DE2922283A1

DE2922283A1 - Verfahren zur verminderung des nitrat- und nicotingehalts von tabak

Info

Publication number: DE2922283A1
Application number: DE19792922283
Authority: DE
Inventors: Vernon Louis Geiss; Lawrence Edmond Gravely; Charles Fred Gregory
Original assignee: Brown and Williamson Tobacco Corp
Current assignee: Brown and Williamson Holdings Inc
Priority date: 1978-06-15
Filing date: 1979-05-31
Publication date: 1979-12-20
Also published as: CA1134297A; GB2023995B; FR2437794B1; FR2437794A1; GB2023995A; US4557280A; DE2922283C2; CH655230A5; BE876993A

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verminderung des Nitrat- und Nicotingehalts von Tabak, indem der Tabak mit einer Kultur eines Mikroorganismus behandelt wird. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Behandlung von Tabak, um den Nitrat- und Nicotingehalt zu vermindern. Hierdurch wird beim Einarbeiten in ein Tabakrauchprodukt ein Rauch mit verminderter Abgabe von Stickoxiden, Cyanwasserstoff und Nicotin erhalten, ohne daß gewünschte Aroma- und Geschmackseigenschaften oder andere Rauchqualitäten verlorengehen.

Aus verschiedenen Gründen ist es oftmals erwünscht, den Nitrat- und Nicotingehalt von Tabak zu vermindern. So haben z.B. in den letzten Jahren Zigaretten mit niedrigem Nicotingehalt eine erhebliche Aufmerksamkeit beim Verbraucher gefunden. Weiterhin ist ein Bedarf nach Zigaretten mit niedriger Abgabe entstanden, und . zahlreiche Techniken sind verfügbar geworden, um den Nitrat- oder Nicotingehalt des Tabaks zu vermindern.

Bei der Entfernung oder Verminderung des Nitratgehalts wird nach der üblichsten Methode die Verwendung von Chemikalien zur selektiven Nitratentfernung aus Tabakextrakten durch lonenverzögerungstechniken in Betracht gezogen. Die Verminderung des Nicotingehalts von Tabak ist sowohl durch chemische MaBnabmen als auch durch eine mikrobielle Behandlung bewirkt worden» In den ÜS-PSen 4 011 141, 4 037 609 und 4 038 993 werden mikrobielle Behandlungen zur Verminderung des Nicotingelialts von Tabak beschrieben. Es ist jedoch keine Behandlung "bekannt, die eine selektive«, gleichzeitige Verminderung sowohl des Hitrat- als auch des- Nicotingehalts von Tabak in. einer Behandlung ermöglicht* ohne daß der Gehalte aller Arovermindert wird ο Insbesondere ist noch kein

Verfahren bekannt, bei dem Mikroorganismen verwendet werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verminderung des Nitrat- und Nicotingehalts von Tabak zur Verfügung zu stellen. Weiterhin soll durch die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines wäßrigen Mediums zur Verfügung gestellt v/erden, das einen Mikroorganismus enthält, der zur Verminderung bzw. zum Abbau des Nitrat- und Nicotingehalts von Tabakmaterialien geeignet ist.

Durch die Erfindung wird nun ein Verfahren zur Verminderung des Nitrat- und Nicotingehalts von Tabaks durch mikrobielle Behandlung zur Verfugung gestellt, bei dem Tabakmaterialien unter kontrollierten Bedingungen der Einwirkung eines Mikroorganismus unterworfen v/erden, der dazu imstande ist, durch eine biochemische Reaktion Nitrate und Alkaloide (Nicotin) abzubauen. Der Mikroorganismus wird in Gegenwart einer Nitrat enthaltenden Verbindung in relativ kleinen Mengen gezüchtet. Der erfindungsgemäß hergestellte Tabak hat einen verminderten Nitrat- und Nicotingehalt. Bei der Einarbeitung in ein Tabakrauchprodukt wird ein milder Rauch mit einem verminderten Gehalt an Stickoxiden, Cyanwasserstoff und Nicotin erhalten. Jedoch erfolgen keine Verluste an erwünschten Aroma-, Geschmaks- und Raucheigenschaften.

Der Erfindung liegt die Feststellung zugrunde, daß bestimmte Mikroorganismen in wäßriger Lösung, wenn sie mit Tabak in Kontakt kommen, den Nitrat- und Ni cotingehalt des Tabaks vermindern bzw. abbauen. Es wurde festgestellt, daß bei einem Tabakmaterial, das mit einer reinen Kultur eines Mikroorganismus behandelt wird, der in einem Nitrat enthaltenden Medium gezüchtet worden ist, sowohl das Nitrat als auch die Alkaloide (Nicotin) in Tabakmater!alien gleichzeitig abgebaut werden. Hierbei wird ein Tabakmaterial erhalten, das beim

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Einbringen in eine Mischzigarette zu vermindertem Abgaben von Stickoxiden, Cyanwasserstoff und Nicotin beiträgt. Die bevorzugte Kultur ist Cellulomonas sp., wie in der US-PS 4 038 993 beschrieben. Auf diese Druckschrift wird ausdrücklich Bezug genommen. Weiterhin wird vorzugsweise eine Nitrat enthaltende Verbindung zu dem Wachstumsmedium, z.B. Kaliumnitrat, gegeben. Jedoch können auch andere Kulturen und andere Nitrat enthaltende Verbindungen, z.B. Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und dergl., verwendet werden.

Bei der erfindungsgemäßen Anwendung der Kultur ist es zweckmäßig, Tabakblättchen oder -stengel zu behandeln und das Nitrat und das Nicotin gleichzeitig zu entfernen oder einen wäßrigen Extrakt von jedem Material herzustellen, das Nitrat und das Nicotin zu entfernen und hierauf den behandelten Extrakt zu dem ursprünglichen Tabakmaterial oder einem rekonstituierten Tabak zurückzugeben. Die Möglichkeit, den Extrakt zu behandeln und sodann zu dem ursprünglichen Tabak zurückzugeben, vermeidet Verluste an löslichen Stoffen, die auftreten, wenn mit Wasser extrahiert wird und dieses als Träger zur Entfernung von Nitrat und Nicotin verworfen wird. Hierdurch werden auch Verluste von anderen, gewünschten Tabakkomponenten vermieden, die bei der Extraktion mit Wasser und Verwerfung auftreten. Das erfindungsgemäße Verfahren gibt auch die Möglichkeit, sowohl Nitrat als auch Nicotin in rekonstituierten Tabakproduktionssystemen zu entfernen, wobei der Tabak extrahiert wird und der Tabak .in nachfolgenden Prozeßstufen zurückgegeben wird, da dieses Enzym(mikrobielle)-System wirksam in einem flüssigen System arbeitet. Bei dem Verfahren wird das Nitrat aufgebrochen und in gasförmigen Stickstoff umgewandelt, der an die Atmosphäre abgegeben wird. Es %mirde festgestellt, daß der pH-Wert des wäßrigen Mediums, das den Mikroorganismus enthält, vor der Zugabe der Tabakmaterialien in einem Bereich von mindestens mehr als 5,6 gehalten werden muß, um einen Mikroorganismus zu ergeben, der mit

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Erfolg gleichzeitig Nitrate und Nicotin abbaut. Der bevorzugte Anfangs-pH-Wert des wäßrigen Mediums ist etwa 7 bis 9,5. Es wurde auch gefunden, daß der Anteil der Nitrat enthaltenden Verbindung in dem wäßrigen Medium mindestens etwa 0,1 Gew.% und vorzugsweise etwa 1 Gew.?-a in dem Medium betragen muß. Obgleich höhere Mengen der Nitrat enthaltenden Materialien verwendet werden können, trägt jedoch eine Erhöhung der Menge an Nitratverbindung über 1 Gew.?o hinaus nicht nennenswert zu den Abbaueigenschaften der Mikroorganismen bei, obgleich auch höhere Konzentrationen anwendbar sind und der Mikroorganismus die Nitratverbindungen auch bei höheren Konzentrationen abbaut.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird zur gleichzeitigen Verminderung des Nitrat- und Nicotingehalts von Tabak ein wäßriges Medium hergestellt, das Mikroorganismen enthält.

Bei der Herstellung eines wäßrigen Mediums wird eine Nähragarlösung (erste Lösung) hergestellt, indem ein handelsübliches Nähragar zu destilliertem Wasser gegeben wird, wobei die Agarmenge im allgemeinen mindestens 5 g/l beträgt. Hierzu wird eine Nitrat enthaltende Verbindung, vorzugsweise Kaliumnitrat, in einer Menge von mindestens 0,1 Gew.% Nitrat/Volumeneinheit Wasser und im allgemeinen von etwa 1 Gew.% Nitrat/ Voluineneinheit Wasser !zugesetzt. Diese Lösung wird sodann in Form von Schrägkulturen in Röhrchen sterilisiert; d.h. Röhrchen, die das Nähragar enthalten, werden in einem Autoklaven mindestens 15 Minuten bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und mindestens 121⁰C schräggelegt, um eine Schrägoberfläche zu ergeben. Das sterilisierte Medium wird sodann in einen Kühlschrank für den späteren Gebrauch gegeben.

Sodann wird eine zweite Lösung hergestellt, die Nicotin und eine Nitrat enthaltende Substanz enthält, welche durch die Kultur behandelt werden soll, die in dem sterilisierten Me-

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drum gezüchtet worden, ist. Eine solche zweite Lösung kann eine Nährbrühe sein, die nur Nitrate enthält und die dadurch hergestellt worden ist, daß man eine handelsübliche Nährbrühe in destilliertem Wasser auflöstj wobei die Menge der Nährbrühe etwa 5 bis 10 g/l beträgt. Für den Fachmann wird ersichtlich, daß die Konzentration der Nährbrühe und der Erhalt einer verwendbaren Kultur variiert werden kann. Diese Lösung wird sodann mindestens 15 min bei mindestens 1,05 atü und 121⁰C oder mehr in einem Autoklaven sterilisiert. Kaliumnitrat oder andere Nitrat enthaltende Verbindungen können zu dieser Lösung vor der Sterilisation zugesetzt werden.

Ein weiteres Beispiel für eine zweite Lösung kann eine Tabakextraktbrühe sein, die sowohl Nitrate als auch Nicotin enthält. Die Tabakextraktbrühe wird in der Weise hergestellt, daß man gewöhnlich etwa 100 g Tabakmateriäl, z.B. ein im Rauchkanal geräuchertes Burleystengelgemisch, nimmt und dieses mit etwa 1000 ml Wasser vermischt, worauf das Gemisch in einem Autoklaven mindestens 30 bis 60 Minuten bei mindestens 1,05 atü und 121⁰C oder mehr gekocht wird. Der resultiertende, flüssige Extrakt wird sodann entfernt und das Flüssigkeitsvolumen wird durch Zugabe von destilliertem Wasser auf die ursprüngliche Menge des Extrakts eingestellt. Der Extrakt wird sodann mit Hefeextrakt vermischt, wobei der Anteil des Hefeextrakts im allgemeinen mindestens 0,3 Gew.% des Volumens der Flüssigkeit beträgst. Gewünsentenfalls können jedoch auch größere Mengen von Hefeextrakt verwendet werden. Das Gemisch wird in Kolben, die mit Baumwolle zugestöpselt sind, abgegeben und mindestens 15 Minuten bei 1,05 atü oder mehr und 121⁰C oder mehr für die nachfolgende Fortpflanzung der Kultur sterilisiert. Vor der Verwendung zum Wachstum der Kultur wird der pH-Wert mit einer geeigneten Säure oder Base auf etwa 7,2 eingestellt.

Der Mikroorganismus, vorzugsweise Cellulomonas sp.,wird auf Nähragar-Schrägkulturen, die die Nitrat enthaltende Verbin-

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dung enthalten, 3 bis 5 Tage bei 20 bis 40°C inkubiert. Das resultierende Wachstumsprodukt wird sodann dazu verwendet, um die Tabakextraktbrühe zu inokulieren, wobei das Inokulum von den Schrägkulturen entfernt wird, indem die Schrägoberfläche mit einer vorgewählten Menge von sterilem, destilliertem ' Wasser gewaschen wird. Die Tabakextraktbrühe wird sodann im allgemeinen etwa 24 Stunden bei etwa 20 bis 4O⁰C gerührt, um das Wachstum der zugesetzten Mikroorganismen zu fördern. Kleinere oder größere Wachstumsperioden, z.B. bis zu etwa 48 Stunden, sind annehmbar.

Das resultierende Inokulum bzw. der resultierende Impfstoff ist sodann zur Verwendung zur Behandlung von weiteren Tabakmaterialien bereit, um deren Nitrat- und Nicotingehalt zu vermindern.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Verfahrensweise zur Herstellung des Inokulums bzw. des Impfstoffs.

(a) Nähragar + 1 ,0% Kaliumnitrat

Handelsübliches Nähragar (entwässerte Form) von Difco Laboratories wurde zu destilliertem Wasser im Verhältnis von 23 g/l gegeben. Die 23. g Nähragar enthielten 3 g Rindfleischextrakt, 5 g Pepton und 15 g Agar. Zu dieser Lösung wurde 1 Ge\?.% Kaliumnitrat/Volumeneinheit Wasser gegeben. Die resultierende Lösung hatte einen End-pH-Wert von 6,8.

Dieses Medium wurde sodann als Schrägkultur in Röhrchen in einem Autoklaven 15 min bei 1,05 atü und 121 C sterilisiert, abgekühlt und für die spätere Verwendung zum Wachstum von Kulturen gekühlt.

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(b) Nährbrühe

Eine Lösung von Nährbrüheraedien vmrde hergestellt, indem entwässerte Nährbrühe von Difco Laboratories in einer Menge von 8 g/l zu destilliertem Wasser gegeben wurde. Die Mhrbrühe enthielt 5 g Pepton und 3 g Rindfleischextrakt. Das resultierende, wäßrige Medium wurde sodann 15 min bei 1,05 atü und 121⁰C zum späteren Gebrauch beim Wachstum der Kultur sterilisiert.

(c) Im Rauchkanal geräucherte/Burleystengel-Tabak-Extraktbrühe

Eine im Rauchkanal geräucherte/Burleystengel-Tabak-Extraktbrühe wurde hergestellt, indem 100 g im Rauchkanal geräucherte /Bürleystengel zu 1000 ml Wasser gegeben wurden und indem das Gemisch 40 min bei 1,05 atü und 121⁰C im Autoklaven gekocht wurde. Der resultierende Flüssigkeitsextrakt wurde entfernt, und das Flüssigkeitsvolumen wurde auf seine ursprüngliche Menge mit destilliertem Wasser eingestellt. Die Flüssigkeit wurde sodann mit Hefeextrakt (HE) in einer Menge von 0,5 Gew.% Hefeextrakt/Volumeneinheit Flüssigkeit vermischt, und das Gemisch wurde in Kolben eingefüllt, die mit Baumvrolle zugestöpselt und 15 min bei 1,05 atü und 121⁰C zur nachfolgenden Kulturfortpflanzung sterilisiert wurden.

(d) Inokulierung der Brühe

Der Mikroorganismus, Gellulomonas sp., wird auf den Nähragar-Schrägkulturen 3 bis 5 Tage lang bei 30°C inkubiert. Flüssige Medien, wie z.B. Nährbrühe oder eine im Rauchkanal geräucherte /Burleystengel-Tabak-Extraktbrühe, v/erden mit einem sterilen Waschwasser von Schrägkulturen in einer Rate von 2% (Vol/ VoI) inokuliert. Der pH-Wert der Brühe vor der Inokulierung wird mit Salzsäure oder Natriumhydroxid auf 7,2 bis 7,5 eingestellt. Die Kolben werden sodann etwa 24 h bei 30°C mit 220 U/min gerührt.

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Beispiel

Dieses Beispiel beschreibt den Nitrat- -und Nicotinabbau,der in Burleystengel-Extrakt bei verschiedenen pH-Werten stattfindet.

Ein wäßriger Extrakt von BurleyStengeln wurde gemäß Beispiel 1(c) hergestellt und in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 250 ml/ Kolben eingegeben. Diese Medien wurden zur Bestimmung der Nitrat- und Nicotinabbaukapazität von Cellulomonas sp. verwendet. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

	pH	^N03V^Ug/nl	) Alkaloid (Nicotin) (mg/ml)
Burleys tengel-Extrakt- briihe - pH 7,2
O h 7 h 25 h 30 h Burleystengel-Extrakt- ' brühe - pH 5,6	7,18 7,08 7,75 8,15	220 80 0 0	0,32 0,04 0,02 0,02
0 h 7 h 25 h 30 h Burleystengel-Extrakt- brühe - pH 4,8	5,60 5,59 5,65 5,70	295 305 265 300	0,41 0,39 0,39 0,37
0 h 7 h 25 h 30 h	4,82 4,85 4,90 4,80	305 310 285 300	0,41 0,42 0,40 0,40

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß Cellulomonas sp. bei einem pH-Wert von 7,2 den größten Teil des in dem Extrakt verfügbaren Nitrats und Nicotins abbaute, während bei einem niedrigeren pH-Wert (5,6 und 4,8), wenn, überhaupt, nur ein sehr geringer Abbau stattfand.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt den Nitratabbau in anderen Materialien als Tabak.

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Cellulomonas sp. wurde bei den unten beschriebenen Bedingungen in einem Medium aus Nährbrühe + 0,1% KNO, gezüchtet, wobei ein Versuchsfermentator von New Brunswick (MF214) verwendet wurde. Die Inokulierungskultur wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei das Nähragar von Beispiel 1(a) und die nicotinfreie Nährbrühe von Beispiel 1(b) verwendet wurden. Die Züchtungsbedingungen waren wie folgt:

Rühren (U/min) 300

Belüften (cup/min) 4000

Medium Nährbrühe + 0,1% KI¹IO₃ (Gew./Vol.)

Volumen des Mediums (1) 8

Temperatur (⁰C) 30

pH 7,0

Inokulierungsrate(Vol/Vol) 5%
Inokulierungsalter (h) 20

Inokulierungsmediura Nährbrühe + 0,1% KNO₃ Antischaummittel p-1200 (Dow Chemical-⁷ Company) pH-Kontrolle 2N HCl

2N NaOH

Die folgenden Veränderungen des Nitratgehalts traten auf:

VJachs turns zeit (h) NO^ ( /Ug/ml) p_H Zellzählung (x10 )

4100 53 350 1600 1100 3400 3100 4700

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß das Nitrat durch

die Cellulomonas sp. Kultur vor 29 h bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,2 entfernt wurde.

Beispiel 4

Inokulum	h	nach	d.	*•J—J*	138	7,70
1	h	It	It	Inokulierung	126	6,90
2	h	Il	It	It	120	. 7,00
4	h	Il	ti	Il	114	7,20
6	h	Il	It	ti	108	7,20
21	h	ti	Il	It	132	7,18
29	h	It	Il	Il	0	7,05
45		Il	0	7,55

Dieses Beispiel zeigt den Nitrat- und Nicotinabbau, der in einer Burley-Extraktbrühe mit einer relativ hohen Nitratkonzentration auftritt.

Cellulomonas sp. wurde in einem New Brunswick Fermentator (MF214) in Burley-Extraktbrühe,hergestellt gemäß Beispiel

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1(c) gezüchtet. Die Wachstumsbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 3> mit der Ausnahme, daß das Wachstumsmedium Burley-Extraktbrühe war. Die folgenden Veränderungen in den Nitrat- und Alkaloidgehalten traten auf:

Wachstumszeit (h) NO,(/ug/ml) Alkaloid(Nicotin) pH

NO, ( /ug/ml	) AlkaloidCNicotin)
J I	(mg/ml)
4680	0,430
0	0,028
4380	0,240
4500	0,202
4380	0,136
4200	0,036
2910	0,040
2040	0,038
2040	0,038
1350	0,040
1320	0,040
1380	0,036
900	0,034
900	0,034

vor der Inokulierung Inokulum

nach der Inokulierung 1 h nach d.Inokulierung

2h» » "

4h" " "

6h" " "

8h" " "

Q J₁ Il Il Il

24 h " " »

26 h " » »

30 h » » »

48 h " " "

50 h " " "

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß Cellulomonas sp. den größten Teil des in dem Extrakt verfügbaren Nitrats und Nicotins abbaute.

Beispiel

Dieses Beispiel zeigt verschiedene Gehalt einer Nitrat enthaltenden Verbindung, die beim Züchten eines Mikroorganismus zum Abbau von Nitraten verwendet v/erden kann.

Cellulomonas sp. wurde in einer nicotinfreien Nährbrühe (NB) + 0,1# KNO^, hergestellt gemäß Beispiel 1(b), gezüchtet. Die Kultur wurde dazu verwendet, um Nährbrühe mit variierenden Mengen von KNO₃, zugesetzt auf Gew./Vol.-Basis, zu inokulieren. Die folgenden Veränderungen traten beim Rühren dieser Kultur und bei 30⁰C und 16Ο U/min auf:

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NO ₃ (/ug/ml) pH

ETh" 2ϊΠϊ Ö*Tä 25 h

inokuliert

335 155 6,97 8,17

500 240 7,00 7,95

3000 2370 6,95 8,05

4980 4560 6,92 8,15

Kontrolle - nicht inokuliert 460 400 6,99 7,19

Es wird ersichtlich, daß Cellulomonas sp. einen Teil des Nitrats bei allen anfänglichen Nitratkonzentrationen von 335 bis 3000/Ug/ml Nitrat in der Nährbrühe abbaute und eine kleine Menge des Nitrats oberhalb 4980/Ug/ml abbaute. Die geringfügige Veränderung der Kontroll-Nitratkonzentration liegt nahe am Analysenfehler. Sie war nicht auf eine mikrobielle Einwirkung zurückzuführen, da zu den Kontrollmedien keine Kultur gegeben worden war.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt den Effekt der Belüftung auf die im Tabakextrakt gezüchteten Kulturen.

Cellulomonas sp. wurde in einem wäßrigen Extrakt von im Rauchkanal geräucherten/Burleystengeln, hergestellt gemäß Beispiel 1(c), bei den folgenden kontrollierten Bedingungen in einem Versuchsfermentator van New Brunswick (MF 214) gezüchtet:

Rühren (U/min) 600

Belüften (cup/min) 8000

PH 7,3

Temperatur ( C) 30

Zeit (h) 22

Antischaummittel p-1200 (Dow Chemical Company)

Inokulierungsrate(Vol/Vol) 5%

Volumen des Mediums (l) 8

Art des Mediums wäßriger Extrakt von im Rauchkanal

geräucherten Burleystengeln. Der • pH-Wert wurde mit 2N HCl und 2N

NaOH kontrolliert

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Zeit	Zellzählung	490	PH	Nitrat
	(x10^b/ml)	640		( /Ug/ml) 1534
vor d.Inoku]	0	1220	7,31	0
Inokulum	5000	4200	8,17	1486
nach d.Inokul. 350	7,40
1 h nach d.		1448
Inokul.	7,40	1491
3 h "	7,41	1449
5 h "	7,35	1450
22 h "	7,23

- 20 -

Die Zunahme der Zellmasse und die chemischen Veränderungen während des Züchtens bzw. Wachsens waren wie folgt:

Alkaloid(Nicotin) (mg/ml)

0,32 0,02 0,30

0,27 0,20 0,08 0,02

Die obigen Werte zeigen, daß bei den angewendeten Bedingungen, insbesondere einer hohen Belüftungsrate (8000 cur/min), das Nitrat nicht abgebaut wird, daß jedoch die Alkaloide abgebaut wurden.

Die auf diese Weise gezüchtete Kultur wurde zur Behandlung von Burleyblättchen wie folgt verwendet:

Trockengewicht Kultur NaOH (1N) Wasser d. Tabaks (kg) (ml) (ml) (ml) 1,7 2436 379,5 2269

Die Behandlung wurde in einem Kunststoffbeutel (nichtbelüftete Umgebung) 24 h bei 30°C durchgeführt, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

Behandlungszeit NO- (%) Alkaloid 00 Feuchtig- pH (h) ^p keit QS)

0 3,54 1,42 74,4 7,33 24 0;22 0,32 76,4 8,38

Es wird ersichtlich, daß in einer nichtbelüfteten Umgebung Cellulomonas sp. sowohl Nitrat als auch Nicotin abbaute. Der Burleytabak mit vermindertem Nitrat- und Nicotingehalt wurde mit anderen Tabakmaterialien vermischt und mit einer Kontrollmiüchung verglichen, die unbehand "\ten Burleytabak enthielt. Ec wurden folgende Ergebnisse erhalten:

9 0 .'» ß 5 1 / 0 ß 6 1

Chemische Eigenschaften der Mischung

NO» 00 Alkaloide (Nicotin) pH

Kontrolle"*"¹" 1,63 1,79

Versuch⁴" 1,04 1,32

⁺⁺enthaltend nichtbehandelte Burleyblättchen enthaltend behandelte Burleyblättchen

Diese Mischungen wurden zu Zigaretten verarbeitet und in der Maschine geraucht, wobei die folgenden Abgaben von Stickoxiden, Cyanwasserstoff und Nicotin festgestellt wurden.

Abgaben pro Zug

HCN Nicotin Züge () (mg)

Kontrolle 54 28,4 0,13 7,3

Versuch 33 22,8 0,11 7,2

Die Werte zeigen eine 38,8?oige Verminderung der Stickoxide (NOx), eine 19,7?£ige Verminderung des Cyanwässerstoffs und eine 15»3/4ige Verminderung des Nicotins.

Beispiel 7

Dieses Beispiel zeigt den Effekt der Belüftung beim Wachstum der Kultur, wobei die verminderte Belüftung die Umgebung für den Nitratabbau in flüssigen Systemen liefert.

Cellulomonas sp. wurde in einem wäßrigen Extrakt von im Rauchkanal geräucherten/Burleystengeln,hergestellt gemäß Beispiel 1(c), bei folgenden Bedingungen in einem Versuchsfermentator von New Brunswick (MF214) gezüchtet:

Rühren (U/min) 600 (1. 4h) 300 (letztes 20 h)

Belüften (cm⁵/min) 8000 (1 .nur 4 h)

keines (letztes 20 h)

pH 7,0

Temperatur (C) 30

Zeit (h) 24

Antischaummittel p-1200 (Dow Chemical Company)

Inokulierungsrate(Vol/Vol) 5?6

Medium (Vol.) 8 1

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Typ des Mediums wäßriger Extrakt von im Rauchkanal

geräucherten/Burleystengeln

der pH-Wert wurde mit 2N HCl und 2N NaOH kontrolliert.

Die Zunahme der Zellmasse und die chemischen Veränderungen während des Wachstums waren wie folgt:

Zellzählung	PH	Nitrat	Alkaloid(Nico
(x10⁶)		C /ug/ml) 3173	tin(m,e;/ral)
g +	7,12	50	0,48
7400	7,40	NB	0,05
ng 155	7,27	HB	NB
kul.430	7,25	NB	NB
410	7,17	2534	NB
840	7,14	1171	NB
1040	7,02	50	0,06
1490	7,08	50	NB
2500	7,15	50	0,06
8000	7,34	0,06

vor d.Inokulierung Inokulum nach d.Inokulierung 1 h nach der ] 2h» » 3h" " 4h" " 6h" »

8h" » 24 h " »

geringfügige Verunreinigung NB nicht bestimmt

Die obigen Werte zeigen, daß bei den angewendeten Bedingungen, insbesondere einer hohen anfänglichen Belüftungsrate (4 h) und anschließend keiner nennenswerten Belüftung (20 h), sowohl Nitrat als auch Alkaloide abgebaut wurden. Insbesondere wird ersichtlich, daß der Nitratabbau sehr bald nach Unterbrechung der Belüftung begann.

Die, wie hierin beschrieben, gezüchtete Kultur wurde zur Behandlung eines im Rauchkanal geräucherten/Burleystengel-Gemisches über einen Zeitraum von 27 h verwendet, wobei das Inokulum mit einer Rate von 2,4 ml/g Tabakgewicht angewendet und der Tabak bei 30⁰C inkubiert wurde. Es traten die folgenden chemischen Veränderungen auf:

Behandlungszeit NO^ (%) Alkaloide (%) (h) °

0,0 2,8 0,34

6,5 2,3 nicht bestimmt

27,0 0,4 0,06

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Die behandelten Tabake wurden mit anderen Tabakmaterialien
vermischt und mit einer Kontrollmischung verglichen, die unbehandelte Stengel enthielt. Nachstehend sind die erhaltenen Werte bei zwei verschiedenen Gehalten von behandelten Materialien zusammengestellt:

Chemische Eigenschaften der Mischung

Probe Zugesetzte Menge der NO, (?o) Alkaloide(Ni- pH
Stengel ^D cotin) (%)

Kontrolle normal 1,33 1,85 5,45

2,5x normal 1,67 1,47 5,48

Versuch⁴" normal 0,85 1,79 5,77

2,5x normal 0,69 1,26 6,42

enthaltend behandelte Stengelmaterialien.

Diese Mischungen wurden zu Zigaretten verarbeitet und in der Maschine geraucht, wobei die folgenden Unterschiede zwischen den Kontroll- und Versuchst rodukten festgestellt.wurden:

Probe Zugesetzte Menge Abgaben pro Zug

der Stengel N0x(/ugj HCWC/ug) Nicotin Züge

^{1 l} (mg)

Kontrolle normal 44,4 24,4 0,13 8,8

2,5x normal 51,8 18,7 0,11 8,3

Versuch normal 32,2 19,1 0,13 9,5

2,5x normal 20,7 7,4 0,09 10,0

Die Werte der Rauchabgabe zeigen eine 27?oige und 60^ige Verminderung der Stickoxide und eine 21,7/oige und 60,4&Lge Verminderung des Cyanwasserstoffs für normale und 2,5x normale
Zusatzmen.fren von behandeltem Stengelmaterial. Die Werte zeigen auch eine signifikante Erhöhung der Anzahl der Züge,wenn behandelte Materialien in die Mischung mit 2,5>- normaler Rate eingearbeitet wurden.

Beispiel 8

co Beispiel beschreibt die VerfahrensweSse, die zum Extraki vor- Tabakblättchen mit Viasser zur Entfernung von Nitrat und Nicotin angewendet wurde. Dpi Extrakt wurde mit. Cellhilo-

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monas sp. zur Entfernung von Nitrat und Nicotin behandelt und danach wurde der modifizierte Extrakt in den ursprünglichen Tabak zurückgegeben.

Ein Tabakextrakt wurde hergestellt, indem 100 g Burleyblättchen mit 1 1 Wasser vermischt wurden,und die Mischung wurde 2 h bei Raumbedingungen stehengelassen. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Extrakt gesammelt, indem die Flüssigkeit dekantiert wurde und der Tabak zur Entfernung von zusätzlicher Flüssigkeit gepreßt wurde. Der Tabak wurde in Raumluft zum Trocknen ausgebreitet, während der Extrakt (700 ml) der nachstehend beschriebenen, mikrobiellen Behandlung unterworfen wurde.

Eine reife Kultur von.Cellulomonas sp. wurde in einem gesonderten Tabakextraktmedium, hergestellt gemäß Beispiel i(c), gezüchtet und zu dem oben beschriebenen Tabakextrakt mit einer Rate von 10$£ (Vol/Vol) gegeben. Vor der Zugabe der Kultur wurde der pH-Wert des Extrakts auf 7,0 + 0,1 erhöht. Die Kultur wurde in dem Extrakt in einem Erlenmeyerkolben auf einem Drehschüttler mit 30⁰C inokuliert. Die folgenden chemischen Veränderungen traten während der 18stündigen Inkubationszeit auf:

Cellulomonas sp-Behandlung von Burleyblättchenextrakt

NO, (/ug/ml) Alkaloid (Nicotin) ³ ' (mg)

Burleyblättchenextrakt 1872 1,47

reife Cellulomonas sp.-Kultur 0 0

Extrakt nach der Behandlung 66 0,09

Es wird ersichtlich, daß das Nitrat und das Nicotin vregen der Behandlung fast vollständig abgebaut wurden (96,5/S bzw. 93,995).

Nach 18 h wurde der behandelte Extrakt zu dem ursprünglich extrahierten Tabak in drei Stufen wegen der großen Menge des betreffenden Extrakts zurückgegeben. Dies erfolgte in der Weise, daß eine Portion zugegeben wurde, gründlich gemischt

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wurde und vor der nächsten Zugabe an der Luft getrocknet: wurde. Y/ährend dieser Verfahrensweise traten die folgenden chemischen Veränderungen auf;

Tabakanalyse

— ^N05(S0 Alkaloid (Nicotin) (%)

Burleyblättchen vor der Extraktion 1,96 2,46

Burleyblättchen nach der Extraktion 0,72 0,97 Burleyblättchen nach Zurückzugabe

des behandelten Extrakts 0,39 0

Es wird ersichtlich, daß die Nitrate und Alkaloide (Nicotin) aus dem Extrakt entfernt worden waren und daß ihr Anteil daher in dem Tabak, in den der behandelte Extrakt zurückgegeben wurde, signifikant vermindert wurde. 80% des Nitrats und 100% der Alkaloide wurden durch diese Methode entfernt. Ein Teil des Nitrats und der Alkaloide wurden aus dem Tabak durch die Kultur während des Trocknens nach der Rückgabe entfernt.

Die hierbei erhaltenen Tabake wurden für Herstellungsverfahren verwendet.

Beispiel 9

Dieses Beispiel beschreibt einige Unterschiede im Endprodukt, die erhalten werden können* wenn man eine Ultrafiltrationseinrichtung im Zusammenhang mit der Tabakextraktion, Extraktbehandlung und Extraktrückgabe gemäß Beispiel 8 anwendet. In diesem Beispiel wurde der gleiche Tabak wie in Beispiel 8 verwendet.

Ein Burleyblättchenextrakt wurde wie in Beispiel 8 hergestellt. Der Extrakt wurde sodann mit einem Filter mit einer Porengröße von 0,2 Mikron in einer Amicon Ultrafiltration vorrichtung (Modell TCF10) filtriert, bevor der filtrierte Extrakt mit Cellulomonas sp. inokuliert und gemäß Beispiel 8 behandelt wurde«. Nach der Behandlung wurde der Extrakt erneut filtriert ₉ bevor die Rückgabe begonnen wurde. Die auf

denr Filter während der ersten Filtration zurückgehaltenen Materialien wurden gleichfalls in den extrahierten Tabak zurückgegeb en.

Die auf dem Filter während der zweiten Filtration zurückgehaltenen Materialien wurden nicht in den Tabak zurückgegeben. In dem Extrakt traten die folgenden chemischen Veränderungen auf:

Chemische Veränderungen während der Ultrafiltration und Behandlung des Burleyextrakts mit Cellulomonas sp.

NO

(/ug/ml) Alkaloid (Nicotin)

' (rna· /τηΊ ^

(mg/ml)

Burleyblättchenextrakt 1872 1,47

reife Cellulomonas sp.-KuItür 0 0

Extrakt nach der Filtration 2028 1,48 Extrakt nach der Behandlung

mit Cellulomonas sp. 110 0,12

Die folgenden chemischen Veränderungen wurden in dem extrahierten Tabak während der Extraktion und Behandlung gemessen: Tabakanalys e Burleyblättchen NO^ (%) Alkaloid(Nicotin) (%)

vor der Extraktion 1,96 2,46 nach der Extraktion 0,72 0,79 nach Zurückgabe des behandelten Extrakts 0,75 0,72

Es wird ersichtlich, daß die Nitrate und Alkaloide (Nicotin) aus dem Extrakt durch Cellulomonas sp. entfernt wurden. Jedoch erfolgte im Gegensatz zu Beispiel 8 keine weitere Entfernung aus dem extrahierten Tabak während der Zurückgabe. In diesem Beispiel kommt die mikrobielle Kultur niemals in Kontakt mit dem Tabak, während in Beispiel 8 die Kultur den Tabak während der Rückgabe kontaktiert.

Die hierbei erhaltenen Tabake wurden für Herstellungsvorgänge verwendet.

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Beispiel 10

Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit von Cellulomonas sp. zur Entfernung von Nitrat und Nicotin aus rekonstituierten Tabakmaterialien.

Eine wäßrige Extraktbrühe wurde wie folgt hergestellt. 150 g rekonstituierter Tabak wurden in 1 1 Wasser 1 min in einem Waringmischer aufgeschlämmt. Nach der Aufschlämmung wurde das Gemisch 10 min bei Raumtemperatur gehalten und danach durch Zentrifugieren abgetrennt und mit destilliertem Wasser zur Sterilisierung bei 121⁰C und 1,05 atü während 15 min auf das ursprüngliche Volumen gebracht. Es wurden verschiedene Zubereitungen hergestellt, zu denen Hefeextrakt (HE) mit 0,3% (Gew./Vol.) vor der Sterilisation zugesetzt wurde. Im Rauchkanal geräucherter/Burleystengel-Extrakt (mit 0,5% Hefeextrakt) wurde gemäß Beispiel 1(c) hergestellt und als Kontrollextrakt verwendet. Die pH-Werte der Brühen wurden vor der Inokulierung mit Cellulomonas sp. auf 7,2 eingestellt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Züchtungszeit (h)

Kontrolle

NO₃(/ug/inl)	Alkaloide (Nico tin) (mg/ml)	pH
2246 O O	0,23 0 0	7,30 8,50 8,12
	Versuch
1859 1641 39	1,12 0,88 0,08	7,34 7,46 8,08
1878 0,28 0,14	1,09 0,35 0,06	7,21 8,04 8,17

0 24

48

ohne Hefeextrakt

24 48

mit Hefeextrakt

24 48

Es wird ersichtlich, daß die Kultur das Nitrat und die Alkaloide (Nicotin) der rekonstituierten Tabakmaterialien mit oder ohne Zugabe von Hefeextrakt wirksam abbauen kann.

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Beispiel

11

Dieses Beispiel zeigt die Effekte von aeroben und anaeroben Tabakbehandlungen.

Cellulomonas sp. wurde in einer im Rauchkanal geräucherten/ Burleyextraktbrühe, hergestellt gemäß Beispiel i(c), jedoch ohne Zugabe von Hefeextrakt, 25,5 h in einem Versuchsfermentator von Nevr Brunswick (MF214) unter folgenden Bedingungen gezüchtet:

600 (1. 4h) 300 (letzte 21,5 ti) 8000 (1. 4h) 0 (letzte 21,5 h) im Rauchkanal geräucherte/Burley-

Rühren (U/min) Belüften (cnP/min) Medium

Mediumvolumen (l)

Temperatur (⁰C)

Inokulumrate (% Vol/Vol)

Inokulumalter (h) Antischaummittel Inokulum-Rührges chwin-

digkeit (U/min) Inokulum-Medium

extraktbrühe

30

7,0

22

p-1200 (Dow Chemical)

160 ) Inokulum im Rauchkanal geräu- ν für MF214 eherte/Burleyextrakt- Wachstumsbrühe J zyklus

Zeit (h)

am Beginn
25,5

NO

(/Ug/ml) Alkaloid (mg/ml)

3565 0

2,84
0,24

PH

7,15 7,06

Nach 25,5 h wurde die Kultur zur Behandlung von im Rauchkanal geräucherten/Burleystengeln unter aeroben und anaeroben Bedingungen verwendet, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

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Aerobe Behandlungen Zeit (h)

0 2T

pH NO*Alkaloide (%) NO, Alkaloide

behandelt 6,48 2,75 0,17 0,12 0,10

7,53 2,75 0,17 0,13 0,09

Kontrolle 5,20 2,75 0,17 2,72 0,12

Anaerobe Behandlungen

behandelt 6,82 2,75 0,17 0,12 0,09

7,22 2,75 0,17 0,15 0,09

Kontrolle 5,20 2,75 0,17 2,78 0,19

Alle Behandlungen erfolgten bei einem Feuchtigkeitsgehalt von 75% und sie wurden 24 h bei 30⁰C in Kunststoffbeutein durchgeführt. Weiterhin wurden anaerobe Behandlungen mit anaeroben BBL(Bältimore Biological Laboratories)-Systemzylindern "GASPAIi" durchgeführt, wobei ein BBL-Katalysator zum Binden von atmosphärischem Sauerstoff verwendet wurde. Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß die Erfindung unter anaeroben Bedingungen und unter Bedingungen, bei den eine Verfügbarkeit von Sauerstoff nicht kontrolliert wird, durchgeführt werden kann.

Beispiel 12

Dieses Beispiel beschreibt die Effekte der Behandlung von Tabak mit Zellen sowie überstehender Flüssigkeit vom Zellwachstum.

Cellulomonas sp. wurde in Kolben mit im Rauchkanal geräucherter/Burleystengel-Extraktbrühe mit O,5°o (Gew./Vol) zugesetztem Hefeextrakt, hergestellt gemäß Beispiel 1(c) , gezüchtet.

Die Inokulierung des Kolbens und die Inkubation erfolgten wie in Beispiel 1(d). Am Ende der Wachstumsperiode wurde die Kultur gemäß Fig. 1 behandelt.

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- 30 Fig.

Kultur

ψ Aufteilung

Tabakbehandlung

auf das ursprüngl. Volumen in sterilem Wasser resuspendiert

Zentrifugieren (10 000 U/min während 15 min unter Verwendung eines Kopfes vom GSA-Typ in einer Sorvall RC2-B-Zentrifuge)
Zellpellets

überstehendes Produkt
I Aufteilung

Tabakbehandlung

Hi s chen/Susp endi eren

Tabakbehandlung

Millipore
(0,22/um)

Filtration

Ino kuli erung von frischem im Rauchkanal geräuchertem/ Burleyextrakt Inokulierung von frischem im Rauchkanal geräuchertem/ Burleyextrakt

Tabakbehandlung

Inkubation

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2922233

Bei dem in der Figur dargestellten Verfahren wurden die . folgenden Ergebnisse erhalten:

Herstellung der Kultur

im Rauchkanal geräucherte/ Burley-Extraktbrühe mit 0,5% HE

Kontrolle Oh (nicht inokul.) 24 h

inokuliert Oh

24 h

resuspend.Zellen überstehendes Produkt filtriertes, überstehendes

Produkt 40 0,026 8,27

Die resuspendierten Zellen und gefiltertes, überstehendes Produkt wurden zur Inokulierung von gesonderten, frischen Kolben von im Rauchkanal geräucherter /Burley-Extraktbrühe mit 10 ml/Kolben (250 ml Extrakt/500 ml Kolben) verwendet. Es wurde 24 h bei 30⁰C mit 220 U/min inkubiert. Der Extrakt wurde, wie in Beispiel i(c), hergestellt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Tabelle II Zeit (h) NO₃(^UgZmI) Alkaloide (mg/ml)

Tabelle I	Alkaloide (mg/ml)	PH
ί S&i)	0,290 0,290	7,13 7,04
1618 1550	0,280 0,028	7,11 8,06
1559 39	0 0,026	8,32 8,16
0 36

₃ ^

resuspend. Zellen 0 1482 0,27 7,02

24 0 0 8,15

gefiltertes,über- 0 ι 1522 0,27 7,21

stehend.Produkt- 24 * 1022 0,30 7,75

Die resuspendierten Zellen, die ursprüngliche Kultur, filtriertes überstehendes Produkt und nichtfiltriertes überstehendes Produkt wurden alle gesondert zur Behandlung von 50 g-Proben von im Rauchkanal geräucherten/Burleystengeln mit etwa 75% Feuchtigkeit über einen Zeitraum von 24 h bei 30⁰C in Kunststoffbeuteln verwendet. Bei einer Kontrollprobe wurde der pH-¥ert eingestellt und es wurde mit Wasser ohne Inokulum behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

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Tabelle III

Tabakbehandlungen	0 24	MO₃(Si)
Zeit (h)	0 24	4,34 4,12
Kontrolle (kein Inokulum)	0 24	4,48 0,61
ursprüngliche Kultur	0 24	4,33 2,72
resuspendierte Zellen	filtriertes,über- 0 stehend.Produkt 24	4,65 4,51
überstehendes Produkt		4,46 4,04

Alkaloide (Nicotin) {%)

PH

0,59 0,37

0,56 0,05

0,56 0,18

0,56 0,42

0,57 0,49

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß die überstehende Flüssigkeit, wenn sie von der Kultur abgetrennt wird, nicht die Fähigkeit hat, Nitrate und Nicotin in Tabak abzubauen.

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Claims

PATENTANWÄLTE A. GRÜNECKER

H. KlNHELDEY

DR-INGL \J^rC>

^W# STOCKMAlR

Da-INa A-E(CALTECHl

K. SCHUMANN

DR RER NAT.-OPL-PHIS

P. H. JAKOB

DlPL-INa

G. BEZOLD

QRRERNAX-DPl-CHEM.

8 MÜNCHEN 22

MAXIMILIANSTRASSE 43

31. Mai 1979 P 13 890

BROWN & WILLIAMSON TOBACCO CORPORATION

West Hill Street, Louisville, Kentucky 40232, USA

Verfahren zur Verminderung des Nitrat- und Nicotingehalts

von Tabak

Patentansprüche

1. Verfahren zur Verminderung des Nitrat- und Nicotingehalts von Tabak, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) den Tabak mit einem wäßrigen Medium kontaktiert, das. einen Mikroorganismus enthält, der den Nitrat- und Nicotingehalt des Tabaks vermindert bzw. abbaut; und daß man

(b) den Tabak etwa 18 Stunden bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40°C in Kontakt hält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Medium eine Nitrat enthaltende Verbindung enthält.

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telefon (oaa) aaaaea telex oe-asaeo Telegramme monapat telekopierer

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitratverbindung aus der Gruppe Kaliumnitrat, Natriumnitrat und Ammoniumnitrat ausgewählt ist.

4. «Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichiB t, daß der Anteil der Nitratverbindung im Bereich von etwa 0,1 bis 1,0 Gew.# des wäßrigen Mediums liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Cellulomonas sp. ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontaktierung bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 9,5 durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das wäßrige Medium in der Weise herstellt, daß man

(a) mindestens 5 Gew.?o Nähragar zu Wasser unter Bildung einer ersten Lösung gibt;

(b) 0,1 bis 1,0 Gew.% einer Nitratverbindung zu der ersten Lösung zusetzt;

(c) die erste Lösung sterilisiert, indem man sie mindestens 15 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und bei 121⁰C oder mehr erhitzt, um ein sterilisiertes Medium zu bilden;

(d) Cellulomonas sp. zu dem sterilisierten Medium zugibt und Cellulomonas sp. über einen Zeitraum von etwa 3 bis 5 Tagen bei etwa 20 bis 40°C inkubieren läßt; und daß man

(e) das resultierende Wachstum aus dem Nähragar-Nitrat-Medium entfernt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das erste Medium innerhalb eines Reagenzglases auf einer Schrägkultur sterilisiert, wobei eine Schrägoberfläche für das Wachstum vorgesehen ist.

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_ 3 —

9. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß man eine Tabakextraktbrühe herstellt, indem man

(a) Tabakmaterial zu Wasser unter Bildung einer zweiten Lösung gibt;

(b) die zweite Lösung in einem Gefäß mindestens 40 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und bei einer Temperatur von mindestens 121⁰C kocht;

(c) die gekochte zweite Lösung mit Wasser auf etwa ihr ursprüngliches Volumen einstellt;

(d) Hefeextrakt in einer Menge von etwa 0,1 bis 2,0 Gew. 56 Extrakt/Volumeneinheit zumischt;

(e) die zweite Lösung mindestens 15 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü und einer Temperatur von mindestens 121°C sterilisiert; und daß man

(f) das resultierende Wachstum von der Nähragar-Nitratverbindung zu der sterilisierten zweiten Lösung zusetzt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufrechterhaltung des Tabaks in Kontakt mit dem Mikroorganismus in Abwesenheit von freiem Sauerstoff durchführt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufrechterhaltung des Tabaks in Kontakt mit dem Mikroorganismus in Anwesenheit von Sauerstoff durchführt.

12. Verfahren zur Herstellung eines mikrobielle Substanzen enthaltenden Mediums zur Verwendung bei der gleichzeitigen Verminderung des Nitrat- und Nicotingehalts von damit zu behandelnden Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) mindestens 5 Gew.% Nähragar zu Wasser unter Bildung einer, ersten Lösung gibt;

(b) 0,5 bis 1,0 Gew.% einer Nitrat enthaltenden Verbindung zu der ersten Lösung zusetzt;

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(c) diese erste Lösung sterilisiert, indem man sie mindestens 15 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 psig) auf mindestens 121⁰C erhitzt; und

(d) Cellulomonas sp. zu dem ersten Medium zusetzt
und diese erste Lösung etwa 3 bis 5 Tage lang bei etwa 20
bis 40⁰C inkubieren läßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitrat enthaltende Verbindung Kaliumnitrat ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sterilisation des ersten Mediums innerhalb eines Reagenzglases auf einer Schrägkultur vornimmt, wobei eine
Schrägoberfläche für das Wachstum vorgesehen ist.

15· Verfahren zur Verminderung des Nitrat-und Nicotingehalts von Tabak, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) Tabak in eine wäßrige Lösung einmischt;

(b) den Tabak aus der wäßrigen Lösung herausnimmt, wodurch eine Tabakextraktbruhe zurückbleibt;

(c) Cellulomonas sp. zu der Brühe zusetzt;

(d) Cellulomonas sp. inkubiert; und

(e) die inkubierte Cellulomonas sp. in der Brühe
zu dem Tabak zusetzt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung Wasser ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß man die Brühe nach der Stufe (b) sterilisiert.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sterilisation mindestens 15 Minuten lang bei einem Druck von mindestens 1,05 atü (15 psig) und einer Temperatur von mindestens 121⁰C durchführt.

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19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Hefeextrakb zu der Brühe vor der Zugabe von Cellulomonas sp. zusetzt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des Hefeextrakts etwa 0,1 bis 2,0 Gew.?ä der Brühe beträgt.

21. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation unter Rühren erfolgt.

22. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Zugabe von Cellulomonas sp. den pH-Wert der Brühe auf 7,0 bis 9,5 einstellt.

23. Verfahren zur Verminderung des.Nitrat- und Nicotingehalts von Tabak, dadurch gekennzeichnet, daß. man

(a) Tabak in eine wäßrige Lösung einmischt;

(b) den Tabak aus der wäßrigen Lösung entfernt, wodurch eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt;

(c) die Tabakextraktbrühe durch eine semipermeable Membran leitet, wobei die Membran eine genügend große Porengröße hat, daß ein erstes Retentionsprodukt zurückgehalten wird und der Durchtritt von vorgewählten Extraktkomponenten gestattet wird, wodurch ein erstes durchgegangenes Produkt erhalten wird, und daß man

(d) das erste durchgegangene Produkt, das die vorgewählten Extraktkomponenten enthält, mit Cellulomonas sp. zur Entfernung von Nitrat und Nicotin behandelt.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man

(e) das erste, behandelte, durchgegangene Produkt durch eine semipermeable Membran leitet, wobei die Membran eine genügend große Porengröße hat, daß ein zweites Reten-

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tionsprodukt zurückgehalten wird, das Cellulomonas sp. enthält, und daß der Durchtritt des behandelten Extrakts gestattet wird, wobei der behandelte Extrakt ein zweites durchgegangenes Produkt darstellt;

(f) das zweite durchgegangene Produkt mit dem ersten Retentionsprodukt vermischt; und daß man

(g) das Gemisch aus zweitem durchgegangenem Produkt und erstem Retentionsprodukt zu dem in der Stufe (b) herausgenommenem Tabak zusetzt.

25. Tabakprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß es durch ein Verfahren zur Verminderung des Nitrat- und Nicotingehalts von Tabak hergestellt worden ist, bei dem man

(a) den Tabak mit einem wäßrigen Medium kontaktiert, das einen Mikroorganismus enthält, der den Nitrat- und Nicotingehalt des Tabaks vermindert bzw. abbaut; und daß man

(b) den Tabak etwa 18 Stunden bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40°C in Kontakt hält.

26. Produkt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Medium eine Nitrat enthaltende Verbindung einschließt.

27. Produkt nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitratverbindung aus der Gruppe Kaliumnitrat, Natriumnitrat und Ammoniumnitrat ausgewählt ist.

28. Produkt nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil der Nitratverbindung im Bereich von etwa 0,1 bis 1,0 Gew.?o des wäßrigen Mediums liegt.

29. Produkt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Cellulomonas sp. ist.

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30. Prodiakt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontaktierung bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 9,5 durchführt.

31. Produkt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Medium dadurch hergestellt worden ist, daß man

(a) mindestens 5 Gew.% Nähragar zu Wasser unter Bildung einer ersten Lösung gibt;

(b) 0,1 bis 1,0 Gew.% einer Nitratverbindung zu der ersten Lösung zusetzt;

(c) die erste Lösung sterilisiert, indem man sie mindestens 15 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und bei 121⁰C oder mehr erhitzt, um ein sterilisiertes Medium zu bilden;

(d) Cellulomonas sp. zu dem sterilisierten Medium zugibt und Cellulomonas sp. über einen Zeitraum von etwa 3 bis 5 Tagen bei etwa 20 bis 40°C inkubieren laßt; und daß man

(e) das resultierende Wachstum aus dem Nähragar-Nitrat-Medium entfernt.

32. Produkt nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man das erste Medium innerhalb eines Reagenzglases auf einer Schrägkultur sterilisiert, wobei eine Schrägoberfläche für das Wachstum vorgesehen ist.

33· Produkt nach Anspruch 31» dadurch gekennzeichnet, daß man eine Tabakextraktbrühe herstellt, indem man

(a) Tabakmaterial zu Wasser unter Bildung einer zweiten Lösung gibt;

(b) diese zweite Lösung in einem Gefäß mindestens 40 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und bei einer Temperatur von mindestens 121⁰C kocht;

(c) die gekochte, zweite Lösung mit Wasser auf ungefähr ihr ursprüngliches Volumen einstellt;

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(d) Hefeextrakt in einer Menge von etwa 0,1 bis 2,0 Gew.% Extrakt/Volumeneinheit zumischt;

(e) diese zweite Lösung mindestens 15 Minuten lang "bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und bei einer Temperatur von mindestens 121⁰C sterilisiert; und daß man

(f) das resultierende Wachstum von der Nähragar-Nitratverbindung zu der sterilisierten zweiten Lösung zusetzt,

34. Produkt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufrechterhaltung des Tabaks in Kontakt mit dem Mikroorganismus in Abwesenheit von freiem Sauerstoff vornimmt.

35· Produkt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufrechterhaltung des Tabaks in Kontakt mit dem Mikroorganismus in Anwesenheit von Sauerstoff vornimmt.

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