CN113614220A - 细胞壁分解促进方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细菌的细胞壁分解促进方法。本发明的细胞壁分解促进方法的特征在于，在糖的存在下，使N‑乙酰胞壁质酶作用于细菌作用，上述糖为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖、以及它们的衍生物中的1种或2种以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌的细胞壁分解促进方法。
背景技术
细菌的细胞壁维持细胞结构，保护细胞免受因细胞内包含蛋白质等较多的分子引起的膨压。另外，由于细胞壁位于细胞的最外层，因此，发挥调节细胞与外部环境的交互作用的作用。因此，在阐明细菌的性质并谋求其利用方面，重要的是理解细胞壁的组成、结构、功能。
革兰氏阴性细菌的细胞壁由肽聚糖层和其外侧的外膜构成，另一方面，革兰氏阳性细菌的细胞壁由较厚的肽聚糖层构成，且被磷壁酸或糖链所修饰。肽聚糖中，以由重复N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡糖胺构成的糖链作为基本骨架，在胞壁酸的羧基上键合由几个氨基酸构成的肽，且该肽彼此交联，由此形成牢固的网状结构。
作为分解细菌的细胞壁的酶，已知有N-乙酰胞壁质酶(系统名：肽聚糖N-乙酰胞壁酰水解酶)等。N-乙酰胞壁质酶是将构成肽聚糖的N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4糖苷键水解的酶，被利用于核酸提取、细胞壁结构或细胞壁构成成分的研究、原生质体的制备等。另外，报告了如果使作为N-乙酰胞壁质酶的1种的溶菌酶与同样作为N-乙酰胞壁质酶的1种的变溶菌素作用于乳酸菌作用，则其杀菌作用中可看到协同效应(非专利文献1)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：小林修等，科学与工业，75(3)，117-122，2001
发明内容
然而，判明即便在并用溶菌酶与变溶菌素的情况下，也存在细菌的细胞壁的肽聚糖未被充分分解的情况。因此，本发明的课题在于提供一种能够简便且高效地分解细菌的细胞壁的方法。
因此，本发明人等为了探索在利用N-乙酰胞壁质酶进行的细菌的细胞壁分解中促进分解反应的物质而进行了各种研究，结果发现，通过在戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖的存在下进行细胞壁分解反应，细胞壁分解率和/或初期的细胞壁分解速度提高，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的[1]～[12]。
[1]一种细胞壁分解促进方法，其特征在于，在糖的存在下，使N-乙酰胞壁质酶作用于细菌，上述糖为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖以及它们的衍生物中的1种或2种以上。
[2]根据[1]所述的细胞壁分解促进方法，其中，上述糖为选自D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、L-岩藻糖、L-甘露糖、L-鼠李糖和D-果糖中的1种或2种以上。
[3]根据[1]或[2]所述的细胞壁分解促进方法，其中，上述N-乙酰胞壁质酶来自球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞壁分解促进方法，其中，上述N-乙酰胞壁质酶为变溶菌素。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的细胞壁分解促进方法，其中，上述细菌为革兰氏阳性菌。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的细胞壁分解促进方法，其中，上述细菌为乳杆菌属细菌。
[7]一种细菌的细胞壁分解促进剂，以糖作为有效成分，上述糖为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖以及它们的衍生物中的1种或2种以上。
[8]根据[7]所述的细胞壁分解促进剂，其中，上述糖为选自D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、L-岩藻糖、L-甘露糖、L-鼠李糖和D-果糖中的1种或2种以上。
[9]一种细菌的细胞壁分解促进用试剂盒，含有糖和N-乙酰胞壁质酶，上述糖为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖以及它们的衍生物中的1种或2种以上。
[10]根据[9]所述的细胞壁分解促进用试剂盒，其中，上述糖为选自D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、L-岩藻糖、L-甘露糖、L-鼠李糖和D-果糖中的1种或2种以上。
[11]一种糖的用于制造细胞壁分解促进剂的应用，上述糖为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖以及它们的衍生物中的1种或2种以上。
[12]根据[11]所述的应用，其中，上述糖为选自D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、L-岩藻糖、L-甘露糖、L-鼠李糖和D-果糖中的1种或2种以上。
根据本发明，在使用N-乙酰胞壁质酶的细菌的细胞壁分解中，通过在特定的糖的存在下进行分解这样的简便的方法，能够提高细菌的细胞壁分解率和/或初期的细胞壁分解速度。由此，能够以高产率且高纯度得到细胞壁分解产物，能够有助于阐明细菌的细胞壁、细胞膜或细胞质的组成、结构、功能。
附图说明
图1是表示利用N-乙酰胞壁质酶进行的细胞壁分解反应中的D-葡萄糖或L-鼠李糖的添加效果的图。
图2是表示利用N-乙酰胞壁质酶进行的细胞壁分解反应中的L-鼠李糖的添加效果的图(A：反应温度37℃，B：反应温度50℃)。
图3是表示利用N-乙酰胞壁质酶进行的细胞壁分解反应中的L-鼠李糖的添加效果的图(A：来自球孢链霉菌ATCC 21553的变溶菌素，B：变溶菌素(重组))。
图4是表示利用N-乙酰胞壁质酶进行的细胞壁分解反应中的各种糖的添加效果的图。
图5是表示利用N-乙酰胞壁质酶进行的细胞壁分解反应中的各种糖的添加效果的图(A：D-阿拉伯糖对各酶的效果，B：各种糖对仅变溶菌素的效果)。
图6是表示利用N-乙酰胞壁质酶进行的细胞壁分解反应中的D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖或L-鼠李糖的添加效果的图。
图7是表示利用N-乙酰胞壁质酶进行的细胞壁分解反应中的D-阿拉伯糖添加时的反应温度的不同引起的效果的不同的图。
具体实施方式
本发明的细菌的细胞壁分解促进方法的特征在于：在糖的存在下，使N-乙酰胞壁质酶作用于细菌，上述糖为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖以及它们的衍生物中的1种或2种以上。本发明中的细胞壁分解促进是指细胞壁分解率的提高和/或初期的细胞壁分解速度的提高。
本发明中，作为分解细胞壁的对象细菌没有特别限定，例如可举出乳酸菌、双歧杆菌、梭菌等革兰氏阳性菌；大肠杆菌、拟杆菌属等革兰氏阴性菌。其中，优选为肽聚糖厚的革兰氏阳性菌，更优选为乳酸菌、双歧杆菌，特别优选为乳酸菌。作为乳酸菌，优选为属于乳酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属、小球菌属等的乳酸菌，更具体而言，可举出干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、加氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、约古特乳杆菌(Lactobacillus jugurti)、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、肠膜明串珠菌、戊糖片球菌等，特别优选为干酪乳杆菌。作为干酪乳杆菌，优选为干酪乳杆菌YIT 9029(FERM BP-1366)。
该细菌的制备方法没有特别限定，只要按照常规方法进行即可。例如，可以将该细菌的种菌接种于能够使其增殖的培养基中进行培养，培养后，使用离心分离或过滤等分离、纯化菌体的方法进行制备。作为培养基，可举出MRS等混合有个别成分的合成培养基、或使用有乳或脱脂乳粉等乳成分的培养基，但并不限定于这些。所得到的菌体可直接供于细胞壁分解反应，也可以使其悬浮于三羟甲基氨基甲烷马来酸酯(Tris-maleate)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液等pH值为7.0附近且发挥缓冲功能的缓冲液中，而将该悬浮液用于细胞壁分解反应。
本发明中使用的分解细菌的细胞壁的酶只要为N-乙酰胞壁质酶就没有特别限定，优选为来自球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)的N-乙酰胞壁质酶。这里，“来自球孢链霉菌的N-乙酰胞壁质酶”除球孢链霉菌产生的野生型的N-乙酰胞壁质酶以外，也可以为使编码该N-乙酰胞壁质酶的基因在大肠杆菌等中表达而得到的酶或通过基因重组技术修饰该基因并使其表达而得到的酶且保持N-乙酰胞壁质酶活性的酶。作为N-乙酰胞壁质酶，例如可举出N-乙酰胞壁质酶M1、N-乙酰胞壁质酶M2、至少含有N-乙酰胞壁质酶M1和N-乙酰胞壁质酶M2的混合物等，作为代表例，可例示变溶菌素。或者，作为N-乙酰胞壁质酶，也可以利用市售品，例如，可例示来自球孢链霉菌ATCC 21553的变溶菌素(Sigma-Aldrich Co.制造)、变溶菌素(重组)(A&A Biotechnology制造)等。N-乙酰胞壁质酶的形态没有特别限定，可使用酶蛋白质的干燥物、包含酶蛋白质的粒子和包含酶蛋白质的液体等。在本发明的细胞壁分解促进方法中，上述N-乙酰胞壁质酶可单独使用或组合使用2种以上，也可并用其它细胞壁分解酶。
N-乙酰胞壁质酶的使用量只要考虑所使用的细菌量或反应体系的大小等适当地设定即可，例如优选为1～1000U，更优选为10～500U，进一步优选为50～300U。这里，1U是指以粪链球菌的细胞壁悬浮液为底物，在pH值6.0、37℃、1mL的反应条件下，在1分钟内产生0.01的ΔA600nm的酶量。
本发明中所使用的糖系为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖以及它们的衍生物中的1种或2种以上的糖。这里，二糖是指2分子单糖记性糖苷键合而成的糖，寡糖是指1～10分子左右的单糖通过糖苷键而成的糖，多糖系指多数个单糖进行糖苷键合而成的糖。作为糖的衍生物，例如可举出糖的羟基被取代为氢原子而成的脱氧糖、糖的羟甲基被取代为羧基而成的糖醛酸、糖的羟基被取代为胺基而成的氨基糖、糖的羰基被还原成醇而成的糖醇等，但并不限定于这些。糖可以为天然物，也可以为合成物。
戊醛糖为在1位具有醛基的碳原子数5的单糖。作为戊醛糖，可以为D体和L体中的任一种，具体而言，可举出D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖和L-来苏糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖和L-核糖。作为戊醛糖的衍生物，可举出D-脱氧核糖、D-阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇等。另外，作为二糖、寡糖和多糖，可举出木二糖、樱草糖、蚕豆糖、木葡聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖-I等。其中，从细胞壁分解促进效果的方面出发，优选为D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖和L-来苏糖、L-木糖、D-核糖或L-核糖。
L体的己醛糖为在1位具有醛基的碳原子数6的单糖中的L体单糖。具体而言，可举出L-甘露糖、L-阿洛糖、L-阿卓糖、L-葡萄糖、L-古洛糖、L-艾杜糖、L-半乳糖和L-塔罗糖。作为L体的己醛糖的衍生物，可举出L-岩藻糖、L-鼠李糖、L-塔罗甲基糖、可立糖、艾杜糖醛酸、L-甘露醇等。另外，作为二糖、寡糖和多糖，可举出海葱二糖、新橙皮糖、芸香糖、芦丁酮糖、褐藻糖胶、鼠李半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖-II等。其中，从细胞壁分解促进效果的方面出发，优选为L-岩藻糖、L-甘露糖或L-鼠李糖。
己酮糖为在2位具有酮基的碳原子数6的单糖。作为己酮糖，可以为D体和L体中的任一种，具体而言，可举出D-果糖、L-果糖、D-阿洛酮糖、L-阿洛酮糖、D-山梨糖、L-山梨糖、D-塔格糖和L-塔格糖。其中，从细胞壁分解促进效果的方面出发，优选为D-果糖。
上述糖中，从细胞壁分解促进效果的方面出发，优选为戊醛糖、L体的己醛糖、己酮糖或它们的衍生物，更优选为戊醛糖、L体的己醛糖或它们的衍生物。具体而言，优选为D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、L-岩藻糖、L-甘露糖、L-鼠李糖或D-果糖，更优选为D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、L-岩藻糖、L-甘露糖或L-鼠李糖，进一步优选为D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖或L-岩藻糖，从廉价的方面出发，特别优选为D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、L-木糖或L-岩藻糖。这些糖可以单独使用，也可以组合使用2种以上。
糖的使用量只要考虑所使用的细菌量或反应体系的大小等适当地设定即可，例如从细胞壁分解促进效果和糖的溶解性的观点考虑，优选为0.01～3M，更优选为0.05～2M，进一步优选为0.1～1.5M，特别优选为0.5～1.5M。
上述糖作为细菌的细胞壁分解促进剂有用。上述糖可以作为细菌的细胞壁分解促进剂而直接使用，也可以作为用于制造细菌的细胞壁分解促进剂的原材料而使用。本发明的细菌的细胞壁分解促进剂除上述糖以外，也可以包含溶剂，作为溶剂，可举出水性介质。作为水性介质，除水以外，还可举出磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、古德氏缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、氨缓冲液等各种缓冲液，可以包含它们中的1种或2种以上。本发明的细菌的细胞壁分解促进剂对溶剂的溶解性良好，容易操作。另外，本发明的细菌的细胞壁分解促进剂除上述糖和溶剂以外，也可以包含pH缓冲剂、表面活性剂等。
为了实施本发明的细菌的细胞壁分解促进方法，只要在上述糖的存在下使N-乙酰胞壁质酶作用于细菌即可。糖的添加顺序没有特别限定，例如可以在细菌悬浮液中添加糖，其后添加N-乙酰胞壁质酶而进行细胞壁分解反应，也可以在细菌悬浮液中添加N-乙酰胞壁质酶，其后添加糖而进行细胞壁分解反应。
细胞壁分解反应的反应温度只要为能够维持N-乙酰胞壁质酶的活性的温度即可，从酶活性的观点考虑，优选为30～60℃，更优选为35～55℃，进一步优选为37～50℃。反应时间根据所使用的细菌的种类等而不同，从分解率的观点考虑，优选为10分钟～48小时，更优选为30分钟～24小时。作为pH值，优选为5.5～8.0，更优选为6.0～7.0。
细胞壁的分解的进行程度例如可以使用分光光度计测定反应前与反应后的菌悬浮液的浊度(OD615)，根据下式(1)算出分解率而进行评价。
分解率＝1－(反应后的OD615/反应前的OD615)(1)
本发明中的细胞壁分解率的提高是指例如利用上述式算出的细胞壁分解率与上述糖不存在下的情况相比有所提高。另外，本发明中的初期的细胞壁分解速度的提高是指至N-乙酰胞壁质酶作用后5小时后、优选为2小时后、更优选为1小时后的细胞壁分解速度与上述糖不存在下的情况相比有所提高。
为了实施本发明的细菌的细胞壁分解促进方法，优选使用含有糖和N-乙酰胞壁质酶的细菌的细胞壁分解促进用试剂盒，该糖为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖以及它们的衍生物中的1种或2种以上。根据需要，也可以在该试剂盒中包含缓冲液、记载有实施方法的说明书等。
根据本发明的细菌的细胞壁分解促进方法，如下述实施例所示，通过在上述糖的存在下使N-乙酰胞壁质酶作用于细菌，能够促进细胞壁分解反应。在细胞壁分解反应结束后，根据需要，可以适当组合酶处理、透析、色谱等通常的方法而从反应液中以高产率回收分解产物。作为该方法，没有特别限定，例如只要将反应液进行蛋白酶处理，接着进行核酸酶处理，其后进行透析即可。
实施例
接着，举出实施例对本发明进一步进行详细说明，但本发明并不受它们任何限定。
实施例1细菌的细胞壁分解1
(1)供试菌株
使用干酪乳杆菌YIT 9029(以下，称为YIT 9029)。
(2)培养基的制备
通过制造商指定的方法制备Difco乳酸杆菌MRS肉汤(Difco Lactobacilli MRSBroth)(Becton,Dickinson and Company制造)，在50mL的聚丙烯制离心管(EppendorfNorth America,Inc.制造)中分注30mL。
(3)菌液的制备
将在MRS肉汤中培养的约2×109CFU/mL的前培养菌液30μL接种于(2)中制备的30mL的MRS肉汤后，在37℃培养24小时。
(4)细胞壁的分解
将包含2～3×109CFU/mL的YIT 9029的菌液离心分离(5000×g、15分钟)，利用与原先的菌液同量的杀菌水将沉淀清洗3次。将菌悬浮于与原先的菌液同量的5mM三羟甲基氨基甲烷马来酸酯缓冲液(Sigma-Aldrich Co.制造)(pH值6.4)中，每1mL悬浮液添加100μg的蛋白溶菌酶即来自鸡蛋清冻干粉的溶菌酶(Lysozyme from chicken egg whitelyophilized powder)(Sigma-Aldrich Co.制造，以下称为Lysozyme或者溶菌酶)和100U的变溶菌素(重组)(A&A Biotechnology制造)。将反应液在37℃处理24小时。另外，为了研究糖的添加对细胞壁分解反应造成的影响，使用以最终浓度成为0.5M的方式在三羟甲基氨基甲烷马来酸酯缓冲液中添加D-葡萄糖或L-鼠李糖而成的缓冲液代替上述三羟甲基氨基甲烷马来酸酯缓冲液，同样地进行反应。将各反应进行3次。
(5)分解率的测定
使用分光光度计PiCOSCOPE PAS-110(Ushio电机株式会社制造)，经时测定菌悬浮液的615nm(最大吸收波长；测定波长区域575-660nm)处的浊度(OD615)，根据下式(1)算出分解率。分解率以3次的平均值±标准偏差表示。
分解率＝1－(反应后的OD615/反应前的OD615) (1)
(6)结果
如图1所示，与不添加糖的情况相比，在添加有D-葡萄糖的情况下，确认到细胞壁分解率的降低。另一方面，在添加有L-鼠李糖的情况下，确认到细胞壁分解率的上升。
实施例2细菌的细胞壁分解2
使所添加的L-鼠李糖的浓度为最终浓度0(不添加糖)、0.5、1.0或1.5M，将反应温度变为37或50℃，除此以外，与实施例1的方法同样地进行反应，研究L-鼠李糖对细胞壁分解反应赋予的效果。将各反应进行3次。
其结果，如图2所示，与反应温度无关，L-鼠李糖的浓度越高，分解率的上升越快。反应温度37℃时，反应第5小时的分解率在未添加L-鼠李糖的情况下为0.36，在添加有L-鼠李糖1.5M的情况下为0.83。反应温度50℃时，反应第1小时的分解率在未添加L-鼠李糖的情况下为0.33，在添加有L-鼠李糖1.5M的情况下为0.69。反应第24小时的分解率在添加有L-鼠李糖1.5M的情况下，在反应温度37℃时为0.97，在反应温度50℃下为0.87。
实施例3细菌的细胞壁分解3
使所添加的L-鼠李糖的浓度为最终浓度1.5M，使用100U的来自球孢链霉菌ATCC21553的变溶菌素(Sigma-Aldrich Co.制造)或100U的变溶菌素(重组)(A&ABiotechnology制造)作为N-乙酰胞壁质酶，将反应温度变为37或50℃，除此以外，与实施例1的方法同样地进行反应，研究L-鼠李糖对细胞壁分解反应赋予的效果。将各反应进行1次。
其结果，如图3所示，与反应温度或所使用的来自球孢链霉菌的N-乙酰胞壁质酶的种类无关，与未添加糖的情况相比，在添加有L-鼠李糖的情况下，确认到细胞壁分解率的上升。因此，表明L-鼠李糖促进细胞壁分解，与来自球孢链霉菌的N-乙酰胞壁质酶的种类无关。
实施例4细菌的细胞壁分解4
将添加的糖变为D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖或D-果糖，除此以外，与实施例1的方法同样地进行反应，研究各糖的细胞壁分解促进效果。将各反应进行3次。
其结果，如图4所示，确认到D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、L-岩藻糖、L-甘露糖具有细胞壁分解促进效果。另外，确认到D-木糖、D-果糖在反应第1小时具有细胞壁分解促进效果。特别是在添加有L-岩藻糖的情况下，在反应1小时得到未添加糖的情况下的约3倍的分解率，在添加有D-阿拉伯糖或L-阿拉伯糖的情况下，在反应1小时得到未添加糖的情况下的约4倍的分解率。
实施例5糖添加的效果的验证1
由实施例1～4预想到D-阿拉伯糖等糖使变溶菌素的活性上升，促进细胞壁的分解。但由于也无法否定使同时添加的溶菌酶的活性上升的可能性，因此对一部分糖研究了单独利用变溶菌素或溶菌酶处理YIT 9029时的分解率。具体而言，以最终浓度1.5M添加D-阿拉伯糖作为糖，单独使用变溶菌素(重组)(A&A Biotechnology制造)、单独使用溶菌酶、或组合使用变溶菌素(重组)与溶菌酶，除此以外，与实施例1的方法同样地进行反应。将各反应进行1次。另外，以最终浓度0.5、1.0或1.5M添加L-鼠李糖、L-甘露糖、L-岩藻糖或L-阿拉伯糖作为糖，单独使用变溶菌素(重组)(A&A Biotechnology制造)，除此以外，与实施例1的方法同样地进行反应。将各反应进行3次。
其结果，如图5A所示，D-阿拉伯糖在单独使用溶菌酶的情况下并未表现出显著的分解促进，在单独使用变溶菌素的情况和并用变溶菌素与溶菌酶的情况下表现出分解促进。另外，如图5B所示，在实施例4中确认到分解促进效果的L-鼠李糖、L-甘露糖、L-岩藻糖和L-阿拉伯糖在单独使用变溶菌素的情况下也确认到分解促进效果。因此，表明各种糖使变溶菌素的活性上升。
实施例6糖添加的效果的验证2
对实施例4中变溶菌素活性的上升率高的D-阿拉伯糖和L-阿拉伯糖研究了D体与L体的促进效果的优劣和添加阿拉伯糖时的最佳条件。具体而言，以最终浓度0、0.1、0.5、1.0或1.5M添加D-阿拉伯糖或L-阿拉伯糖，将反应温度变为37或50℃，除此以外，与实施例1的方法同样地进行反应。将各反应进行3次。
其结果，如图6所示，在0.1M～1.5M的浓度范围内，D体与L体的促进效果没有差别。另外，在1.0M与1.5M时，在反应第1小时分解率均超过80％，但与1.0M相比，1.5M时的各时间分解率稍高，且在0.1M～1.0M之间观察到浓度依赖性，因此认为接近室温下在水中的溶解度的上限的1.5M为最佳浓度。进而，如图7所示，在短时间内的反应中，50℃的分解率高于37℃的分解率，在添加有D-阿拉伯糖1.5M的情况下，分解率在1小时达到93％。
Claims (12)
1.一种细胞壁分解促进方法，其特征在于，在糖的存在下，使N-乙酰胞壁质酶作用于细菌，所述糖为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖以及它们的衍生物中的1种或2种以上。
2.根据权利要求1所述的细胞壁分解促进方法，其中，所述糖为选自D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、L-岩藻糖、L-甘露糖、L-鼠李糖和D-果糖中的1种或2种以上。
3.根据权利要求1或2所述的细胞壁分解促进方法，其中，所述N-乙酰胞壁质酶来自球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞壁分解促进方法，其中，所述N-乙酰胞壁质酶为变溶菌素。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞壁分解促进方法，其中，所述细菌为革兰氏阳性菌。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞壁分解促进方法，其中，所述细菌为乳杆菌属细菌。
7.一种细菌的细胞壁分解促进剂，以糖作为有效成分，所述糖为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖以及它们的衍生物中的1种或2种以上。
8.根据权利要求7所述的细胞壁分解促进剂，其中，所述糖为选自D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、L-岩藻糖、L-甘露糖、L-鼠李糖和D-果糖中的1种或2种以上。
9.一种细菌的细胞壁分解促进用试剂盒，含有糖和N-乙酰胞壁质酶，所述糖为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖以及它们的衍生物中的1种或2种以上。
10.根据权利要求9所述的细胞壁分解促进用试剂盒，其中，所述糖为选自D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、L-岩藻糖、L-甘露糖、L-鼠李糖和D-果糖中的1种或2种以上。
11.一种糖的用于制造细胞壁分解促进剂的应用，所述糖为选自作为单糖的戊醛糖、L体的己醛糖或己酮糖、以该单糖的1种以上作为构成糖的二糖、寡糖和多糖以及它们的衍生物中的1种或2种以上。
12.根据权利要求11所述的应用，其中，所述糖为选自D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、L-岩藻糖、L-甘露糖、L-鼠李糖和D-果糖中的1种或2种以上。
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