DE2509653A1 - Neue gegen kokzidien wirksame substanz und deren herstellung durch kultur eines streptomyces - Google Patents

Neue gegen kokzidien wirksame substanz und deren herstellung durch kultur eines streptomyces

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DE2509653A1 DE19752509653 DE2509653A DE2509653A1 DE 2509653 A1 DE2509653 A1 DE 2509653A1 DE 19752509653 DE19752509653 DE 19752509653 DE 2509653 A DE2509653 A DE 2509653A DE 2509653 A1 DE2509653 A1 DE 2509653A1
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Description

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Asomarm - Ολ R. Koenigsberger Dipl.-Phys. R. Hoäzbauer - Dipl.-lng. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun.
PATENTANWÄLTE
TELEFON: SAMMEL-NR. 22 5341
TELEX 529979 TELEGRAMME: ZUMPAT
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MÜNCHEN 91139-809. BLZ 7OO 1OO 8O
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8 MÜNCHEN 2.
BRÄUHAUSSTRASSE 4
SC 4384A475 1 Vhü
RHONE-POULENC INDUSTRIES, Paris / Prankreich
Neue gegen Kokzidien wirksame Substanz und deren Herstellung durch Kultur eines Streptornyces.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue antibiotische Substanz, die nachfolgend mit der Nummer 31 559 RP bezeichnet wird, deren Metallsalze und deren Salze mit Stickstoffbasen, deren Herstellungsverfahren und diese enthaltende Zusammensetzungen.
Das 31 559 RP besitzt infolge seiner Wirksamkeit gegen Kokzidien, die sich neben seiner antibakteriellen Wirksamkeit und seiner Wirksamkeit gegenüber Malaria äußert, ein spezielles Interesse. Ebenso ist sie insbesondere als. Wachs turns faktor für Wiederkäuer und als Mittel zur Bekämpfung von Dysenterie von Schweinen bekannt.
Das 31 559 HP kann ausgehend von geeigneten Kulturmilieus eines nachfolgend näher gekennzeichneten neuen Mikroorganismus, der der Gattung Streptomyces angehört und durch die Bezeichnung Streptomyces hygroscopicus DS 24 3^7 (NRRL 5787) gekennzeichnet ist, erhalten werden.
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Das 31 559 RP enthält Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff. Die Elementarzusammensetzung seines Natriumsalzes beträgt etwa:
C £ = 63,2 H £ = 8,8 0 # = 24,3 Na % = 2,9.
Sein Neutraläauivalent (ermittelt durch Bestimmung des Natriumsalzes in essigsaurem Milieu durch Perchlorsäure) beträgt 836.
Gemäß seiner Elementaranalyse und seiner Protonen- und -^C-NMR-Spektren entspricht das Natriumsalz von 31 559 RP wahrscheinlich der ungefähren Formel ChuH^^ „0..^ ,Ja.
Andererseits gestatten es die Protonen- und -^C-NMR-Spektren die Anwesenheit von vier Methoxygruppen in dem Molekül zu erfassen.
Das Natriumsalz von 31 559 RP ist außerdem durch die folgenden
physikalisch-chemischen Eigenschaften gekennzeichnet:
Aussehen: weißes mikrokristallines Pulver,
Löslichkeit: [Aufzeichnung gemäß der Pharmacopee Francaise,
IX. Ausgabe, 2. Teil, Seite 13 (1972)].
Praktisch unlöslich in Wasser.
Wenig löslich in Kohlenwasserstofflösungsmitteln wie Hexan. Löslich in Alkoholen wie Methanol, den Ketonen wie Aceton, in
Dimethylformamid und Äthylacetat.
Leicht löslich in chlorierten Lösungsmitteln wie Methylenchlorid
und Chloroform.
Schmelzpunkt (bestimmt auf dem Kofler-Block): 220°C (Zersetzung)
Drehwert: (c = 1,050 Methanol)
[α]20 =+ 51,2° + 1° [α]20 = + 101° + 1,5° •«20 _ j. ,Mo +2·
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Ultraviolett-Spektrum: (Bestimmung ausgehend von einer Lösung mit 0,950 mg/ml in Äthanol) Keine charakteristische Absorption bis zu 210 nrn.
Infrarot-Spektrum: (Bestimmung ausgehend von Preßlingen im
Gemisch mit KBr) Dieses Spektrum ist in Fig. 1 dargestellt, in der an den Abszissen einerseits die Wellenlängen, ausgedrückt
in Mikron (obere Skala) und andererseits die Wellenzahlen in
cm" (untere Skala) und an den Ordinaten die optischen Dichten angegeben sind.
In Tabelle I sind für dieses Produkt die Infrarot-Hauptabsorp
tionsbanden ausgedrückt in Wellenzahlen (cm" ) angegeben.
F tF = Tabelle I 1090 έρ
3430 F m = 1372 έρ. 1072 F
318ο tF tf = 1362 έρ. 1065 έρ
2970 F 1350 έρ. 1040 F
2935 έρ. 1335 έρ. IOI8 F "
2925 F 1298 έρ. 1000 έρ
288ο m 1292 m 985 F
2825 έρ. 1260 ep. 968 tF
26οο tf -1238 F 94o F
2θ6θ tf 1220 έρ. 928 m
1945 tf 1200 F 912 F
1350 tf 1190 έρ. 890 m
1760 tf .1185 έρ. 870 F
1730 έρ. 1170 F 852 m
1630 F 1152 f 828 m
1590 F 114Ο έρ. 815 έρ
1450 F 1115 F 792 έρ
1393 F 1108 έρ. 788 m
1330 1092 tF stark
sehr stark F - schvjach
mittel f = Schulter
sehr schwach έρ.=
775 έρ
765 έρ.
748 m
705 m
655 έρ.
635 m
610 f
590 tf
570 έρ.
565 f
550 f
535 f
500 tf
482 tf
420 m
378 f
350 m
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_ if _
Das Natriumsalz von 31 559 RP kann auch durch aufsteigende Dünnschichtchroniatograpnie an Siliciumdioxydgel unter Verwendung von zwei Lösungsmittelgernisch-Systemen charakterisiert werden:
1.) Kthylacetat, Cyclohexan, Wasser, Butanol (5O-5O-25-5 in Volumina):-in diesem System besitzt das Natriumsalz von j51 559 RP einen Rf-Wert von 0,5.
2.) Methylenehorid, Methanol (Sh-6 in Volumina): in diesem System besitzt das Natriumsalz von 31 559 RP einen Rf-Wert von
0,7.
Bakteriostatische in vitro-Aktivität:
Das 31 559 RP zeigt eine bakteriostatisehe Aktivität, die sich insbesondere auf besimmte Bakterien, die die Gram-Pärbung annehmen, auswirkt.
Die bakteriostatische Aktivität des Natriumsalzes von J51 559 in bezug auf eine bestimmte Anzahl an Keimen wurde durch eine der häufig für diesen Effekt verwendeten Verdünnungsmethoden bestimmt. Für jeden Keim bestimmte man die geringste Konzentration an Wirksubstanz, die unter definierten Bedingungen vollständig die sichtbare Entwicklung in einer geeigneten Nährbrühe verhindert. Die Ergebnisse der verschiedenen Bestimmungen sind in der nachstehenden Tabelle II angegeben, in der die minimalen bakteriostatischen Konzentrationen in Mikrogramm der Substanz je cm-5 des Versuchsmilieus angegeben sind.
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Tabelle II
untersuchte Bakterienorganismen
minimale bakteriostatische Konzentrationen
(in ug/orrr )
Staphylococcus aureus, Stamm 209 P- 0,8 ATCC 653S P
Staphylococcus aureus, Stamm Smith " 2,5 Sarcina lutea - ATCC 9341 1,9
Streptococcus faecalis - ATCC 8043 0,5
Streptococcus pyogenes hemolyticus,
Stamm Dig 7 (Pasteur-Institut) 0,8
Diplococcus pneumoniae, Stamm TiI (Pasteur-Institut) . 0,2
Neisseria catarrhalis (A 152, Pasteur-Institut) 50
Bacillus subtilis - ATCC 6633 . 0,8
Bacillus cereus - ATCC 6630 0,5
Mycobacterium species - ATCC 607 25
Escherichia coil - ATCC 9637 > 150
Shigella dysenteriae, Shiga L (Pasteur-Institut) > 150
Salmonella paratyphi A (Stamm Lacasse, Pasteur-Institut) y 150
Salmonella schottmuelleri (paratyphi B), (Stamm Fougene, Pasteur-Institut) > 150
Proteus vulgaris \ I50
Pseudomonas aeruginosa w I50
Toxizität:
Beim Küken beträgt die zu 50 % letale Dosis (DLj-q) des Natriumsalzes von 31 559 RP 150 mg/kg p.o. bei einer einmaligen Verabreichung.
Aktivität gegenüber Kokzidien:
Die Aktivität gegenüber Kokzidien des Natriumsalzes von 31 559 HP wurde beim insbesondere durch Eimeria tenella und Eimeria acervulina infizierten Küken bestimmt.
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Die Aktivität gegenüber Kokzidien des in die Nahrung eingebrachten Natriumsalzes von 31 559 P-P zeigt sich bei nichttoxischen Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,04 ßew..-^ des in der Nahrung enthaltenen Produktes.
Aktivität gegenüber Malaria:
Das Natriumsalz von 31 559 RP besitzt auch eine Aktivität gegenüber Malaria in bezug auf experimentelle Infektionen mit Plasmodium beim Küken und bei der Maus.
Der Erzeugerorganismus von gegenüber Kokzidien wirksamem 51 559 HP ist ein Streptomycesstamm, der ausgehend von einer Erdprobe, die in Indien entnommen wurde, isoliert wurde und den man mit der Nummer DS 24 367 bezeichnet hat. Eine Probe desselben wurde in dem Northern Regional Research Laboratory des US-Department of Agriculture in Peoria, 111. (USA) hinterlegt, wo er mit der Bezeichnung NRRL 57^7 registriert wurde. Nach Bekanntmachung der vorliegenden Anmeldung ist der Mikroorganismus jedermann zugänglich.
Die Isolierung dieses Stammes wurde unter Befolgung der allgemeinen Methode durchgeführt, die darin besteht, eine geringe Menge der Erde in sterilem destilliertem V/asser zu suspendieren, die Suspension auf verschiedene Konzentrationen zu verdünnen und ein geringes Volumen jeder Verdünnung auf der Oberfläche von Petrischalen, die ein Gelose-Nährmilieu enthalten, zu verteilen. Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 25°C, die es den Mikroorganismen gestattet, sich zu entwickeln, werden die Kolonien, die man für die Untersuchung isolieren möchte, entnommen und in geneigte Gelose-Nährmedien versetzt, um hieraus ergiebigere Kulturen zu erhalten.
Der Stamm Streptomyces DS 24 367 gehört der Species Streptomyces hygroscopious an, deren wesentliche Eigenschaften von H.D. Tresner und E.P. Backus (Applied Microbiology, 4, 243 - 250, 1956) und von S.A. Waksman (The Actinomycetes, II, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, Seiten 230 - 231) definiert sind und
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aus diesem Grunde .wurde er auch mit der Bezeichnung Straptomyces hygroscopicus, Stamm DS 24 167 versehen.
S. hygroscopicus DS 2^- 367 besitzt in der Tat die drei folgenden Eigenschaften, die den drei Eigenschaften entsprechen,durch die H.D. Tresner und S.F. Backus sowie S.A. Waksraan die Species S. hygroscopicus definieren:
a) Seine Sporophoren enden im allgemeinen in dicht gedrängten Spiralen mit einer Windung von mehreren Umdrehungen. Seine spiraligen Sporophoren sind üblicherweise an einem Faden entlang unter Bildung von mehr oder weniger langgestreckten Knäueln angeordnet.
b) Sein Sporen bildendes Luftmycel zeigt, wenn es auf einem guten Entvrieklungsstadium angelangt ist, eine dunkelgraue Färbung, die der von der Species S. hygroseopicus gezeigten entspricht.
c) Über bestimmten Kulturmilieus, die eine gute Entwicklung des Luftmycels gestatten, erscheinen durch Alterung an den Sporen bildenden Oberflächen schwarze glänzende Zonen von feuchtem Aussehen, die für die Species S. hygroseopicus charakteristisch sind.
Im Falle von S. hygroseopicus DS 24 367 erfolgt die Bildung des Luftmycels häufig in einer nur wenig ergiebigen Weise, wobei über einer bestimmten Anzahl von Kulturmilieus sogar ein Fehlen festzustellen·ist. Tritt ein graues Sporen bildendes Luftmycel auf, so erfolgt die Bildung von schwarzen Zonen durch Altern, wenn sie erfolgt, im allgemeinen nur ziemlich eingeschränkt und sie ist auf bestimmte. Stellen oder kleinen Zonen, die sich mehr auf Stellen in dem Luftmycel als auf die gesamte Oberfläche verteilen, begrenzt. Indessen ist sie insbesondere über Hefeextrakt-Gelose von Pridham,über Hafermehl- und Tomatenextrakt-Gelose von Pridham und über Glucose-Asparagin-Gelose sichtbar und beobachtbar.
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.Ϊ b U 9 6 5 3
Der von S.A. Waksman in "The Actinomync*-■·$'" ?ls Referenz genannte Stamm 3. hygr ο s c ο ρ i cus zeigt ür>er einigen Kulturmilieus, für die sein morphologisches Aussehen beschrieben j st, einige geringe Unterschiede gegenüber dem Stamm DS 24 367, dessen wesentlichste darin bestehen, daß er ein Luftmycel über Saccharose-Nitrat-Gelose und über Nährgelοse bildet, während über diesen beiden Milieus der Stamm DS 24 367 keine bildet. Überdies reduziert S.hyRrosoopicus über einem Milieu, das Saccharose als.-Kohlenstoffquelle enthält, nicht Niträte.,während unter den gleichen Bedingungen der Stamm DS 24 367 !Titrate stark zu Nitriten reduziert. Jedoch sind diese wenigen Unterschiede zu unbedeutend, um den Stamm DS 24 367 von der Species S. hygroscopicus, von der er im übrigen die zu seiner Definition dienenden Hauptmerkmale besitzt, zu unterscheiden.
S. hygroscopicus DS 24 367 bildet Sporenketten, die im allgemeinen in dichtgedrängten Spiralen mit einer beschränkten Anzahl von Umdrehungen, die selten mehr als 3 oder 4 betragen, enden, obwohl man gelegentlich Spiralen beobachten kann, die eine wesentliche höhere Anzahl von Umdrehungen bilden,oder auch einige Sporenketten, die einfach in ihrem Endteil gekrümmt sind, ohne eine vollständige Umdrehung zu bilden,oder auch Spiralen,die mehr oder weniger locker und entrollt sind. Die Sporen tragende Komponente weist eine knäuelförmige Struktur auf, wobei die spiraligen Sporophoren, die ihrerseits einige Verzweigungen aufweisen können, an einem Hauptfaden entlang, der eine ziemlich große Länge erreichen kann, angeordnet sind. Die Sporen sind oval bis zylindrisch und besitzen Maßangaben von 0,8 bis 1,0 »u/ 0,6 bis 0,8 μ. Die mikroskopischen Untersuchungen haben eine identische Organisation der Sporen tragenden Vorrichtung über Gelose von Bennett und über Hafer-Tomaten-Gelose von Pridham gezeigt. Aufgrund seiner Art der Sporulation ist S. hygroscopicus DS 24 in dem Abschnitt Spira der Klassifikation von Pridham einzuordnen.
S. hygroscopicus DS 24 367 entwickelt sich gut bei 25°C, etwas weniger gut bei 370C und nicht bei 500C. In den bei 25°C durchgeführten Kulturen besitzt er die folgenden biochemischen Eigenschaften: 509837/0962
BAD ORiGiNAL
Bildung von Melanin Bildung von 1I3S Tyrosinase
Verflüssigung von Gelatine Verwertung von Cellulose
Bildung von Nitriten, ausgehend von Nitraten Hydrolyse von Stärke Kultur über Milch
negativ negativ negativ positiv positiv
stark positiv positiv
Peptonisation ohne Koagulation; geringe Änderung des pH während eines Monats
Die Kultureigenschaften von Streptomyces hygyoscopicus DS 24 sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Es handelt sich um Kulturen, die an einem guten Entwicklungsstadium angelangt sind, d.h. von ungefähr 2 bis 3 Wochen bei 25°C,sofern es nicht anders angegeben ist. Diese Eigenschaften wurden über üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Streptomyces-Stämmen verwendeten Nährgelosen und .Brühen beobachtet, wobei die Kulturen über Gelose-Milieus über geneigten Gelosen durchgeführt wurden. Eine bestimmte Anzahl von verwendeten Kulturmilieus ist nach den in "The Actinomycetes" (S.A. Waksman, Seiten 193 - 197* Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950) angegebenen Vorschriften hergestellt worden. In diesem Fall sind sie durch den Buchstaben W,gefolgt von der Zahl, die ihnen in "The Actinomycetes" zugeteilt wurde, angegeben. Die Referenzen oder Zusammensetzungen der anderen Kulturmilieus sind die folgenden:
Ref.A -uBennett's Agar" - S.A. Waksman - The Actinomycetes«,
' Bd. 2, S. 331 - No. 30 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961
Ref.B - "Hiekey and Tresner's Agar" - T.G. Pridham et al - Antibiotics Annual, 1956 -.1957, S; 950
Ref.C - Zusammensetzung W-23 unter Zusatz von 2 % Gelose
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Ref.D - "Yeast Extract Agar" - T.G. Pridham et al - Antibiotics Annual, 1956 - 1957, S. 950
Ref.E - "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G. Pridham et al Antibiotics Annual, 1956 - 1957, S. 950
Ref.F - "Melanin formation medium" - S.A. Waksman - The Actinomycetes, Bd. 2, S. 333 - No. 42 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961
Ref.G - W.E. Grundy et al - Antibiotics and Chem. 2, 401, 1952
Ref .H - "Inorganic Salts Starch -Agar" - T.G. Pridham et al Antibiotics Annual, 1956 - 1957, S. 951
Ref.I - entspricht der Zusammensetzung W-1, in der 30 g Saccharose durch 15g Glucose ersetzt wurden
Ref.J - entspricht der Zusammensetzung W-1, in der 30 g Saccharose durch 15 6 Glycerin ersetzt wurden
Ref.K - entspricht der Zusammensetzung W-18> in der 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt wurden
Ref.L - entspricht der Zusammensetzung W-18, in der Saccharose unterdrückt und durch kleine teilweise in die Flüssigkeit eingebrachte Filterpapierstreifen ersetzt wurde
Ref.M - "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" Society of American Bacteriologists, Genf, N.Y.,
' 11SO"18
Ref.N - "Plain Gelatin" - hergestellt gemäß den Angaben von "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" Society of American Bacteriologists, Genf, N.Y.,
50
Ref.P - Im Handel erhältliche pulverförmige entrahmte Milch, die gemäß den Angaben des Herstellers wieder hergestellt wurde
Ref.Q, - Für die Untersuchung der Bildung von K?S von H.D. Tresner und F. Danga - Journal of Bacteriology, 76, 239-244,1958 angegebenes Milieu.
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te* V-Λ"
crt σ co co
ο to cn ro
Kultur Entwick /egetatives Mycel
milieus lungsgrad «
OeIose vor gelb-bräunlich
Bennett gut bis braun-gelb
(Ref.A)
Gelose von
Hickey und mäßig braun-gelb
Tresner
(Ref.3)
Gelose von
Emerson gut hellbraun-gelb
(Ref.C)
Hefe-
extrakt-
Gelose von ziemlich braun-gelb.
Pridham gut
(Ref.D)
lockere Bestandteile (enthaltend das gesamte Luftmycel
und die gesamte —
Sporulation)
weißlich bis grau sehr schwach entwickelt
weißlich
in Form von Spuren
weißlich
in Form von Spuren
weißlich bis grau sehr schwach entwickelt
Erscheinen von kleinen schwarzen für die Species "S. hygroscopicus" charakteristischen Punkten durch Alterung;
Lösliches
Pigment
Biochemische Beobachtungen und Eigenschaften
schwach
braun-gelb
sporentragender Bestandteil in Form von Knäueln - Sporenketten, die in dichtgedrängten Spiralen enden. Ovale bis zylindrische Sporen mit Maßangaben von 0,8 bis 1,0 p/0,6 bis 0,8 μ
schwach
braun-gelb
keines oder]
sehr
schwach
bräunliches
CJJ CjJ
Kultur cxi Nährgelo- Entwick I
vegetatives Mycel		 lockere Bestandteile Lösliches Biochemische Beobach
milieus CO ■ se lungsgrad (enthaltend das ge Pigment tungen und Eigen
00 Glucose- fW-5) samte Luftmy&el schaften
" Pepton- ■ Tyrosin- und die gesamte
Gelose Hefe- Sporulation)
Hafer ο (W-6) extrakt- weißlich bis grau Sporentragender Be
mehl- und to Gelose für sehr schwach ent ständteil in Form von
Tomaten cr> die Bil wickelt Knäueln - Sporenketten,
extrakt- dung von zifemlich gelbbraun bis Erscheinen von kleinen sehr die in dicntgedrängten
Gelose vor Melanin gut braungelb schwarzen für die schwach Spiralen enden. Ovale
Pridham (Ref.F) Species "S. hygrosco- bräunlich bis zylindrische Spo
' (Ref.E) Calcium- picus" charakteristi ren mit Maßangaben von
malat-Ge-
lose von
trainskv		 schen Punkten durch 0,8 bis 1,0 μ/Ο,β bis
0,8 u '
Alterung
mäßig grau-gelblich bis
braungelb weißlich schwach
in Form von Spuren gelb
bräunlich
bis schwach
braungelb
mäßig braungelb keiner
keines
Bildung von Melanin:
sehr braungelb bis keiner ins violett negativ (die Bestimmun-,.
schwach braun-orange gehende gen wurden gemäß den
braun Empfehlungen des .Verfall
gräulich sers durchgeführt) .*£?
CD
CD
CD
Ol
Auflösung von Calcium-CO
sehr farblos bis keiner keines malat: positiv, jedoch
gering
schwach weiß-gräulich
[Ref.G)
Kultur Entwick vegetatives Mycel lockere Bestandteile * Lösliches Biochemische Beobach cn
milieus lungsgrad (enthaltend das ge Pigment tungen und Eigen CD
samte Luftmycel schaften CO
und die gesamte <J>
Sporulation) .cn
Ovalbumln- sehr farblos bis keiner keines
Gelose schwach weiß-gräulich
(W-12)
Glucose- mäßig leicht grünlich weißlich bis grau schwach
Asparagin- gelb sehr mäßig entwickelt gelb
cnGelose Erscheinen von klei gräulich
ο(W-2) nen schwarzen für die
CO Species "S. hygrosco-
OO picus" charakteristi
CO schen Punkten durch
O Altern
coGlycerin- mäßig schwach grau weißlich bis gräulich keines odei
o) Asparagin- gelblich bis gelb in Form von Spuren schwach
N((w-5)e· bräunlich
Stärke- ' mäßig grau-gelblich bis weißlich bis grau in keines oder Hydrolyse von Stärke;
Mineral braun-gelb Form von Spuren sehr positiv
salze- schwach
Gelose von bräunlich
Pridham
(Ref.H)
Stärkeni- schwach schwach grau keiner keines
trat-Gelo- bräunlich
'se (W-10)
syntheti schwach sehr schwach grau keiner schwach
sche Gelo gelb bräunlich gelb-
se von bräunlich
Czapek aus
Saccharose
Kultur
milieus		 Entwick
lungsgrad		 egetatives Mycel lockere Bestandteile
(enthaltend das ge
samte Luf tmycel .■■ ■ ■ .
und die gesamte
Sporulation)		 Lösliches
Pigment		 Biochemische Beobach
tungen und Eigen
schaften
synthe
tische Ge
lose von
Czapek aus
Glucose
(Ref.I)		 schwach sehr schwach gelb
bräunlich		 keiner schwach
gelb-
b'räuhlich
synthe-
cn tische Ge-
°lose von
^Czapek aus
ωGlycerin
,j (Ref .J) ■		 schwach schwach gelb
bräunlich		 keiner schwach
gelb
bräunlich
ostärkeni-
00 tratbrühe		 schwach weißlich keiner keines Bildung von Nitriten:
stark positiv
syntheti
sche Brühe
von Czapek
aus Saccha
rose
(W-18)		 schwach flockenartige ·
weißliche Kultur		 keiner keines Bildung von Nitriten:
stark positiv
syntheti
sche· Brühe
von Czapek
aus Glucos
(Ref.K)		 schwach flockenartige
weißliche Kultur		 keiner keines Bildung von Nitriten
stark positiv
CD (JD
Kulturmilieus
Entwicklungsgrad
vegetatives Mycel
lockere Bestandteile (enthaltend das gesamte Luftmycel' und die gesamte Sporulation)
Lösliches
Pigment
Biochemische Beobachtungen und. Eigenschaften
o
cd
oo
synthetische Brühe von Czapek aui Cellulose (Ref.L)
Nitratnährbrühe (Ref.M)
Kultur über Kartoffeln (W-27)
reine 12 fgige Gelatine (Ref.N)
entrahmte Milch
schwach
schwach
sehr mäßig
gut
gut
Gelose von Tresner und Danga (Ref.P)
sehr mäßig
flockenartige weißlich Kultur
braun-gelblicher
Ring
schwach graubräunlich
weißlich bis hellbräunlich
weiß-gelblicher Ring, der nach einem Monat Kultur gelb-bräunlich wird
schwach braungelblich
p^rau
sehr mäßig über aus der Brühe herausragen· dem Papier entwickelt
keiner
weißlich in Form von Spuren
keiner
keines
keines
schwach
graubräunlich
keines
keiner
keiner
keines
Bildung von Nitriten: stark positiv
Verwertung von Cellulose: positiv
Bildung von Nitriten: stark positiv
positive Verflüssigung:
gut
Peptonisation ohne Koagulation:
keine bemerkenswerte
Änderung des pH während eines Monats oder sehr geringe Ansäuerung
Bildung von
negativ
(die Bestimmungen wurden gemäß den Smpfehlungen des Verfasser durchgeführt Λ
CTi CD CO CD
Die Befähigung von Streptonyces hygroscopicus DS 24 367 > verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zur Sicherstellung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde gemäß dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact. 56, I07 114, 1948) beschrieben. Der Entwicklungsgrad wurde nach einer angemessenen Inkubationszeit bei 25°C über dem durch die Autoren angegebenen Basenmilieu beobachtet, wobei man entweder die Glucose durch verschiedene jeweils untersuchte Kohlenstoffquellen oder SO^(NH^)2 durch die verschiedenen jeweils untersuchten Stickstoffquellen ersetzte. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.
509837/0962
untersuchte
Kohlenstoff
quellen		 Verwertung untersuchte Stick
stoffquellen		 Verwertung
D-Xylose positiv, je
doch langsam		 NO ,Na positiv
L-Arabinose positiv NO2Na positiv
L-Rhamnose positiv S04(NH4)2 positiv
D-Glucose positiv PO4H(NH4)2 positiv
D-Galactose positiv, je
doch langsam		 Harnstoff positiv
D-Fructose positiv L-Asparagin positiv
D-Mannose positiv, je
doch langsam		 Glucosamin positiv
L-Sorbose negativ Glycocoll positiv
Lactose positiv Sarcosin positiv
Maltose negativ DL-Alanin positiv
Saccharose positiv DL-Valin positiv
Trehalose positiv DL-Asparagin-
säure		 positiv
Cellobiose positiv L-Glutaminsäure positiv
Raffinose positiv L-Arginin positiv
Dextrin positiv L-Lysin positiv
Inulin positiv DL-Serin positiv
Stärke positiv DL-Threonin positiv
Glycogen positiv DL-Methionin negativ
Glycerin positiv Taurin negativ
Erythrit negativ DL-Phenylalanin positiv, je
doch langsam
Adonit positiv L-Tyrosin positiv
Dulcit negativ DL-Prolin positiv
D-Mannit positiv L-;!ydroxyprolin positiv
D-Sorbit negativ L-Histidin positiv
Inosit negativ L-Tryptophan positiv, je
doch langsam
Salicin negativ Betain negativ
509837/0962
Das Verfahren zur Herstellung von J1 559 RP besteht im wesentlichen darin, Streptomyces hygroscopicus DS 24 367 oder dessen Mutantenerzeuger über einem Milieu und unter geeigneten Bedingungen zu kultivieren und das gebildete Produkt im Laufe der Kultur abzutrennen.
Die Kultur von Streptomyces hygroscopicus DS 24 J6j kann nach jeder aeroben Kulturmethode auf der Oberfläche oder in der Tiefe durchgeführt werden, wobei jedoch diese letztere aus Gründen der Einfachheit zu bevorzugen ist. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Vorrichtungstypen, die in der Fermentationsindustrie laufend im Gebrauch sind.
Insbesondere kann man den folgenden Weg für den Ablauf der Verfahrensmaßnahmen anwenden:
Streptomyces hygroscopicus DS 24 367 - Stammkultur
si
KuIuur über Gelose
Kultur in einem gerührten Fläscnchen Inokulationskultur in einer Fermentiervorrichtung in der Fermentiervorrichtung gebildete Kultur
Das Fermentationsmilieu muß im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoff- und eine assimilierbare Stickstoffquelle, anorganische Elemente, insbesondere Chloride und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, enthalten, wobei diese Elemente in Form von wohldefinierten Produkten oder durch komplexe Gemische, wie man sie bei biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, eingebracht werden können.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlenhydrate, wie Glucose, die Dextrine, Stärke oder andere Kohlenwasserstoffsubstanzen, w.e Zuckeralkohole (Glycerin) oder wie bestimmte organise.;1-Sauren» wie Milchsäure oder Citronensäure,verwenden. Ee- ;t Tinte r.ierische oder pflanzliche öle, wie Schweinefett oder
503837/0962
Sojaöl, können vorteilhafterweise diese verschiedenen Kohlenwasserstoffquellen ersetzen oder diesen zugefügt sein.
Geeignete assimilierbare Stickstoffquellen sind außerordentlich verschieden. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie die anorganischen oder organischen Ammoniumsalze, Harnstoff oder bestimmte Aminosäuren sein. Sie können auch durch komplexe Substanzen, die im wesentlichen Stickstoff in protidischer Form enthalten, eingebracht sein, wie Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Soja-, Erdnuß-.oder Fischmehl, -Weinextrakte, Hefeextrakte, lösliche Destillate und Maiswasser.
Unter den zugefügten anorganischen Elementen können bestimmte einen Pufferungseffekt aufweisen oder wie die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder die Calcium- oder Magnesiumcarbonate neutralisierend wirken. Andere wie die Alkali- oder Erdalkalichloride und -sulfate gewährleisten das für die Entwicklung von Streptomyces hygroscopicus DS 24 367 und die Bildung von 3I 559 RP erforderliche ionische Gleichgewicht. Schließlich wirken bestimmte insbesondere als Aktivatoren für die metabolisciien Reaktionen von Streptomyces hygroscopicus DS 24 3o7· Und zwar sind diese Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.
Die Wachstumsfaktoren sind vitaminische Naturprodukte, wie Riboflavin, Folsäure und Pantothensäure.
Der pH-Wert des Fermentationsmilieus zu Beginn der Kultur muß zwischen 5*8 und J,8 und vorzugsweise zwischen 6,2 und 7,4 liegen. Die für die Fermentation optimale Temperatur liegt zwischen 25 und 30 C, wobei eine zufriedenstellende Bildung bei Temperaturen zwischen 23 und 33°C erhalten wird. Die Luftzufuhr bei der Fermentation kann zwischen ziemlich breiten Werten variieren. Es wurde jedoch gefunden, daß Luftzufuhren von 0,3 bis 3 1 Luft je Liter Brühe und je Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an 31 559 RP wird nach 2 bis 8 Tagen der Kultur erhalten, wobei diese Zeit xresentlich vom verwendeten Milieu abhängt.
50'.; 837/0962
Aus dem Vorstehenden geht hervor, daß die allgemeinen Bedingungen für die Kultur von Streptomyces hygroscopicus DS 24 zur Bildung von 31 559 HP innerhalb eines breiten Bereiches variieren und den jeweiligen speziellen Erfordernissen angepaßt· werden können.
Das 31 559 RP kann aus den Fermentationsbrühen auf die folgende Weise isoliert werden.
Die Brühe wird bei einem sauren pH-Wert, der im allgemeinen zwischen 3 und 6 und vorzugsweise bei ca. 5 liegt, filtriert. Die in dem Filtrationskuchen zurückgehaltene Aktivität wird hieraus mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels, eines niederen Alkohols, beispielsweise Methanol oder eines chlorierten Lösungsmittels, wie Methylenchlorid, extrahiert.
Nach einer geeigneten alkalischen Behandlung kann 31 559 RP in Form des Natriumsalzes aus den vorstehend erwähnten Lösungen durch Kristallisationen nach Konzentration unter vermindertem Druck und gegebenenfalls anschließender Verdünnung durch ein Nicht-Lösungsmittel oder ein schlechtes Lösungsmittel und Aufbewahren in einer Kältekammer isoliert werden.
Das 31 559 HP oder dessen Natriumsalz können durch übliche klassische Methoden, wie Kristallisation, Chromatographie über verschiedenen Adsorptionsagentien oder Gegenstromverteilung gereinigt werden.
Das folgende Beispiel zeigt, wie die Erfindung in die Praxis umgesetzt werden kann.
Beispiel
A) Fermentation
Man beschickt eine Fermentationsvorrichtung von 170 Litern mit
Pepton · 1200 g
Hefeextrakt 600 g
Glucose-monohydrat 1200 g
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Gelose 240 g und
" Leitungswasser aufgefüllt auf 110 1.
Der pH wird durch Zugabe von 70 ctrr 10 N-Natronlauge auf 7,30 eingestellt. Man sterilisiert das Milieu durch Einleiten von Dampf bei 122°C während 40 Min., Nach dem Abkühlen beträgt aufgrund der Kondensation des Dampfes während der Sterilisation das Volumen der Brühe 120 1 und der pH hat einen Wert von 6,85. Man setzt dann mit 200 cnr einer in einem Erlenmeyer gerührten Kultur von Streptomyces hygroseopicus DS 24 367 an. Die Kultur wird bei 27 C während 25 Stdn. unter Rühren und unter Zufuhr von steriler Luft entwickelt. Sie ist dann für das Ansetzen der produzierenden Kultur geeignet.
Die produzierende Kultur vjird in einer Permentationsvorrichtung von 800 1, beschickt mit den folgenden Substanzen, durchgeführt:
Lösliche Destillate Bohnen in Körnern
Glycerin
Natriumchlorid
Kobaltchlorid-hexahydrat-Lösung von 20 g/l
Leitungswasser aufgefüllt auf
■5
Der pH des Milieus wird durch Zugabe von 200 cnr 10 N-Natronlauge auf den Wert 7,50 eingestellt und man sterilisiert dann die Brühe durch Einleiten von Dampf von 122°C während 40 Min.· Nach Abkühlen beträgt aufgrund der Kondensation des Dampfes während der Sterilisation das Volumen der Brühe 390 1. Es wird durch Zur-Joe von 10 1 steriler wäßriger Lösung, die Glucose-monohydrat 4 kg
enthält, auf 400 1 aufgefüllt.
Der pH des Milieus beträgt 6,65. Man setzt mit 4o 1 der Inokulationskultur in der vorstehend beschriebenen Fermentationsvorrichtung von 170 1 an. Die Kultur wird bei 27°C während II3 Stdn.
509837/0962
2 kg
10 kg
6 kg
2 kg
0,4 1 und
365 1
unter Rühren mit einer sich mit 205 Umdr./Min. drehenden Turbine und unter Luftzufuhr mit einem Volumen an steriler Luft von 20 nr./Std. entwickelt. Am Ende des Verfahres beträgt der pH der Kultur 7j 65 und das Volumen 38O 1.
B) Extraktion:
4OO 1 der wie vorstehend angegeben erhaltenen Brühe werden durch Zugabe von 2,8 1 einer 6 N-Salzsäurelösung auf einen pH von 5 gebracht und dann während einer halben Stunde gerührt. Nach Zugabe von 20 kg Filtrationsadjuvans wird die Brühe über einer Filterpresse filtriert und der Filtrationskuchen über dem Filter mit 100 1 Wasser, dessen pH durch eine 6 N-Salzsäure lösung auf 5 eingestellt ist, gewaschen. Das Filtrat und ' das Waschwasser werden entfernt.
Der Filtrationskuchen wird in 300 1 Methanol aufgeschlämmt. Die erhaltene Mischung wird durch Zugabe von 200 cm β N-Natronlauge auf einen pH von 7 eingestellt und während einer halben Stunde gerührt.
Die Mischung wird über einer Filterpresse filtriert und der Filtrationskuchen über dem Filter mit 80 1 Methanol gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser werden vereinigt und unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) zur Erzielung von 30 1 wäßrigem Konzentrat konzentriert. Dieses Konzentrat wird durch Zugabe .von 290 enr 6 N-Salzsäure auf einen pH von 3 eingestellt und dann während 10 Min. in Gegenwart von 30 1 Methylenchlorid gerührt. Die beiden Phasen werden getrennt. Man extrahiert noch zweimal gemäß diesem Verfahren die wäßrige Phase mit jeweils J50 1 Methylenchlorid.
Die drei Methylenchloridextrakte werden vereinigt und mit 9 1 V/asser gerührt, ^^?obei man bis zur Erzielung eines pH von 3 in der wäßrigen Phase (20 cnr 6 N-Salzsäure) ansäuert. Die organische Phase wird abgetrennt und mit 18 1 Wasser gewaschen, indem man bis zur Erzielung eines-pH-Wertes von 9,5 in der wäßrigen Phase (20 cm 6 N-Natronlauge) Natronlauge zufügt.
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Die Methylenenloridphase wird unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bis zur Erzielung eines Volumens von 1 1 konzentriert.
C) Reinigung:
Das vorstehend erhaltene Methylenchloridkonzentrat wird langsam bei Raumtemperatur in 10 1 Hexan gegossen.
Die Lösung wird filtriert. Man trennt so 63 g inaktiver Unlösliehkeiten ab.
Das FiItrat wird unter vermindertem Druck (5 bis 10 mm Hg) bis zur Erzielung eines Volumens von ca. 0,5 1 konzentriert. Diese Lösung wird während 2 Stdn. bei einer Temperatur von 0 C gerührt und man beläßt dann 24 Stdn. bei +4°C.
Die erhaltenen Kristalle werden.durch Zentrifugieren der Lösung isoliert und anschließend mit 250 cnr Hexan von +4 C gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Man isoliert so 103 g des Natriumsalzes von 31 559 RP*
D) Umkristallisation:
57 g des vorstehend erhaltenen Natriumsalzes von 31 559 RP werden in 1,2 1 Aceton in Lösung gebracht und während 15 Min. ■gerührt. Man fügt 2,5 S wit Salzsäure gewaschene Entfärbungskohle hinzu, rührt dann erneut während einer halben Stunde und trennt schließlich die Entfärbungskohle durch Filtration ab.
Zu dem langsam gerührten Filtrat werden 750 cnP destilliertes Wasser hinzugefügt. Das Natriumsalz von 31 559 RP kristallisiert langsam bei einer Temperatur von 0°C.
Die Kristalle werden durch Filtration isoliert, mit 150 cirr eines Aceton/Wasser-Gemisches (50.: 50 in Volumina) gewaschen und unter vermindertem Druck bei 35 C getrocknet.
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- 24 Man erhält 35 g des Natriumsalzes von 31 559 RP ·
Man erhält durch Konzentration der Mutterlaugen auf die Hälfte ihres anfänglichen Volumens und anschließendes Abkühlen auf 4°C erneut 13*2 g des Natriumsalzes von 31 559 RP·
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind gegen Kokzidien wirksame Zusammensetzungen, die das 31 559 RP oder dessen Metallsalze oder Salze mit Stickstoffbasen enthalten und insbesondere gemischte Nahrungsmittel für Tiere oder konzentrierte Mischungen für tierische Nahrungsmittel, die 31 559 RP oder dessen Metallsalze oder Salze mit Stickstoffbasen gegebenenfalls in Gegenwart eines weiteren Mittels gegen Kokzidien enthalten. Diese Zusammensetzungen sind insbesondere zur Bekämpfung von Kokzidiose von Vögeln und insbesondere von Geflügel verwendbar.
Die zur Erzielung einer annehmbaren Wirkung erforderliche Dosis kann natürlich gemäß dem Wert der Nahrungsmittel selbst innerhalb ziemlich breiter Grenzen variieren.
Im allgemeinen genügt es, daß die den Tieren zur Verfügung gestellten Nahrungsmittelmengen 0,005 bis 0,04 Gew.-^ von 31 559 RP oder dessen Metallsalzen oder Salzen mit Stickstoff- basen enthalten.
Das 31 559 RP oder dessen Metallsalze oder Salze mit Stickstoffbasen können in Form einer gleichförmigen Dispersion in den fertigen Nahrungsmittelzusammensetzungen in den vorstehenden Dosen verteilt werden.
Es kann auch in ergänzenden Nahrungsmitteln in einer Dosis von 0,025 bis 1 % meistens mit weiteren Additiva xvie Vitaminen und Mineralsalzen verteilt v/erden. Diese ergänzenden Nahrungsmittel können enfrveder der Nahrungsmittelmenge zugemischt werden oder als solche verbraucht werden und weisen im allgemeinen 5 bis 20 Ja der Nahrungsmittelmenge auf.
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Die für die Herstellung der fertigen Nahrungsraittelmengen oder der ergänzenden Nahrungsmittel verv?endeten "Vormischungen" enthalten üblicherweise O,C5 bis 20 ?> von 31 559 RP oder dessen Metallsalzen oder Salzen mit Stickstoffbasen, die durch einen Nahrungsmittelfüllstoff verdünnt sind. Sie stellen ein bequemes Zwischenprodukt dar, das die gleichförmige Verteilung des wirksamen Produktes in den Nahrungsmitteln erleichtert. Die Vormischungen selbst werden im allgemeinen aus Konzentraten, die 99,9 bis 20 fo von 31 559 RP oder- dessen Metallsalzen oder Salzen mit Stickstoffbasen unter Zusatz von verzehrbaren denaturierenden Agentien, wie Nahrungsmittel-Farbstoffen, geschmacksgebenden Komponenten, zerteilenden oder die Agglomerierung verhindernden Agentien und Nahrungsmittelfüllstoffen enthalten, hergestellt.
Die Konzentrate und Vormischungen.sind im allgemeinen pulverförmig. Die ergänzenden Nahrungsmittel und die fertigen Nahrungsmittelzusammensetzungen können entweder pulverförmig oder in Form von gemäß üblichen Techniken hergestellten Granulaten vorliegen.
Das folgende Beispiel erläutert eine erfindunsgemäße Zusammensetzung:
Beispiel A;
Man stellt ein Basis-Nahrungsmittel der folgenden Zusammensetzung her:
Mehl aus Getreidekleie 13,2H £
Gerstenmehl 13* 2^ %
Maismehl 13,41 %
Weizenmehl 31,32 %
Fischmehl 8,92 %
Sojamehl 8,92 %
dehydratisiertes Futtermehl ^,56 %
Hefeextrakte 2,33 %
pulverförmige Trockenmilch 2,68 %
Natriumchlorid " 0,09 %
Calciumchlorid . 0,89 %
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anorganische Elemente ' Ο,Οβ %
vitaminischer Komplex:
Vitamin A 4000 I.E.Ag
Vitamin D^ 1000 I.E.Ag
Cholinchlorid . 11,5 mg/kg
Riboflavin 2,24 mg/kg
Zu diesem Nahrungsmittel fügt und verteilt man gleichmäßig 0,02 % des Natriumsalzes von J1 559 RP.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft als Wachstumsfaktor für Wiederkäuer (Rinder, Schafe, Ziegen) und als Mittel zur Bekämpfung der Dysenterie von Schweinen verwendbare Zusammensetzungen.
Diese Zusammensetzungen bestehen aus gemischten Nahrungsmitteln für Wiederkäuer und Schweine und aus konzentrierten Mischungen für tierische Nahrungsmittel, die das Antibioticum 31 559 RP oder dessen Salz enthalten.
Die zur Erzielung eines annehmbaren Effekts erforderliche Dosis kann natürlich entsprechend den tierischen Species und gemäß dem Nährwert der Nahrungsmittel selbst innerhalb breiter Bereiche variieren.
Es ist insbesondere vorteilhaft, eine tägliche Menge an Antibioticum 31 559 RP zwischen 50 und 250 mg je Tier den Tieren zur Verfügung zu stellen.
Vorzugsweise wird das Antibioticum J51 559 RP in den ergänzenden Nahrungsmitteln, die von diesem 0,01 bis 0,1 % meistens zusammen mit anderen Additiva, wie Vitaminen und Mineralsalzen enthalten, verteilt. Die ergänzenden Nahrungsmittel können entweder der Nahrungsmittelmenge zugemischt werden oder als solche verbraucht werden und enthalten üblicherweise ca. 1 bis 10 % der täglichen Nahrungsmittelmenge. Das 31 559 RP entspricht somit 0,0001 bis 0,0.1 Gew.-% der täglichen Nahrungsmittelmenge.
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Die zur Herstellung der fertigen Nahrungsmittelmengen oder der ergänzenden Nahrungsmittel verwendeten "Vormischungen" enthaltenim allgemeinen 0,1 bis 5 <f0 Antibioticum 31 559 RP* das in einem Nahrungsmittelfüllstoff verdünnt ist. Sie stellen eine bequeme Zwischenstufe dar, die die gleichmäßige Verteilung des · Antibioticums J1 559 RP in den Nahrungsmitteln erleichtert.Die "Vormischungen" selbst werden im allgemeinen,ausgehend von Konzentraten, die 99*9 bis 5 # Antibioticum j51 559 RP unter Zusatz von verzehrbaren denaturierenden Agentien, wie Nahrungsmittelfarbstoffen, aromatisierenden Agentien, dispergierenden oder die Agglomerierung verhindernden Agentien und Nahrungsfüllstoffe enthalten, erhalten.
Die Konzentrate und "Vormischungen" sind im allgemeinen pulverförmig. Die ergänzenden Nahrungsmittel können entweder pulverförmig sein oder in Form von gemäß üblichen Techniken hergestellten Granulaten vorliegen. In diesen Zusammensetzungen können das Antibioticum 31 559 RP oder dessen Salze in Form von feinen freien oder mit einer Umhüllung bedeckten Partikeln vorliegen.
Das folgende Beispiel zeigt die Verwendung des Antibioticums 51 559 RP als Wachstumsfaktor.
Beispiel 3
Zwölf junge Rinder der Rasse Holstein werden in Einzelzellen, de ren durchschnittliche Fläche 48 m beträgt, gebracht und dann gewogen.
Die zu untersuchenden Nahrungsmittel werden vom Tag 0 ab, d.h. vom Tag des Beginns des Versuches ab, verteilt. Die Rinder werden darauf nach 23 Tagen und dann nach 56 Tagen gewogen und es wird das Gewicht der während dieses Zeitraumes verbrauchten nahrungsmittel bestimmt.
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Es werden die durchschnittlichen Gewichtszunahmen und der durchschnittliche Nahrungsmittelumsatz für jedes zu untersuchende Tier in Intervallen von O bis 28 Tagen und 28 bis 56 Tagen bestimmt.
Die Tiere erhalten ihre Nahrung zweimal je Tag. Die tägliche Nahrungsmittelmenge wird derart bestimmt, daß die Rinder das Maximum an Nahrung aufnehmen ohne hiervon etwas zurückzulassen.
In dem Versuch werden die jungen Rinder in drei Gruppen aufgeteilt. Jedes Tier erhält ein Basisnahrungsmittel, das aus Mais, Heu und einer Eiweißergänzung besteht.
Jedes Tier der Gruppe I erhält das Basisnahrungsmittel.
Jedes Tier der Gruppe II erhält das Basisnahrungsmittel, in dem die.' Eiweißergänzung 100 mg Antibioticum 31 559 RP enthält.
Jedes Tier der Gruppe III erhält das Basisnahrungsmittel, in dem die Eiweißergänzung 200 mg Antibioticum J1 559 RP enthält.
Die durchschnittliche tägliche Nahrungsmittelmenge je Tier besitzt die folgende Zusammensetzung:
Gruppe I Gruppe II Gruppe III
Mais 8,86 kg 8,96 kg 8,91 kg
Heu 1,46 kg 1,45 kg 1,47 kg
Eiweißergänzung ' 0,49 kg 0,5 kg 0,51 kg
Antibioticum 31 559 RP 0 100 mg 200 mg
Die verwendete Eiweißergänzung ist unter der Bezeichnung "Pro Blend 50" von der Soci£te Landmarck, Inc., im Handel erhältlich und enthält insbesondere:
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Gesamtes Proteinäquivalent Lipide Pflanzliche Fasern Vitamin A
,3
< 9 fo "> 65 000 Einheiten/kg,
Die erhaltenen Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen
zusammengefaßt:
I - durchschnittliches Gewicht in kg (je Tier)
I am Tag 0 nach 28 Tagen 2 nach 56 Tagen
Gruppe II 285 ,1 325, 2 374, 5
Gruppe III 284 ,9 325, 381, 1
Gruppe 286 ,6 333 387
II - Änderung des durchschnittlichen Gewichtes und Grad des Umsatzes
O - 28 Tage Grup
pe :-
III		 28 - 56 Tage Grup
pe
III		 O - 56 Tage Grup
pe
III
Grup
pe
I		 Grup
pe
II		 46,4 Grup
pe
I		 Grup
pe
II		 54 Grup
pe
I		 Grup
pe
II		 100,4
durchschnitt- 4o,1
liehe Ge
wichtszunahme
in kg je Tier		 40,3 1,65 49,3 55,9 1,93 89,4 96,2 1,79
durchschnitt
liche Ge- .. 1,43
wichtszunahme
je Tag je Tier		 9,84 1,76 1,99 η,94 1,59 1,72 10,89.
durchschnitt
licher Ver- 9,S3
brauch je kg
je Tag je Tier		 9,76 5,94
9837 		11,78 6,19 10,81 10,9. O,08
Grad des Um- / er
satzes J 		6,77
5 0 		6,70
/096 		6,04
2 		6,77 6,34
So weisen während den ersten 28 Tagen die Tiere, die 100 mg je Kopf und je Tag von 31 559 RP erhalten, eine Gewichtszunahme von 3 fo mehr und einen Umsatzgrad von 1,3 % weniger als die Vergleichstiere auf, wobei diese Prozentsätze bei den Tieren, die 200 mg je Kopf und je Tag an 31 559 RP erhalten, 15,3 ^. bzw. 13,4 % betragen.
Während der zweiten Periode (28 - 56 Tage) überholen die Tiere, die 100 mg pro Tag von 31 559 RP erhalten, diejenigen, die die stärkere Dosis erhalten. Die Gewichtszunahmen betragen 13,4 fo mehr und die Grade des Umsatzes 9,8 % weniger als bei den Vergleichstieren mit einer Dosis von 100 mg je Tag, wobei diese Prozentsätze 9,6 fo bzw. 7,6 % für die Dosis von 200 mg je Tag betragen.
Über den gesamten Versuchszeitraum (56 Tage) sind die durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahmen um 7,8 % und 12,2 % und die Umsatzgrade um 6,4 % und 10,2 % in bezug auf die Vergleichstiere bei Dosen von 100 bzw. 200 mg pro Tag an 31 559 RP verbessert.
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Claims (8)

  1. Patentansprüche
    f. yi) Neue antibakterielle und gegenüber Kokzidien wirksame mit der Nummer 31 559 RP bezeichnete Substanz sowie deren Metallsalze und Salze mit Stickstoffbasen, deren Natriumsalz dadurch gekennzeichnet ist,
    daß es in Form eines weißen mikrokristallinen Pulvers, das in Wasser praktisch unlöslich, in Kohlenwasserstofflösungsmitteln wie Hexan wenig löslich, in Alkoholen wie Methanol, den Ketonen wie Aceton, in Dimethylformamid und Äthylacetat löslich und leicht löslich in chlorierten Lösungsmitteln, wie Methylenchlorid und Chloroform ist,
    daß seine prozentuale Zusammensetzung etwa beträgt C <& = 63,2 H % = 8,8 0 % = 24,8 Na % = 2,9 daß sein Schmelzpunkt 220 C (unter Zersetzung) beträgt, daß sein Drehwert ( c = 1,050 fj - Methanol)
    la·}*0 - +51,2« + 1° [«]??. = + 101° + 1,5* W?L - + 167° + 2°
    beträgt,
    daß es im Ultravioletten keine charakteristische Absorption aufweist,
    daß sein Infrarot-Spektrum die folgenden Absorptionsbanden aufweist
    3430, 3180, 2970, 2935, 2925, 2880, 2825, 26OO, 2060, 1945, 1850, 176O, 1730, 1630, 1590, 1450, 1398, 1380, 1372, 1362, 1350, 1335, 1298, 1292, 1260, I23S, 1220, 1200, 1190, II85, II70, II52, 1i40,
    1115, 1108, 1092, 1090, 1072, 1065, io4o, 1018, 1000, 985, 968,
    940, 928, 912, 890, 870, 852, 828, 815, 792, 788, 775,
    765, 7^8, 705, 655, 635, 610, 590, 570, 565, 550, 535,
    500, 482, 420, 373, 350 cm"1,
    509837/0 962
    daß es bei der aufsteigenden Dünnschicht-Chromatographie über Siliciumdioxydgel unter Verwendung eines Äthylacetat-Cyclohexan-Wasser-Butanol-Gemisches (50-50-25-5 in Volumina) als Lösungsmittel einen Rf-Wert von 0,5 und unter Verwendung eines Methylenchlorid-Methanol-Gemisches (9k/6 in Volumina) als Lösungsmittel .einen Rf-V/ert von 0,7 aufweist, daß seine Aktivität gegenüber Kokzidien sich beim Küken in minimalen Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,04 Gew.-$> in der Nahrung zeigt.
  2. 2.) Verfahren zur Herstellung des Produktes gemäß Anspruch 1 und von dessen Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man in aerober Weise Streptomyces hygroscopicus DS 2k 367 (NRRL 5787) oder dessen Mutantenerzeuger über einem geeigneten klassischen Milieu unter für diese Art von Kultur üblichen Bedingungen kultiviert und anschließend das im Verlauf der Kultur gebildete 31 559 RP?gegebenenfalls in Form eines Salzes,abtrennt und reinigt,
  3. 3·) Zusammensetzung für tierische Nahrungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,0001 bis 99,9 Gew.-^ an Antibioticum 31 559 RP (freie Säure oder kombiniert in Form des Metallsalzes oder des Salzes mit einer Stickstoffbase) zusammen mit von Tieren verzehrbaren Substanzen enthält.
  4. 4.) Zusammensetzung gemäß Anspruch 3* die in Nahrungsmittel für Tiere eingebracht werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,05 bis 99,9 Gew.-^ Antibioticum 3I 559 RP im Gemisch mit Nahrungsmittel-Verdünnungsmitteln für Tiere enthält.
  5. 5.) Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, die in tierischen Nahrungsmitteln verwendbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie als gegenüber Kokzidien wirksame Substanz 0,005 bis 1 % 31 559 RP gegebenenfalls gemeinsam mit weiteren gegenüber Kokzidien wirksamen Agenzien enthält.
  6. 6.) Zusammensetzung gemäß Anspruch 3^ die in Nahrungsmitteln für Wiederkäuer verwendbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie als
    509837/0962
    Wachsturnsfaktor 0,C001 bis 0,1 % Antibioticum 31 559 RP, das zu der Nahrungsrittelmenge oder zu ergänzenden Nahrungsmitteln zugefügt ist, enthält.
  7. 7.) Zusammensetzung gemäß Anspruch 3* die in Nahrungsmitteln für Schweine verwendbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Mittel zur Bekämpfung von Dysenterie 0,0001 bis 0,1 £ Antibioticum J1 559 HP, das der Nahrungsmittelmenge oder den ergänzenden Nahrungsmitteln zugefügt ist, enthält.
  8. 8.) Neuer Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus DS 24 (NRRL 5787)-
    509837/0962
    Jf
    Leerseite
DE2509653A 1974-03-05 1975-03-05 Gegen Kokzidien wirksame Substanz und deren Herstellung durch Kultur eines Streptomyces Expired DE2509653C2 (de)

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