DE2634187A1

DE2634187A1 - Verfahren zur maximalen steigerung des wachstums und der nikotinabbauaktivitaet von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2634187A1
Application number: DE19762634187
Authority: DE
Inventors: Vernon L Geiss; Lawrence E Gravely; Richard P Newton
Original assignee: British American Tobacco Co Ltd
Current assignee: British American Tobacco Investments Ltd
Priority date: 1975-11-17
Filing date: 1976-07-29
Publication date: 1977-05-26
Also published as: US4011141A; CA1067027A; GB1523835A

Description

^"E£ N Ί Λ Ν V/Ä LT E

A. GRÜNECKER

DlPL-ING.

H. KINKELDEY

DR-INQ

W. STOCKMAIR

DR-ING · AeE(CAl-TECH)

K. SCHUMANN

DFL HER MAT, · DtPL-R-iYS

P. H. JAKOB

DlPL-INa

G.BEZOLD

DR RHI NAT.- EJiPL-CHEM.

8 MÜNCHEN

MAXIMILIANSTRASSE

29. Juli 1976 P 10 605-60/co

British-American Tobacco Company !limited

P.O.Box 482, Westminster House,

KObank, London SWlP 3JE, England

Verfahren zur maximalen Steigerung des Wachstums und der Nikotinabbauaktivität von Mikroorganismen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur maximalen Steigerung des Wachstums und der Nikotinabbauaktivität von Mikroorganismen, die zur Behandlung von Tabak zur Verminderung seines Nikotingehalts verwendet v/erden. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Züchten bestimmter Mikroorganismen in einer Nikotin enthaltenden Brühe bei kontrollierten Bedingungen, wobei maximales Mikroorganismen-Wachstum und maximale Nikotinabbauaktivität erhalten werden,

Aus verschiedenen Gründen soll der Nikotingehalt von Tabak oft vermindert werden. Beispielsweise haben in den vergangenen Jahren "milde" Zigaretten mit niedrigem Nikotingehalt beim Verbraucher großes Interesse gefunden.

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TELEFON (O8B) 22 20 63

TELEX ΟΕ-2Θ38Ο

TELEGRAMME MONAPAT TELEKOPIERER

Zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak gibt es viele Verfahren. Bei den meisten dieser Verfahren werden jedoch zusammen mit dem Nikotin andere Bestandteile des Tabaks entfernt. Durch die Entfernung der anderen Bestandteile werden die wünschenswerten Aroma- und Geschmackseigenschaften oder andere wünschenswerte Raucheigenschaften nachteilig beeinflußt. Es besteht daher Bedarf nach Verfahren, mit denen der Nikotingehalt von Tabak selektiv vermindert werden kann, ohne daß die gewünschten Raucheigenschaften nachteilig modifiziert werden.

Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak durch Behandlung mit Mikroben werden in der deutschen Patentschrift . ... ... (Patentanmeldung P

entsprechend der US-Anmeldung mit der Serial Nr. 632 804, die am gleichen Tag, wie die vorliegende Anmeldung,eingereicht wird und bei der Geiss, Gregory, Newton und Gravely Erfinder sind) und in der deutschen Patentschrift . ... ... (Patertanmeldung P , entsprechend der US-Anmeldung mit der Serial Nr. 632 863, die am gleichen Tag, wie die vorliegende Anmeldung, eingereicht wird und bei der Newton, Geiss, Jewell und Gravely als Erfinder genannt sind) beschrieben.

Bei den Mikrobenbehandlungen dieser schwebenden Patentanmeldungen werden Mikroorganismen-Kulturen verwendet, die gegenüber Nikotin spezifisch sind. Dadurch wird der Nikotingehalt des Tabaks wesentlich vermindert, ohne daß die anderen Komponenten des Tabaks wesentlich beeinflußt werden. Obgleich der Nikotingehalt des Tabaks nach diesen Verfahren vermindert wird, bleiben die organoleptischen Eigenschaften, die dem Tabakrauch, der aus dem Tabak gebildet wird, zugeschrieben werden, im wesentlichen erhalten. Nach der Behandlung wird jedoch ein milderer Rauch erzeugt.

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur maximalen Steigerung des Wachstums und der Nikotinabbauaktivität von Mikroorganismen, die durch biochemische Mechanismen, wobei 3-Succinoylpyridin gebildet wird, Nikotin abbauen. Bei dem Verfahren wird ein Nikotin enthaltendes Wachstumsmedium mit den Mikroorganismen inokuliert. Die Brühe wird belüftet und bewegt. Während der Wachstumszeit sollten der pH-Wert der Brühe zwischen etwa 6 und 7,8 und die Temperatur zwischen etwa 10 und etwa 45°C gehalten werden. Die Brühe sollte eine Anfangsnikotinkonzentration von mindestens 0,5 mg/ml bis zu der Menge, die für die Mikroorganismen toxisch ist, besitzen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur maximalen Steigerung des Wachstums und der Nikotinabbauaktivität von Mikroorganismen, die Nikotin nach einem biochemischen Mechanismus, wobei 3~Succinoylpyridin gebildet wird, abbauen, wobei die Mikroorganismen aus der Gruppe Cellulomonas sp. und Pseudomonas putida ausgewählt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Nikotin enthaltende Brühe mit den Mikroorganismen inokuliert und die Brühe belüftet und bewegt, wobei

(a) der pH-Wert der Brühe zwischen etwa 6 und etwa 7,8 gehalten wird,

(b) die Anfangsnikotinkonzentration der Brühe bei mindestens 0,5 mg/ml bis zu der Menge, die für die Mikroorganismen toxisch ist, gehalten wird und

(c) die Brühe bei einer Temperatur zwischen etwa 10 und etwa 45⁰C gehalten wird.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Maximierung des Wachstums und der Nikotinabbauaktivität von Mikroorganismen geschaffen, mit denen Tabak zur Verminderung seines Nikotingehalts behandelt werden kann. Bei der vorliegenden Erfindung können solche Mikroorganismen verwendet werden, die Nikotin nach einer biochemischen Reaktion, bei der 3-Succinoylpyridin wie auch 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin und andere Nebenprodukte gebildet werden, abbauen. Nachdem die Kulturen

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der Mikroorganismen nach dem erfindimgs gemäß en Verfahren hergestellt wurden, können sie zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak verwendet v/erden, indem man den Tabak mit den Kulturen bei geeigneten Temperatur-, Feuchtigkeits- und pH-Bedingungen inokuliert.

Erfindungsgernäß wird ein Verfahren zur Maximierung des Wachstums und der Nikotinabbauaktivität bestimmter Mikroorganismen geschaffen, bei dem eine Nikotin enthaltende Brühe mit den Mikroorganismen inokuliert wird und die Brühe belüftet und bewegt wird. Die Mikroorganismen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet werden, sind Mikroorganismen, die Nikotin nach einem biochemischen Mechanismus, bei dem 3-Succinoylpyridin gebildet wird, abbauen. Geeignete Mikroorganismen werden aus der Gruppe von Cellulomonas sp. und Pseudomonas putida ausgewählt.

Während der Zeit, während der die Kultur der Mikroorganismen in der Brühe gezüchtet wird, wird der pH-Wert der Brühe zwischen etwa 6 und etwa 7,8 gehalten. Die Temperatur wird zwischen etwa 10 und etwa 45⁰C gehalten. Die Brühe sollte eine Anfangsnikotinkonzentration von mindestens 0,5 mg/ml Nikotin bis zu der Menge enthalten, die für die Mikroorganismen toxisch ist.

Die Mikroorganismenkultur zeigt eine maximale Nikotinabbauaktivität nach dem Zeitpunkt, nachdem die Kultur ihren maximalen Sauerstoffbedarf und maximale Kohlendioxidentwicklung zeigt, aber vor dem Zeitpunkt nach diesen Maxima, wo die Kultur minimalen Sauerstoffbedarf und minimale Kohlendioxidbildung zeigt. Aus diesem Grund wird der Tabak bevorzugt mit der Kultur behandelt, nachdem die Maxima beobachtet wurden, aber vor dem darauffolgenden minimalen Sauerstoffbedarf und der minimalen Kohlendioxidentwicklung.

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In der beigefügten Figur sind der Sauerstoffbedarf und die Kohlendioxidentwicklung wie auch der Alkaloidabbau für das Kulturwachstum in einer Nikotin enthaltenden Brühe graphisch dargestellt.

Reine Kulturisolate von Bakterien, die Nikotin durch biochemische Mechanismen, bei denen 3-Succinoylpyridin gebildet wird, abbauen und die zur Behandlung von Tabak zur Verminderung seines Nikotingehalts geeignet sind, können durch Kulturanreicherungsverfahren erhalten werden.. Drei Bakterienspecies, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, wurden aus Zigarrentabak erhalten.

500 g Zigarrentabak aus Puerto Rico werden mit Wasser auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 80% eingestellt. Der Tabak wird fest bzw. eng übereinandergestapelt, mit einer Plastikfolie umhüllt und kann über Nacht bei etwa 25⁰C inkubieren. Nach 18 Stunden werden von dem Tabak für die Bestimmung der Alkaloide Proben entnommen und es erfolgt ein Umstapeln. Der Inkubatioiis- und Umstapelungszyklus wird einige Tage weitergeführt, bis der Alkaloidgehalt im Tabak sehr niedrig ist.

Nach einigen Tagen werden 5 g des behandelten Zigarrentabaks zu einem Kolben aus Nährmedium gegeben, das Nikotinbrühe enthält, und unter Schütteln wird bei 30⁰C inkubiert. Die Nikotinbrühe enthält 0,02 g FeSO^, 4 ml Nikotin, 2,0 g KH₂PO^, 5,0 g KCl, 0,2 g MgSO₄, 0,1 g Hefeextrakt und 1 1 Wasser zur Einstellung des pH-Werts der Brühe auf 6,8.

Eine anschließende Alkaloidanalyse der Nikotinbrühe zeigt, daß das Nikotin abgebaut wurde. Nikotin wird zu der Brühe zur Einstellung des Nikotingehalts auf 4 mg/ml gegeben. Diese verarmt wieder an Nikotin. Frische Nikotinbrühe wird mit Material aus dem ersten Kolben inokuliert, und wieder tritt Nikotinverarmung auf. Frisches Medium mit zusätzlichem

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Nikotin wird bei mehreren, nachfolgenden Übertragungen verwendet «

Proben aus den Kolben mit der inokulierten Nikotinbrühe werden auf Nikotinagar aufgestrichen, der die gleiche Zusammensetzung wie das Nikotinbrühe enthaltende Nährmedium besitzt, ausgenommen, daß 1,556 Agar zugegeben v/erden und daß bei 30°C inkubiert wird. Die stärksten Kolonien von Bakterien, die sich auf dem Nikotinagar entwickeln, werden mehrere Male zur Herstellung reiner Stämme wieder aufgestrichen.

Aus den ursprünglichen Kolonien werden drei Bakterienstämme erhalten, identifiziert und bei dem U.S. Department of Agriculture (bei dem Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois) hinterlegt. Ein Stamm, der in der vorliegenden Anmeldung als Isolat Cellulomonas sp . (NRRL B-8063) gezeichnet wird, besitzt unregelmäßige Kolonien. Ein anderer Stamm, der in der vorliegenden Anmeldung als Isolat Pseudomonas putida (NRRL B-8062) bezeichnet wird, besitzt milchartige, glatte Kolonien, und der dritte Stamm, der in der vorliegenden Anmeldung als Isolat Pseudomonas putida (NRRL B-8061) bezeichnet wird, besitzt glatte, weiße Kolonien.

Die Stämme NRRL B-8061 und NRRL B 8062 zeigen eine stärkere Nikotinabbauwirkung als der Stamm NRRL B-8O6j5. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden als bevorzugte Mikroorganismen Fseudomonas putida (NRRL B-8061) verwendet, obgleich Pseudomonas putida (NRRL B-8062) in seinen meisten Eigenschaften sehr ähnlich ist. Die morphologischen und biochemischen Eigenschaften von Pseudomonas putida (NRRL B-8061 und NRRL B-8062) und Cellulomonas sp. (NRRL B-8063) sind in den Tabellen I, II bzw. III angegeben.

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Tabelle I

Morphologische und biochemische Eigenschaften von Pseudomonas putida (NRRL B-8061)

A. Morphologie

Stäbchen, die in ihrer Form oval bis kurz sind, Durchmesser von 0,8 bis 1,0 /u, 1,0 bis 2,2 /u lang, hauptsächlich kokkenförmig; sie bilden Paare und längere Filamente.

Form der Kolonie:

Nähragar: opalisierend, leicht dunkelgelb oder cremefarben gefärbt, flache, glatte Kanten.

Pepton-Hefeextrakt: Aussehen sehr ähnlich wie beim Nähragar; es.tritt gleichzeitig die Bildung eines diffusionsfähigen, gelben Pigments auf, das unter ultraviolettem Licht fluoresziert. Dieses Pigment wird insbesondere in Glucose enthaltenden Medien gebildet.

Nikotinagar: fadenförmig, opak, perlgrau, butterartige Konsistenz, glänzend.

Hirn-Herz-Infusionsagar: kreisförmig, bucklig bzw. vorgewölbt, gerunzelt, wellenförmig verlaufend, glitzernd, opak, perlgrau.

Wachstumsart in statischer Herz-Hirn-Infusionsbrühe: trübe, membranes Oberflächenwachstum, flockiges Sediment, starkes Wachstum.

Gramnegativ.

Frei beweglich durch drei oder mehrere polare Flagella.

B. Physiologie

Obligatorisch aerob; stark aerotaktisch. Optimales Wachstum: 25 bis 30⁰C; Bereich: 12 bis 37⁰C. ' Nitrat wird zu Nitrit reduziert; es bildet sich kein Gas. Telluritreduktion: negativ.

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Wachstum mit Benzoesäure als Substrat. Wachstum mit Citrat als einzige Kohlenstoffquelle, bildet ein fluoreszierendes, gelbes Pigment.

Kein Wachstum auf Trehalose oder mit Mandelsäure, 2-Hydroxypyridin oder Pyridin.

Hydrolyse von Arginin: positiv. Gelatine, Stärke, Cellulose, Casein und Harnstoff werden nicht hydrolysiert.

Milchsäure wird gebildet.

Oxidase wird gebildet.

Ammoniak wird gebildet.

Säure und Schwefelwasserstoff v/erden nicht gebildet«,

Catalase ist vorhanden.

Acetylmethyl-carbinol und Indol sind nicht vorhanden.

Lackmulmilch: alkalisch, dann reduziert.

Keine Hämolyse von Blutagar.

Säure, aber kein Gas aus: Adonit, Arabinose, Cellobiose, Dulcit, Fructose, Galactose, Mannose, Melibiose, Raffinose, Rhamncse, Salizin.

Wachstum ohne Säure- oder Gasbildung mit Lactose, Saccharose, Maltose, Glucose, Xylose, Dextrin, Glycerin, Mannit und Inosit.

Wachstum, aber keine Phenazinpigmentbildung auf Kings Medium A. Wachstum und fluoreszierendes Pigment auf Kings Medium B.

Wachstum mit Nicotin und Nicotinsäure als einzige Kohlenstoff quellen. Das UV-Spektrum der Wachstumsflüssigkeit zum Zeitpunkt der Pigmentierung zeigt die Akkumulation von 2,5-Dihydroxypyridin bei beiden Substraten.

GC-Verhältnis: Schmelzpunktverfahren: 62,5. CsCl-Dichtegradientenzentrifugierung: 63,2.

Pathogenizität: beim Meerschweinchen nicht-pathogen bei oraler Fütterung oder intraperitonealer Injektion.

Quelle: Tabak.

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Tabelle II

Morphologische und biochemische Eigenschaften von Pseudomonas putida (NRRL B-8062)

A. Morphologie

Stäbchen, in ihrer Form oval bis kurz, 0,8 bis 1,0/U Durchmesser, 1,0 bis 2,2 /u lang; hauptsächlich kokkenförmig; sie bilden Paare und längere Filamente.

Form der Kolonie:

Pepton-Hefeextraktagar: das Aussehen ist ähnlich wie auf dem Nähragar; begleitet von der Bildung eines diffusionsfähigen gelben Pigments, das unter ultraviolettem Licht fluoresziert. Dieses Pigment wird insbesondere in Medien, in denen Glucose vorhanden ist, gebildet.

Nikotinagar: filiform, opak, perlgrau, butterartige Konsistenz, glitzernd.

Hirn-Herz-Infusionsagar: kreisförmig, gerunzelt, wellenförmig, bucklig, glitzernd, opak, perlgrau.

Wachstumsart in statischer Hirn-Herz-Infusionsbrühe: trübe, membranartiges Oberflächenwachstum, flockiges Sediment, starkes Wachstum. ·

Gramnegativ.

Frei beweglich durch zwei oder mehr polare Flagella.

B. Physiologie

Obligatorisch aerob; stark aerotaktisch. Optimales Wachstum: 25 bis 30⁰C. Bereich: 12 bis 37⁰C ¹ Nitrat wird zu Nitrit reduziert; es wird kein Gas gebildet.

Telluritreduktion: negativ.

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Wachstum mit Benzoesäure als Substrat. Wachstum mit Citrat als einzige Kohlenstoffquelle; ein gelbes, fluoreszierendes Pigment wird gebildet.

Milchsäure wird gebildet.

Oxidase wird gebildet.

Ammoniak wird nicht gebildet.

Säure und Schwefelwasserstoff werden nicht gebildet.

Catalase ist vorhanden.

Acetylmethyl-carbinol und Indol sind nicht vorhanden.

Lackmusmilch: alkalisch, dann Reduktion.

Keine Hämolyse von Blutagar.

Säure, aber kein Gas aus: Adonit, Arabinose, Cellobiose, Dulcit, Fructose, Galactose, Mannose, Melibiose, Raffinose, Rhamnose, Salizin.

Wachstum mit Nicotin und Nicotinsäure als einzige Kohlenstoffquellen. UV-Spektrum der Wachstumsflüssigkeit zur Zeit der Pigmentierung zeigt eine Akkumulation von 2,5-Dihydroxypyridin bei beiden Substraten.

GC-Verhältnis: Schmelzpunktverfahren: 61,0. CsCl-Dichtegradientzentrifugierung: 62,2.

Pathogenizität: nicht-pathogen bei Meerschweinchen bei oraler Fütterung oder intraperitonealer Injektion.

Quelle: Tabak.

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.Tabelle III

Morphologische und biochemische Eigenschaften von Cellulomonas sp, (NRRL B-8063)

A. Morphologie

Zellen sind dünn, gebogene oder fast vibroide bzw. vibrioide Stäbchen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 0,7 Ai und einer Länge von 1,5 bis 2,5/u.

Form der Kolonie:

Nähragar: klein, gelb, flach, butterartige Konsistenz mit glatten Kanten.

Pepton-Hefeextrakt: ähnliche Erscheinung wie auf Nähragar. Keine exozellularen Pigmente werden bei Wachstum auf verschiedenen Medien einschließlich von Nikotin gebildet.

Nikotinagar: filiform, opak, perlgrau, membranenartig, glanzlos.

Hirn-Herz-Infusionsagar: kreisförmig, bucklig, erkennbare Konturen, wellenförmig, glanzlos, opak, perlgrau.

Wachstumsart in statischer Hirn-Herz-Infusionsbrühe: trübe, klebrig bzw. zähflüssig, geringelt, mäßiges Wachstum.

Grampositiv, solange jung, beim Erreichen des staionären Wachstums variabel.

Freibeweglich bei Drehbewegung: die Zellen besitzen eine oder zwei polare Flagella.

B. Physiologie

Fakultativ anaerob, obligatorisch aerob, wenn Nitrat vorhanden ist.

Optimales Wachstumt 28 bis 30°C. Bereich: 15 bis 37⁰C ⁱ Nitrat wird zu Nitrit reduziert und Stickstoffgas wird aktiv gebildet.

Wächst mit Nikotin und Benzoesäure als einzige Kohlenstoff quellen. Es wird kein Pigment gebildet. Die spektrale

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Prüfung von Wachstumsflüssigkeit von Nikotin zeigt kein Vorhandensein von Dipyridolen.

Kein Wachstum mit Handelsäure, 2-Hydroxypyridin oder Pyridin.

Keine Hydrolyse mit Gelatine, Stärke, Cellulose, Casein, Harnstoff oder Arginin.

Wächst mit Nictrat als einzige Kohlenstoffquelle»

Telluritreduktion: negativ.

Keine Bildung von Schwefelwasserstoff.

Milchsäure, Oxidase und Ammoniak werden gebildet.

Catalase, positiv.

Indol ist vorhanden, schwach.

Aeetylmethyl-carbinol ist nicht vorhanden.

Lackmusmilch: alkalisch, dann Reduktion.

Kein Pigment auf Kings Medium A oder B.

Wachstum ohne Säure- oder Gasbildung auf Glucose, Saccharose, Maltose, Fructose, Galactose, Raffinose, Xylose, Salizin, Adonit, Glycerin und Inosit.

Kein Wachstum auf Lactose.

Säure, aber kein Gas aus: Arabinose, Cellobiose, Mannose, Melibiose, Rhamnose, Dextrin, Dulcit und Mannit.

Keine Hämolyse von Blutagar.

GC- Verhältnis: Schmelzpunktverfahren: 69,2. CsCl-Dichtegradientzentrifugierung: 68,9.

Pathogenizitat: bei der oralen Fütterung oder der intraperitonealen Injektion bei Meerschweinchen nicht-pathogen.

Quelle: Tabak.

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Mikroorganismenstämme, wie NRRL B-8O6I und NRRL B-8062 sowie NRRL B-8O63, können gezüchtet werden, indem man eine Nährmedium enthaltende Nikotinbrühe, wie die zuvor beschriebene Brühe, mit den Mikroorganismen inokuliert. Bei einer typischen Inokulation werden die Mikroorganismen von einer Nikotinagar-Schrägkultur, wie der zuvor beschriebenen Nikotinagar-Schrägkultur, zu der Brühe gegeben. Die inokulierte · Brühe wird dann in eine Fermentationsvorrichtung, wie einen New Brunswick Scientific Fermentro (MF-214), die mit einer Kontrolleinrichtung für den pH-Wert und einer Kontrollvorrichtung für den gelösten Sauerstoff ausgerüstet ist, gegeben.

Vor der Zugabe in die Fermentationsvorrichtung kennen die Mikroorganismen in einem Nikotinbrühe enthaltenden Nährmedium wachsen. Geeignete Bedingungen sind eine Temperatur von etwa 3O⁰C und milde Bewegung, wie man sie beispielsweise durch Rühren der Brühe mit etwa 220 U/min erhält. Die Mikroorganismen können während beispielsweise 22 bis 26 Stunden in der Brühe wachsen.

Die inokulierte, Nährmedium enthaltende Brühe kann dann zu der Tabakextraktbrühe, bevorzugt zu einem Burleytabakextrakt, die 0,5 mg/ml Nikotin bis zu der Menge, die für die Mikroorganismen toxisch ist, enthält, gegeben werden. Bevorzugt liegt die Nikotinkonzentration zwischen etwa 1,5 und etwa 12 mg/ml. Konzentrationen an Nikotin über etwa 12 mg/ml verlangsamen normalerweise das Mikroorganismenwachstum stark.

In der Fermentationsvorrichtung wird das Inokulum belüftet und bewegt. Eine geeignete Belüftungsrate sollte zwischen etwa 0,25 und etwa 2 Volumeneinheiten Luftverdrängung/min für jede Volumeneinheit Brühe liegen und bevorzugt etwa 1 Verdrängungslufteinheit/min betragen (z.B. 1 1 Luft/min für je 1 1 Brühe). Eine geeignete Bewegung kann durch Rühren mit einem Rührflügel mit einer Rate zwischen etwa 300 und · 900 U/min, be\rorzugt etwa 6OO U/min, erreicht werden.

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Obgleich die Mikroorganismen leicht bei verschiedenen Kombinationen von Belüftung und Bewegung gezüchtet werden können, gibt es einige weniger bevorzugte Kombinationen. Beispielsweise erhält man bei einer Belüftungsrate _t die wesentlich unter 0,25 Luftverdrängungseinheiten/min liegt, nicht die ausreichenden Sauerstoffmenge für ein schnelles Kulturwachstum. Eine größere Luftbewegung als 2 Verdrängungslufteinheiten/min ist nicht erforderlich oder verursacht eine übermäßige Schaumbildung. Die Schaumbildung bewirkt zusätzliche Kontrollschwierigkeiten und mögliche Verunreinigungsprobleme. Ähnliche Überlegungen gelten bei Bewegungsraten unter etwa 300 U/min und über etwa 900 U/min.

Eine Belüftung des Burleyextrakt-Waehstumsmediums kann während des Mikroorganismenwachstums zu Schaumbildung führen. Es ist daher bevorzugt, ein Antischaummittel zu der Brühe zuzugeben. Bevorzugt wird ein im Handel erhältliches Polyglykol-Antischaummittel, das als Dow Corning P-1200 bekannt ist, ein Polyglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1200 und einer Viskosität bei 37,8°C (100⁰F) von 93,1 cSt., verwendet.

Während des Kulturwachstums sollte der pH-Wert so kontrolliert werden, daß er zwischen etwa 6 und etwa 7,8 liegt. Die Mikroorganismen werden innerhalb dieses gesamten Bereichs wachsen und eine gute Nikotinabbauaktivität entwickeln. Es ist jedoch bevorzugt, den pH-Wert so zu kontrollieren, daß er zwischen etwa 6,7 und etwa 7,2 liegt. Ein pH-Wert von 7 ist besonders bevorzugt, da die Verwendung eines pH-Kontrollwerts von etwa 7 eine Flexibilität entweder nach oben oder nach unten ergibt, sofern sie während der Inokulumentwicklung erforderlich ist. Eine Einstellung des Kontroll-pH-Werts bei 6 oder 7,8 ergibt nur eine geringe Flexibilität nach oben oder unten, da die Kultur bei pH-Werten außerhalb dieses Bereichs nicht wächst und keine gute Nikotinabbauaktivität

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entwickelt. Chlorwasserstoffsäure und Natriumhydroxid, wie 2n HCl und 2n NaOH, können zur Kontrolle des pH-Werts verwendet werden.

Eine Kultur kann ohne genaue pH-Kontrolle gezüchtet werden und anschließend zur Tabakbehandlung verwendet werden. Ohne Kontrolle verschiebt sich jedoch der pH-Wert natürlicherweise aufwärts nach 8 oder darüber. Ein Wachstum bei einem konstanten pH-Wert von 8 oder darüber hinhibiert die Kulturentwicklung und -aktivität stark. Wenn während der Inkubierung der pH-Wert 8 erreicht und dort verbleibt, ist es sehr schwierig, aktive Mikroorganismen zu erhalten.

Während des Wachstums der Kultur der Mikroorganismen sind Änderungen in der Temperatur annehmbar. Während längerer Wachstumszeiten sollte die Temperatur zwischen etwa 10 und etwa 45°, bevorzugt zwischen etwa 28 und 32⁰C, gehalten werden. Bei einer Temperatur unter 10⁰C ist das Wachstum sehr langsam, und Temperaturen über 45⁰C sind schädlich für die Mikroorganismen. Einmal hergestellte Kulturen können bei Kühltemperaturen gelagert werden, bevor sie zur Behandlung des Tabaks verwendet werden, ohne daß dieses nachteilig für die Mikroorganismen ist.

Die Menge an verwendetem Inokulum ist nicht kritisch. Die Kulturherstellungszeit hängt von der Menge an Mikroorganismen ab, die zur Inokulierung der Nikotin enthaltenden Brühe verwendet wurden. Die Inokulierung der Nikotin enthaltenden Brühe mit etwa 1 bis etwa 10 Vol-% (bevorzugt etwa 5 Vol-90 Inokulum, das etwa 1 χ 10^ bis 3 χ 10^ Zellen/ml enthält, ergibt in etwa 6,5 Stunden eine Kultur mit guter Tabaknikotinabbauaktivität.

Zur Erreichung eines guten Wachstums und einer guten Nikotinabbauaktivität sollte die Nikotin enthaltende Brühe

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eine Anfangsnikotinkonzentration von mindestens 0,5 mg/ml besitzen. Im allgemeinen ergeben höhere Anfangsalkaloidgehalte in der Brühe höhere Zellzählungen zu dem Zeitpunkt, wenn die Mikroorganismen ihre Maximumaktivität erreicht haben. Für eine gegebene Inokulumrate erfordern höhere Anfangsalkaloidgehalte eine längere Inkubationszeit, bis die maximale Aktivität erreicht ist.

Die Kultur, die Nikotin abbaut und die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet werden kann, erreicht bei einem Verfahren, bei dem eine periodische Inokulumentwicklung durchgeführt wird, schneller ihre maximale Nikotinabbauaktivität. Spezifischer gesagt, wird eine Nikotin enthaltende Brühe mit Mikroorganismen inokuliert, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet vmrden, und werden dann die Mikroorganismen erneut nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet, so erreicht die Kultur des zweiten Züchtungsverfahrens maximale Nikotinabbauaktivität schneller als die des ersten Züchtungsverfahrens, wobei angenommen wird, daß die Mikroorganismen, die zur Inokulierung der Brühe des ersten ¥achstumsverfahrens verwendet wurden, nicht nach den erfindungsgemäßen Bedingungen gezüchtet wurden. Man nimmt an, daß diese Erscheinung (1) auf eine größere Anfangszellmasse bei Inokulum, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet wurde, und (2) eine verstärkte Enzymaktivität der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchteten Kultur zurückzuführen ist.

Es gibt bei dem Kulturwachstum in der Nikotin enthaltenden Brühe zwei Merkmale, die direkte Anzeichen für die Nikotinabbauaktivität der Mikroorganismen sind. Diese sind der Sauerstoffverbrauch und die Kohlendioxidentwicklung. Der Sauerstoffbedarf und die Kohlendioxidentwicklung können leicht analysiert werden, und dies ist ein Verfahren, bei dem bestimmt werden kann, wann die Kultur für die Anwendung auf den Tabak fertig ist.

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In der beigefügten Zeichnung sind der Sauerstoffverbrauch (ausgedrückt als relative Prozent Sättigung von gelöstem Sauerstoff in dem System) und die Kohlendioxidbildung (ausgedrückt als Prozent CO2 in dem Luftabstrom) für Mikroorganismen, die in 8 1 Burleymischung-Brühe gezüchtet wurden, graphisch dargestellt. Die Alkaloidkonzentration der Brühe ist ebenfalls in der Figur graphisch dargestellt.

Die Brühe enthält eine Anfangsnikotinkonzentration von etwa 2 mg/ml und wird mit 3 Vol-% eines Inokulums inokuliert, das während 22 Stunden in einer Nährstoffe enthaltenden Nikotinbrühe, wie zuvor beschrieben, gezüchtet wurde. Die Kultur wird bei 30⁰C in einer Brühe gezüchtet, die mit Rührflügeln, die mit 600 U/min laufen, bewegt wird. Luft wird in die Brühe in einer Rate von 8 l/min eingeleitet, und der pH-Wert wird unter Verwendung von 2n HCl und 1n NaOH reguliert.

Die maximale Nikotinabbauaktivität wird erhalten, wenn sich die Alkaloidkonzentration in der Brühe etwa 0,2 mg/ml nähert. Dieser Punkt fällt mit dem Zeitpunkt zusammen, nachdem die Kultur ihren maximalen Sauerstoffbedarf und die maximale Kohlendioxidentwicklung zeigt, liegt aber vor dem Zeitpunkt, der diesem Zeitpunkt folgt, wo die Kohlendioxidbildung und der Sauerstoffbedarf Minima erreichen.

Die Zeit des maximalen Sauerstoffbedarfs ist in der Zeichnung am Punkt A dargestellt. Ein paralleles Maximum bei der Kohlendioxidentwicklung tritt auf, welches bei Punkt B dargestellt ist. Die Maxima liegen unmittelbar vor dem Zeitpunkt, wo die Kultur ihre maximale Nikotinabbauaktivität be-r sitzt. Später, wenn die Kohlendioxidentwicklung ihren minimalen Wert erreicht (Punkt D) und der Sauerstoffbedarf seinen minimalen Wert erreicht oder schnell abfällt (Punkt E), ist der Zeitpunkt der maximalen Nikotinabbauaktivität vorbei. Die optimale Nikotinabbauaktivität wird in der Fläche erhalten, die in der graphischen Darstellung mit "C" bezeichnet wird.

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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung des Inokulums Nikotinagar und Brühe

Nikotinagar wird entsprechend der folgenden Rezeptur hergestellt:

Nikotin	1	4,0	ml	g
FeSO₄		0,025 g	g
KH₂PO₄		2,0	5 g
KCl	,8	5,0	g
MgSO₄	O₉Zi	g
Hefeextrakt	0,1
Agar	5,0
destilliertes oder ent
ionisiertes Wasser bis zu	1 1
End-pH-Wert 6	•

Das Medium wird 15 Minuten in einem Autoklaven bei 1,05 atü (15 psig) und 121⁰C sterilisiert. Das Nikotin wird üblicherweise zu dem Medium gerade vor seiner Verwendung zugegeben. Eine Brühe des obigen Mediums wird ohne Zugabe von Agar hergestellt.

Tabak-Nikotinbrühe

Ein Burleytabakextrakt wird folgendermaßen hergestellt: 100 g Burleytabak werden mit 1000 ml Wasser vermischt und 25 Minuten in einem Autoklaven bei 1,05 atü und 121⁰C gekocHt. Die entstehende Flüssigkeit wird entfernt und das Volumen wird auf die ursprügnliche Menge eingestellt. Ein gleiches Volumen einer wäßrigen Brühe, die 0,05 g FeSO₄, 4,0 g KH₂PO^, 10,0 g KCl, 0,5 g MgSO₄ und 0,2 g Hefeextrakt enthält, wird zu dem Burleytabakextrakt zugegeben. Das Medium wird 15 Minuten in einem Autoklaven bei 1,05 atü und 121⁰C sterilisiert. Gerade vor der Verwendung wird Nikotin bis zu einer Endniko-

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tinkonzentration von 4,0 mg/ml zugegeben. Tabak, der einer Flue-curing-Behandlung unterworfen wurde, kann in diesem Medium anstelle von Burleytabak ebenfalls verwendet werden.

Im folgenden wird Tabak, der einer Flue-curing-Behandlung unterworfen wurde, als "Flue-curing Tabak" bezeichnet.

Tabakextraktbrühe

Tabakextraktbrühe wird auf gleiche Weise, wie der in der Tabak-Nikotinbrühe verwendete Burleyextrakt, hergestellt. Abhängig von der gewünschten Endnikotinkonzentration kann Wasser gegebenenfalls zugegeben werden.

Brüheninokulation

Die Mikroorganismen, wie die Stämme NRRL B-8061, werden auf Agarschrägplatten 25 bis 72 Stunden bei 30⁰C inkubiert. Flüssiges Medium, z.B. Tabak-Nikotinbrühe, wird mit steriler Wasserwaschlösung von den Schrägkulturen, das auf eine optische Dichte von 0,5, abgelesen bei 650 m/u an einem Spektrophotometer (B&L Spectronic 20), verdünnt wurde, inokuliert. Eine 1?oige (Vol/Vol) Inokulumrate der standardisierten Suspension wird zu einem der Brühenmedien für die Kulturfortpflanzung zugegeben. Das Wachstum wird verstärkt, wenn man Rotationsbewegung während 24 bis 48 Stunden bei 30⁰C und 220 U/min verwendet.

Beispiel 2

Zur Erläuterung des Einflusses der Belüftung und der Bewegung wird eine Tabak-Nikotinbrühe, wie in Beispiel Tbeschrieben, mit Pv putida ( (NRRL B-8061) inokuliert. Dazu verwendet man steriles Wasserwaschwasser von Nikotinagar-Schrägplatten, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurden.

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263Λ187

Nach dem Stehenlassen während 24 Stunden bei 3O⁰C wird die Tabak-Nikotinbrühe zur Inokulation getrennter 8 1 Ansätze von Burleytabakextraktbrühe, wie in Beispiel 1 beschrieben, in einer New Brunswick Scientific Fermentationsvorrichtung (MF-214) verwendet. Die Burleytabakextraktbrühe wird mit 3 Yo1-% Tabak-Nikotinbrühe inokuliert.

Die Mikroorganismen werden in der Burleytabakextraktbrühe bei 30°C und unterschiedlichen Belüftungs- und Rührbedingungen gezüchtet. Drei Ansätze werden folgendermaßen Druckluft ausgesetzt und in den angegebenen Raten bewegt: 1Ö00 ccm/min und 300 U/min; 4000 ccm/min und 600 U/min; und 4000 ccm/min und 900 U/min. Der pH-Wert der Ansätze wird unter Verwendung von HCl und NaOH reguliert. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle IV angegeben.

Aus Tabelle IV ist erkennbar, daß das beste Wachstum unter Verwendung einer hohen Bewegungsrate ( 900 U/min) und einer niedrigen Belüftungsrate (4000 ccm/min) erhalten wird. Rührt man mit 900 U/min, so bildet sich eine wesentliche Schaummenge. Mäßige Belüftungs- (8000 ccm/min) und Bewegungs-(600 U/min)-Raten sind bevorzugt (vergl. Beispiel 3 und Tabelle V).

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Tabelle IV
Alkaloidzersetzung bei verschiedenen Belüftungs/Bewegungs- bzw.Rührkombinationen

Belüftung(ccm/min)	(U/min)	Alka	16 000	pH-	Zähl.	Alka	4 000	pH-	Zähl.	4	000
Bewegung	Zäh	loide	300	Wert	d.le-	loide	600	Wert	d.le-		900
Proben	lung d.	(mg/	gelöstes		bens-	(mg/	gelöst.		bensf.	Alka	gelöst. pH-
beschrei	lebens	ml	O₂ {% re		fähig.	ml)	O₂ (% re		Zellen	loide	O₂ (% Wert
bung	fähigen		lativ)		Zellen		lativ)		(Zelle/	(mg/	rela
	Zellen				(Zelle/ml) (x 10^ö)					ml)	tiv)
	(Zelle/ml) (x 105)

_o vor der

eo Inokula»

oo tion

Ü2 Inpkulum 2 100

nach

do Inokulation s

Stdonach
d cInokulο ι

1
2

•6

7,5

10
'
22

21

20

34

84

370

960

2110
2700
3600
3300

1,87
0,14

1,69

1,72
1,67
1,65
1,65
1,54

1,76

1,21
0,77
0,26
0,18

100 100 96 80 44 18 12

7,2

7,5

7_s0

1 300

34

1,65 0,07

1,65

82

84

7,88 - 2,11
7,39 1 670 0,14

7,0	40
7,0	38
7₉O	47
7,0	147
7,0	500
7,0	690
7,0	3100
7,0	-
7,0
7,0
7,0
7,0
7,0

1,65	88
1,56	88
1,57 ·	86
1,57	81
1,57	70
1,46	64
1,33	47
1,27	36

7,26	86
7,17	72
7,18	330
7,19	1010
7,17	2400
7,16	3400
7,40	6600
7,60	9200

0,98

80

6,9

5.6 7,9

7,28 25 2,04 72 6,6

7,0

7,1 7,2 7,5 7,6 7,6 7,7 7,7

2,20	73	K) CT)
2,15	72	CO
1,96	68
1,76	60
1,76	47
1,80	40
0,55	34
0,1	70

CO

at)

Beispiel 5

Zur Erläuterung der Bedeutung der pH-Kontrolle wird P. putida (NRRL B-8061) unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 2 in zwei Ansätzen von 8 1 Burleynikotinextraktbrühe gezüchtet. Man belüftet mit Druckluft in einer Rate von 8000 ccm/min und rührt mit 600 U/min. Bei dem einen Ansatz wird der pH-Wert nicht kontrolliert, wohingegen bei dem anderen Ansatz der pH-Wert mit 1n HCl und 2n NaOH bei 7,0 kontrolliert wird.

Da die Mikroorganismen basische Komponenten bilden, findet eine Verlagerung im pH-Wert der Burleytabakextraktbrühe in Richtung auf 8 statt. Es ist somit nicht möglich, den pH-Wert konstant bei 7,0 zu kontrollieren. Bei dem Ansatz, bei dem der pH-Wert kontrolliert wird, kann man jedoch den pH-Wert unter 8 halten und irgendwelche Verlagerungen im pH-Wert nach oben dauern nicht lange genug, um die Tabaknikotinabbauaktivität der Mikroorganismen zu zerstören. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle V angegeben.

Zu verschiedenen Zeiten während des Wachstums der Mikroorganismen werden Teile der Kultur entnommen und Tabak wird damit behandelt. Der Tabak wird dann in der Masse 16 Stunden gelagert. Wie aus den Werten der Tabelle V hervorgeht, besitzt der Ansatz, dessen pH-Wert kontrolliert wurde, eine verstärkte Tabaknikotinabbauaktivität. Dieser Unterschied ist besonders bei den beiden Ansätzen von Mikroorganismen ausgeprägt, die während 7 Stunden gezüchtet wurden.

Bei längeren Wachstumszeiten verlieren die Mikroorganismen sowohl in dem Ansatz, dessen pH-Wert kontrolliert wurde, als auch in dem Ansatz, dessen pH-Wert nicht kontrolliert wurde, ihre Nikotinabbauaktivität beim Tabak. Bei dem Ansatz, dessen pH-Wert kontrolliert wurde, kann man die Tabaknikotinabbauaktivität jedoch wieder herstellen, indem man frisches Nikotin

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zu der Brühe gibt. In dem Ansatz, dessen pH-Wert nicht kontrolliert wird, ist es nicht möglich, die Nikotinabbauaktivität durch die Zugabe von frischem Nikotin zu dem Ansatz
wieder herzustellen.

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Tabelle V

Wachstum und Alkaloidabbau bei Brühen, deren pH-Wert kontrolliert und nicht kontrolliert wurde

Probenbeschreibung Zählung der lebensfähigen Zellen r (Zellen/ml)(x10 )

Alkaloide (mg/ml)

PH

pH-Kontrolle Ja nein

pH-Kontrolle ja nein

Kontrolle

nein

Alkaloide im Tabak nach I6stündiger Behandlung

pH^Kontrolle ,ja nein

vor d.Inokulation
Inokulum

-* Std.nach der
° Inokulation:

O
1
2

5
6

6,5

7,5

1280

143

500

2200

3700

5600

1280

138

580

1820

2100

3400

2,09
0,14

1,98
1,98
1,87
1,95
1,65

1,43
1,27
0,66
0,33

1,89 0,14

1,87 2,09 1,98 1,87 1,78

1,76 1,67 1,37 1,27

6,0 6,6 7,0 7,0 7.2 7,6 7,8 7,9 7,9 7,85

5,8 7,8

5,88 5,97 6,11 6,39 7,23

8,'07 8,16

3,29

2,83 0,93

3,65

3,35 2,40

B e i S₁ ρ i e 1 4

Zur Erläuterung des Einflusses des Anfangsalkaloidgehalts im Wachstumsniedium werden vier Ansätze von Mikroorganismen entsprechend dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 2 gezüchtet. Bei jedem dieser Versuche werden 8 1 Burleytabakextraktbrühe mit 5 Vol-% Tabak-Nikotinbrühe, die etwa 2 χ 10° Zellen/ml enthält, in einer Fermentationsvorrichtung, die mit einer Rate von 600 U/min gerührt wird und einer Belüftung mit Druckluft in einer Räte von 8000 ccm/min unterworfen wird, inokuliert. In jedem Fall wird die Temperatur bei etwa 30⁰C kontrolliert, und der pH-Wert wird so kontrolliert, daß er so nahe wie möglich an 7,0 liegt. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle VI angegeben. Die Anfangsalkaloidgehalte der Wachstumsmedien sind in Tabelle VI aufgeführt.

Aus den Werten der Tabelle VI ist erkennbar, daß es umso langer dauert, bis die Kultur ihr maximales Nikotinabbaupotential erreicht, je höher der Anfangsalkaloidgehalt ist. Es gibt jedoch eine minimale Zeit, die für die Ausbildung einer starken Enzymaktivität erforderlich ist, unabhängig von dem Anfangsalkaloidgehalt.

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Tabelle VI

Einfluß des Anfangsalkaloidgehalts	(	vor d.Inokulation	Jehalt 1	auf die Zeit	2 Gehalt 3	der
Inokulumhersteilung	Inokulum	0,81		2,28
Probenbeschreibung	nach d«Inokulation	0,14	Alkaloid (mg/ml)	0,05
Stunden nach der	0,68	Gehalt	2,24	Gehalt 4
Inokulation:		1,84		3,18
1		0,07		0,07
2	0,58	1,45	2,10	2_r92
3	0,38		2,04
4 ■	0,38		1,92
VJ!	0,19	1,40	1,81	2,66
5,5	0,08	1,50	1,54	2,77
6	0,05	1,44	0,94	2,77
6,5	• —	1,28	—	2,65
7.	-	1,14	0,38	2,47
	-	0,79	0,12	2,26
		0,30	—
0,13	-
-	1,22

Beispiel 5

Um zu zeigen, daß P. putida (NRRL B-8061) sich bei periodischer Entwicklung schneller entwickelt, wird der Mikroorganismus in zwei Stufen gezüchtet. Bei der ersten Stufe wird der Mikroorganismen im wesentlichen so gezüchtet, daß man, wie in Beispiel 2 beschrieben, arbeitet, ausgenommen, daß 8 1 Burleytabakextraktbrühe mit 5 Vol-% Tabak-Nikotinbrühe inokuliert werden. Die Burleyextraktbrühe wird mit 600 U/min bewegt und in einer Rate von 8000 ecm Luft/min bei 30⁰C belüftet. Nach 7 Stunden Wachstum wird ein Teil der Burleyextraktmischung aus der Fermentationsvorrichtung entnommen und als Inokulum für die zweite Fermentationsstufe verwendet. Die zweite Stufe wird mit 5 Vol-% Burleytabakextrakt von der ersten Stufe inokuliert und bei identischen Bedingungen, wie sie bei der ersten Stufe verwendet wurden gezüchtet. Aus den Werten der Tabelle VII ist erkennbar, daß bei der zweiten Stufe höhere Zellkonzentrationen erhalten werden.

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Tabelle VII

Verlauf der Änderung im Alkaloidgehalt bei Herstellung des Inokulums in der Fermentationsvorrichtung in zwei Stufen ■

Probenbeschreibung

Stufe Stufe 2

Zähl.d.
lebensf.
Zellen
(Zellen/
ml)(x1QP)

Alkaloid (mg/ml)

pH

gelöst. Sauerstoffrelativ) Zähl.d.
lebensf.
Zellen
(Zellsn/ml)
(x 10^b)

Alkaloid (mg/ml)

pH gelöster

Sauerstoff (% relativ)

vor der Inokulation
Inokulum 2600

nach d.Inokulation 72
Std.nach d.Inokulation:

1
2
3
4
4,5

l· 6,5 7

116

410

560

1230

1760
3400
3000

5700

2,46 0,07 2,17

1,99 1,84 1,83 1,84

1,62 1,27 0,72

0,126

6,0 7,5 7,0

7,0	58
7,0	55
7,1	52
7,1	40
7,3	20
7,4	22
7,4	8
7,4	40
7,6	51

5700
500

530

2280
2740
3920
5100

17300

2,16 0,13 2,16

2,06 1,81 1,78 1,35 0,79 0,18 0,14 0,12

6,8

8,11

7,0

7,0 7,1 7,4 7,5 7,6 7,6 7,8 7,7

60 60

50

44

28

24 44 46

Leerseite

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur maximalen Steigerung des Wachstums und der Nikotinabbauaktivität von Mikroorganismen, die Nikotin nach einem biochemischen Mechanismus, wobei 3-Succinoylpyridin gebildet wird, abbauen, wobei die Mikroorganismen aus der Gruppe Cellulomonas sp. und Pseudoinonas putida ausgewählt werden, dadurch gekenn ζ eich, net, daß man eine Nikotin enthaltende Brühe mit den Mikroorganismen inokuliert und die Brühe belüftet und bewegt, wobei

(a) der"pH-Wert der Brühe zwischen etwa 6 und etwa 7*8 gehalten wird,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet f daß als Brühe Tabakextraktbrühe mit einer Anfangsnikotinkonzentration zwischen etwa 1,5 und etwa 12 mg/ml verwendet wird.

3. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß ein Teil der inokulierten Grühe nach einer geeigneten Wachstumszeit entfernt und zur Inokulation einer zweiten, Nikotin enthaltenden Brühe verwendet wird.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß die zweite, Nikotin enthaltende Brühe belüftet und bewegt wird, wobei die Brühe eine Anfangsnikotinkonzentration von mindestens 0,5 mg/ml bis zu der Menge besitzt, die für die Mikroorganismen toxisch ist.

709821/0S81 original inspected

5. Verfahren nach. Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß'die zweite, Nikotin enthaltende Brühe bei einem pH-\vert zwischen 6 und 7,8 und einer Temperatur zwischen etwa 10 und etwa 45⁰C gehalten wird.

6. "Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5_S dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur, nachdem die Kultur maximalen Sauerstoffbedarf und maximale Kohlendioxideiitwicklung gezeigt hat, aber vor dem Zeitpunkt nach dem Auftreten des maximalen Sauerstoffbedarfs und der maximalen Kohlendioxidbildung, wo die Kultur minimalen Sauerstoffbedarf und minimale Kohlendioxidbildung zeigt,

zur Behandlung von Tabak verwendet wird.

7· Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß als Brühe Burleytabakextraktbrühe verwendet wird.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Brühe einen Anfangs-pH-¥ert von etwa 6,7 bis etwa 7,2 besitzt und bei einer Temperatur von etwa 28 bis etwa 32⁰C gehalten wird.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Brühe in einer Rate zwischen etwa 0,25 und etwa 2 Volumeneinheiten Luftverdrängung/min für jede Volumeneinheit Brühe belüftet wird.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet , daß die Brühe durch Rühren in einer Rate von J500 bis 900 U/min bewegt wird.

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