DK145679B - Fremgangsmaade til fremstilling af fructose - Google Patents

Description

i 145579

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af fructose ved isomerisering af en opløsning af glucose ved kontakt med en microorganisme af Streptomyces-slægten eller med et enzym stammende 5 herfra.

Til enzymatisk isomerisering af glucose til fructose, sættes glucose isomerase (D-xylose-ketol-isomerase, 5, 3, 1, 5.) til en opløsning af glucose, f.eks. majssirup, og reaktionsbetingelserne kontro-10 lieres på en sådan måde, at en del af glucosen omdannes til fructose, idet mængden af glucose, der omdannes til fructose, er en funktion af en ligevægtskonstant, som ved 60°C er 1.

En række litteratursteder beskriver enzymatiske 15 fremgangsmåder til omdannelse af glucose til sirupper, der indeholder glucose og fructose, under anvendelse af enzymer, der er extraheret fra en række mikroorganismearter, f.eks. af slægterne Pseudomonas, Lactobacillus,

Esherichia, Aerobacter, Bacillus og Streptomyces.

20 Således kendes bl.a. fra engelsk patentskrift nr.

1.103.394 en fremgangsmåde til fremstilling af sirup indeholdende fructose ved behandling af en glucoseopløsning med et isomeriserende enzym, udvundet fra en microorganisme af slægten Streptomyces, som assimilerer xylan ved 25 dyrkning i et substrat indeholdende xylan eller xylan-holdige materialer. Specielt benyttes til enzymfremstillingen St. flavovirens, St. echinatus, St. achromo-genous eller St. albus yT - nr. 4. Den pr..· vægtenhed tør cellevægt, eller rumfangsenhed kultursubstrat, 30 opnåede isomeraseaktivitet har dog ikke en for den tekniske anvendelse tilfredsstillende størrelse.

Det har nu vist sig, at også to hidtil kendte Streptomyces-stammer er i stand til i tilfredsstillende udbytter, at producere et isomeriserende enzym virksomt 35 overfor glucose, dersom de dyrkes på et passende dyrkningssubstrat, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved,at 2 145679 der til isomeriseringen anvendes en af Streptomyces-stammerne NRRL 11.120 og NRRL 11.121 eller et enzym stammende fra en af disse stammer.

Disse stammer, der er isoleret fra træområder, i 5 den botaniske have i Pavia, Italien, har nu fået numrene Cl 71/Ά og Cl 77/22 og er deponeret i the Northern Regional Research Center, U.S, Department of Agriculture, Peoria, 111. under de nævnte numre NRRL 11.120 og NRRL 11.121.

10 De har følgende karakteristika, der er angivet nedenfor: 3 145S79

Cl 71/A Cl 77/22 A. Farve af det modne og grå grå sporulerede mycelium (Gy) (Gy) B. Morphologi af sporangierne rectus flex- rectus flex- ibilis ibilis (BF) (BF) 5 C. Mørkebrune melanoid- til stede til stede pigmenter (C+) (C+) D. Overflade af sporerne glat glat (SM) (SM) E. Assimilering af C kilder: 10 D-glucose + + D-xylose + + D-arabinose + + D-rhamnose D-fructose + (+) 15 D-galactose + + raffinose - + D-mannitol i-inositol + (+) salicin + + 20 sucrose F. Dannelse af forbindelser ingen ingen med antibiotisk virkning G. Farve af det vegetative cream til cream til mycelium lysebrun lysebrun H. Følsomhed over for sensitiv sensitiv 25 streptomycin 4 145679

Prøverne med undtagelse af E udførtes på Fe-Co-Asparaginagar. Til prøven for udnyttelsen af forskellige C-kilder, E., anvendtes Pridham og Gottlieb's grundsubstrat.

5 Ifølge beskrivelsen i Bergey's Manual of Deter minative Bacteriology, 8, udgave (1974) hører Strep-tomyces sp. stammerne Cl 71/A og Cl 77/22 til de grå rækker, og de adskiller sig fra bl.a. de i ovennævnte engelske patentskrift nævnte Streptomyces-arter 10 ikke blot ved den store forskel i evnen til produktion af glucoseisomerase, men også i andre henseende, som følgende:

St. flavovirens : Madne og sporulerede mycelium gult..

St. echinatus : Sporeoverflader tornede eller hårede.

20 St. achromogenous : Danner intet farvestof.

St. albus T - nr. 4: Modne sporulerede mycelium hvidt.

Som nærbeslægtede med de ifølge opfindelsen anvendte kan endvidere anses følgende kendte Strepto-myces-stammer: Steptomyces olivaceus NRRL 3583 og 25 3916, Streptomyces olivochromogenes ATCC 21114 og

Streptomyces wedmorensis ATCC 21175. Ligesom de ifølge opfindelsen anvendte danner disse stammer gråt luftmycelium, og de kan også danne glucoseisomerase, men de adskiller sig fra disse bl.a. i følgende henseender: 30 Streptomyces olivaceus-stammer danner spiral eller løkkeformede sporekæder og danner ikke melanoid- 145579 s pigmenter.

Streptomyces olivochromogenes ATCC 21114 danner spiral- eller løkkeformede sporekæder.

Streptomyces wedmorensis ATCC 21175 danner ikke 5 melanoid-pigmenter.

De ifølge opfindelsen anvendte Streptomyces-stammer NRRL 11.120 og NRRL 11.121 adskiller sig dermed klart fra nævnte, kendte stammer, og de må som før angivet anses for hidtil ukendte stammer.

10 Kulturerne af microorganismerne NRRL 11.120 og NRRL 11.121 kan dyrkes under aerobe betingelser ved en vilkårlig almindelig metode, som f.eks. overfladekulturer eller fortrinsvis i en neddykket kultur i forgæringsbeholdere med omrøring, Et dyrkningssubstrat, 15 der kan være enten fast eller flydende, indeholder en assimilerbar C-kllde, en nitrogenkilde såvel som mineralsalte og sporstoffer.

Som carbonkilder kan der anvendes maltekstrakt, glucose, maltose og andre sukkerarter, glycerol, majs-20 støbevædske, aminosyrer, peptider og andre. Som nitrogenkilder kan anvendes organiske eller uorganiske nitrogenforbindelser, som f.eks. gærekstrakt, peptoner, tryptoner, kødekstrakt, aminosyrer, caseinhydro-lysater, soyabønnemel, salte af NO^ og af NH^. For at 25 opnå tilfredsstillende vækst kræves andre sporstoffer, som f.eks. magnesium, cobolt, fosfor, svovl og vækst-stimulerende faktorer.

En fordel ved de omhandlede Streptomyces-stammer er den kendsgerning, at de er i stand til at hydrolysere 30 xylaner.

Xylose, der sædvanligvis anvendes som en induk-tor for glucoseisomerase-aktivitet, er dyrt og muligheden for i stedet for at anvende xylaner, der i udstrakt grad forekommer naturligt (hvedestrå; 15-20%, 35 bagasse 30%, træ fra nåletræer fra 7-12%, bredbladet stedsegrønne; fra 20-25%, oliefrøskaller; fra 25-30%) er en fordel. Xylose kan også opnås ved sur hydrolyse af xylaner. Desværre dannes uønskede eller 145679 6 toxiske produkter under syrehydrolysen, som f.eks. furfural, hydroxymethylfurfural og lævulinsyre.

Et passende dyrkningssubstrat har f.eks. følgende sammensætning: 5 Gærekstrakt 5 til 20 gram/liter (g/1)

Glucose 10 g/1

Spor af KH~PO. og MgSO.

NH4C1 eller NåN03 1 g /1 10 Opløsningen indstilles til pH 7 med soda eller fosfatbuffer. Det pH område, der er passende for kulturen, går fra 5-9, idet intervallet fra 6,8 til 7,3 foretrækkes, og temperaturen er mellem 20°C og 40°C, idet intervallet 29°C til 31°C foretrækkes.

15 Det har vist sig fordelagtigt, at adskille vækst fasen fra induktionsfasen. I praksis tilsættes induk-torerne xylose eller xylaner efter microorganismernes vækstfase.

Dersom glucose har været anvendt i dyrknings-20 substratet som carbonkilden, er det passende at opsamle biomassen ved centrifugering for at skille den fra dyrkningssubstratet, og overføre massen til induktionssubstratet, som indeholder 0,5% til 2% xylose sammen med Co og Mg ioner.

25 Ekstraktionen af glucose-isomerase fra myceliet sker ved metoder, der er almindelig inden for en-zymologien.

Til dette formål findeles cellerne med specielle maskiner, som f.eks. "French Pressure Cell", Manton 30 Gaulin Homogenisator, roterende findelere og lignende, eller ved hjælp af ultralydtilførsel. Enzymet kan lige så godt ekstraheres fra acetonepulvere eller fra frysetørrede ekstrakter.

Den opnåede glucoseisomerase har en tilfreds-35 stillende stabilitet over for varme,

Isomeriseringen af glucose kan ske ved en vilkårlig almindelig fremgangsmåde. Glucoseopløsningen kan direkte sættes til en kultur af mieroorganismerne, 7 U5679 d.v.s. til friskt mycelium eller til- mycelium, der har været frysetørret og lagret, såvel som til acetonepulvere eller til frysetørret mycelium. I disse tilfælde er det nødvendigt at isomerasen stabiliseres 5 ved behandling af myceliet i 30 minutter ved 75°C ved en pH værdi på 7,5.

Det er også muligt at anvende præparater, der indeholder isomerase i form af rå eller renset iso-merase, som er opnået ud fra myceliet af de ovenfor 10 omtalte microorganismer.

Endelig kan en yderligere teknisk og økonomisk forbedring opnås ved at immobilisere enzymet ved kombination med macromolekylære forbindelser under dannelse af kemiske bindinger med matrixen eller bindinger af 15 en ionisk art, eller ved fysisk immobilisering.

De følgende eksempler forklarer opfindelsen nærmere.

Eksempel 1 20 Der fremstilles et dyrkningssubstrat, der har følgende sammensætning; Gær ekstrakt 10 g/1

Enzymatisk casein-hydrolysat 10 g/1

Na2HP04, 12H20 6 g/1 25 KH2P04 3 ^/1 NH4C1 1 g/1

MgS04, 7H20 0,2 g/1

Glycerol 10 g/1 idet de ovenfor anførte ingredienser opløstes i afioni-30 seret vand og indstilledes til en pH værdi på 7,0 med soda.

Det således fremstillede dyrkningssubstrat fordeltes i 500 ml bredhalsede kolber, idet man anbragte 100 ml substrat i hver kolbe. Steriliseringen udførtes 35 ved 116°C i 30 minutter.

Substratet tilsåedes med en steril suspension i afioniseret vand af sporer af stammen NRRL 11.120 (Cl 71/A) af Streptomyces, dyrket i 4-5 dage ved 30°C

8 145670 på en asparagin Fe-Co-skråagar. Skråagaren havde følgende sammensætning: L-asparagin 10 g/1

Oksekødekstrakt 2 g/1 5 KH2P04 0,5 q/fl

CoCl2# 6H20 1 milligram (mg))fra en pr. liter-(lj )frisk )fremstil- 7H20 1 m9/l J^gOI,10S- 10 Xylose 10 g/1

Agar 20 g /1 idet komponenterne opløstes i afioniseret vand, og den resulterende opløsning indstilledes til en pH værdi på 7,0 med soda. Steriliseringen udførtes ved 116°C 15 i 30 minutter. Inkuberingen udførtes med orbital omrøring (220 omdrejninger pr. minut) ved 30°C. 24 timer efter tilsåningen sattes der til hver kolbe 1 g xylose og 0,024 g CoCl2, 6H20. Efter yderligere 24 timers dyrkning opsamledes cellerne ved centrifugering 20 og vaskedes med en 0,1 M Na2S03 buffer, pH 0,7 indeholdende Co++ 1o“4M og Mg++5XlO-3M.

100 ml af en sådan-killtur gav 4,9 g fugtige celler.

Disse celler opslemmedes atter i 49 ml af den 25 0,1 M Na2S03 buffer, pH 7,0, nævnt overfor (1 g fugtige celler i 10 ml buffer), og celleopslemningen ledtes gennem en "French Pressure Cell"-presse indtil cellerne var gået itu. I den således opnåede råekstrakt bestemtes den enzymatiske aktivitet: 1 g fugtige celler 30 indeholdt 290 enzymenheder.

En del af de fugtige celler anbragtes i en vacuumovn, således at man kunne bestemme tørvægten, og ud fra 1,76 g fugtige celler opnåede man 0,340 g tørrede celler. Den enzymatiske aktivitet bestemtes 35 på følgende måde:

Til en reaktionsblanding indeholdende: 4,5 ml af en substratopløsning, indeholdende 3,67 mol D-glucose, 5 x 10 3 mol Mg++, 10 4 mol Co++ og 0,1 mol 145679 9

Na^O^ i af ioniseret vand med pH = 7,0, sattes 0,5 ml rå ekstrakt. Inkuberingen foretoges i to timer på et vandbad ved 60°C. Reaktionen afbrødes ved afkøling af blandingen til 0°C. Den optiske drejning af prøven 5 (a2 t) og af prøven inden reaktionens begyndelse (aQ) måltes ved stuetemperatur i et "Perkin-El-mer 141"pola-rimeter, natriumlinien (549 nm), kuvettens optiske vej = 0,1 dm.

Dersom man som en "Snamprogetti"-enhed definerer, 10 den del af enzymet, der i løbet af en time under de ovenfor anførte forsøgsbetingelser producerer 1 milligram (mg) fructose, kan enzymenhederne pr. g fugtige celler udregnes ved følgende forhold: "Snamprogetti"-enheder pr. gram fugtige celler = 15 (Oq — x tøs forsøgsglucose) x 10 (ctgluc.} “ (otfruct.} x 0,1 x C x 0,5 x 2 hvori: 20 <Vuc.> - 16 <“fruct.> = -98 ' 35 C = g/ml 0,1 = optisk vej i decimeter (dm = 0,1 m)

Eksempel 2 25 Kulturer af NRRL 11.121 (Cl 77/22)-streptomyces- stammen, fremstillet som i eksempel 1, inkuberes under orbital omrøring ved 30°C.

24 timer efter tilsåningen, sættes der til hver kolbe 1 g xylose og 0,024 g CoCl2, 6H20. Efter 24 30 timers yderligere inkubering ved 30°C, opsamles cellerne ved centrifugering og vaskes med 0,1 M Na^O^ buffer, pH 7, indeholdende Co++ 10~4M og Mg++5xl0”3M, 5,2 g fugtige celler opnåedes ud fra 100 ml af denne kultur.

35 Disse celler opslemmedes atter i 52 ml af den 0,1 M Na SCL1 . buffer, pH 7, nævnt ovenfor (1 g fugtige 2 ** ‘ celler i 10 ml buffer) og celleopslemningen ledtes til en "French Pressure Cell"-presse, indtil cellerne 10 145S79 var ituslået. I den således opnåede ekstrakt bestemtes den enzymatiske aktivitet, og 1 g fugtige celler fandtes at indeholde 300 enzymenheder.

En portion af de fugtige celler anbragtes i en 5 vacuumovn for at bestemme vægten: ud fra 1,80 g fugtige celler opnåedes 0,312 g tørrede celler.

Eksempel 3

Kulturer af NRRL 11.120 (Cl 71/A)—streptomyces-10 stammen, der var fremstillet som beskrevet i eksempel 1 og udpodet i et vækstsubstrat med samme sammensætning scan i eksempel 1, bortset fra at glycerol var erstattet med sylaner som C-kilden, inkuberedes under omrøring ved 30°C. 24 timer efter tilsåningen sattes der til 15 hver kolbe 0,024 g CoCl2f 6Η2<0. Efter yderligere

24 timers inkubering opsamledes cellerne ved centrifugering og vaskedes med en 0,1 M Na2S0 -buffer pH

7,0 indeholdende Co++ 10 og Mg++5xlO*^M. 100 ml af en sådan kultur gav 3,3 g fugtige celler. Disse 20 celler genopslemmedes i 33 ml 0,1 M Na2S03 pH 7,0 buffer omtalt ovenfor ( 1 g celler i 10 ml buffer), og celleopslemningen ledtes til .en "French Pressure Cell"-presse, indtil cellerne var sønderdelt. Den enzymatiske aktivitet i ekstrakten fremstillet på denne måde be-25 stemtes, og 1 g af cellerne gav 190 enzymatiske enheder.

Eksempel 4

Kulturer af NRRL 11.121 (Cl 77/22)«*streptomyces-stammen fremstillet som i eksempel 3 inkuberedes under 30 omrøring ved 30°C. 24 timer efter tilsåningen sattes til hver kolbe 0,024 g CoCl2, CH20, Efter yderligere 24 timers inkubering opsamledes cellerne ved centrifugering og vaskedes med en 0,1 M Na^-SO^-buffer med pH 7,0 indeholdende Co++ 10 og Mg + 5xlO'"^M.

35 100 ml af denne kultur gav 3,2 g fugtige celler, Disse celler genopslemmedes i 32 ml af den ovenfor omtalte 0,1 M Na2S03-buffer med pH 7,0 (1 g fugtige celler i 10 ml buffer) og celleopslemningen ledtes gennem 11 145879 en "French Pressure Cell"-presse, indtil cellerne var itubrudt.

Den enzymatiske aktivitet bestemtes i den således opnåede ekstrakt, og 1 g fugtige celler indeholdt 5 200 enzymatiske enheder.

Eksempel 5

Kulturer af NRRL 11.120 (Cl 71/A) streptomyces-stammen fremstilledes, og cellerne udvandtes, som 10 angivet i eksempel 1.

Efter at induktionsstadiet var overstået, opsamledes cellerne ved centrifugering og vaskedes med en 0,1 M Na0SO_-buffer med pH 7, indeholdende Co++ -4 4+ J -3 10 M og Mg 5x10 M. Fra 400 ml af denne kultur op-15 nåede man 18,3 g fugtige celler.

6,2 g fugtige celler opslemmedes atter i 25 ml 0,1 M Na2S03~buffer med pH 7,0 og sattes under omrøring ved -10°C til 120 ml acetone. Efter 15 minutters behandling opsamledes cellerne på et filtrerpapir, 20 vaskedes med acetone, opsamledes og tørredes i vacuum ved stuetemperatur. Ud fra 6,2 g fugtige celler opnåedes 1,1 g tørre celler. Den enzymatiske aktivitet af acetonepulveret bestemtes, og 1 g celler behandlet med acetone indeholdt 2370 enheder enzym.

25

Eksempel 6

Kulturer af NRRL 11,121 (Cl 77/22)-streptomyces-stammen fremstilledes, og cellerne udvandtes, som angivet i eksempel 1. Efter afslutning af induktions-30 trinet opsamledes cellerne ved centrifugering og vaskedes med 0,1 M Na2S03-buffer med pH 7,0 indeholdende Co++ 10 og Mg++ 5x10 ^M. Ud fra 400 ml af denne kultur opnåedes 28,2 g fugtige celler, 9,2 g fugtige celler opslemmedes atter i 25 ml 0,1 M 35 Na2SC>3pH 7,0 buffer og sattes under omrøring og ved en temperatur på -10°C til 120 ml acetone. Efter 15 minutters behandling opsamledes cellerne på et filtrerpapir, vaskedes med acetone, opsamledes og tørredes i 12 145679 vacuum ved stuetemperatur. Ud fra 9,2 g fugtige celler fik man 1 g tørre celler.

Man bestemte den enzymatiske aktivitet af acetonepulveret, og man fandt, at 1 g acetonebehandlede 5 celler indeholdt 2100 enzymenheder.

Eksempel 7

Man fremstillede celler af Streptomycesstammen NERTi 11.120 (CL 71/A) således san beskrevet i eksempel 1 og 10 behandlede med acetone således som beskrevet i eksempel 5.

Cellerne behandlet med acetone anvendtes til bestemmelse af isomeriseringsprocenten af glucose som en funktion af tiden i en reaktionsblanding.

15 Forsøgsbetingelserne var følgende: a) Celler behandlet med acetone: 10 g b) Substratvolumen : 1 1

c) Reaktionstemperatur : 60°C

Substratet havde følgende sammensætning: 20 Glucose 60% (vægt/vol), Mg++5mM, Co++ 0,1 itlM,Na2S03 100 mM, pH 7,0.

Isomeringsprocenterne var følgende:

Tid i timer % omdannelse 3 12 25 6 20 9 27,2 12 32,6 15 37,1 18 40,5 30 23 44,5