CH640002A5 - Procedimento per la produzione di fruttosio e sciroppi contenenti fruttosio e glucosio mediante ceppi microbici. - Google Patents
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Description
640002
2
RIVENDICAZIONE Procedimento per la produzione di fruttosio e sciroppi contenenti fruttosio e glucosio consistenti nel mettere in contatto una soluzione di glucosio con un microorganismo del genere Streptomyces sp., contrassegnati dai numeri di deposito NRRL e NRRL 11 120 e 11 121.
to:
Essi possiedono le caratteristiche riportate qui di seguici 71/A
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la produzione di fruttosio e sciroppi di fruttosio e glucosio mediante l'impiego di un enzima isomerizzante, ottenuto da microorganismi del genere Streptomyces.
Per l'isomerizzazione enzimatica di glucosio in fruttosio viene aggiunta la glucosioisomerasi (D-xilosio-chetol-iso-merasi, 5.3.1.5) ad una soluzione di glucosio, p. es. sciroppo di mais, e le condizioni di reazione vengono controllate in modo tale che una parte del1 glucosio viene tasformata in fruttosio, la quantità di glucosio che viene trasformata in fruttosio dipende da una costante di equilibrio che è, a 60°C, eguale ad 1.
Numerose pubblicazioni descrivono procedimenti enzimatici per la trasformazione di glucosio in sciroppi contenenti glucosio e fruttosio utilizzando enzimi estratti da numerose specie di microorganismi dei generi Pseudomonas, Lactobacillus, Escherichia, Aerobacter, Bacillus ecc.
Il procedimento per la produzione di fruttosio e sciroppi contenenti fruttosio e glucosio secondo l'invenzione è caratterizzato nella rivendicazione precedente.
Questi ceppi, isolati da terreno di bosco nell'orto botanico di Pavia, sono contrassegnati con i numeri CI 71/A e CI 77/22 e sono depositati presso il Northern Regional Research Center US Department of Agriculture, Peoria (111.) (il 1. 6. 1977) con i numeri NRRL 11 120 e NRRL 11 121.
A. colore del micelio maturo e sporificato io B. morfologia degli sporangi
C. pigmenti melanoidi marrone scuro
15
D. superficie delle spore
E. Assimilazione di fonti di carbonio D-glucosio D-xilosio D-arabinosio L-ramnosio D-fruttosio D-galattosio raffinosio D-mannitolo i-inositolo salicina saccarosio
F. formazione di composti con attività antibiotica
35 G. colore del micelio vegetativo
20
25
30
grigio (Gy)
rectus flexibilis
(RF)
presenti (C+)
smooth (SM)
+ + + + +
40
H. sensibilità contro la streptomicina
+ +
assente crema a marrone chiaro sensibile
CI 77/22
grigio (Gy)
rectus flexibilis
(RF)
presenti (C+)
smooth (SM)
+ + +
(+) +
+
(+) +
assente crema a marrone chiaro sensibile
Le prove (esclusa E) venivano eseguite su Asparagine agar Fe-Co. Per prova di utilizzazione di diverse fonti di 45 carbonio (E) veniva usato il terreno basale di Pridham e Gottieb (1948).
Secondo le descrizioni in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Edizione 8° (1974) i ceppi Streptomyces sp. CI 71/A e CI 77/22 appartengono alla serie gri-50 già, si differenziano in 2 o più caratteristiche biochimiche dalle 25 specie inserite in questa serie.
Le colture dei microorganismi che fanno parte di questa invenzione possono essere eseguite in condizioni aerobiche con, qualsiasi metodo noto p. es. in colture di super-55 ficie o, preferibilmente in coltura sommersa, usando fermentatori agitati.
Un terreno di coltura, che può essere solido o liquido, contiene una fonte di carbonio assimilabile, una fonte di azoto nonché sali minerali e oligoelementi.
60 Come fonti di carbonio possono essere usati estratto di malto, glucosio, maltosio, saccarosio nonché altri zuccheri, glicerina, corn steep liquor, amminoacidi, peptidi ecc. Come fonti di azoto possono essere usati composti di azoto organici od inorganici come estratto di lievito, peptone, tryp-65 tone, estratto di carne, amminoacidi, idrolizzati di caseina, farina di soia, sali di No~3 e di NH+4. Per una buona crescita sono inoltre necessari oligoelementi come magnesio, cobalto, fosforo, zolfo e fattori stimolanti di crescita.
3
640002
Un importante vantaggio dei ceppi di Streptomiceti, che sono oggetto della presente invenzione, è il fatto che sono in grado di idrolizzare xilani.
Lo xilosio, comunemente usato da induttore dell'attività enzimatica è molto caro e la possibilità di utilizzare ali suo posto xilani che sono molto comuni in natura (paglia di grano 15-20%; bagassa 30%; legno di conifere 7-12%; legno di latifogli 20-25%; gusci di semi oleosi 25-30%), costituisce un importante vantaggio. Lo xilosio può essere ottenuto anche per idrolisi acida di xilani. Durante l'idrolisi acida si formano però composti non desiderati o tossici per i microorganismi come p. es. furfurale, idrossimetilfur-furale e acido levulinico.
Un terreno di coltura idoneo ha p. es. la seguente composizione:
estratto di lievito 5-20 g/1
glucosio 10 g/1
tracce di KH2P04, MgS04
NH4C1< o NaNOg 1 g/1
La soluzione viene portata con soda o tampone fosfato a pH 7. L'intervallo di pH idoneo per la coltura è compreso fra 5 e 9, preferibilmente tra 6,8 e 7,3 e la temperatura tra 20 e 40°C, preferibilmente 29-31°C.
Si è dimostrato vantaggioso scindere la fase di crescita dalla fase di induzione. In pratica si aggiunge l'introduttore, xilosio o xilani dopo la fase di crescita dei microorganismi. Se nel terreno di crescita è stato usato glucosio come fonte di carbonio è opportuno raccogliere la biomassa mediante centrifugazione, separandola dal terreno di crescita e di trasferirla nel terreno d'induzione contenente 0,5-2% xilosio e ioni Co++ o Mg++.
L'estrazione della glucosioisomerasi dal micelio avviene con i comuni metodi usati in enzimologia. Per questo scopo le cellule vengono disintegrate con appositi apparecchi, p. es. French Pressure Cell, Manton Gaulin Homogenizer, disintegratori rotativi ecc., oppure con ultrasuoni. L'enzima può essere estratto altrettanto bene da polveri acetoni-che o da liofilizzati.
La glucosioisomerasi, ottenuta dai ceppi microbici, che sono oggetto della presente invenzione, è caratterizzata da una buona termostabilità.
L'isomerizzazione del glucosio può avvenire con un metodo noto. Si può aggiungere la soluzione di glucosio direttamente ad una coltura di microorganismi cioè a micelio fresco, oppure conservato in stato congelato, nonché a polvere acetonica o micelio liofilizzato. In questi casi è necessario stabilizzare l'isomerizzazione attraverso trattamento del micelio per 30 min a 75°C, pH 7,5.
È altresì possibile utilizzare preparazioni che contengono l'isomerasi come estratti o come concentrati di essi, preparazioni di isomerasi grezza o purificata e che sono state ottenute dal micelio di microorganismi sopra menzionati.
Infine un ulteriore miglioramento tecnico ed economico può essere apportato immobilizzando l'enzima attraverso combinazione con composti macromolecolari mediante formazione di legami chimici con la matrice, oppure legami di tipo ionico, oppure mediante immobilizzazione fisica.
Gli esempi che seguono evidenziano altre modalità operative concernenti la presente invenzione ma non solo limitanti di essa.
Esempio 1
Si prepara un brodo di coltura avente la seguente composizione:
Estratto di lievito
10
gr/1
Idrolizzato enzimatico di caseina
10
gr/1
NasHPO, X 12H20
6
gr/1
kh2po4
3
gr/1
nh4ci
1
gr/1
MgS04 X 7H20
0,2
gr/1
glicerolo
10
gr/1
sciogliendo i suddetti composti in acqua deionizzata e portando a pH 7,0 con soda.
Il terreno, così preparato, viene distribuito in beute con collo largo da 500 mi, addizionando 100 mi di brodo per beuta; si sterilizza per 30' a 116°C.
Esse vengono inoculate con una sospensione, in acqua deionizzata sterile, di spore del ceppo CI 71/A di Streptomyces, cresciuto per 4-5 giorni a 30°C su slants di agar Asparagina Fe-Co, la cui composizione è la seguente:
L-Asparagina
10
gr/l
Beef-extract
2
gr/l kh2po4
0,5
gr/l
CoC12 X 6h20
1
mgr/1
FeSO, X 7h20
1
mgr/1
xilosio
10
gr/l
Agar
20
gr/l sciogliendo i suddetti composti in acqua deionizzata e portando a pH 7,0 con soda; si sterilizza per 30' a 116°C. L'incubazione viene condotta sotto agitazione orbitale (220 r.p.m.) a 30°C.
Dopo 24 ore dall'inoculo si aggiungono per ogni beuta 1 gr di xilosio e 0,024 gr di CoCl2 X 6HaO. Dopo altre 24 ore di incubazione le cellule vengono raccolte per centrifugazione e lavate con tampone Na2SOa 0,1 pH 7,0, contenente Co++ 10~4M ed Mg++ 5 X 10~3M.
Da 100 mi di questa brodocoltura si ottenevano 4,9 gr di cellule umide.
Queste cellule venivano risospese in 49 mi del tampone Na2S03 0,1 M pH 7,0 sopra indicato (1 gr di cellule umide in 10 mi di tampone) e le sospensioni cellulari passate alla French Pressure Celi Press, fino alla rottura delle cellule.
Nell'estratto grezzo così ottenuto veniva determinata l'attività enzimatica: 1 gr di cellule umide conteneva 290 unità di enzima.
Una porzione di cellule umide era stata messa in stufa a vuoto per determinarne il peso secco e da 1,76 gr di cellule umide si erano ottenuti 0,340 gr d'i cellule secche.
L'attività enzimatica veniva determinata nel seguente modo:
ad una miscela di reazione contenente:
4,5 mi di soluzione di substrato (D-glucosio 3,67 M, Mg++
5 X 10'3M, Co" 10~4M, Na^Oa 0,1 M in acqua deionizzata, pH 7,0)
venivano aggiunti 0,5 mi di estratto grezzo.
5
io
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
640002
4
L'incubazione avveniva per 2 ore di bagnomaria a 60°C. La reazione era bloccata raffreddando a 0°C la miscela. Le rotazioni ottiche del campione (a2h) e del campione (a0) erano misurate a temperatura ambiente in un polarimetrico Perkin - Elmer 141 linea del sodio (549 nm), cammino ottico della euvetta = 0,1 dm.
Se definiamo come (Unità - SNAMPROGETTI) quella porzione di enzima che produce 1 mgr di fruttosio per ora nelle condizioni di saggio sopra citate, le unità di enzima per gr di cellule umide si ottengono con la seguente:
U = (a0 — a2g) X (mgr di glucosio saggio)
- ^ ^
SLlde611' [(asl,,J ~ (a'™")] X 0.1 X C X 0,5 X 2
dove (a„iuc) = +54°, 16
(Ofrntt.) = -98°, 35
C = gr/ml
0,1 - cammino ottico (dm).
Esempio 2
Brodo colture del ceppo CI 77/22 di Streptomyces, preparate come nell'esempio 1 vengono incubate sotto agitazione orbitale a 30°C.
Dopo 24 h dall'inoculo si aggiungono ad ogni beuta
1 gr di xilosio e 0,024 gr di CoCl2 X 6H20. Dopo altre 24 h di incubazione a 30°C, le cellule vengono raccolte per centrifugazione e lavate con tampone Na2SOs 0,1 M pH 7,0, contenente Co++ 10~4M ed Mg++ 5 X 10 3M.
Da 100 mi di questa brodocoltura si ottenevano 5,2 gr di cellule umide.
Queste cellule venivano risospese in 52 mi del tampone Na2SOs 0,1 M pH 7,0, sopra citato, (1 gr di cellule umide in 10 mi di tampone) e le sospensioni cellulari passate alla French Pressure Celi Press, fino alla rottura delle cellule.
Nell'estratto così ottenuto veniva determinata l'attività enzimatica: 1 gr di cellule umide conteneva 300 unità di enzima.
Una porzione di cellule umide era stata messa in stufa a vuoto per determinare il peso e da 1,80 gr di cellule umide si erano ottenuti 0,312 gr di cellule secche.
Esempio 3
Brodo colture del ceppo CI 71/A di Streptomyces, preparate come nell'esempio 1 e inoculate in un terreno di crescita avente la stessa composizione di quello dell'esempio 1, salvo che il glicerolo è sostituito con gli xilani (come fonte di carbonio), vengono messe a incubare sotto agitazione a 30°C. Dopo 24 h dall'inoculo, si aggiungono ad ogni beuta 0,024 gr di CoCl2 X 6H20. Dopo altre 24 h di incubazione a 30°C, le cellule vengono raccolte per centrifugazione e lavate con tampone Na2S03 0,1 M pH 7,0, contenente Co** 10-4M e Mg" 5 X 10 3M.
Da 100 mi di questa brodocoltura si ottenevano 3,3 gr di cellule umide.
Queste cellule venivano risospese in 33 mi del tampone Na2SO, 0,1 M pH 7,0, sopra citato (1 gr di cellule umide in 10 mi di tampone) e le sospensioni cellulari, passate alla French Pressure Celi Press, fino alla rottura delle cellule. Nell'estratto così ottenuto veniva determinata l'attività: 1 gr di cellule umide conteneva 190 unità di enzima.
Esempio 4
Brodo colture del ceppo CI 77/22 di Streptomyces, preparate come nell'esempio 3, vengono messe a incubare sotto agitazione a 30°C.
Dopo 24 h dall'inoculo, si aggiungono ad ogni beuta 0,024 gr di CoCl2 X ôELjO. Dopo altre 24 h di incubazione a 30°C, le cellule vengono raccolte per centrifugazione e lavate con tampone Na2SOa 0,1 M pH 7,0 contenente Co++ 10~4M e Mg++ 5 X 10-3M.
Da 100 mi di questa brodocoltura si ottenevano 3,2 gr di cellule umide.
Queste cellule venivano risospese in 32 mi del tampone Na^Oj 0,1 M pH 7,0, sopra citato (1 gr di cellule umide in 10 mi di tampone) e le sospensioni cellulari, passate alla French Pressure Celi Press, fino alla rottura delle cellule. Nell'estratto così ottenuto veniva determinata l'attività: 1 gr di cellule umide conteneva 200 unità di enzima.
Esempio 5
Brodo colture del ceppo CI 71/A di Streptomyces vengono preparate e le cellule indotte come nell'esempio 1.
A fine induzione, le cellule vengono raccolte per centrifugazione e lavate con tampone Na2SOa 0,1 M pH 7,0, contenente Co++ l(h4 e Mg++ 5 X 103M.
Da 400 mi die questa brodocoltura si ottenevano 18,3 gr di cellule umide.
6,2 gr di cellule umide venivano risospese in 25 mi di tampone Na2SOs 0,1 M pH 7,0 e aggiunte, sotto agitazione a — 10°C, a 120 mi di acetone. Dopo 15 minuti di trattamento, le cellule venivano filtrate su carta da filtro, lavate con acetone, raccolte e seccate sotto vuoto a temperatura ambiente.
Da 6,2 gr di cellule umide si otteneva in questo modo 1,1 gr di cellule secche.
Sulla polvere acetonica veniva determinata l'attività enzimatica: 1 grammo di cellule trattate con acetone conteneva 2370 unità di enzima.
Esempio 6
Brodo colture del ceppo CI 77/22 di Streptomyces vengono preparate e le cellule indotte come nell'esempio 1.
A fine induzione, le cellule vengono raccolte per centrifugazione e lavate con tampone Na2SOs 0,1 M pH 7,0, contenente Co++ IO-4 e Mg"1"1" 5 X 10_3M.
Da 400 mi di questa brodocoltura si ottenevano 28,2 gr di cellule umide.
9,2 gr di cellule umide venivano risospese in 25 mi di tampone Na^C^ 0,1 M pH 7,0 e aggiunte, sotto agitazione e alla temperatura di — 10°C, a 120 mi di acetone. Dopo 15 minuti di trattamento, le cellule venivano filtrate su carta da filtro, lavate con acetone, raccolte e seccate sotto vuoto a temperatura ambiente.
Da 9,2 gr di cellule umide si otteneva in questo modo 1 gr di cellule secche.
Sulla polvere acetonica veniva determinata l'attività enzimatica: 1 gr di cellule trattate con acetone conteneva 2100 unità di enzima.
Esempio 7
Cellule del ceppo CI 77/A di Streptomyces, vengono preparate come nell'esempio 1 e trattate con acetone come nell'esempio 5.
Le cellule trattate con acetone vengono usate per determinare la percentuale di isomerizzazione del glucosio in funzione del tempo, nella miscela di reazione.
Le condizioni di saggio erano le seguenti:
a) cellule trattate con acetone: 10 gr b) volume di substrato: 1 litro c) temperatura di reazione: 60°C.
II substrato aveva la seguente composizione: glucosio 60% (p/v), Mg++ 5 mM, Co++ 0,1 mM, Na2SOs 100 mM, pH 7,0.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Le percentuali di isomerizzazione erano le seguenti:
Tempo (ore) % conversione
3
12
6
20
9
27,2
12
32,6
15
37,1
18
40,5
23
44,5
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