit 2,0 ml 0,025 m Acetatpufler (pH 6,0) und 1 ml der Brühenenzymlöeung, die mit destilliertem Wasser auf das lOfache Vdlumein verdünnt war, oder 1 ml der gereinigten Enzymlösüng, die miJ destiUiertem Wasser auf das 500fache Volumen verdünnt war, versetzt, so daß man insgesamt 4,0 ml erhielt. Man ließ die Mischung 30 Minuten bei 37' C reagieren. Die optische Dichte der Reaktionsmischung wurde dann bei 600 πΐμ gemessen, und die Einheit des Enzyms und das Reaktionsverhältnis des zu lyolysierenden Mikroorganismus wurden nach der weiter vorn angegebenen Gleichung berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt.

Tabelle VII

Brühenenzymlösung
Gereinigte F.nzymlösung

Einheil

135 4000

Rcduklionsvcrhältnis |%|

81 48

Beispiel 4

Der Streptomyces griseus ATCC 21 483 wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet. Mit der gewonnenen Enzymlösung wurde die Lyse der Zellen verschiedener Arten von Mikroorganismen in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt; die Aktivität wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengestellt.

0,01
0,10
0,20
0.40

Der Streptomyces griseus ATCC 21 483 wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, und die dabei gewonnene Kulturbrühe wurde abzentrifugierl. Die überstehende Flüssigkeit wurde als Brühenenzymlösung verwendet. Außerdem wurde die überstehende Flüssigkeit durch Sättigen mit Amrcioniumsulfal zwischen 30 und 90% weiter ausgesalzt. Der entstandene Niederschlag wurde in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und der Dialyse unterworfen. Der Lösung wurde dann so viel Aceton zugesetzt, daß der Acetongehalt 40% betrug. Nach dem Abtrennen des entstandenen Niederschlags wurde der überstehenden Flüssigkeit eine weitere Menge Aceton zugesetzt, so daß die Acetonmenge jetzt 60% betrug. Der entstandene Niederschlag wurde in der bereits erwähnten Pufferlösung gelöst und der Dialyse unterworfen.

Tabelle VIII Mikroorganismen, die lyolysiert werden

. Grampositive Bacterien
Kariogener Streptokokkus BHT ...

Streptokokkus salivarius

Streptokokkus lactis

Streptokokkus bovis

Slreptokokkus faecalis

Mikrokokkus lysodeikticus

Sarcina lutea

Staphylokokkus albus

Siaphylokokkus aureus

Bacillus subtilis PCI 219

Bacillus sphaericus

Bacillus mcgaterium

Tetrakokkus soyae

Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus arabinosus

Aktivität

95 90,7 13,3 17,1 105.5 16,2 12,9 34,2 25,7 153,9 199,5 28,0 12,9 36,8 73,6

Fortsetzung

/ο

Mikroorganismen, die lyol; siert werden

Aktivität

IO

«5

20

Lactobacillus bulgaricus 25,9

Lactobacillus casei 8,6

Lactobacillus biocbi IFO 3077 20,1

Lactobacillus biochi IFO 3078 31,6

Lactobacillus biochi IFO 3079 20,1

2. Gramnegative Bacterien

Eschericbia coli 3,8

Aeromonas hydrophila 5,7

Arthrobacter simplex 6,7

Proteus OM-9 2,2

Cellulomonas flavigena 13,3

Flavobacterium esteroaromaticum 16,7

Pseudomonas fluorescens 17,1

Pseudomonas aeruginosa 14,7

Beispiel 5

Der Streptomyces griseus ATCC 21 483 wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, und die gewonnene Kulturbrühe wurde ab/entnfugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch Sättigen mit Ammoniumsulfat im Bereich von 30 bis 90% ausgesalzt. Der entstandene Niederschlag wurde in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und der Dialyse unterworfen. Die Lösung wurde dann mit so viel Aceton versetzt, daß sich ein Acetongehalt von 40% ergab. Nach der Entfernung des entstandenen Niederschlags wurde die überstehende Flüssigkeit weiter mit Aceton versetzt, so daß der Acetongehalt jetzt 60% betrug. Der entstandene Niederschlag wurde in der bereits genannten Pufferlösung gelöst und der Dialyse unterworfen. Zu der entstandenen überstehenden Flüssigkeit gab man eine 10%ige wäßrige Calciumchloridlösung uud entfernte den Niederschlag. Die überstehende Flüssigkeit wurde der Gefriertrocknung unterworfen, so daß man eine Enzymprobe mit einer Aktivität von 544 Einheiten pro Milligramm erhielt. Die Enzymprobe wurde für den folgenden Versuch verwendet.

Wasser verdünnt wurde. Die Lösung wurde zum Impfen voa Mitis salivarius-Agarmedmm verwendet, welches Streptomycin enthielt, und bei 37°C 40 Stunden inkubiert; anschließend wurden die entstandenen Kolonien gezählt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen IX und X zusammengestellt. In den Tabellen sind die Ergebnisse von Proben nach 7 bzw. 11 ~>aen angegeben.

Tabelle IX
Anzahl der Kolonien (· 10³)

Kontrollversuch	Versuch mit Enzym
(ohne Enzym)
371	2
9	0
19	0
2	<1
173	0
3	<1
28	0

Tabelle X
Anzahl der Kolonien (· 10³)

Kontrollversuch (ohne Enzym)

151
81
14
21
25

Versuch mit Enzym

0 0 0 1 3

45

Versuch

Für den Versuch wurden Goldhamster, die 21 Tage alt waren, verwendet und mit einer kariogenen Diät gefüttert (Krasse: Archives Oral Biology, Bd. 10, S. 215, 1965). Es wurde dann sichergestellt, daß im Maul keine Streptomycin-resistenten Bakterien existierten. Danach wurde ein Streptomycin-resistenter Stamm von kariogenem Streptokokkus (K ! R) in die Backentaschen der Hamster eingeführt. Eine Gruppe der Hamster erhielt Trinkwasser, welches 7,5 Einheiten pro Milliliter des erfindungsgemäßen Enzyms enthielt. Etwa 10 ml des Trinkwassers wurden pro Tag getrunken. Die andere Gruppe der Hamster erhielt Trinkwasser, welches kein Enzym enthielt. Auch in dieser Gruppe wurden pro Tag etwa 10 ml Trinkwasser getrunken. Proben von Zahnablagerungen wurden mit Hilfe eines Stäbchens mit weichem Ende einige Tage nach der Infektion entnommen.

Die Proben wurden in einer Hefeextraktlösung dispergiert, die dann gegebenenfalls mit destilliertem

Beispiel 6

Es wurde eine Zahnpasta mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Glycerin 25,70%

Natriumcarboxymethylcellulose .. 0,95%

Destilliertes Wasser 20,15%

Dicalciumphosphat 46,00%

Calciumcarbonat 5,80%

Saccharin 0,25%

Aroma 0,65%

Brühenenzymlösung

gemäß Beispiel 3 0,50%

Gesamt 100,00%

Beispiel 7

Es wurde ein Zahnpulver mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Natriumlauroylsarcosid 3%

Natriumcarboxymethylcellulose .. 1%

Dinatriumphosphat 2%

Saccharin 0,2%

Aroma 1>8%

Enzymprobe gemäß Beispiel 5 0,01%

Dicalciumphosphat Restmenge

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Enzym mit der Fähigkeit zur Lysc der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen, S dadurch gekennzeichnet, daß es durch Züchten von Streptomyces diastatochromogenes ATCC 21481, Streptomyces farinosus ATCC 21482 oder von Streptomyces griseus var. ATCC 21483

in einem Nährmediuna und durch anschließende, in üblicher Weise durchgeführte Isolierung au:, der Fermentationsflüssigfceit erhalten worden ist.

2. Verfahren zur Herstellung des Enzyms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces diastatochromogenes ATCC 21481, Streptomyces farinosuis ATCC 21482 oder Streptomyces griseus var ATCC 21483 in einem Nährmedium züchtet und anschließend das Enzym in üblicher Weise aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert.

3. Präparat zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries, dadurch gekennzeichnet, daß es das Enzym gemäß Anspruch 1 als Wirkstoff in Mischung mit einem üblichen Trägermaterial enthält.

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