KR820001312B1 - 글루코즈-이성화 효소의 제조방법 - Google Patents

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Description

글루코즈-이성화 효소의 제조방법

본 발명은 글루코즈를 프락토즈로 이성화하는데 사용하기에 적당한 효소의 제조에 관한 것이다.

최근에는 옥수수 전분으로 부터 프락토즈 함유 시럽을 제조하는 것과 관련하여 특히 글루코즈의 프락토즈로의 효소적 전환에 상당한 관심이 생겼다.

이 전환에 사용된 글루코즈 이성화 효소는 아트로박터(Arthrobacter)속, 스트랩토마이세스고, 바실루스(Bacillus)속 및 악티노플레인스(Actinoplanes)속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있다. 글루코즈 이성화 효소의 또 다른원이 최근에 미국특허 3956066호에 공지되었는데 여기에는 플라보 박테리움 데보란스 종의 멤버에 의해 글루코즈 이성화 효소를 제조하는 것이 공지되어 있다.

본 발명은 상당량의 글루코즈 이성화효소를 제조할 수 있는 플라보 박테리움 아보레슨스(Flavobacerium arborescens)종의 균주의 발견을 포함한다. 이 효소는 글루코즈 이성화 공정에 사용하기에 아주 적당하다.

여기에 공지된 미생물이 플라보 박테리움 아보레슨스종의 멤버로 되어 있지만 현재 이 미생물의 적당한 분류에 대해서 약간의 논쟁이 있다는 것을 주시해야 한다. 벌기(Bergey)의 결정적 세균학 편람 8판 362-363면은 플라보박테리움 아보레슨스종이 부당하게 플라보박테리움 속으로 분류되어 있다고 지적하고 있다.

이 미생물에 대한 새로운 분류나 개정된 학명이 아직 정해지지 않았다. 그러므로 플라보 박테리움 아보레슨스를 재분류하면 종국에는 또 다른 속명이 채택될 것이라는 것을 이해하면서 여기서는 쓰던 학명을 사용한다.

미국특허 3956066호에 기재된 플라보 박테리움 데보란스는 재분류의 후보가 아니라는 것과 따라서 실제로 다른 속에 속한다는 것을 주시해야 한다.

본 발명에 관련하여 사용되는 바람직한 미생물은 아메리칸 타입 컬춰 클랙손(American /Type Cultuye Collection)으로부터 이용할 수 있는 배양 ATCC 4358로 부터 단리된 돌연변이체 균주이다. 상당량의 글루코즈 이성화효소를 제조할 수 있는 플·아보레슨스의 바람직한 균주는 일리노이주 피로이어시 USDA NR RL(Northern Regional Research Laboratory)의 ARS 컬춰 콜랙숀에 영구 보관되어 있으며 배양 NRRLB-11022 및 NRRLB-11023으로 이용될 수 있다.

바람직한 세가지 균종의 일반적 성질은 다음과 같다.

(a) 형태학적 성질

0.5 내지 2.5μ의 간성균으로 단일형과 사슬형의 발생을 한다. 육즙에서 긴 파형의 실을 형성한다.

운동성이 없고 그람양성이다.

(b) 각종 배지상에서의 생육상태

·젤라틴 집락모양-낮은 배율로 보면 실 모양의 가지를 친 것 같이 보인다. 중앙은 황색풍을 띠게 되며, 경계쪽은 반투명해지며 수목의 형상이 된다.

·젤라틴 안정도-노란색 침전이 생기면서 액화됨.

·한천사면 배양-천천히 탁한 오렌지색으로 성장.

·육즙 배양-탁해지고, 노란 침전이 생기고, 막이 없다.

·리트머스로 착색한 우유-천천히 엉김. 리트머스 환원, 중성반응.

·감자 배양-짙은 오렌지색, 무성히 자람.

(c) 생육의 범위

질산염 용액에서는 자라지 않고, 아질산염의 형성이 않됨. 호기성, 통성 혐기성 최적온도 30℃

(d) 위의 사실 이외에도 ATCC 4358은 키실로즈(xylose)만을 탄화수소원으로 포함하는 영양배지에서는 이성화효소의 활성도를 갖지만, 글루코즈나 락토즈만을 탄화수소원으로 포함하는 영양 배지에서는 활성도를 갖지 못하는 특색이 있다.

NRRL B-11022는 탄화수소원으로 락토즈만을 포함하는 영양배지에서 이성화 효소의 실질적인 활성화를 갖을뿐 아니라, 글루코즈만 썼을 대도 약간의 효소활성도를 갖을 수 있다.

NRRL B-11023은 영양배지에 탄화수소원으로 글루코즈나 락토즈 중에서 하나만 있어도 실질적인 이성화 효소의 활성도를 갖는다.

실질적인 이성화효소 활성도란 육즙 1ml당 활성도 정도가 최소한 500마이크로 단위인 활성도로 정의한다.

여기에 공지된 미생물은 탄소원, 질소원 및 무기염원을 함유하는 여러가지 배지에서 배양될 수 있다.

전형적인 배지로는 가수분해된 동물단백질, 옥수수 침지액, 브레워(brewer's)의 효소 추출물, 인산이수소칼륨, 인산일수소칼륨 및 적당한 탄화수소가 포함된다. 사용가능한 탄화수소로는 키실란, 전분 및 셀룰로즈의 가수분해물과 키실로즈, 글루코즈, 말토즈, 슈크로즈 및 락토즈가 포함된다. 생장배지의 처음 pH는 약 7이고 발효는 적당한 발효기나 진탕플라스크내의 약 30℃에서 호기적으로 수행한다. 최대 이성화 효소 활성은 일반적으로 약 48-72시간안에 도달된다.

미생물에 의해 생긴 이성화효소 활성은 약 60℃에서 30분간 0.5ml의 효소함유 제조물과 충분한 텍스트로즈를 함유하는 용액 1.5ml, 트리신(Tricine) 완충액(pH 8) 및 염화 마그네슘을 함유하는 혼합물을 배양하므로써 분석하여 마지막 농도로 각각 0.1M, 0.1M 및 0.03M을 얻었다. 배양기간의 말기에 이성화반응이 0.5ml의 1.0N 산염을 가하므로써 종결된다. 원심분리 후에 맑은 상등유분을 적당히 희석하고 생긴 프락토즈를 공지된 엘·메시네오와 인·뮤사라의 공정(Int. J.Biochem 3,18, 691-699, 1972)에 의해 결정한다. 이성화 효소 활성을 미크로단위로 표시하면, 1미크로 단위의 활성은 상기 분석조건하에서 매분당 1미크로그램의 프락토즈를 생산하는 효소의 양으로 정의된다.

유리한 배양조건하에서 이 바람직한 균주에 의해 생긴 이성화효소의 양은 선기술에서 공지된 다른 이성화효소-제조 미생물보다 매우 크다는 것이 알려졌다. 이 바람직한 균주에 의한 이성화 효소 제조율은 사용된 배양조건에 의해 상당히 변한다. 특히 놀랍고도 기대하지 못했던 것은 성장배지에 락토즈를 사용했을 때 이성화효소 제조율이 최대이었다는 것이다.

예를 들면, 2%의 락토즈를 함유한 배지에 NRR B-11022를 배양시켜 발효육즙 1ml당 2892미크로 단위의 이성화효소를 얻었다. 이와 같이 바람직한 균주는 오직 탄화수소원으로써 락토즈를 함유한 영양배지에서 배양했을 때 많은 양(육즙 1ml당 500미크로단위 혹은 그 이상)의 이성화효소 활성을 생산할 수 있다는 사실에 의해 선기술 미생물과 더 구별되고 특정화 될 수 있다.

배지에 탄화수소를 첨가하지 않아도 많은 양의 효소를 제조할 수 있다. 1%의 가수분해된 동물 단백질(미시간주 디트로이트시 디프코(Difco) 실험실로부터 얻은 박토-트립톤(Bacto-Trypthon)), 1%의 옥수수 침지액, 1%의 효모추출물, 1%의 인산일 수소칼륨, 0.5%의 인산이 수소칼륨 및 지시된 바와 같은 2%의 탄화수소를 함유한 배지에서 플·아보레슨스의 균주를 30℃에서 배양한 것을 기초로 하여 이 사실이 표 1의 데이타에 나타나 있다.

[표 1]

플·아보레슨스에 의해 제조된 이성화 효소는 약 6-10 pH와 약 45-90℃에서 유효한 활성을 나타낸다.

표 2는 30℃에서 72시간 동안 락토즈함유 영양배지에서 NRRL B-11022를 배양하며 얻은 전체세포와 관련된 이성화효소 활성에 대한 pH의 영향을 나타내고 표 3은 온도의 영향을 보여준다. 효소의 안정도는 표 4의 데이타에 나타나 있다. 표 2와 3의 데이타를 위해 얻은 세포를 한번 세척하고 발효육즙 내의 세포의 원농도까지 물에 재현탁시킨다.

상기에 기술된 표준분석 공정은 pH를 연구함에 따라 완충액이 변하고 온도의 영향으로 실험중에 온도가 변하는 것을 제외하고는 이성화 효소 활성을 측정하는데 사용된다. 표 4에 요약된 안정도 연구는 염화 마그네슘(0.004M)을 함유한 0.05M 트리신 완충액(pH 8)내에서 세척된 세포를 배양하는 것과 표준분석 공정을 사용하여 특정된 간격에서 배양된 세포를 분석하는 것을 포함한다.

[표 2]

1. 피페스(PIPES)는 모노나트륨 1,4-피페라진디에탄설폰산 이다.

2. 트리신은 N-[2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)네틸]글리신이다.

[표 3]

[표 4]

효소를 함유하는 세척된 세포를 분석하여 결정한 것과 마찬가지로, 효소는 pH와 8과 60℃에서 적어도 200시간 동안 근본적으로 안정하다는 것이 표 4의 데이타로 부터 확실하다. 70℃와 pH 8에서 200시간 가열할 때 적어도 활성의 85%는 보유하므로써 세척된 세포효소 제제는 더 특징적이다.

플·아보레슨스에 의해 제조된 이성화 효소는 글루코즈를 프락토즈로 전환시키는데 매우 효과적이며 선기술에 공지된 여러가지 공정이 그런 전환을 위해 사용 가능하다. 예를 들면, 효소제제가 미생물로부터 나온 세포물질을 그곳에서 구성하는 그런 배치(batch) 조작에 전세포는 직접 사용되거나 연속 조작을 위해 고정된 배드(bed)에 정지된다. 또 다른 방법으로는 세포-유리 추출물은 그 안에서 이성화 효소가 공지된 방법에 의해 세포로부터 유리되는데 사용되고 배지 시스팀에서 가용성 효소로 사용되거나 연속 조작에 사용하기 위해 정지시킨다. 그런형으로 효소를 사용하기 위한 방법은 예컨대 뷔스와 벤카타수브라만에 의해(CHEMTECH 3,667-684, 1973 및 47-55, 309-320 및 434-444, 1974 참조) 공지되어 있다.

글루코즈 이성화를 위해 이성화효소가 사용되는 형에 관계없이, 반응은 45090℃의 온도에서 바람직하게는 60-75℃에서 수행해야 한다. 글루코즈함유 용액의 pH는 상승된 온도에서 분해 생성물의 생성을 최소한으로 하기위해 약 6-10 바람직하게는 6.5-8.0을 유지해야 한다. 효소는 산 및/혹은 효소 처리에 의해 제조된 전분 가수분해 물과 마찬가지로 비교적 순수한 글루코즈 용액과 함께면 효과적이다.

30-60중량부의 글루코즈 농도가 전환단계를 위해 바람직하다. 효소활성은 소량의 마그네슘 이온을 글루코즈 함유 용액에 가해줌으로써 증진된다. 이성화로부터 얻은 프락토즈 함유 용액은 활성탄과 이온교환수지로 처리하는 것과 같은 통상의 방법을 사용하여 정제될 수 있다.

다음 실시예는 본 발명의 이용과 이점을 더욱 설명해줄 것이다.

[실시예 1]

500ml 엘렌마이어 플라스크에 다음을 함유하는 영양배지 100ml을 넣었다.

상기 배지를 플·아보레슨스 NRRL B-11022로 부터 새로 제조된 접종물로 접종시키고 접종된 배지를 로타리진탕기를 사용하여 30℃에서 교반했다. 72시간 말기에 세포를 걷워들여 세척했다. 분석한 결과 전육즙 1ml당 2892미크로단위와 동등한 이성화효소 활성의 존재가 밝혀졌다.

[실시예 2]

글루코즈의 프락토즈로의 이성화는 실시예 1의 공정에 의해 얻은 세척된 전세포 10g을, 염화마그네슘에 대하여는 0.01M인 50%(중량/부피) 글루코즈 시럽 500ml에 가하여 수행되었다.

시럽의 pH는 수산화 나트륨을 사용하여 8.0으로 맞추고 시럽을 서서히 교반하면서 60℃에서 배양했다.

20시간 후에 시럽을 프락토즈에 대해 분석하여 45%의 글루코즈가 프락토즈로 전환된 것을 알았다.

[실시예 3]

영양배지에 락토즈 대신 키실로즈를 사용하는 것과 접종물을 플·아보레슨스 ATCC 4358로부터 제조하는 것은 제외하고 실시예 1의 공정을 반복했다. 72시간 후에 세포를 걷워들여 분석한 결과 전 육즙 1ml당 546미크로단위와 동등한 이성화효소 활성이 존재하였다.

[실시예 4]

영양배지에 락토즈 대신 글루코즈를 사용하고 접종물을 플·아보레슨스 NRRL B-11023으로 부터 얻는 것을 제외하고는 실시예 1의 공정을 반복했다.

64시간 말기에 걷워들인 세포를 분석하여 전육즙 1ml당 580미크로단위와 동등한 이성화 효소활성을 갖는다는 것을 알았다.

[실시예 5]

글루코즈의 프락토즈로의 효소적 전환은 실시예 4의 공정에 의해 얻은 젖은세포 1g을 염화마그네슘에 대해서 0.005M인 50%(중량/부피) 글루코즈용액 500ml로 도입하므로서 효과적이었다. 시럽의 pH는 수산화나트륨을 사용하여 8.0으로 맞추고 용액을 서서히 교반하며 60℃에서 배양했다. 27시간후에 용액을 분석한 결과 프락토즈함량이 33%이었다.

[실시예 6]

플·아보레슨스 NRRL B-11022를 실시예 1에 기술된 영양배지를 사용한 10ℓ짜리 뉴부론스비크(New Brunswick) 발효기에서 70시간 동안 30℃에서 배양했다. 세포를 걷워들이고 공지된 응결공정에 의해 정지시켜 g당 75미크로단위의 이성화 효소활성을 나타내는 건조되고 응결된 세포집합체를 얻었다. 연속적인 글루코즈 이성화를 위해 5g의 건조된 집합체를 함유하는 직경이 1인치인 유리컬럼을 사용했다.

컬럼을 60℃에서 유지시키고 염화마그네슘에 대해서 0.005M이고 pH를 8.0-8.4에 맞춘 50%(중량/부피) 글루코즈 용액을 시간당 26ml의 유동속도로 컬럼을 통과시켰다.

컬럼으로 부터의 용출액을 프락토즈에 대해 분석한 결과 글루코즈의 프락토즈로의 전환 정도는 약 45%이었다.

Claims (1)

1. 호기성 상태에 있는 온도 약 30℃, 초기상태의 pH가 대략 7 정도인 탄소, 질소, 무기염원을 포함한 영양배지에서 플라보박테리움아보레슨스 균종에 속하는 미생물을 배양하고, 글루코즈-이성화효소를 회수하는 것을 특징으로 하는 글루코즈-이성화효소의 제조 방법.