DE2634188A1

DE2634188A1 - Verfahren zur verminderung des nikotingehalts von tabak durch mikrobielle behandlung

Info

Publication number: DE2634188A1
Application number: DE19762634188
Authority: DE
Inventors: Vernon L Geiss; Lawrence E Gravely; Charles F Gregory; Ky Louisville; Richard P Newton
Original assignee: British American Tobacco Co Ltd
Current assignee: British American Tobacco Investments Ltd
Priority date: 1975-11-17
Filing date: 1976-07-29
Publication date: 1977-08-04
Also published as: GB1523836A; CA1110440A; US4140136A; US4038993A; CA1077422A

Description

Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak durch mikrobielle Behandlung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak durch Behandlung des Tabaks mit Kulturen von Mikroorganismen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Behandlung von Tabak, bei dem der Tabak bei kontrollierten Bedingungen dem Einfluß von besonderen Mikroorganismen unterworfen wird. Dabei wird der Nikotingehalt des Tabaks in relativ kurzer Zeit vermindert. Das Verfahren ist für die Verminderung des Nikotingehalts von Tabak sehr wirksam. Die gewünschte Intensität des Rauches, der von aus dem Tabak hergestellten Rauchwaren erzeugt wird, wird nicht wesentlich vermindert. Die Reizeigenschaften des Rauches, der von dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Tabak gebildet wird, werden jedoch vermindert.

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TBLEFON (080) 33 98 Oa

TBLKX OB-QO SiO TELEQRAMME MONAPAT TBLKKOPIERER

Aus verschiedenen Gründen soll der Nikotingehalt von Tabak oft vermindert werden. Beispielsweise haben in den vergangenen Jahren "milde" Zigaretten mit niedrigem Nikotingehalt beim Verbraucher großes Interesse gefunden.

Zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak gibt es viele Verfahren. Bei den meisten dieser Verfahren werden jedoch die anderen Tabakbestandteile zusammen mit dem Nikotin entfernt. Die Entfernung der anderen Bestandteile beeinflußt die wünschenswerten Aroma- und Geschmackseigenschaften oder andere wünschenswerte Raucheigenschaften nachteilig. Es besteht daher ein Bedarf nach Verfahren, mit denen der Nikotingehalt von Tabak selektiv vermindert werden kann, ohne daß die gewünschten Raucheigenschaften nachteilig modifiziert werden.

Bei der erfindungsgemäßen mikrobiellen Behandlung werden Kulturen von Mikroorganismen verwendet, die gegenüber Nikotin spezifisch sind. Dabei wird der Nikotingehalt des Tabaks wesentlich vermindert, ohne daß auf die anderen Komponenten des Tabaks irgendein Einfluß ausgeübt wird. Obgleich der Nikotingehalt des Tabaks vermindert wird, bleiben die organoleptischen Eigenschaften, die dem Rauch zuzuordnen sind, der aus dem Tabak gebildet wird, im allgemeinen erhalten. Nach der Behandlung wird jedoch ein milderer Rauch erzeugt.

Die Tabakfermentierung wird seit vielen Jahren bei der Herstellung von Zigarren, Kautabak und Schnupftabak durchgeführt. Die Behandlung von Zigarettentabak nach diesen Verfahren ist jedoch nicht sinnvoll, da lange Zeiten, üblicherweise Tage oder Wochen, erforderlich sind, bis die Fermentierung beendigt ist. Diese Ferment!erungsverfahren ergeben im allgemeinen ebenfalls beachtliche Verluste in der Tabakmasse, oft so viel wie 20 bis 25% des Ausgangstrockengewichts.

Die Behandlung von Nikotin einschließlich von aus Pflanzenquellen stammendem Nikotin mit Mikroorganismen, die Nikotin durch chemische Mechanismen abbauen, wobei 6-Hydroxynicotin gebildet wird, ist bekannt. Ein solches Verfahren wird in der US-PS 3 644 176 beschrieben. Obgleich diese Mikroorganismen für den Abbau von relativ konzentriertem Nikotin geeignet sind, ist ihre Verwendung bei der Aufbereitung von Tabak während der Herstellung von Rauchwaren, insbesondere von Zigaretten, wirtschaftlich nicht möglich. Es sind extrem lange Behandlungszeiten zwischen dem Tabak und diesen Mikroorganismen für eine wesentliche Verminderung des Nikotingehalts bei praktischen Betriebsbedingungen erforderlich.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, mit dem der Nikotingehalt von Tabak wirtschaftlich und selektiv vermindert werden kann, ohne daß der Tabak nachteilig beeinflußt wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts des Tabaks durch mikrobielle Behandlung. Tabak wird bei kontrollierten Bedingungen dem Einfluß von Mikroorganismen unterworfen, die Nikotin durch biochemische Reaktion, wobei inter alia 3-Succinoylpyridin gebildet wird, abbauen. Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Tabak ergibt, wenn er bei Rauchwaren verwendet wird, einen milden Rauch mit vermindertem Nikotingehalt. In den Aroma-, Geschmacks- und Raucheigenschaften beobachtet man keine Verluste.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Tabak mit Mikroorganismen, die Nikotin durch biochemische Mechanismen, wobei 3-Succinoylpyridin gebildet wird, abbauen können, inokuliert, den inokulierten Tabak so reguliert, daß

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(a) ein Feuchtigkeitsgehalt von mindestens· 50 Gew.?o, bezogen auf das Gesamtgewicht an Tabak und Wasser,

(b) eine Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 45⁰C und

(c) ein Anfangs-pH-Wert zwischen etwa 5 und etwa 8 aufrechterhalten werden,und die Mikroorganismen in Kontakt mit dem Tabak während einer Zeit hält, die ausreicht, daß die Mikroorganismen auf das in dem Tabak enthaltene Nikotin einwirken können, wodurch der Nikotingehalt des Tabaks vermindert wird.

Erfindungsgemäß kann der Nikotingehalt von Tabak wesentlich, wirtschaftlich und selektiv vermindert werden, ohne daß der Tabak nachteilig beeinflußt wird. Bei dem Verfahren wird die Tabakaufbereitungszeit nicht wesentlich verlängert. Es sind keine wesentlichen, zusätzlichen Energieleistungen erforderlich, da die Mikroorganismen ihre Energie fast ausschließlich von dem in dem Tabak enthaltenen Nikotin erhalten. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren tritt kein merklicher Verlust an Tabakmasse auf.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Entnikotinisierung bzw. Nikotinverarmung von Tabak geschaffen, bei dem der Tabak mit einer besonderen Gruppe von Mikroorganismen bei geeigneten Temperatur-, Feuchtigkeits- und pH-Bedingungen inokuliert wird. Bei der vorliegenden Erfindung können solche Mikroorganismen verwendet werden, die durch biochemische Reaktion, bei der 3-Succinoylpyridin wie auch 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin und andere Nebenprodukte gebildet werden, Nikotin abbauen. Das Entnikotinisierungsverfahren kann leicht zusammen mit bekannten Verfahren für die Aufbereitung von Tabak während der Herstellung von Rauchwaren verwendet werden.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak, bei dem Tabak mit Mikroorganismen behandelt wird, die Nikotin durch biochemische Me-

chanismen, wobei 3-Succinoylpyridin gebildet wird, abbauen. Nach der Zugabe der Mikroorganismen zu dem Tabak muß der Feuchtigkeitsgehalt bei einem Wert von mindestens 50 Gew.96, bezogen auf das Gesamtgewicht des Tabak-Wasser-Gemisches, gehalten wird.

Nach der Zugabe der Mikroorganismen zu dem Tabak muß die Temperatur so kontrolliert werden, daß sie zwischen etwa 20 und etwa 45°C liegt. Der Anfangs-pH-Wert des Gemisches wird zwischen etwa 5 und etwa 8 gehalten. Der Tabak wird mit den Mikroorganismen während einer Zeit behandelt, die ausreicht, daß die Mikroorganismen auf das in dem Tabak enthaltene Nikotin einwirken können. Der Nikotingehalt des Tabaks wird dabei durch Abbau zu inter alia 3-Succlnoylpyridin vermindert.

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Tabak ergibt einen milden, angenehm schmeckenden Rauch. Der angenehme Geschmack der Rauchwaren, die aus Tabak hergestellt werden, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurde, kann teilweise durch die Anwesenheit von Nikotinabbauprodukten, insbesondere 3-Succinoylpyridin und 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin, die den Wohlgeschmack und Duft ändern, bedingt sein.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung von Nikotinabbauprodukten verwendet werden, indem man die Mikroorganismen zu einem wäßrigen, eine Quelle für Nikotin enthaltenden Medium,, die Tabak sein kann oder auch nicht, zugibt. Wird das erfindungsgemäße Verfahren für einen solchen Zweck verwendet, sollte das Verfahren so reguliert werden, daß eine Anfangsnikotinkonzentration von etwa 0,1 mg Nikotin/ml Wasser bis etwa 14 mg Nikotin/ml Wasser vorhanden ist. Die Abbauprodukte, wie 3-Succinoylpyridin und 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin, können gewonnen und als Aroma- bzw.Geschmackszusatzstoffe bei Rauchwaren verwendet werden.

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Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders für die Behandlung von Burleytabak geeignet. Burleytabak besitzt normalerweise einen relativ hohen Nikotingehalt und ergibt einen recht herben bzw. strengen Rauch. Zur Verminderung dieser "Herbheit" bzw. "Strenge" wird Burleytabak normalerweise mit Casingzusammensetzungen behandelt.Wird Burleytabak nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt, so wird nicht nur der Nikotingehalt vermindert, sondern ebenfalls die Herbheit vermindert, und zwar in solchem Ausmaß, daß der Burleytabak in Rauchwaren ohne Durchführung des Casingverfahrens verwendet werden kann.

Anhand der beigefügten Zeichnung wird eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform näher erläutert. In der Figur ist ein schematisches Blockdiagramm dargestellt, gemäß dem ein Tabakblattgut-Behandlungsverfahren erläutert wird, das eine erfindungsgemäße mikrobielle Behandlung umfaßt.

Reine Kulturisolate von Bakterien, die Nikotin durch biochemische Mechanismen abbauen, wobei 3-Succinoylpyridin gebildet wird, und die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können durch Kulturanreicherungsverfahren erhalten werden. Drei Bakterienspecies, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, wurden aus Zigarrentabak erhalten.

Der Feuchtigkeitsgehalt von 500 g Zigarrentabak aus Puerto Rico wird mit Wasser auf 80$ eingestellt. Der Tabak wird fest bzw. eng übereinandergestapelt, mit Plastik umhüllt und kann über Nacht bei etwa 25⁰C inkubieren. Nach 18 Stunden werden von dem Tabak Proben für die Alkaloidbestimmung entnommen. Der Tabak wird dann umgestapelt. Der Inkubations-

und Umstapelungszyklus wird mehrere Tage fortgeführt, bis der Alkaloidgehalt im Tabak sehr niedrig ist.

Nach einigen Tagen werden 5 g des behandelten Zigarrentabaks in einen Kolben von Nikotinbrühe gegeben,und unter Schütteln wird bei 30⁰C inkubiert. Die Nikotinbrühe enthält: 0,02 g FeSO₄, 4 ml Nikotin, 2,0 g KH₂PO₄, 5,0 g KCl, 0,2 g MgSO₄, 0,1 g Hefeextrakt und 1 1 Wasser zur Einstellung des pH-Werts der Brühe auf 6,8.

Eine anschließende Alkaloidanalyse der Nikotinbrühe zeigt, daß das Nikotin abgebaut wurde. Nikotin wurde erneut zu der Brühe bis zu einem Nikotingehalt von 4 mg/ml zugegeben. Die Brühe verarmte wieder an Nikotin. Frische Nikotinbrühe wird mit Material aus dem ersten Kolben inokuliert, und wieder tritt eine Nikotinverarmung auf. Frisches Medium mit zusätzlichem Nikotin wird bei mehreren nachfolgenden Übertragungen verwendet.

Proben aus den Kolben der inokulierten Nikotinbrühe werden auf Nikotinagar aufgestrichen der gleichen Zusammensetzung wie die Nikotinbrühe, mit Ausnahme der Zugabe von 1,5% Agar. Es wird bei 30⁰C inkubiert. Die stärksten Kolonien von Bakterien, die sich auf dem Nikotinagar entwickelten, werden mehrere Male zur Herstellung reiner Stämme wieder aufgestrichen.

Aus den ursprünglichen Kolonien werden drei Stämme von Bakterien erhalten, identifiziert und bei dem U.S. Department of Agriculture (bei dem Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois) hinterlegt. Ein Stamm, der in der vorliegenden Anmeldung als Isolat Cellulomonas sp. (NRRL B-8O63) bezeichnet wird, besitzt unregelmäßige Kolonien. Ein anderer Stamm, der in der vorliegenden Anmeldung als Isolat Pseudomonas putida (NRRL B-8062) bezeichnet wird, besitzt glatte., milchartige Kolonien, und der dritte Stamm, der im folgenden als Isolat Pseudomonas putida (NRRL B-8O6I) bezeichnet wird, besitzt glatte, weiße Kolonien.

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Die Stämme NRRL B-8O6I und NRRL B-8062 zeigen eine stärkere Nikotinabbauwirkung,als der Stamm NRRL B-8063. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden als bevorzugte Mikroorganismen Pseudomonas putida (NRRL B-8061) verwendet, obgleich Pseudomonas putida (NRRL B-8062) in den meisten Eigenschaften sehr ähnlich ist. Die morphologischen und biochemischen Eigenschaften von Pseudomonas putida (NRRL B-8061) und (NRRL B-8062) und Cellulomonas sp. (NRRL B-8063) sind in den Tabellen I, II bzw. III angegeben»

Die Stämme NRRL B-8061, B-8062 und B-8063 werden in Einzelheiten beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch nicht auf die Verwendung dieser spezifischen Organismen beschränkt. Irgendwelche Mikroorganismen, die Nikotin nach biochemischen Mechanismen abbauen, wobei 3-Succinoylpyridin gebildet wird, können verwendet werden. Selbstverständlich können die Mikroorganismen auch andere Nikotinabbauprodukte außer 3-Succinoylpyridin bilden, und dieses muß nicht das einzige gebildete Abbauprodukt sein.

Damit die Mikroorganismen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, ist es wesentlich, daß sie Nikotin zu 3-Succinoylpyridin abbauen. Es ist unerheblich, ob andere Abbauprodukte gebildet werden. Mikroorganismen, die Nikotin abbauen, ohne wesentliche Mengen an 3-Succinoylpyridin zu bilden, wie solche, die Nikotin zu 6-Hydroxynicotin abbauen, sind für das erfindungsgemäße Verfahren ungeeignet.

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Tabelle I

Morphologische und biochemische Eigenschaften von Pseudomonas putida (NRRL B-8061)

A. Morphologie

Stäbchen, die in ihrer Form oval bis kurz sind, Durchmesser von 0,8 bis 1,0/u, 1,0 bis 2,2 /u lang, hauptsächlich kokkenförmigj sie bilden Paare und längere Filamente.

Form der Kolonie:

Nähragar: opalisierend, leicht dunkelgelb oder cremefarben gefärbt, flache, glatte Kanten.

Pepton-Hefeextraktagar: Aussehen sehr ähnlich wie beim Nähragar; es tritt gleichzeitig die Bildung eines diffusionsfähigen, gelben Pigments auf, das unter ultraviolettem Licht fluoresziert. Dieses Pigment wird insbesondere in Glucose enthaltenden Medien gebildet.

Nikotinagar: fadenförmig, opak, perlgrau, butterartige Konsistenz, glänzend.

Hirn-Herz-Infusionsagar: kreisförmig, bucklig bzw. vorgewölbt, gerunzelt, wellenförmig verlaufend, glitzernd, opak, perlgrau.

Wachstumsart in statischer Herz-Hirn-Infusionsbrühe: trübe, membranes Oberflächenwachstum, flockiges Sediment, starkes Wachstum. '

Gramnegativ. ' .

Frei beweglich durch drei oder mehrere polare Flagella.

B. Physiologie

Obligatorisch aerob; stark aerotaktisch. Optimales Wachstum: 25 bis 30⁰C. Bereich: 12 bis 37⁰C Nitrat wird zu Nitrit reduziert; es bildet sich kein Gas. Tellurltreduktion: negativ.

Wachstum mit Benzoesäure als Substrat. Wachstum mit Citrat als einzige Kohlenstoffquelle, bildet ein fluoreszie- t rendes, gelbes Pigment. '

Kein Wachstum auf Trehalose oder mit Mandelsäure, 2-Hydroxypyridin oder Pyridin.

Hydrolyse von Arginin: positiv. Gelatine, Stärke, Cellulose, Casein und Harnstoff werden nicht hydrolysiert; Milchsäure wird gebildet.

Oxidase wird gebildet.

Ammoniak wird gebildet.

Säure und Schwefelwasserstoff werden nicht gebildet.

Catalase ist vorhanden.

Acetylmethyl-carbinol und Indol sind nicht vorhanden.

Lackmusmilch: alkalisch, dann Reduktion.

Keine Hämolyse von Blutagar.

Säure, aber kein Gas aus: Adonit, Arabinose, Cellobiose, Dulcit, Fructose, Galactose, Mannose, Melibiose, Raffinose, RhamnQse, Salizin.

Wachstum ohne Säure- oder Gasbildung mit Lactose, Saccharose, Maltose, Glucose, Xylose, Dextrin, Glycerin, Mannit und Inosit.

Wachstum, aber keine Phenazinpigmentbildung auf Kings Medium A. Wachstum und fluoreszierendes Pigment auf Kings Medium B.

Wachstum mit Nicotin und Nicotinsäure als einzige Quellen für Kohlenstoff. Das UV-Spektrum der Wachstumsflüssigkeit zum Zeitpunkt der Pigmentierung zeigt die Akkumulation von 2,5-Dihydroxypyridin bei beiden Substraten.

GC-Verhältnis: Schmelzpunktverfahren: 62,5· CsCl-^ Dichtegradientenzentrifugierung: 63,2.

Pathogenizitätt bein Meerschweinchen nicht-pathogen bei oraler Fütterung oder intraperitonealer Injektion.

Quelle: Tabak.

Tabelle II

Morphologische und biochemische Eigenschaften von Pseudomonas putida (NRRL B-8062)

A. Morphologie

Stäbchen, in ihrer Form oval bis kurz, 0,8 bis 1,0 /u Durchmesser, 1,0 bis 2,2 /u lang; hauptsächlich kokkenförmig; sie bilden Paare und längere Filamente.

Form der Kolonie:

Pepton-Hefeextraktagar: das Aussehen ist ähnlich wie auf dem Nähragar; begleitet von der Bildung eines diffusionsfähigen, gelben Pigments, das unter ultraviolettem Licht fluoresziert. Dieses Pigment wird insbesondere in Medien, in denen Glucose vorhanden ist, gebildet.

Nikotinagar: filiform, opak, perlgrau, butterartige Konsistenz, glitzernd.

Hirn-Herz-Infusionsagar: kreisförmig, gerunzelt, wellenförmig, bucklig, glitzernd, opak, perlgrau.

Wachstumsart in statischer Hirn-Herz-Infusionsbrühe: trübe, membranartiges Oberflächenwachstum, flockiges Sediment, starkes Wachstum.

Gramnegativ.

Frei beweglich durch drei oder mehr polare Flagella.

B, Physiologie

Obligatorisch aerob, stark aerotaktisch. Optimales Wachstum: 25 bis 30⁰C. Bereich: 12 bis 37°C Nitrat wird zu Nitrit reduziert; es wird kein Gas gebildet.

Telluritreduktion: negativ.

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Wachstum mit Benzoesäure als Substrat. Wachstum mit Citrat als einzige Kohlenstoffquelle; ein gelbes, fluoreszierendes Pigment wird gebildet.

Hydrolyse von Arginin: positiv. Gelatine, Stärke, Cellulose, Casein und Harnstoff werden nicht hydrolysiert.

Milchsäure wird gebildet.

Oxidase wird gebildet.

Ammoniak wird nicht gebildet.

Säure und Schwefelwasserstoff werden nicht gebildet.

Catalase ist vorhanden.

Acetylmethyl-carbinol und Indol sind nicht vorhanden.

Lackmulsmilch: alkalisch, dann Reduktion.

Keine Hämolyse von Blutagar.

Säure, aber kein Gas aus: Adonit, Arabinose, Cellobiose, Dulcit, Fructose, Galactose, Mannose, Melibiose, Raffinose, Rhamnose, SaIizin.

Wachstum ohne Säure oder Gasbildung mit Lactose, Saccharose, Maltose, Glucose, Xylose, Dextrin, Glycerin, Mannit und Inosit.

Wachstum mit Nicotin und Nicotinsäure als einzige Kohlenstoffquellen. Das UV-Spektrum der Wachstumsflüssigkeit zur Zeit der Pigmentierung zeigt eine Akkumulation von 2,5-Dihydroxypyridin bei beiden Substraten.

GC-Verhältnis: Schmelzpunktverfahren: 61,0. CsCl-pichtegradientzentrifugierung: 62,0.

Pathogenizität: nicht-pathogen bei Meerschweinchen bei oraler Fütterung oder intraperitonealer Injektion.

Quelle: Tabak.

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Tabelle III

Morphologische und biochemische Eigenschaften von Cellulomonas sp. (NRRL B-8063)

A. Morphologie

Zellen sind dünn, gebogene oder fast vibroide bzw. vibrioide Stäbchen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 0,7/u und einer Länge von 1,5 bis 2,5/u.

Form der Kolonie:

Nähragar: klein, gelb, flach, butterartige Konsistenz mit glatten Kanten.

Pepton-Hefeextraktagar: ähnliche Erscheinung wie auf Nähragar. Keine exozellularen Pigmente werden bei Wachstum auf verschiedenen Medien einschließlich von Nikotin gebildet.

Nikotinagar: filiform, opak, perlgrau, membranenartig, glanzlos.

Hirn-Herz-Infusionsagar: kreisförmig, bucklig, erkennbare Konturen, wellenförmig, glanzlos, opak, perlgrau.

Wachstumsart in statischer Hirn-Herz-Infusionsbrühe: trübe, klebrig bzw. zähflüssig, geringelt, mäßiges Wachstum.

Grampositiv, solange jung; beim Erreichen des stationären Wachstums variabel.

Freibeweglich bei Drehbewegung; die Zellen besitzen eine oder zwei polare Flagella.

B. Physiologie

Fakultativ anaerob, obligatorisch aerob, wenn Nitrat

vorhanden ist.

Optimales Wachstum: 28 bis 30⁰C. Bereich: 15 bis 37°C Nitrat wird zu Nitrit reduziert und Stickstoffgas wird-

aktiv gebildet.

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Wächst mit Nikotin und Benzoesäure als einzige Kohlenstoff quellen. Es wird kein Pigment gebildet. Die spektrale Prüfung von Wachstumsflüssigkeit von Nikotin zeigt kein Vorhandensein von Dipyridolen.

Kein Wachstum mit Mandelsäure, 2-Hydroxypyridin oder Pyridin.

Keine Hydrolyse mit Gelatine, Stärke, Cellulose, Casein, Harnstoff oder Arginin.

Wächst mit Citrat als einzige Kohlenstoffquelle.

Tellur!treduktion: negativ.

Keine Bildung von Schwefelwasserstoff.

Milchsäure, Oxidase und Ammoniak werden gebildet· Catalase, positiv.

Indol ist vorhanden, schwach.

Acetyl-methyl-carbinol ist nicht vorhanden.

Lackmusrailch: alkalisch, dann Reduktion.

Kein Pigment auf Kings Medium A oder B.

Wachstum ohne Säure- oder Gasbildung auf Glucose, Saccharose, Maltose, Fructose, Galactose, Raffinose, Xylose, Salizin, Adonit, Glycerin und Inosit.

Kein Wachstum auf Lactose.

Säure, aber kein Gas aus: Arabinose, Cellobiose, Mannose, Melibiose, Rhamnose, Dextrin, Dulcit und Mannit.

Keine Hämolyse von Blutagar.

GC-Verhältnis: Schmelzpunktverfahren: 69,2. CsCl-Dichtegradientzentrifugierung: 68,9.

Pathogenizität: bei der oralen Fütterung oder der intraperitonealen Injektion bei Meerschweinchen nicht-pathogen.

Quelle: Tabak.

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In der beigefügten Zeichnung wird das erfindungsgemäße Verfahren im Zusammenhang mit einem Aufbereitungsverfahren von Tabak bei der Herstellung von Rauchwaren näher erläutert« Entsprechend diesem Verfahren wird Tabak einer Vorbehandlung (3) unterworfen. Die Vorbehandlung kann nicht mehr als die übliche Stufe sein, bei der Tabak kontrollierten Temperatur- und kontrollierten Feuchtigkeitsbedingungen zur Verbesserung seiner Handhabung unterworfen wird.

Nach der Vorbehandlung wird der Tabak mit der mikrobieilen Kultur behandelt (4)· Vor der Inokulation mit der mikrobiellen Kultur wird eine Inokulumanreicherung (5) durchgeführt.

Eine Kultur der Mikroorganismen wird in einer Nikotin enthaltenden.Brühe, bevorzugt in. einer Burleytäbak-Extraktbrühe, gezüchtet. Die Brühe sollte während der Anreicherung belüftet und bewegt werden. Üblicherweise verwendet man eine mäßige Belüftung und eine Bewegung, wie man sie mit Rühren der Brühe bei niedriger Geschwindigkeit erzeugt. Die Brühe sollte einen Anfangs-pH-Wert zwischen etwa 5 und 8, bevorzugt zwischen etwa 6,2 und 7»8, besitzen. Zusätzlich sollte die Brühe zwischen etwa 10 und 45⁰C, bevorzugt zwischen etwa 28 und 32⁰C, gehalten werden.

Die Brühe sollte eine Anfangs-Nikotinkonzentration von mindestens 0,1 mg/ml und bevorzugt von mindestens 1,5 mg/ml besitzen. Die Brühe sollte nicht eine Nikotinkonzentration haben, die höher ist als es der. Menge anspricht, die für die Mikro-Organismen toxisch ist. Nikotinkonzentrationen über etwa 12 mg/ml bewirken im allgemeinen ein wesentlich langsameres Wachstum der Mikroorganismen.

Nach der Inokulation des Tabaks mit den Mikroorganismen, wird der Feuchtigkeitsgehalt des inokulierten Tabaks bei einem Wert von mindestens 50 Gew.%, bezogen auf das Ge-

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sanitgewicht an Tabak- und Wasser-Geraisch, gehalten. Bevorzugt wird der Feuchtigkeitsgehalt bei einem Wert von mindestens 65 Gew.?o gehalten. In einigen Fällen ist es bevorzugt, das Inokulum zu der wäßrigen Tabakaufschlämmung zu geben, wie man sie oft bei der Herstellung von rekonstituiertem Tabakblattgut u.a. verwendet. Typischerweise enthalten solche Aufschlämmungen bis zu 20 Gew.% Tabak_o Durch Behandlung der bei der Herstellung von rekonstituiertem Tabak verwendeten Aufschlämmungen kann eine Entnikotinisierung durchgeführt werden, ohne daß es erforderlich ist, daß Wasser von dem Tabak, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wird_f zu entfernen.

Die Temperatur des inokulierten Tabaks wird zwischen etwa 20 und etwa 45⁰C, bevorzugt zwischen etwa 27 und etwa 32⁰C, gehalten. Der Anfangs-pH-Wert des inokulierten Tabaks wird zwischen etwa 5 und etwa 8, bevorzugt zwischen etwa 6 und etwa 7,5, gehalten.

Nach der Inokulierung wird der Tabak in der Masse gelagert (6). In der Masse Lagern bedeutet nichts anderes als eine statische Behandlung bei aeroben Bedingungen und bei den oben angegebenen Feuchtigkeits-, Temperatur- und pH-Bedingungen. Das Lagern in der Masse ermöglicht, daß die Mikroorganismen auf den Tabak einwirken und dadurch den Alkaloid (Nikotin)-Gehalt des Tabaks vermindern. Manchmal ist es bevorzugt, zwischenzeitlich zu mischen.

Zur Einstellung des Anfangs-pH-Werts innerhalb der gewünschten Grenzen kann es gegebenenfalls erforderlich sein, eine geringe Menge eines alkalischen Materials, wie eine Änmoniumhydro3cid-· oder Natriumhydroxidlösung, zu dem Tabak zuzugeben. Jedoch besitzen viele Tabaksorten inhärent einen pH-Wert innerhalb des gewünschten Bereichs _p und dann ist keine Einstellung erforderlich«, ' -

Die Menge an Bakterien;, die zu dem Tabak zugegeben wirdj, ist nicht kritische Selbst sehr kleine Mengen an Bakterien werden wachsen und eine wesentliche Nikotinverminderung ergeben, vorausgesetzt, daß die Mikroorganismen in Kon= takt mit dem Tabak während einer ausreichend langen Zeit ge= halten werden,, Sehr große Mengen an Bakterien sind schädlich., und die maximale Menge an Bakterien, die verwendet.wird, wird nur durch wirtschaftliche Erwägungen bestimmt,. Je mehr Bakterien angewendet werden, umso schneller läuft das Entnikotinisierungsverfahren bzw„ Nikotinverarmungsverfahren ab„ Aus praktischen Gründen werden bevorzugt Bakterienmengen von mindestens 1,0 χ 10' Zellen/g Trockengewicht des Tabaks verwendete

Die Zeit, während der die Bakterien in Kontakt mit dem Tabak gehalten werden, ist nicht kritisch» In- einigen Fällen, wo eine starke Entnikotinisierung gewünscht wird, werden Be= handlungszeiten bis zu etwa 50 Stunden oder langer verwendet„

Üblicherweise bewirken technische Überlegungen, daß das Entnikotinisierungsverfahren möglichst schnell ablaufen solle Lange Behandlungszeiten ergeben ebenfalls einen Verlust an Tabakmasse.

Es wurde gefunden, daß eine beachtliche Nikotinverar» mung innerhalb von etwa 1 bis 10 Stunden erreicht wird» Damit man eine beachtliche Nikotinverminderung in Zeitdauern unter 1 Stunde erhält, müßte ein sehr konzentriertes Bakterien» inokulum verwendet werden. Bei der technischen Aufbereitung des Tabaks ist es bevorzugt, die Entnikotiniaerung in weniger als 10 Stunden zu beendigen Die Zeit, die für einen gegebenen Wert an Nikotinverminderung erforderlich ist_p wird verkürzt, wenn die Teilchengröße des Tabaks verkleinert wird.

Nach dem Lagern in der Masse wird der Tabak zur Einstellung des Feuchtigkeitsgehalts auf Werte, wie sie üblicher-

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weise "bei der Tabakaufbereitung verwendet werden, getrocknet (7). Nach dem Trocknen können Casingzusammensetzung bzw. Sossierzusammensetzungen angewendet werden (8), und der Tabak kann einer Redryingbehandlung (9) unterworfen werden, bevor mit der üblichen Aufbereitung (10) weiter fortgefahren wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zusammen mit bekannten Tabakcasingzusammensetzungen und -verfahren durchgeführt werden. Casinglösungen, die Zucker, Sirupe, Lakritze, Honig, Schokolade, aromatische Harze usw. enthalten, werden zu dem Burley- oder zu Tabakblattwarenmischungen als Geschmacks- bzw. Aromamittel und zur Milderung und Verminderung,, der "Strenge" solcher Tabaksorten zugegeben.

In einigen Fällen kann die Durchführung eines Casing-Verfahrens des behandelten Tabaks nicht erforderlich oder unerwünscht sein< > In solchen Fällen können die Casing-(8) und Redryingstufe (9) weggelassen werden, und man arbeitet stattdessen auf dem Weg 17 und führt den Tabak direkt zu der normalen Tabakaufbereitungsstufe. Beispielsweise wird normalerweise strenger Burleytabak durch die mikrobielle Behandlung gemildert, und der so behandelte Tabak kann direkt, ohne daß eine Casingbehandlung erfolgt, in Rauchwaren eingearbeitet werden.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Behandlung des Tabaks nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird in der deutschen Patentschrift . ... ... (Patentanmeldung P entsprechend der US-Anmeldung Ser.No. 632 863, die am gleichen Tag wie die vorliegende Anmeldung eingereicht wird und bei der Newton, Geiss, Jewell und Gravely Erfinder sind) beschrieben. Ein Verfahren zur Maximierung der Kultur aktivität wird

in der deutschen Patentschrift (Patentanmeldung

P entsprechend der US-Anmeldung Ser.No.632 857,

die am gleichen Tag wie die vorliegende Anmeldung eingereicht

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wird und bei der Gravely, Geiss und Newton als Erfinder benannt sind) beschriebene

Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Verminderung des Nikotihgehalts von Tabak und Tabakteilen geeignet„ Verschiedene Formen des Tabaks in verschiedenen Graden und Stufen des Härtens können verwendet werden» Beispielsweise kann das Verfahren durchgeführt werden mit Tabakstreifen bzw₀ «rippen oder mit Burleystreifen bzw₀ »rippen;, die keinerRe-= drying«, jedoch einer Flue-curing-Behandlung unterworfen wurden«, Das Verfahren kann weiterhin mit Tabakstreif en oder Burleystreifen bzw» -rippen durchgeführt -werden, die einer Redrying- und . Flue-curing-Behandlung" unterworfen wurden» Es •kann außerdem mit Burleyrippen, die einer Flue-curing-Be- ° handlung unterworfen wurden, Verarbeitungsmehl, Stocks , zerkleinertem Tabak und ihren Gemischen durchgeführt werden_o Das Verfahren kann ebenfalls mit Nikotin enthaltenden Materialien, die zur Herstellung von solchen Produkten, wie Tabak·= ersatzmaterialien und rekonstituiertem Tabak, verwendet werden, durchgeführt werden₀

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Tabak ist besonders für die Herstellung von Tabakrauchwaren, wie Zigaretten, geeignete Der Tabak ist insbesondere gut für die Herstellung von Tabakwaren geeignet, die einen niedrigen Nikotingehalt besitzen sollen» Wird der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Tabak in Rauchwarenprodükte eingearbeitet, so ergeben diese einen Rauch mit verminderter Nikotinabgabe wie auch mit bevorzugten Aroma- und Geschmacksei·= genschaftenο Die Anwesenheit geringer Mengen- wie von Mengen, die inhärent in Tabak, der nach dem erfindungsgemäßen Ver·= fahren behandelt wurde, vorhanden sind, an Nikotinabbau·= produkten, insbesondere von 3=Succinoylpyridin und 6=Hydroxy~ 3-=succinoylpyridin, bewirkt, daß die Rauchwaren bevorzugte Aroma= und Geschmackseigenschaften besitzen«»

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde in Zusammenhang mit der Entnikotinisierung von Tabak beschrieben. Es kann ebenfalls zur Herstellung von Tabakabbauprodukten, insbesondere von 3-Succinoylpyridin und 6~Hydroxy-3-succinoylpyridin, verwendet werden. Wird es zu einem solchen Zweck verwendet, so muß die Nikotinquelle natürlich nicht Tabak sein. Bei einem solchen Verfahren wird die Anfangsnikotinkonzentration bei etwa 0,1 mg Nikotin/ml !fässer bis etwa 14 mg Nikotin/ml Wasser und bevorzugt bei etwa 1 mg bis etwa 2 mg Nikotin/ml Wasser liegen. Die Mikroorganismen werden bevorzugt in Mengen von mindestens 1 χ 10 Zellen/ml Wasser zugegeben. Die anderen Behandlungsbedingungen sind gleich, wie bei dem Entnikotinisierungsverfahreno

3-Succinoylpyridin kann aus dem wäßrigen Behandlungsgemisch durch Filtration des Mediums, Entfernung des Wassers durch Verdampfen und Extraktion des Rückstands mit heißem Chloroform isoliert werden. Nach der Verdampfung von Chloroform bleibt 3-Succinoylpyridin zurück.

6-Hydroxy-3-succinoylpyridin kann durch Filtrieren der Kultur, 1Ofache Konzentrierung der Lösung durch Verdampfen von Wasser und Ansäuern der konzentrierten Lösung mit HCl auf einen pH-Wert von etwa 3 isoliert werden. Der sich bildende Niederschlag kann durch Zentrifugieren abgetrennt werden, mit verdünnter HCl und Äther gewaschen und getrocknet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung des Inokulums Nikotinagar und -brühe

Nikotinagar wird unter Verwendung der folgenden Bestandteile hergestellt:

709831/0803

	2634188
Nikotin	4,0 ml
FeSO₄	0,025g
KH₂PO₄ ;	2,0 g
KCl /	.59* g
MgSO₄ :_{r :}	0,25 g
Hefeextrakt .	0,1 g
Agar	15pO g
destilliertes oder entionisiertes
Wasser bis zu	1 1

End~pH-Wert 6,8

''- Das Medium wird 15 Minuten in einem Autoklaven "bei 1,05 atü (15 psig) und 121⁰C sterilisiert. Nikotin wird üblicherweise zu; dem Medium gerade vor der Verwendung zugegeben. Eine Brühe des obigen Mediums wird hergestellt, indem man Agar wegläßt.

Tabak-Nikotinbrühe .

Ein Extrakt aus Burleytabak wird folgendermaßen hergestellt: 100 g Burleytabak werden mit 1000 ml Wasser vermischt und 25 Minuten in einem Autoklaven bei 1,05 atü und 121⁰C gekocht. Die entstehende Flüssigkeit wird entfernt und das Volumen wird auf die ursprüngliche Menge eingestellt. Ein gleiches Volumen einer wäßrigen Brühe, die 0,05 g FeSO₄, 4,0 g KH₂PO₄, 10,0 g KCl, 0,5 g MgSO₄ und 0,2 g Hefeextrakt enthält, wird zu dem Burleytabakextrakt gegeben. Das Medium wird 15 Minuten in einem Autoklaven bei 1,05 atü und 121⁰C sterilisiert. Gerade vor der Verwendung wird Nikotin bis zu einer Endnikotinkonzentration von 4,0 mg/ml zugegeben. Tabak, der einer Flue-curingbehandlung unterworfen wurde, kann ebenfalls in diesem Medium anstelle von Burleytabak verwendet werden_β

Tabakextraktbrühe

Tabakextraktbrühe wird auf gleiche Weise hergestellt, wie bei dem*Burleyextrakt beschrieben, der bei der Tabak-

709831/0603

Nikotinbrühe verwendet wurde. Wasser kann oder kann nicht zugegeben werden, abhängig von der gewünschten Nikotinendkonzentration.

Brülienino kuli erung

Die Mikroorganismen, wie der Stamm NRRL B-8061, werden auf Agarschrägplatten 24 bis 72 Stunden bei 30⁰C inkubiert. Flüssiges Medium, z.B. Tabak-Nikotinbrühe, wird mit dem sterilen ¥aschwasser von Schrägkulturen, die auf eine optische Dichte von 0,5, abgelesen bei 650 m/U auf einem Spektrophotometer (B&L SPECTRONIC 20), verdünnt wurden, inokuliert. Eine 1%ige (Vol/Vol) Inokulumrate an standardisierter Suspension wird zu einem der Brühenmedien für die Kulturvermehrung zugegeben. Optimales Wachstum wird erreicht, wenn man eine Rotationsbewegung während 24 bis 48 Stunden bei 30⁰C und 220 U/min verwendet.

Beispiel 2

Typische Werte für den Abbau von Nikotin durch P-putida (NRRL B-8061) in flüssigem Medium werden im folgenden angegeben. Diese Versuche werden bei 30⁰C und Rotationsbewegung mit 220 U/min in Erlenmeyerkolben durchgeführt.

	Ges amtalkalo ide (mg/ml)	Brühe PH	% Verminde rung
Nikotinbrühe 0 Stunden 20 Stunden	3,85 0,22	6,5 5,5	94,3
Tabak-Niko tin-Brühe 0 Stunden 16 Stunden	4,80 0,70	6,5 7,5	85,4
Nikotin-Wasser-Gemisch 0 Stunden 72 Stunden	1,72 0,07	6,5 5,3	95,9
Tabakextrakt 0 Stunden 17 Stunden	1,61 0,10	5,5 6,9	93,8

709831/0603

In allen Fällen zeigen die nichtiiiokuli erten Kontrollen geringe oder keine Änderung in dem Alkaloidgehalt der Gemische.

Beispiel 3

Die Fähigkeit der reinen Kulturstämmen NRRL B-8061, NRRL B 8062 und I¹IRRL B-8O63 Nikotin zu zersetzen wird mit Tabak-Nikotin-Brühe unter Verwendung von Burleytabak und Flue-curing Tabakextrakten, wie in Beispiel Λ beschrieben, verglichen» Waschlösungen von Nikotinagar-Schrägkulturen werden für jede Kultur als Inokulum hergestellt und die Brühenkulturen werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, inkubiert. Die Ergebnisse dieser Versuche sind im folgenden aufgeführt. .

Stamm	Brühe	Alkaloidgehalt(mg/ml)	24 Std.	9ö Std.	% Vermin
NRRL.		0 Std.	0,30 0,63	0,10 0,12	derung
B-8061	Burley-Nikotin Flue-curing Nikotin	4,90 4,90	2,15 3,10	0,07 0,07	98,0 97,6
B-8062	Burley Nikotin Flue-curing Nikotin	5,15 4,95	2,53 3,85	0,08 0,09	98,6 98,6
B-8063	Burley-Nikotin Flue-curing Nikotin	5,35 4,95	98,5 98,2

Aus den obigen Vierten ist erkennbar, daß alle drei Mikroorganismen bei Burleytabak und bei Tabak, der einer Fluecuring-Behandlung unterworfen wurde (und der im folgenden der. Einfachheit halber als "Flue-curing Tabak" bezeichnet wird), wirksam sind.

Beispiel 4

200 ml Wasser-Tabak-Gemisch mit einer Konsistenz von 8% (Gew./Gew.), das technisch häufig als Tabakaufschlämmung für die Herstellung von rekonstituiertem Tabak bezeichnet

709831/0603 ·

wird, wird mit 50 ml Pseudomonas putida (NRRL B-8061), gezüchtet in einer Tabak-Nikotin-Brühe, wie in Beispiel 1 beschrieben, inokuliert. Die inokulierte Tabakaufschlämmung wird 24 Stunden bei 25°C unter Rotationsbewegung mit 220 U/min inkubiert. Eine Kontrollprobe, bei der das Inokulum durch steriles Wasser ersetzt ist, wird ebenfalls behandelt» Zu ausgewählten Zeiten während der Behandlung werden die Aufschlämmungen auf rostfreie Stahlplatten, die über einem Dampfbad befestigt sind, mit der Hand gegossen und getrocknet* Der Prozentgehalt der Gesamtalkaloide vor und nach der Behandlung ist der folgende.

Inokuliert mit P.putida(NRRL B-8061) % Gesamtalkaloide 0 Stunden 1,00

8 Stunden 0,45

24 Stunden 0,25

nichtinokulierter Vergleich

0 Stunden 1,00

8 Stunden 1,10

24 Stunden 0,95 ■

Beispiel 5

P. putida (URRL B-8061) wird in einer Nikotinbrühe, die 2 mg/ml Nikotin und 4 mg/ml Trypticase (BBL) enthält, gezüchtet. Die Kultur wird 20 Stunden, wie in Beispiel 1 beschrieben, "inkubiert. 50 ml der Kultur werden dann 25 Minuten bei 16 300 X G (Sorvall RC2-B-Zentrifuge, GSA Kopf, 10 000 U/min) zur Abtrennung der Zellen vom Überstand zentrifugiert. Der Überstand und die zellularen Plättchen werden getrennt und der Überstand wird durch ein 0,22 Mikron. Milliporenfilter zur Entfernung restlicher Zellen filtriert. 10 g Burleytabak werden mit 30 ml durch Milliporen filtriertem Überstand vermischt. Die zellularen Plättchen werden in 30 ml ¥asser erneut suspendiert, und dieses Gemisch wird mit 10g Burleytabak vermi.scht. Beide Proben werden 16 Stunden bei 25⁰C in-

70 9831/060 3

kubiert. Die Ergebnisse dieser Versuche wurden, im folgenden angegeben.

% Gesatiitalkalpide Plattchen (Poputida NRRL B-8061)

0 Stunden 2,88

5 Stunden 2,65

72 Stunden 0,33

Überstand

0 Stunden 2,80

5 Stunden 2,78

72 Stunden 2,88

Beispiel 6

1000 g zerkleinerter Bur ley tabak v/erden mit 1846 g Wasser und 1000 g P.putida (NRRL B-8061)-Brüheninokulum, hergestellt in einer Burley-Nikotin-Brühe, wie in Beispiel 1 beschrieben, vermischte Der inokulierte Tabak wird 5,08 bis 7,6 cm (2 bis 3 inches) tief auf ein Tablett gegeben und mit einer Plastikfolie bedeckt» Die Plastikfolie verhindert einen übermäßigen Feuchtigkeitsverlust, stellt aber keine luftdichte Abdeckung dar. Der Tabak wird 24 Stunden bei 25⁰C gehalten. Eine Vergleichsprobe wird auf gleiche Weise hergestellt, ausgenommen, daß die entsprechende Menge an sterilem Wasser anstelle des Inokulums verwendet wird. Die Gesamtalkaloidgehalte und der pH-Wert dieser Proben sind die folgenden«

% Gesamtalkaloide	Inokuliert mit P.putida (NRRL B-8061)	3,45 0,60	pH-Wert des feuchten Tabaks
0 Stunden 24 Stunden
Nichtinokulierter Vergleich	3,29 3,40	6,3 8,5-
0 Stunden . 24 Stunden
Beispiel 7	6,4

4,5 Rg (10 lbs) Tabak, der eine Flue-curing-Behandlung unterworfen wirde, werden mit 9,0 kg (20 lbs) 0,15n ΝΗλΟΗ und

70 983 1/06^3

4,5 kg (10 lt>s) P.putida (KRRL B-8061 )-Inokulum, hergestellt in Burley-Nitkon-Brühe, wie in Beispiel 1 beschrieben* vermischt. Ziii' Erhöhung der Anfangs-pH~¥ertes des Tabaks wird NH^OH zugegeben. Der Tabak wird 10 bis 12,7 cm (4 bis 5 in.) tief auf Tabletts gegeben und mit einer Plastikfolie bedeckt„ Die Plastikfolie verhindert einen übermäßigen Feuchtigkeitsverlust, stellt aber keine luftdichte Abdeckung dar. Der Tabak wird 18 Stunden bei 25⁰C gehalten. Eine Vergleichsprobe wird auf gleiche Weise hergestellt, ausgenommen, daß eine geeignete Menge an sterilem Wasser anstelle des Inokulums verwendet wird. Der Gesamtalkaloidgehalt und der pH-Wert dieser Proben sind im folgenden angegeben«

% Gesamtalkaloide pH-Wert des trok

kenen Tabeks

Inokuliert mit P.putida (KRRL B-8061)	1,74 0,20	7,0 6,8
0 Stunden 18 Stunden
Nichtinokulierter Vergleich	1,71 1,97	7,1 6,8
0 Stunden 18 Stunden
Beispiel 8

4,5 kg (10 lbs) einer Mischung aus Burley und Tabak, der einer Plue-curing-Behandlung unterworfen wurde, in ungefähr gleichen Verhältnissen werden auf gleiche Weise, wie in Beispiel 7 beschrieben, behandelt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind die folgenden.

% Gesamtalkaloide pH-Wert des trokkenen Tabaks

Inokuliert mit P.putida
(NRRL B-8061)

0 Stunden 1,93 6,5

18 Stunden 0,30 7,6

Nichtinokulierter Vergleich

0 Stunden 1,90 6,5

18 Stunden 1,70 6,8

709831/0603

IA 2834188

e is pi el 9

5 g eines Gemisches aus gemahlenem Burley_:, der durch ein Sieb mit; einer lichten Maschenweite von 0,84 mm hindurchgeht (-20 meshj .U-.S. Sieb) und Rippen, die einer Flue-curing-Behandlung unterworfen wurden, in ungefähr gleichen Verhältnissen, werden mit 6 ml Wasser und 5 ml P.putida (NRRL Β-8Θ61)-Inokulum, hergestellt in einer Burley-Nikotinbrühe,, wie in Beispiel 1 beschrieben_? vermischte Der inokulierte Tabak wird in eine Petrischale gegeben und mit einer Plastikfolie bedeckt. Die Plastikfolie verhindert einen übermäßigen Feuchtigkeit sverlust, stellt aber keine luftdichte Bedeckung dar. Der Tabak wird 5 Stunden bei 3O⁰C gehalten. Eine ¥:ergleichsprobe wird auf gleiche Weise hergestellt, ausgenommen, daß eine geeignete Menge an sterilem Wasser anstelle des liiokuluias verwendet wird. Der Alkaloidgehalt der inokulierten Probe wird von 0,55 auf 0,13% reduziert. Der Alkaloidgehalt der Vergleichsprobe ändert sich nicht.

B e i s pi e 1 10 .

Ein Gemisch aus Burley und Tabak, der der FMe-curingbehandlung unterworfen wurde, in ungefähr gleichen Verhältnissen, -yrirß. auf gleiche Weise, wie in Beispiel 8 besenrieben,, behandelt. Hach der mikrobiellen Behandlung wird der zerkleinerte Tabak zu Zigaretten verarbeitet. Die geformten Zigaretten werden in einer konstanten Vakuumrauchvorrichibung., die einen Zug/min nimmt, mit einer 2 Sekunden Zugdauer land einem Zugvolumen von 35 ml geraucht. Die Ergebnisse dieser ¥er~ suche sind die folgenden. -

Gesamtalkaloid- . Zug Rauchanalyse(pro Zigarette) gehalt der Ta- Nr. Teer Nikotin bakmischungÖO mg mg

1,58 0,98 0,71 ;

709831/0603

ni chtinolculi er- ter Vergleich.	2,00	9,2	18,2
Inokulierter Ver such A .:	0,85'	9,2	17,6
inokulierter Ver such B	Ό,45	8,8	17,8

Es ist erkennbar, daß der Nikotingehalt im Rauch erniedrigt ist und daß gleichzeitig die Teerabgabe vermindert ist. Üblicherweise wird die Teerabgabe mit den Geschmacks- und Aromaeigenschaften einer Zigarette in Verbindung gebracht. Die Zigaretten dieses Beispiels werden von einer Prüfgruppe von Rauchern geprüft, die zwischen der gewünschten Stärke, dem Geschmack und der Reizung des Rauchs unterscheiden können und diese bewerten können.

Die mit Mikroben behandelten Zigaretten werden hinsichtlich der Stärke und des Geschmacks vergleichbar mit den Vergleichszigaretten bewertet. Sie besitzen aber mildere Tabakraucheigenschaften, wenn sie mit nichtbehandeltem Zigarettenrauch verglichen werden.

Beispiel 11

Ein Gemisch aus Burleytabak wird auf gleiche Weise, wie in Beispiel 6 beschrieben, behandelt, mit der Ausnahme, daß das Inokulumgewicht 50% des Tabaktrockengewichts beträgt. Nach der Mikrobenbehandlung wird der Burleytabak mit ungefähr gleichen Teilen einer nichtbehandelten Mischung, die dem Fluecuringverfahren unterworfen wurde, vermischt. Der Gesamtalkaloidgehalt der Burleymischung wird von 4,06 auf 1,71% vermindert. Nach dem Vermischen des Burley- und des Fluecuring-Tabaks beträgt der Gesamtalkaloidgehalt 1,6%, verglichen mit 2,0% für die nichtbehandelte Vergleichsprobe.

Die behandelten und die Vergleichsproben werden zu Filterzigaretten verarbeitet und an einer konstanten Vakuumrauchvorrichtung, wie in Beispiel 10 beschrieben, geraucht. Die Versuchsergebnisse sind die folgenden.

* Zug Rauchanalyse (pro Zug)

Nr. Teer (mg) NikotinimgJ

nichtinokulierter Vergl. 8,4 1,90 0,16 inokulierte Probe 8,1 1,84 0,13

709831/06Ό3

Die gleichen allgemeinen Beziehungen für die Rauchchemie, wie sie in Beispiel 10 angegeben "wurden, treten auf.

Aus dem Vorhergehenden ist erkennbar, daß der Nikotingehalt in Nikotin enthaltenden Lösungen und/oder in Tabak auf kontrollierte Weise bis zu etwa 90^ oder mehr v/irksam vermindert v/erden kann. Tabakwaren, die aus einem so behandelten Tabak hergestellt werden, werden von einer Prüfgruppe aus Rauchern so bewertet, daß sie eine vergleichbare "Strenge" und organoleptische Eigenschaften hinsichtlich des Geschmacks und Aromas, verglichen mit nichtbehandelten Vergleichsproben besitzen.

B ei spiel 12

P. putida (NRRL B-8061)-Zellen werden durch Zentrifugieren, wie in Beispiel 5 beschrieben, aus Nikotinbrühekulturen, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet wurden, gesammelt. Die Zellen von 500 ml Kulturen werden in 300 ml Wasser erneut suspendiert; dazu gibt man 0,60 ml Nikotin. Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt und das Gemisch wird auf eine Schüttelvorrichtung gegeben und bei 3O⁰C etwas bewegt. Die analytischen Proben werden für die Bestimmung des ultravioletten Absorptionsspektrums vorbereitet. In der Zeit wird die Nikotinabsorptionskurve (maximal 259 nm) durch das Absorptionsmuster von 3-Succinoylpyridin (großes Maximum bei 232 nm, kleineres Maximum bei 267 nm) ersetzt, was seinerseits durch das Absorptionsmuster von 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin(Maximum bei 275 nm) ersetzt wurde. Das Sammeln von 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin erfolgt, indem man die Kultur , wenn ihr UV-Spektrum seine Anwesenheit anzeigt, durch ein Milliporenfilter filtriert, die Lösung auf das 1Ofache konzentriert und die Lösung mit HCl auf einen pH-Wert von etwa 3 ansäuert. Der sich bildende Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 0,05n HCl und dann mit Äther gewaschen und getrocknet.

709831/0603

3-Succinoylpyridin vrird durch Filtrieren des Mediums, wenn seine Konzentration am höchsten ist, Entfernen des Wassers, durch Verdampfen und Extraktion des Rückstands mit heißem Chloroform isoliert. Nach dem Verdampfen von Chloroform verbleibt ein Rückstand an 3-Succinoylpyridin.

Beispiel 13

Gleiche und getrennte Mengen an Tabak-Nikotin-Brühe von Beispiel 1 v/erden mit den Stämmen MRL B-8061, NRRL B-8062 und NRRL B-8O63 inokuliert und Nikotin enthaltende Brühe von Beispiel 1 wird dem Einfluß dieser Stämme unterworfen. Der Gesamtalkaloidgehalt und die gebildeten Produkte sind die folgenden

Isolat Brühe Gesamtalkaloid- Gesamtalkaloid

gehalt im Aus- gehalt nach gangsmaterial

NRRL

mg/ml

96 Stunden mg/ml

B-8061 Burley-Nikotin

Flue-curing Nikotin

B-8062 Burley-Nikotin

Flue-curing Nikotin

B-8063 Burley-Nikotin

Flue-curing Nikotin

4,90
4,90

5,15
4,95

5,35
4,95

0,10 0,12

0,07 0,07

0,08 0,09

Nach der wie in Beispiel 12 beschriebenen Analyse der unter dem Einfluß der Stämme NRRL B-8061, NRRL B-8062 und NRRL B-8063 gebildeten Produkte enthält jede Tabak-Nikotinbrühe 3-Succinoylpyridin und 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin. Analysen der inokulierten Tabak-Nikotinbrühe zu Beginn der Mikrobeneinwirkung sind negativ hinsichtlich der Anwesenheit der obengenannten zwei Verbindungen, aber nach Beendigung der Mikrobenbehandlung ist der Nikotingehalt wesentlich vermindert, und es wird festgestellt, daß 3-Succinoylpyridin und 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin vorhanden sind.

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Beispiel 14

Kulturen von P> putida (NRRL B-8061), die Nikotin über einen Weg abbauen, bei dem 3-Succinoylpyridin anfällt, und Arthrobacter oxydans (ATCC 14358), bei dem ein Nikotin-Abbauweg stattfindet, der mit der Bildung von 6-Hydroxynicotin beginnt, werden in SchuttelkoIben, wie in Beispiel 5 beschrieben, gezüchtet. Die Zellen von jeder Kultur werden durch Zentrifugieren gesammelt und in 50 ml sterilem Wasser wieder suspendiert. 30 ml jeder Suspension werden getrennt mit 10 g Mengen von Burleytabak-Blattgut vermischt. Ein Teil des Materials aus jeder Tabakbehandlung wird unmittelbar in der Luft betrocknet. Der Rest des Tabaks wird in bedeckte Glasschalen mit Ventilation bei Zimmertemperatur gegeben. Nach 16 Stunden wird dieser Tabak an der Luft getrocknet. Es werden Alkaloidanalysen durchgeführt. Man erhält die folgenden Ergebnisse.

Tabakbeschreibung Alkaloidgehalt

(% Trockengew.)

unbehandelter Tabak 3,55

mit Stamm NRRL B-8061 behandelter Tabak

keine Inkubation 3,25

mit Stamm NRRL B-8061 behandelter Tabak

16 Stunden Inkubation 0,76

mit A.oxydans behandelter Tabak

keine Inkubation 3,42

mit A.oxydans behandelter Tabak

16 Stunden Inkubation 3,55

Beispiel 15

Eine Kultur von P.putida (NRRL B-8061) (250 ml) wird in einer Nikotinbrühe, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Die, Zellen von der reifen Kultur werden durch Zentrifugieren, wie in Beispiel 5 beschrieben, gewonnen und in 31 ml Wasser erneut suspendiert. Dies ergibt eine 8fache Konzentration des Inokulums. 10 g Tabakproben werden mit entweder 1, 5 oder 25 ml des konzentrierten Inokulums inokuliert, wo-

708831/0603

bei Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 30 ml zugegeben wird. Nachdem das behandelte Tabakgut gut vermischt wurde, wurde es sofort an der Luft getrocknet. Nach dem Trocknen erhält man die folgenden Alkaloidgehalte.

Menge an konzentriertem Inokulum	Verhältnis Inokulum zu Tabak(Gew.)+	Alkaloide (% Trockenge wicht)
unbehandleter Tabak	-	3,51
1 ml Inokulum	0,8:1	3,48
5 ml »	4:1	2,98
25 ml »	20:1	1,94

⁺ Üblicherweise ist die nichtkonzentrierte Inokulumanwendungsrate ein 1:1 Verhältnis von Inokulum und Tabak,ausgedrückt durch das Gewicht. Inokulum/Tabak-Verhältnisse von 2:1 und 3:1 sind ohne Konzentration des Inokulums möglich, wenn der Tabakgehalt 75% nicht überschreitet. Eine Konzentration des Inokulums ist erforderlich, wenn das Inokulum/ Tabak-Verhältnis über 3:1 liegt und der Tabakfeuchtigkeitsgehalt 73% nicht überschreitet.

Beispiel 16

P.putida (NRRL B-8061)-Kulturen werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die Kulturen werden zur Behandlung von Burleytabak auf zwei unterschiedliche, obgleich ähnliche Arten verwendete Die Tabakbehandlungen erfolgen entweder in verschlossenen Glasbehältern oder in Glasbehältern mit beschränkter Belüftung des zu behandelnden Tabaks. Das Verhältnis von Tabak, Inokulum und Wasser ist gleich wie bei Beispiel 6. Tabak, Inokulum, Wasser und alle anderen Materialien werden sorgfältig abgewogen, wenn sie zu dem Behandlungssystem zugegeben werden oder daraus entfernt werden. Die .Feuchtigkeitsanalysen werden je nach Bedarf durchgeführt. Zwei System von jeder Art werden hergestellt; eines jeder Art wird 16 Stunden und das andere 40 Stunden inkubiert. Die

709831/Ρ6Ό3

3,55	-
2,02	0,00%
1,10	+2,10%
2,31	-0,71%
0,45	-3,6%

Alkaloidwerte und die Massenänderungen sind im folgenden angegeben.

Systembeschreibung Alkaloide Massen-(% Trockengev/.) änderung

nichtbehandelter Tabak verschlossenes System 15 Stunden

¹¹ " 40 Stunden ventiliertes System 16 Stunden

" " 40 Stunden

Beispiel 17

1,8 kg (4 lbs) Burleyblattgut wird durch Zugabe von 0,9 kg (2 lbs) P.putide (NRRL B-8061)-Inokulum behandelt. Die Kultur wird in einer Tabak-Nikotinbrühe 48 Stunden in Schüttelkolben, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Wasser wird zu dem System bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von 75% zugegeben. Der Tabak wird dann auf ein Gestell gegeben, lose mit einer Plastikfolie bedeckt und 24 Stunden bei 32⁰C inkubiert. Der Alkaloidgehalt des Tabaks wird von 3,78% auf 2,29% reduziert. Der Massenverlust des Tabaks beträgt 5,3%; er wird aus dem Gewicht und den Feuchtigkeitsbestimmungen berechnet.

Beispiel 18

10 g Burleytabak, der mit P.putida (NRRL B-8061), wie in Beispiel 6 beschrieben, behandelt wurde, werden mit 100ml NIL₄OH, pH 9,5, extrahiert. Die Extraktions ze it beträgt 30 Minuten bei Zimmertemperatur unter Rühren. Der pH-We.rt des Extrakts wird mit 1n HCl auf 3,5 eingestellt. Es wird dann" drei Mal mit 100 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformfraktionen werden vereinigt und das Lösungsmittel wird entfernt. 3-Succinoylpyridin wird durch Massenspektralanalyse im Rückstand identifiziert. Im Burleyblattgut, welches nicht mit P.putida (NRRL B-8061) behandelt wurde, stellt man kein 3-Succinoylpyridin fest, wenn man auf gleiche Weise prüft.

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B ei spiel 19

P. putida (NRRL B-8061) wird in Burley-Nikotin-Infusionsbrühe (250 ml/500 nil Kolben), wie in Beispiel 1 beschrieben, 22 Stunden bei 3O⁰C unter Rotationsbewegung gezüchtet. Diese Kultur wird zur Inokulation von 8 1 sterilisierter Burleymischungextraktbrühe in einer Rate von 5% (Vol/Vol), die in einem 14 1 Fermentationskolben enthalten ist, der an einem New Brunswick Scientific Microferm Fermentor (Modell Ko₈ MF-214) befestigt ist, verwendet. Die folgenden Werte zeigen den positiven Anstieg in der Population und das AlkaloidabbauKiuster während des Wachstums und der spezifischen Wachstumsbedingungen.

Burleytabak wird mit Inokulum aus 8 1 Kultur bei einem Kulturalter von 0, 3,5, 5,75, 6 und 6,5 Stunden behandelt. Die Behandlung erfolgt, indem man 10 g des geschnittenen Burleytabaks mit 30 ml Kultur behandelt, gut vermischt und sofort danach den Tabak auf einer Glasschale zum Trocknen bei Zimmerbedingungen ausbreitet.

Zeitpunkt der Kulturwachstum/Alkaloidabbau Tabakbehandlung Probenentnahme Zellkonzen- Alkaloidge- in der Burle3/mi~ tration,- halt schung nach d.Be-

(x 10^b) (mg/ml) pH handl. verbleib ende Gesamtalkaloide (%)

vor d.Inokulation Inokulum 1 160 nach d.Inokulation

0	Stunden	1	43
1	Stunde	1	52
2	Stunden		111
3	Stunden	3	500
3,	5 Stunden		_
4	Stunden	5	040
5	Stunden	900
5,	75 Stunden	_
6	Stunden	100
6,	5 Stunden	-
7	Stunden	600

1,84 0,10

1,77 1,68 1,65 1,56

1,26 0,97

0,19 0,19

7,01 7,7

7,08 7,01 7,00 7,14

7,55 7,53

7,66 7,85

3,01 2,92'

1,39 0,87 0,90

709831/0603

Wachs tumsb edinprung en

Medium: 8 1 Burleyextraktbrühe (sterilisiert) in 14 1 Fermentationskolben .

Bewegung: 600 U/min - getriebener Schaft mit 2 Turbinenschaufeln.

Belüftung: 8000 ecm Luft/min (Sprühvorrichtung mit einer einzigen Düse).

Temperatur: 30⁰C.

Inokulumrate: 5% (Vol/Vol).

Antischaummittel: P-1200 (Dow).

pH-Kontrolle: (New Brundwick Scientific pH controller Modell Nr, PH 22) unter Verwendung von 2n Natriumhydroxidlösung und 2n Chlorwasserstoffsäure.

Beispiel 20

P. putida (NRRL B-8062)-Inokulum wird hergestellt und zur Behandlung einer Burleymischung, wie in Beispiel 19 beschrieben, verwendet. Die Ergebnisse dieser Behandlung werden im folgenden angegeben.

Zeitpunkt der	Zellkonz.	Alkaloid	pH-	Tabakbehandlung:
Prob enentnahme	(x 106)	gehalt	Wert	in der Burley-
		(mg/ml)		misch.nach d.
				Behandl·verbl.
				Gesamtalkaloide (%)
vor der Inokulation	-	1,92	6,33
Inokulum	810	0,1	7,32
Std.nach d.Inokulation
0	44	1,71	7,60
• 1	36	1,66
2	58	1,56	7,37	ψ
3 -	118	1,57	7,46
4	400	1,50	8,78
5	1 250	1,39	8,18
6"	1 200	1,28	7,80
⁽ 6,75	-	-		1,92
7	2 300	0,43	7,68
7,5	2 300	0,13	7,93
7,75	-			2,88

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HO

Wachs tuxnsb edingungen

Medium: 8 1 Burleyextraktbrühe (sterilisiert) in eiern 1 Feriuentationskolben.

Bewegung: 600 U/rain - getriebener Schaft mit 2 Turbinenschaufeln.

Belüftung: 8000 ecm Luft/min (Sprühvorrichtung mit einer einzigen Düse).

Temperatur: 3O⁰C.

Inokulumrate: 5% (Vol/Vol).

Antischaummittel: P-1200 (Dow).

pH-Kontrolle: wie in Beispiel 19·

Beispiel 21

Cellulomonas sp. (NRRL B-8063)-Inokulum wird hergestellt und zur Behandlung eines Burleygemisches, wie in Beispiel beschrieben, verwendet. Die Bedingungen und Ergebnisse dieser Behandlung werden im folgenden angegeben.

Zeitpunkt der Probenentnahme

Zellkpnz. Alkaloid- pH- In d.Burleyniisch. (x 10") gehalt Wert nach d.Behandl. (mg/ml) verbl.Gesamtal" kaloide (%)

or der Inokulation Inokulum Std.nach d.Inokulation

0 1 2 3 4 5 6 7

2 200

39 99 240 520 280 400 900

1,80 0,11

1,74

1,68

1,47

1,45

1,36

0,972

0,540

6,60 7,52

7,13 7,16 7,09 7,18 7,70 7,60 7,10"

2,61 2,60 1,87

Wachstumsbedingungen

Medium: 8 1 Burleyextraktbrühe (sterilisiert) in einem 14⁵I Fermentationskolben.

Belüftung: 8000 ecm Luft/min (Sprühvorrichtung mit einer einzigen Düsejt,

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Bewegung: 600 U/min - getriebener Schaft mit 2 Turbinenschaufeln.

Temperatur: 30⁰C.
Inokulumrate: 5% (Vol/Vol). Antischaummittel: P-1200 (Dow) pH-Kontrolle: wie bei Beispiel

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ι ^te · Leerseite

Claims

Patentansprüche

1 ο Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak, dadurch gekennzeichnet, daß man Tabak mit Mikroorganismenj, die Nikotin durch biochemische Mechanismen, wobei 3-Succinoylpyridin gebildet wird, abbauen können, inokuliert., den inokulierten Tabak so reguliert_? dai3

(a) ein Feuchtigkeitsgehalt von mindestens 50 Gew_e?6_s bezogen auf das Gesamtgewicht an Tabak und Wasser,

(b) eine Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 45⁰C und

(c) ein Anfangs-pH-Wert zwischen etwa 5 und etwa 8 aufrechterhalten werden, und die Mikroorganismen in Kontakt mit dem Tabak während einer Zeit hält, die ausreicht, daß die Mikroorganismen auf das in dem Tabak enthaltene Nikotin einwirken können, wodurch der Nikotingehalt des Tabaks vermindert wird ο

2 ο Verfahren nach Anspruch 1 _s dadurch g e k e η η zeichnet, daß eine wäßrige Aufschlämmung, die bis zu 20 Gew„% Tabak enthält, mit den Mikroorganismen inokuliert wird ο

3ο Verfahren zur Herstellung von Produkten aus Nikotin, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Nikotinquelle in wäßrigem Medium der Einwirkung von Mikroorganismen, die Nikotin durch biochemische Mechanismen, bei denen 3-Succinoylpyridin und 6~Hydroxy-3-succinoylpyridin gebildet werden, abbauen, unterwirft_s wobei die Mikroorganismen aus der Gruppe Cellulomonas sp_o und Pseudomonas putida ausgewählt sind, und wobei

(a) eine Anfangsnikotinkonzentration von etwa 0,1 mg Nikotin/ml Wasser bis etwa 14 mg Nikotin/ml Wasser,

(b) eine Temperatur von etwa 20 bis etwa 45°C und

(c) ein Anfangs-pH-Wert von etwa 5 bis etwa 8 aufrecht-

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ORIGINAL INSPECTED

erhalten werden und die Mikroorganismen mit dem Nikotin während einer Zeit in Kontakt bleiben, die ausreicht, daß die Mikroorganismen auf das Nikotin einwirken und die Nikotinabbauprodukte bilden, und man mindestens eines der Abbauprodukte gewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens entweder 3-Succinoylpyridin oder 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin oder beide Verbindungen isoliert werden»

5® Verfahren nach mindestens einem der Anspräche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Nikotin mit den Mikroorganismen während einer Zeit von etwa 1 bis etwa 10 Stunden behandelt wird.

6« Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 3, 4 oder 5₉ dadurch gekennzeichnet , daß die Menge an Mikroorganismen _v die zu dem Nikotin zugegeben wird, mindestens etwa 1 χ 10 Zellen/ml Wasser beträgt.

7ο Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Anfangsnikotinkonzentration zwischen etwa 1 mg Nikotin/ml Wasser und etwa 2 mg Nikotin/ml Wasser gehalten wird.

So Verfahren zur Behandlung von Burleytabak zur Verminderung seines Nikotingehalts und seiner Strenge, dadurch gekennzeichnet, daß man Burleytabak mit Mikroorganismen;, die Nikotin über einen biochemischen Mechanismus~_s bei dem 3-Succinoylpyridin gebildet wird, abbauen, inokuliert, den inokulierten Tabak so reguliert, daß

(a) ein Feuchtigkeitsgehalt von mindestens 50 Ge bezogen auf das Gesamtgewicht des Tabaks und des Wassers,

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(t>) eine Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 45⁰C und (c) ein Anfangs-pH-v/er t zwischen etwa 5 und etwa 3 aufrechterhalten werden, den Tabak mit den Mikroorganismen während einer Zeit behandelt, die ausreicht, dai3 die Mikroorganismen auf das in dem Tabak enthaltene. Nikotin zur Verminderung des Nikotingehalts des Tabaks einwirken können«

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzei ohne t , daß der Anfangs-pII-Wert bei etwa 6 bis etwa 7*5 gehalten wird.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur bei etwa 27 bis etwa. 32⁰C gehalten wird.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis oder 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Tabak mit den Mikroorganismen während einer Zeit von etwa 1 bis etwa 10 Stunden behandelt wird.

12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis oder 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet ,daß die Menge an Mikroorganismen, die zu dem Tabak zugegeben wird, mindestens etwa 1 χ 10' Zellen/g, Tabak bezogen auf das Trockengewicht, beträgt.

13. . Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12 _y dadurch gekennzeichnet , daß der Feuchtigkeitsgehalt bei mindestens 65 Gew.% gehalten wird.

14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen aus der Gruppe Cellulomonas sp. und Pseudomonas putida ausgewählt werden_e

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15. Tabak, dadurch gekennzeichnet, daß

er nach einem Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 Ms 3 oder 8 Ms 14 behandelt wurde.

16. Rauchware, dadurch gekennzeichnet, daß sie Burleytabak enthält, der gemäß einem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 8 bis 14 behandelt wurde, wobei der Tabak nicht sossiert wurde.

17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Aufschlämmung des Burleytabaks mit den Mikroorganismen inokuliert wird.

18. Rauchware, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine den Geschmack oder das Aroma ändernde Menge von mindestens einer Verbindung aus der Gruppe 3-Succinoylpyridin und 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin enthält.

19. Rauchware, dadurch gekennzeichnet, daß sie Tabak, der gemäß einem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, 8 bis 14 oder 17 behandelt wurde, enthält, wobei der behandelte Tabak nicht' sossiert wurde·.

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