JPH03505676A - バチルスパブリからの新規細胞壁溶菌酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バチルス　バブリからの新規細胞壁溶菌酵素技術分野 本発明は新規溶菌酵素製剤、該酵素の調製方法、および増殖抑制または抗菌剤と してのこれら酵素の使用に関する。こ３５１１７）のような重要なダラム陰性菌 のものを加水分解することができる。

発明の背景 ダラム陰性菌はいたるところにあり、これらのうぢのいくつかたとえば緑膿菌お よびビブリオ　バラへモリティカスは病原性である。

細菌細胞壁を分解しうる酵素は、たとえば上記した標的とする微生物の増殖を調 節または阻止するために使用されつる。

この種の溶菌酵素は、成功していない大部分のものに対し、非常に望まれそして 長い間捜し求められてきた。

当該技術で公知の多数の細菌細胞壁分解酵素のほとんどはダラム陰性菌ではなく ダラム陽性菌のみを溶かす。

ダラム陰性菌の表面構造は非常に複雑である。ペプチドグリカンからなる内膜を 、主にリボ多糖、リポタンパク質および脂質からなる外膜が囲んでいる（シイ、 ニー、シュナイトマンＣ，Ａ、　Ｓｃｈｎａｉｔｍａｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ、　、　１９７１．１０８：５５３およびエイチ、デ仁バイルマンＨ，Ｄ 、　Ｈｅｉｌｍａｎ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１９７２゜３ Ｃ４５６）。細菌表面の多重層はほとんどの溶菌酵素が下層のペプチドグリカン に到達することを妨ぐバリヤーとして作用する（ジェイ、エム、ギー七ンＪ、　 Ｍ、　Ｇｈｕｙｓｅｎ、　Ｂａｃｔｅｒ　ｉｏｌ、Ｒｅｖ、　。

１９６Ｂ、　３２：４２５）。

本発明者らはダラム陰性菌を溶菌する当該技術で公知の３つの溶菌酵素に気がつ く　（ニス、ムラノＳ、　Ｍｕｒａ口０ら、Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　１９７４．３８：２３０５　、テ仁　ヨシモトＴ 、Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　、　１ ９７５．５３ニア０３およびケイ、スズキＫ。

５ｕｚｕｋｉら、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９８５．４９：１７１９ ）　ｏこれらの酵素はそれぞれＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル ムラミダーゼおよびセリンプロテアーゼ型のエンドペプチダーゼとして同定され る。

ダラム陽性および多くのダラム陰性菌たとえばビブリオバラへモリティカスとサ ルモネラ　アリシナを加水分解しうる細菌溶解酵素はこれまでのところ知られて いない。

発明の要約 ここにおいて、バチルス　バブリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｂｕｌｉ）の菌株が 、多くのダラム陽性菌およびダラム陰性菌たとえば大腸リウム　リクエファシエ ンス（Ｃａｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｌ１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）および ミクロコツカス　ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　　１ｕｔｅｕｓ）の細胞 壁を加水分解しつる細胞外酵素を作ることが発見された。

これらの細菌溶解酵素（また溶菌酵素ともいう）は、保護されている標的物に対 し酵素１ｒｄにつき少なくとも約１００単位好ましくは約５００単位／ｒｄを施 こすことにより細菌の増殖を阻止しおよび／または存在する細菌集団を溶菌する ために使用される。

これらの酵素は健康管理を含む様々な用途および食品工業用に有効な抗菌剤であ る。

本発明はバチルス　バプリ細菌溶解酵素、その使用方法および酵素の調製法から なる。

発明の検討 抗菌剤としての本発明細菌溶解酵素の使用を原則として食品工業におけるこれら の使用に関連して以下に述べるが、特定の好ましい使用態様についてのこのよう な強調は全体として本発明の説明を提供する都合の良い方法である。しかしなが ら、本発明の細菌溶解酵素がその溶菌作用のために食品工業以外の他の場所でも 使用されうろことは理解されるべきである。たとえば、生物学的研究に重要な数 少ない使用を掲げるために、溶菌酵素を細胞開口助剤として使用してダラム陽性 およびダラム陰性生物の両方のプロトプラスト化を促進してもよい。

抗菌剤として食品工業に有用である溶菌酵素について、酵素は広い範囲の細菌お よび特に食品腐敗を起こす微生物ならびに食品発生病原微生物を分解することが できなければならない。これまで知られている多くの細菌溶解性酵素、たとえば ミキソバクタ−（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ）　（ジエイ、シ仁エンサインＪ、Ｃ， １Ｅｎｓ　ｉｇｎら１．Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１９６６、９Ｃ５２４）か らのＡＬ−１酵素およびムタノリシン（Ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）　（ストレプ トミセス　グロビスボラスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕ ｓから）はたとえば霊菌、緑膿菌および大腸菌のような食品工業に興味のある幾 つかのダラム陰性菌に対し７不活性であるが、本発明溶菌酵素のすべては溶菌す ることができる。

４９：１７１９）および緑膿菌からの１５２−酵素−ストレプトミセスグリセウ ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｇｒｉｓｅｕｓ）Ｐ−５１からの溶菌酵素（ ティ、ヨシモトＴ、　Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ−Ｆｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈ ｎｏｌ、、　１９７５゜５３ニア０３）のような公知ダラム陰性菌溶菌酵素は、 本発明の細菌溶解性酵素より狭い標的微生物範囲を有する。

本発明の詳細な検討 細菌源 本発明の細菌溶解性酵素は、本発明者らにとって公知のバチルス　バブリの全菌 株により細胞外で作られる。２つの溶菌酵素産生菌株が本発明者らにより分離さ れた；すなわち、バチルス　バブリ菌株３５０−２　（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４ ６）およびバチルスバブリ菌株３９１−１　（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４７）　； 両方の菌株とも本発明の細菌溶解性酵素を分泌する。さらに、バチルス　バブリ の基準菌株、菌株ＮＲ８−９２４を、イリノイ州ペオリアのＵ、Ｓ、Ｄ、　Ａ、 のノーサン　レジオナル　リサーチセンターから得、そしてまた本発明の細菌溶 解性酵素を産生ずることがわかった。たとえば、各溶菌酵素は大腸菌に対し活性 である。ＮＲＲＬ　ＮＲ３−９２４と称する基準菌株は、エル、ケイ、ナヵムラ Ｌ、に、　Ｎａｋａｍｕｒａ。

Ｉｎｔ、Ｊ、ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒ、、］、９９８４４４ 月３４：２２４により記載されている。

２つの菌株はブダペスト条約の条件にしたがって米国イリノイ州ベオリアのアグ リカルチュラル　リサーチ　カルチャー　コレクションに次のように寄託された ：寄託者の参照事項　　３５０−２　　　　　　　３９１−１寄託番号　　　　 　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４６ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４７寄託日　　　　　　　 　１９８９年２月１４日　　　１９８９年２月１４日分類上の名称　　　　バチ ルス　バブリ　　バチルス　パプリバチルス　パブリの溶菌酵素産生菌株の突然 変異体たとえば上記２つの菌株または基準菌株の変異体が作られ、そしてこのよ うなものも本発明の範囲内に意図される。

また、本発明の溶菌酵素を作り出す形質転換体宿主細胞を発生する組換体ＤＮＡ 技術の使用もまた意図される。すなわち、本発明溶菌酵素はバチルス　バブリに 生来のものであり、これにより作り出される必要はない。酵素は全く異なった微 生物種の形質転換宿主細胞により作り出されてもよい。

２つの菌株の特性を以下に示す： 分離物コード　　　　３５０−２　　　　　　　３９１−１最大増殖　　　　　 　４５℃　　　　　　　　４５℃胞子形状　　　　　　楕円形または円形　　楕 円形または円形主な胞子位置　　　　中心から末端へ　　　中心から末端へ細胞 内球形１　　　−　　　　　　　　−嫌気性増殖１　　　−　　　　　　　　　 −カゼイン分解　　　　十　　　　　　　　　＋ゼラチン分解　　　　＋　　　 　　　　　　＋デンプン加水分解　く＋）制限　　　　　（＋）制限ＮＯ’−か らＮＯ”−＋　　　　　　　　　　十＊ａ　グルコース寒天上 ｂ　ペプトン水砂糖、アンドレード（Ａｎｄｒａｄｅ″Ｓ）指示側酸は３０℃に て次の炭素源から作られた：分離物３５０−２　：グリセロール、リボース、Ｄ −キシロース、ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノ ース、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチルグルコサミン 、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、サッカロース、トレ ハロース、デンプン、グリコーゲン、β−ゲンチオビオース、Ｄ−マンノース。

分子ｉ物３９１−１　　：グリセロール、リボース、Ｄ−キシロース、ガラクト ース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、マンニトール、ソ ルビトール、セロビオース、マルトース、ラクトース、サッカロース、トレハロ ース、デンプン、グリコーゲン、Ｄ−マンノース。

３５０−２株と３９１−１株の間には、エスタリン加水分解における反応とコロ ニー形態において差異がみられた。

溶菌酵素 バチルス　パプリ菌株３９１−１により作られる粗製溶菌酵素は、基質として緑 膿菌を用いた場合最適ｐＨ６−０と最適温度５０−６０℃を示した。反応緩衝液 のイオン濃度における変化は溶菌酵素の活性に影響を与える。最適イオン濃度は 、２０ｍＭ　リン酸塩緩衝液、ｐＨ７，０として分離物３９１−１により作られ る酵素に対し測定された。

これまでに入手可能なバチルス　バブリの異なった菌株は少なくとも２つの溶菌 酵素の複合体を作ることがわかっていた。各菌株は個々に異なった溶菌酵素複合 体を作り、相互の差異は存在する個々の酵素活性の内容における変化に少なくと も一部分は帰因する。異なったバチルス　バブリ菌株の各々からの酵素複合体は 、個々の（すなわち、純粋培養）試験微生物に対し他のものよりより有効である かまたはあまり有効でないかのいずれかである。しかしながら、溶菌酵素複合体 の各々は試験標的微生物のすべてに対しかなりの程度まで有効であることが見出 され、そして試験生物リストにはいくつかの公知の面倒なダラム陰性菌が含まれ る。後述の第１表を参照せよ。

細胞壁加水分解活性に対する評価 菌株３５０−２　、菌株３９１−１およびＮＲ５−９２４培養物における細胞壁 加水分解活性は、濁度減少法（ケイ、ハヤシに、ｔｌａｙａｓｈｉら、Ａｇｒｉ ｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、　１９８１．４５（１０）　：２２８９）により 測定された。

生存しているまたは凍結乾燥した標的生物、大腸菌（ＡＴ［’Ｃ２６）、緑膿菌 （ＡＴＣＣ９０２７）　、サルモネラ　アリシナ（ＡＴＣＣ１２３２３）、ビブ リオ　バラへモリティカス（ＡＴＣＣ３５１１７）およびミクロコツカス　ルテ ウス（ＡＴＣＣ４６９５）を、最初に５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，０に懸濁 させ、６６０ｎｍの０００．８とする。この細胞懸濁液２ｒＩＬ１へ、適当に希 釈された酵素ブイヨン０．５ｍｆを加え、そして反応混合物を３０℃にて２０分 間インキュベートする。インキュベート時間終了時、６６０ｎｍにおける細胞懸 濁液の濁度における減少（Δ００６６０ｎ＋ｎ）を分光光度計を用いて測定する 。

１溶菌単位は、１分間につき３０℃の細胞懸濁液濁度が００６６０ｎｍで０．０ ０１減少することを起こす溶菌酵素の量として定義される。

異なった溶菌酵素製剤の測定は、異なった試験微生物に対する細胞壁加水分解活 性に対し広く変化する値を提供することが見出されている。この可変性の点で、 ここで例示されないバチルス　パブリの菌株からの溶菌酵素は多くの標的微生物 に対し試験されその有効レベルが目的とする用途に対し適切であるかどうかｆｌ 認するべきである。

細胞数カウント実験は、６６０ｎｍでの細胞懸濁液の濁度低下が標的生物の実際 の殺滅と関連することを確認した。手段はケイ、ハヤシら（同上）により記載さ れたものと同じであるが、ただし細胞懸濁液を除くすべての溶液をオートクレー ブに入れそして溶菌酵素溶液を濾過滅菌する。インキク４ベーシヨンの最後に、 反応混合物を順次希釈し生き残った細菌数カウントのために普通寒天培地上に置 く。

細胞壁加水分解活性はまた化学的酵素検定により測定された。

（ａ、）Ｎ−アセチルムラミダーゼ活性は、基質として大腸菌（ＡＴＣＣ２６） の細胞壁を用いそしてＮ−アセチルヘキソサミン（細胞壁から放出される）の形 成を追跡することにより測定される。５０ｍＭ　ＭＢＳ緩衝液、ｐ）１６．０中 で作られた大腸菌細胞壁懸濁液１−（細胞壁１．６■含有）へ、酵素溶液０．２ ｍｌを添加し、反応混合物を振とうしながら３０分間３７℃にてインキュベート する。インキュベート時間の最後に、遠心分離により未使用細胞壁を除き、上澄 を用いてｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ＤＭＡＢ）法（ジェイ、エル、 レイシッヒＪ、Ｌ。

Ｒｅ１５５１ｇら、Ｂ　ｉｏ　１．　Ｃｈｅｍ、　、　１９５５．２１７　：　 ９５９−９６６）により放出されたＮ−アセチルヘキソサミンの濃度を測定する 。１単位は３７℃にて細胞壁から１分間当り１μｍｏｌｅＮ−アセチルへキソサ ミンを放出する酵素量である。

（ｂ）Ｎ−−アセチルグルコサミニダーゼは、３０℃にて０．０５Ｍクエン酸ナ トリウム／クエン酸緩衝液ｐＨ７゜Ｏ（０，０５ｍ１総容量）ニオケる合成基質 Ｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチル−Ｂ−Ｄ−グルコサミニド（０，５μｍｏｌ ｌｅ／ｍｌ）を用いて評価する。

加水分解された基質の量は、１＋＋＋／！０．、！ＭダグリシンＮａ０１（緩衝 液、ｐｆ１１２．５を添加することにより酵素反応終結後４１５ｎｍで吸光度を 測定することにより決定する。Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ１単位は検定条 件下で１分間以Ｍｊこ１μｍｏ１ｅＰ−二トロフェノールを遊離するであろう酵 素量として定義される。

溶菌酵素の使用 後述する第１表に示すように、バチルス　バプリ菌株３５０−２（ＮＲＲＬ　Ｂ −１８４４６）および菌株３９Ｌ−１（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４７）からの溶菌 酵素は、様々な標的生物特にダラム陰性病原菌のものに対し優れた溶菌活性を示 す。

サルモネラ、カムピロバクター、ビブリオおよび大腸菌は食品発生病原体である と認められる。細菌性の食品発生疾患の２つのタイプ、すなわぢ中毒と感染が認 められる。食品発生細菌性中毒は、その中に細菌性毒素を含む食品を摂取しその 結果食品中で細菌が増殖することにより起きる。他方、食品発生感染は、生存す る細菌を含む食品を摂取し、次いで宿主において増殖し定着するようになること で起こされ、その結果病気となる。幾つかの病原体は通常の健康な動物、場合に よっては人間の胃腸管に存在する。ある種の病原体は自然の至る所にあり、土壌 および植物中、動物排泄物ならびに動物死体に生じる。貯蔵水も大便で汚染され ている場合病原体を含む場合もある。特に湾岸水は最近認められた病原体ビブリ オ　ブルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）を含んでいる。

１種以上の病原体微生物が生食品へ侵入することを妨ぐことは非常に困難である 。

バチルス　バブリにより作られる溶菌酵素は最初に様々な生食品において１種以 」二の病原体の増殖を阻止するのに使用され、そして次いで細胞壁を溶解するこ とによりすでに存在する病原体を分解するのに使用される。第■表に示すように 、反応混合物１ｍｌにつき５００溶菌単位で３９１−１溶菌酵素製剤は大腸菌（ ＡＴＣＣ２６）の増殖を効果的に阻止することが明らかである。さらに、接種材 料（１０８個の細胞）は完全に溶解した。

同様な阻止が試験生物としてサルモネラ　アリシナ（ＡＴＣＣ１２３２３）を用 いることにより達成される。反応混合物１−につき５００溶菌単位の投与量で、 ３９１−１溶菌酵素は第■表に示すようにサルモネラ　アリシナの１００％増殖 を阻止した。

至る所にある便宜的微生物である緑膿菌の増殖はまた３　９］、−１溶菌酵素に より調節されつる（第■表参照）。５００学位／ｒｎ１の投与量で、３９１−１ 溶菌酵素は緑膿菌の増殖を７時間阻止することができた。１０００単位／ｒｎ１ ．の酵素投与レベルで９９．９９％阻止が達成された。溶菌単位は基質生物とし て大腸菌を用いて評価されたことに注意すべきである。

溶菌酵素濃厚物の調製 本発明の別の見地によれば、溶菌酵素を作る方法を提供するものであり、該方法 はバチルス　パブリの溶菌酵素産生菌株を炭素、窒素およびリンの同化源を含む 普通培地にて好気性条件下に培養し、続いて発酵ブイヨンから細胞外に産生され た溶菌酵素複合体を回収することが特徴的である。バチルス　バブリについて当 該技術で公知の好気性増殖条件および栄養素が使用される。浸漬発酵が好ましい 。

基準菌株（ＮＲ３−９２４）と同様にバチルス　パプリ菌株３５０−２（ＮＲＲ Ｌ　Ｂ−１８４４６）と菌株３９１−１（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４７）は好気性 条件下に他の必須栄養素ときもに同化性炭素および窒素を含む普通培地中で培養 され、培地は公知技術にしたがって配合されそしてそれ自体は本発明の一部を構 成しない。さらに、普通培地は通常のこん跡量の物質も含む。

適当な炭素源は炭水化物たとえばサッカロース、グルコースおよびマルトース、 または炭水化物含有物質たとえば穀粒、大麦、米およびモロコシである。培地に 混入される炭水化物濃度はたとえば１〜１５％のように広く変化するが、しかし 通常は８〜１０％が適当であり、パーセントはグルコースの当量として計算され る。

普通培地における窒素源は自然における有機または無機でよい。適当な有機窒素 源の中には、非常に多数がバチルス培養のための発酵方法に通常使用されている 。例示は大豆粉、大豆細粉、綿実粉、コーンステイープリカーおよび酵母抽出物 である。

タンク発酵における菌株の好気性浸漬培養のために、人工的曝気を使用すること が必要である。曝気の割合は通常のタンク発酵にこれまで使用されたものでよい 。

発酵後、液状酵素生成物は、ブイヨンから原因物質を除去するだけで、および所 望によりたとえば低温での蒸発または限外濾過によるブイヨンの濃縮を介して発 酵ブイヨンから作られうる。最後に保存剤を濃厚液へ加えてもよい。

指摘したように、本発明の細菌溶解性酵素は、たとえばここで記載した菌株の１ つのようなバチルス　パブリに生来の溶菌酵素をエンコードしそして発現する遺 伝子を含むように作られた形質転換微生物細胞を培養し続いて溶菌酵素を培養ブ イヨンから回収することによっＣも調製されつる。すなわち、培養されるべき微 生物は、酵素が天然（溶菌酵素を産生ずる野生株の突然変異体および変異体を含 む）であるバチルス　パブリの溶菌酵素産生株であるかまたは組換ＤＮＡ技術に より溶菌酵素の遺伝子が挿入された形質転換宿主生物のいずれかである。このよ うな技術は当該技術で現在よく知られておりここに記載する必要はない。

好ましい宿主生物はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびアスペルギルス（Ａｓ ｐｅｒｇ　ｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）の菌株である。

酵素製剤 固体酵素製剤は、たとえばＮａａＳ０４のような塩またはエタノールもしくはア セトンのような水混和性溶媒を用いて酵素を沈でんすることにより精製されたお よび／または濃縮したブイヨンから調製される。噴霧乾燥、減圧蒸発または凍結 乾燥のような乾燥方法により発酵ブイヨンからの水の完全除去もまた使用されう る。現在までのところ得られる溶菌酵素製剤の加水分解活性は通常粉末１ｇ当り 約５０００単位である。これはまだ粗生成物であり、より高い単位活性の酵素濃 縮物が所望の場合には精製されうる。

溶菌酵素を含む非ダスト粒状物は、たとえばＵ、　Ｓ、　４．１０６．９９１号 またはＩＪ、　Ｓ、　４．６６１．４５２号により調製され、粒状物は当該技術 で公知の原則にしたがって被覆される。

液状形溶菌酵素製剤は、たとえばプロピレングリコール、他のポリオール、糖質 、糖アルコールおよびホウ酸ならびに当該技術で公知の他の酵素安定剤を添加す ることにより安定化されつる。

本発明をさらに理解するために、次の特定実施例を提供する。

実施例 実施例Ｉ バチルス　バプリ菌株３９１−１（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４７）および菌株３５ ０−２（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４６）を、以下の組成の培地５０献を含む２５０ ｄ三重防止装置付エルレンマイヤーフラスコにおいて回転振とうテーブル＜２５ Ｏｒｐｍ）上で３０℃にて培養した：培地の組成（ｇ／Ａ） 大豆粉　　　　　　　１０ に２ＨＰＯ，ｌ Ｍｇ５Ｄ　４・７Ｈ２０１ 酵母抽出物　　　　　　１ ｐＨ調節は必要ではない。

培養１２〜１６時間後、ブイヨンの溶菌酵素活性度を上述の濁度減少法を用いて 測定した。菌株３９１−１ブイヨンと３５０−２ブイヨンの溶菌活性度は、標的 基質生物として大腸菌（ＡＴＣＣ２６）を用いた場合、それぞれ４９単位／ｄと ４０単位／ｒｒＬ１であった。

例■ 病原体として公知であり卵白リゾチームによる溶解が便宜的であり困難である幾 つかを含む多数の微生物を、菌株３５０−２溶菌酵素と菌株３９］、−１溶菌酵 素の両方に対する基質生物として純粋培養物中で試験した。溶菌酵素は反応混合 物１ｍ１．につき８溶菌単位で投与され（標的基質として大腸菌（ＡＴＣＣ２Ｇ ）を用いて）、テキストに記載されたように評価した。溶菌の％は次のように計 算された： 第１表に示すように、３５０−２と３９１−１溶菌酵素の両方ともダラム陰性菌 を非常に効果的に溶かす。しかしながら、３５０−２からの溶菌酵素と３９１− １からの溶菌酵素は好ましい標的生物が異なる。

ダラム陰性 大腸菌（ＡＴＣ’Ｃ２６＞　　　　　　　　　　　６５　　　　　　８２大腸菌 （Ｎ［１ＶＯ）　　　　　　　　　　　　２２　　　　　　８７緑膿菌（ＡＴＣ Ｃ９０２７）　　　　　　　　　　６６　　　　　　５６霊菌（ＱＭＢ　１．４ ６６）　　　　　　　　　　　４５　　　　　　３３ザルモネラ　アリシナ　　 　　　　　　７１６５（ＡＴＣＣ１２３２３） ビブリオ　パラへモリティカス　　　４７４３（ＡＴＣＣ３５１１，７） カムピロバクター　フエタス　　　　１１１０（ＡＴＣＣ２７３７４） ダラム陽性 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　　　　　　２８　　　　　　 ４１（ＡＴＣ［ｌ’　６６３３） コルネバクテリウム　　　　　　　　　３４５０リクエフアシエンス（ＡＴＣＣ １４９２９）ミクロコツカス　ルテウス　　　　　２５７１（ＡＴ［’Ｃ４６９ ８） ＊　大腸菌（ＮＯＶＯ）は、ニワトリの糞便から分離された大腸菌分離物である 。

例■ 大腸菌（ＡＴＣＣ２６）の増殖培養物に対する３９１−１溶菌酵素の抗菌活性は ティ、ミャマトＴ、　Ｍｉｙａｍａｔｏらにより記載された方法（Ｊ、　Ｆｏｏ ｄ　Ｈｙｇ、　Ｓａｃ、　Ｊａｐａｎ、　Ｖｏｌ、　２８．　ｐ３６４−３７１ ．１９８７）により測定された。

一晩増殖した大腸菌はぼ１０１個細胞（０，５ｍｌ容量中）を反応混合物１０ｒ ｒｆへ接種した。この混合物は普通ブイヨン５ｍｆｆ。

濾過、滅菌された３９１−１溶菌酵素１＋ｎ１（約５０００溶菌単位／ｄ）およ び滅菌水３．５ｍｌ！を含む。混合物を２０Ｏｒｐｍで振とうしながら２４時間 ３０℃にて培養した。６６０％ｍにおける吸光度の変化を測定することにより第 ■表に示すように大腸菌増殖をモニターした。２４時間のインキュベーション終 了時、培養ブイヨンを滅菌希釈し、普通寒天板上に置きそして一晩インキユベー トして実際のＣＰＵ数を得た。３９１−］溶菌酵素活性度（溶菌単位／ｍｆ）を 基質として大腸菌（ＡＴＣＣ２６）を用いることにより評価した。

第■表 増殖（ＯＤｏ。） ０μ／顎　０．０１６０．４９００．５２３０．５７４８．８ｘ　１０＠ＣＦＵ ／−５００μ／ｍｆ　　Ｏ，０２９０，０１５０，０１８０，０１９０３９１− １溶菌酵素は５００単位／献の投与量で大腸菌の増殖を阻害した。さらに、２４ 時間インキュベーション終了時、接種材料（１０８個細胞）は完全に溶菌した。

例■ サルモネラ　アリシナ（ＡＴＣＣ１２３２３＞の増殖における３９１’−１溶菌 酵素の抗菌作用を、例■に記載した方法を用いて確認した。

サルモネラ　アリシナを、２００ｒｐｍで振とうしながら２４時間２５℃　（サ ルモネラ　アリシナが増殖するのに最適温度）にて溶菌酵素を用いておよび用い ることなく培養した。普通ブイヨンは実験に用いられる培地である。基質として 大腸菌を用いて３９１〜１溶菌酵素活性度（単位／ｉｆ）を評価した。

投与量５００単位／献で３９１−１溶菌酵素がサルモネラ　アリシナの増殖を１ ００％まで阻害することができることが第■表において明らかである。大腸菌に おける３９１−１溶菌酵素の効果と同様に、サルモネラ　アリシナの最初の接種 材料（１０’個細胞）もまた完全に溶菌された。

第■表 増殖（ＯＤｏ。） Ｏμ／ｒｎｌＯ，０１４０，１０５０，３４８０，４６１１，ｌＸ１０’ＣＦＵ ／ｍ＆５０（ｌｕ／ｍｌ！　０−０２５０．０１５０．０１４０．０１３０例Ｖ 緑膿菌（ＡＴＣＣ９０２７）の増殖における３９１−１溶菌酵素の抗菌効果は、 例■に記載した方法を用いて確認された。

緑膿菌を、２００ｒｐｍで振とうしながら２４時間３０℃にて酵素を用いておよ び用いることなく培養した。普通ブイヨンは実験に用いられる培地であった。３ ９１−１溶菌酵素活性度（単位／ｍｆ）は、基質として大腸菌を用いて評価した 。

第５表に示すように、５００単位／−の投与量にて、３９１−１溶菌酵素は約７ 時間ＲＩＡ菌の増殖を阻止することができるだけであった。１０００単位／ｄの 投与量で２４時間インキコベーションすると、３９１−１溶菌酵素は生物の９９ ．９９％増足阻止を達成した。

第５表 増殖（００□。） ５００μ／＋ｆ　　Ｏ，０２４０，０２５０，０３５０，６２２１，ｌＸ１Ｏ’ ｃＦＵ／１ｆ１０００μ／ｒｎｌ　　Ｏ，０３９０，０３１０，０２８０，０２ ８１，９ＸｌＯ’ＣＦＵ／ｍ１２２４時間の時点で５００μ／ｍｊ！サンプルに ついて観察されたより良い増殖（より高いＯＤｇｓａ）は、反応混合物へ加えら れた酵素溶液に存在する特別の養分に帰因するものと思われる。

手続補正書（方式） １、事件の表示 ＰＣＴ／ＤＫ９０１００１００ 平成２年特許願第５０６５５４号 ２、発明の名称 バチルス　バブリからの新規細胞壁溶菌酵素３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　ノボノルディスクアクテイーゼルスカブ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、補正の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 明細書及び請求の範囲の翻訳文　　各　１　通国際調査報告 １＊＋＊＋ｙａｕ＋＋、ｌ　１ｌｌｌｌｌｌｃａｌ１４＃　ｋ。ＰＣＴ／ＤＫ　 ９０１００１００

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．バチルス　パブリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｂｕｌｉ）菌株に生来の細菌溶 解酵素からなり、カムピロバクター　フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　 ｆｅｔｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、霊 菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、コリネバクテリウム　リクェ ファシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） およびミクロコッカス　ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｕｔｅｓ）の細 菌細胞壁を加水分解する能力により特徴づけられる細菌溶解酵素製剤。
2. ２．バチルス　パブリ菌株ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４６、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４ ７またはＮＲＳ−９２４に生来の溶菌酵素一種以上からなる請求項１に記載の酵 素製剤。
3. ３．バチルス　パブリの細菌溶解酵素産生菌株を炭素および窒素供給源の存在下 に浸漬条件にて好気性で培養し、その後培養ブイヨンから細菌溶解酵素製剤を回 収することからなる細菌溶解酵素製剤の調製方法。
4. ４．ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４６、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４７、ＮＲＳ−９２４お よびその突然変異体から選択されるバチルス　パブリ菌株を培養することからな る請求項３に記載の方法。
5. ５．細菌増殖に対し保護される目的物へ、バチルス　パブリ由来の細菌溶解酵素 製剤を少なくとも約１００単位／ｍｌの濃度で施し、前記細菌溶解酵素製剤がカ ムピロバクター　フェタス、緑膿菌、霊菌、コリネバクテリウム　リクェファシ ェンスおよびミクロコッカス　ルテウスの細菌細胞壁を加水分解する能力を有す る、細菌増殖を阻止するかまたは細菌細胞を溶解する方法。
6. ６．バチルス　パブリ菌株であってＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４６、ＮＲＲＬＢ−１ ８４４７またはこれらの細菌溶解酵素産生突然変異体である菌株の生物学的に純 粋な培養物。