JPH0224519B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 放射菌科の多数の微生物、なかんずく、アクチ
ノプラナセアエ（Actinoplanaceae）が、グリコ
シド水解酵素、好ましくは消化管の炭水化物分解
酵素のための抑制因子を生成することは、公知で
ある（西ドイツ特許出願公開明細書2064092号）。 更に、ストレプトマイシス（Streptomyces）
属の微生物の菌株から誘導する、制菌作用を有す
る抗生物質である、ノジリマイシンが、ある種の
微生物のα−グルコシダーゼを抑制するというこ
とが公知である（T.Niwaら、Agr.Biol.Chem.
34，966〔1970）〕。 本発明によつて、バチルス（Bacillaceae）科
の微生物の培養によつて、特に桿菌（Bacillus）
属の菌株によつて、消化管中で活性である、グリ
コシド水解酵素に対する抑制因子（抑制剤）、特
にグルコシダーゼ抑制因子（抑制剤）、特にサツ
カラーゼ抑制因子（抑制剤）を生成せしめる。 加うるに、われわれは、バチルス科の微生物の
ある種の菌株、特にDSM7，DSM704および
DSM675菌株が、１−デスオキシノジリマイシン
として公知の抗生物質を生産することをも見出し
た。それ故、本発明は、バチルス属の１−デスオ
キシノジリマイシン生産微生物を培養することか
ら成る、１−デスオキシノジリマイジンの製造方
法を提供する。 以下に記す方法は、本発明の方法において用い
る適当な菌株を発見するために用いる。 バチルス科の菌株、特に桿菌属の菌株は、公知
のようにして土の試料から単離することができ
る。これらの菌株の生長を可能とする栄養溶液を
含有する培養フラスコに、これらの菌株の転移接
種（transinoculation）で接種する。たとえば、
１リツトル当り５ｇのヘプトンおよび３ｇの肉エ
キスを含有する栄養溶液を用いることができる
が、原則として、適当な炭素および窒素源ならび
に栄養素塩類を含有する多くのその他の種類の栄
養溶液を使用することができる。栄養溶液のPH値
は広い範囲内で変えることができる。6.0〜8.0の
栄養溶液の初期PHを選ぶことが好ましい。 きわめて多種の有機物質を、栄養溶液中に炭素
を供給する物質として使用することができる。例
として炭化水素、有機酸およびアルコールを挙げ
ることができる。 酵母エキス、大豆粉、ペプトン、肉エキスおよ
びその他の多くの物質を、窒素源ならびに適当な
無機窒素源として用いることができる。 炭素および窒素源ならびに、例としてFeCO₄，
CaCO₃およびMgSO₄を挙げげることができる栄
養塩類の濃度は、広い範囲内で変えることができ
る。ある場合には、栄養塩類は、複雑な窒素源中
に、付随する物質として、しばしば含有されてい
るから、これらの塩類の別個の添加を省くことが
できる。 抑制因子の生成は、しばしば、栄養培地の組成
に著るしく依存するから、生産能力を最高とする
ために菌株を異なる栄養溶液中で培養することが
望ましい。適当な計画は実施例により知ることが
できる。 たとえば100〜200mlの栄養溶液を１の円錐フ
ラスコ中に入れ、公知のようにして滅菌したの
ち、試験すべき菌株を接種し、次いでフラスコ
を、振とう機上で、15〜80℃において、好ましく
は24〜40℃、または好熱性の細菌の場合には50〜
70℃において、培養する。培養物が、一般に１〜
10日後に、通常は１〜５日後に、認めることがで
きる生長を示すときは、たとえば５mlの試料を取
出して、この試料中の細胞を、過または遠心分
離によつて分離する。以下に記す試験において
は、１〜100μの培養液を用いて、１ml当りの
抑制能力を計算する。 細胞を、各回５容量（細胞の容量に対して）の
アセトンを用いて２回抽出し、次いで５容量のジ
エチルエーテルによつて１回抽出する。併せた抽
出物を乾固するまで濃縮し、水中に取つて凍結乾
燥する。凍結乾燥物を10〜1000μｇ／mlの濃度
で、以下に記す試験に用いる。 アミラーゼ試験 アミラーゼ抑制因子単位（1AIU）は、２アミ
ラーゼ単位を50％の範囲まで抑制する抑制因子の
量と定義する。アミラーゼ単位（AU）は、下記
の試験条件下に、１分間に殿粉中の1μ当量のグ
ルコシド結合を分解する酵素の量である。分解し
た結合のμ当量数は、比色的に、ジニトロサリチ
ル酸を用いて、生成する還元糖のμ−当量として
測定し且つマルトース標準曲線の助けをかりて、
マルトース当量のμ−当量として示す。試験を行
なうためには、PH6.9の0.4mlの0.02Mグリセロ燐
酸ナトリウム緩衡液／0.001MCaCl₂中の10〜
1000μｇの抑制因子、すなわち１〜100μの試験
すべき培養液を、1.0mlのアミラーゼ溶液（20〜
22AU／ml）に加え、且つその混合物を35℃の水
浴中で約10〜20分間平衡化する。次いで、予め35
℃に加温してある、濃度１％の殿粉溶液0.5mlと
共に35℃において５分間培養したのち、１mlのジ
ニトロサリチル酸試薬（Colowick−Kaplan，
Meth.Enzymol.，第１巻、149頁中のP.Bernfeld
による）を加える。発色させるために、このバツ
チを沸とう水浴上で５分間加熱し、次いで冷却し
且つ10mlの蒸留水を加える。540nmにおける吸光
を同様にして調製した、アミラーゼを含有しない
ブランク値に対比して測定する。評価のために、
抑制因子の添加後になお有効なアミラーゼの活性
を、予め記録してあるアミラーゼ標準曲線から読
み取り、この値から使用したアミラーゼの抑制百
分率を計算する。抑制百分率を、商 抑制因子μｇ※ ／AU※※ ※ 乾燥物質に対して ※※ 抑制せしめてない同系列のバツチ中の
AUの関数としてブロツトし、この曲線から
50％抑制点を読み取り、抑制因子のAIU／
mgに換算する。 サツカラーゼ試験 サツカラーゼ抑制因子単位（SIU）は、２サツ
カラーゼ単位を50％の範囲まで抑制する抑制因子
の量として定義する。１サツカラーゼ単位（SU）
は、下記の試験条件下に、１分間に1μモルのス
クロースをグルコースとフルクトースに分解する
酵素の量である。生成するグルコースのμモル数
は、サツカラーゼによるスクロースのそれ以上の
分解がもはや生じない条件下に、グルコースオキ
シダーゼの助けをかりて、定量する。この試験を
行なうためには、１〜20μｇの抑制因子、すなわ
ち１〜20μの測定すべき溶液を、0.12SUの含量
に調節した0.05mlのサツカラーゼ溶液に加え、そ
の混合物をPH6.0の0.1Mマレイン酸ナトリウム緩
衡液を用いて0.1mlにする。PH6.0の0.1Mマレイン
酸ナトリウム緩衡液を用いて適当なSU含量に希
釈した。B.Borgstrom，A.Dahlquist，Acta.
Chem.Scand.，12（1958）、1997頁による豚の小腸
粘膜からの可溶化したサツカラーゼを用いること
が適当である。この混合物を35℃で10分間平衡化
させたのち、予め35℃に加温した、PH6.0の0.1M
マレイン酸ナトリウム緩衡液中における0.05Mの
スクロース溶液0.1mlを加える。この混合物を35
℃で20分間培養し、１mlのグルコースオキシダー
ゼ試薬の添加によつてサツカラーゼの反応を停止
させ、次いで混合物を35℃において更に30分間培
養する。グルコースオキシダーゼ試薬は、２mgの
グルコースオキシダーゼ（メツサーズベーリンゲ
ル、純度）をPH7.0の100mlの0.565Mトリス−
HCl中に溶解し、次いで１mlの洗剤溶液（２ｇの
トリトンＸ＋８ｇの分析級95％エタノール）、１
mlのジアニシジン溶液（20mlのH₂O中の260mgの
ｏ−ジアニシジン・2HCl）および0.5mlのペルオ
キシダーゼ（メツサーズベーリンゲル、凍結乾燥
物、純度）の濃度0.1％水溶液を加えることに
よつて調製することが適当である。次いで１mlの
濃度50％のH₂SO₄を加えたのち、混合物を、相
当するブランク値と対比して、545nmにおいて測
定する。評価のために、使用するサツカラーゼの
抑制百分率を計算し且つグルコース標準曲線の助
けをかりて、50％抑制点からSIU／ｇまたは
SIU／に換算する。 マルターゼ試験 マルターゼ抑制因子単位（MIU）は、２マル
ターゼ単位を50％の範囲まで抑制する抑制因子の
量として定義する。１マルターゼ単位（MU）
は、下記の試験条件下に１分間に1μモルのマル
トースを2μモルのグルコースに分解する酵素の
量である。生成するグルコースのμモルは、マル
ターゼによるマルトースのそれ以上の分解がもは
や生じない条件下に、グルコースオキシダーゼ反
応の助けによつて、定量する。試験を行なうため
に、１〜20μｇの抑制因子は、すなわち１〜20μ
の試験すべき溶液を、0.060〜0.070MUの含量
に調節した0.05mlのマルターゼ溶液に加える。B.
BorgstromおよびA.Dahlquist，Acta Chem.
Scand.12，1997（1958）に従がい、豚の小腸粘膜
からの可溶化したマルターゼを使用し、PH6.0の
0.1Mマレイン酸ナトリウム緩衡液によつて適当
なMU含量に希釈することが適当である。この混
合物をPH6.0の0.1Mマレイン酸ナトリウム緩衡液
を用いて0.1mlとし且つ35℃において10分間平衡
化させる。次いで、予め35℃に加温した。PH6.0
の0.1Mマレイン酸ナトリウム緩衡液中の0.05M
マルトース溶液0.1mlを加える。この混合物を35
℃において20分間培養し、マルターゼ反応を、サ
ツカラーゼ試験方法において記したグルコースオ
キシダーゼ試薬１mlの添加によつて、停止させた
のち、混合物を35℃において更に30分間培養す
る。次いで１mlの濃度50％H₂SO₄を加え且つ混
合物を、相当するブランク値に対比させて、
545nmで測定する。 評価のために、使用するマルターゼの抑制百分
率を計算し且つグルコース標準曲線の助けによつ
て、50％抑制点からMIU／ｇまたはMIU／に
換算する。 バチルス科の多数の菌株を、上記の方法によつ
て試験した。グルコシド水解酵素に対する顕著な
抑制活性が、特にバチルス属の菌株の場合に、こ
こに認められた。枯草菌（B.subtilis）、枯草菌ニ
ゲル変種（B.subtilis var.niger）、アミロリケフ
アシエンス菌（B.amyloliquefaciens）、ロンギス
ポルス菌（B.longisporus）、ポリミクサ菌（B.
polymyxa）およびコアギユランス菌（B.
coagulans）の種は、収率に関してもつとも有利
であることが認められた。 試験において活性な抑制剤であることが記載の
方法によつて認められた菌株における頻度は、５
％を超えた。特に活性な菌株の例を、第１表に示
す： 【表】 上の表の菌株は、ゲツチンゲンにあるドイツ微
生物蒐集所（Deutsche Sammulung fur
Mikroorganismen）（DSM）において、規定し
たDSM番号のもとに保管されており、且つそこ
から取得するこことができる。 菌株DSM704，740，741および742は新菌株で
ある。それ故、本発明は、これらの菌株の試験管
内培養をも包含する。これらの菌株の性質を第２
表に示す。残りの菌株は、文献により公知であり
且つDSMの“1974年菌株カタログ”中に記され
ている。 【表】 の生成

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 桿菌属の１−デスオキシノジリマイシン生産
   微生物を培養することを特徴とする、１−デスオ
   キシノジリマイシンの製造方法。 ２ 菌株FERM−P4234（DSM7）、FERM−ＰNo.
   4235（DSM704）、FERM−ＰNo.4244（DSM675）
   またはFERM−ＰNo.4248（DSM372）の微生物を
   培養する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 微生物を栄養溶液中で15〜80℃の温度で１〜
   ８日間、通気と共に、培養し、細胞を遠心分離し
   且つ１−デスオキシノジリマイシンを培養液から
   または細胞抽出物から単離する、特許請求の範囲
   第１又は２項の何れかに記載の方法。