DE2634186A1

DE2634186A1 - Verfahren zur verminderung des nikotingehalts von tabak durch mikrobielle behandlung

Info

Publication number: DE2634186A1
Application number: DE19762634186
Authority: DE
Inventors: Vernon L Geiss; Lawrence E Gravely; John N Jewell; Ky Louisville; Richard P Newton
Original assignee: British American Tobacco Co Ltd
Current assignee: British American Tobacco Investments Ltd
Priority date: 1975-11-17
Filing date: 1976-07-29
Publication date: 1977-05-26
Also published as: CA1044554A; US4151848A; US4037609A; GB1523837A

Description

Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak durch mikrobielle Behandlung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak durch Behandlung des Tabaks mit Kulturen von Mikroorganismen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Behandlung von Tabak, bei dem der Tabak mit besonderen Mikroorganismen bei kontrollierten Bedingungen behandelt wird. Bei diesem Verfahren wird der Nikotingehalt des Tabaks innerhalb relativ kurzer Zeit vermindert. Das Verfahren ist für die Verminderung des Nikotingehalts von Tabak sehr wirksam. Die Intensität des. Rauches, der von Rauchwaren, die aus dem Tabak hergestellt werden, erzeugt wird, wird nicht wesentlich vermindert. Die Reizeigenschaften des Rauches, der von dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Tabak gebildet wird, werden jedoch vermindert.

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TELEFON (08Θ) 22 08 62

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TELEQRAMME MONAPAT TELEKOPIEBER

Aus verschiedenen Gründen soll der Nikotingehalt von Tabak oft vermindert werden. Beispielsweise haben in den vergangenen Jahren "milde" Zigaretten mit niedrigem Nikotingehalt beim Verbraucher größeres Interesse gefunden.

Zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak gibt es viele Verfahren. Bei den meisten dieser Verfahren v/erden jedoch die anderen Tabakbestandteile zusammen mit dem Nikotin entfernt. Die Entfernung der anderen Bestandteile beeinflußt die wünschenswerten Aroma- und Geschmackseigenschaften nachteilig oder andere Raucheigenschaften werden verschlechtert. Es besteht daher Bedarf nach Verfahren, mit denen der Nikotingehalt von Tabak selektiv vermindert werden kann, ohne daß die gewünschten Raucheigenschaften nachteilig modifiziert werden*

Bei der erfindungsgemäßen mikrobieilen Behandlung werden Kulturen von Mikroorganismen verwendet, die für Nikotin spezifisch sind. Dabei wird der Nikotingehalt des Tabaks wesentlich vermindert, ohne daß auf die anderen Komponenten des Tabaks irgendein Einfluß ausgeübt wird. Obgleich der Nikotingehalt des Tabaks vermindert wird, bleiben die organoleptischen Eigenschaften, die dem Rauch zuzuordnen sind, der aus dem Tf-^!:>ak gebildet wird, im allgemeinen erhalten. Nach der Behair mg wird jedoch ein milderer Rauch erzeugt.

Die Tabakfermentierung wird seit vielen Jahren bei der Herstellung von Zigarren, Kautabak und Schnupftabak durchgeführt. Die Behandlung von Zigarettentabaken nach diesem Verfahren ist nicht sinnvoll, da sehr lange Zeiten, üblicherweise Tage oder Wochen, für die Beendigung der Fermentierung erforderlich sind. Diese Fermentierungsverfahren ergeben im allgemeinen auch beachtliche Verluste in der Tabakmasse, oft so viel wie 20 bis 25 Gew.% der trockenen Ausgangsmaterialien.

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Die Behandlung von Nikotin einschließlich von Nikotin, das aus Pflanzenquellen stammt, mit Mikroorganismen zur Zersetzung des Nikotins durch biochemische Mechanismen, wobei 6-Hydroxynicotin gebildet wird, ist bekannt. Ein solches Verfahren wird in der US-PS 3 664 176 beschrieben. Diese Mikroorganismen sind für die Zersetzung von relativ konzentriertem Nikotin geeignet. Ihre Verwendung bei der Behandlung von Tabak bei der Herstellung- von Rauchwaren, insbesondere von Zigaretten, ist jedoch wirtschaftlich nicht möglich. Es sind extrem lange Behandlungszeiten zwischen dem Tabak und diesen Mikroorganismen für eine wesentliche Verminderung des Nikotingehalts bei praktischen Betriebsbedingungen erforderlich.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, mit dem der Nikotingehalt von Tabak wirtschaftlich und selektiv vermindert werden kann, ohne daß der Tabak nachteilig beeinflußt wird. Die Raucheigenschaften des Tabaks, wie der Geschmack, der Geruch und das Aroma, sollen dabei nicht nachteilig beeinflußt werden.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren für die Verminderung des Nikotingehalts von Tabak durch mikrobielle Behandlung. Tabak wird bei kontrollierten Bedingungen mit Mikroorganismen behandelt. Durch eine biochemische Umsetzung wird das Nikotin abgebaut, und inter alia wird 3-Succinoylpyridin gebildet. Bevor der Tabak mit den Mikroorganismen behandelt wird, wird der Tabak zur Erhöhung seines Feuchtigkeitsgehalts bedampft. Man erhält bei diesem Verfahren nach kurzen Behandlungszeiten Tabake mit niedrigem Nikotingehalt, ohne daß ein Massenverlust auftritt. ¥ird nach diesem Verfahren behandelter Tabak zur Herstellung von Tabakrauchwaren verwendet, so ergeben diese einen milden Rauch mit vermindertem Nikotingehalt. In den Aroma-, Geschmacks- und Raucheigenschaften beobachtet man keine Verluste.

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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Tabak mit Dampf während einer Zeit behandelt, die ausreicht, den Feuchtigkeitsgehalt des Tabaks auf mindestens 15 Gew.% einzustellen, den Tabak mit mindestens 1 χ 10' Zellen an Mikroorganismen/g, bezogen auf das Trockengewicht des Tabaks, zum Abbau des Nikotins durch einen biochemischen Mechanismus, bei dem 3-Succinoylpyridin gebildet wird,inokuliert, den inokulierten Tabak so kontrolliert, daß

(a) ein Feuchtigkeitsgehalt von mindestens 50 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht von Tabak und Wasser,

(b) eine Temperatur zwischen etwa 20 und 45⁰C und

(c) ein Anfangs-pH-Y/ert zwischen etwa 5 und etwa 8 aufrechterhalten werden,

die Mikroorganismen in Kontakt mit dem Tabak während einer Zeit hält, die ausreicht, daß die Mikroorganismen auf das in dem Tabak vorhandene Nikotin einwirken können, so daß der Nikotingehalt des Tabaks vermindert wird, und den Tabak zur Verminderung seines Feuchtigkeitsgehaltes und zur Beendigung der Einwirkung der Mikroorganismen auf ihn trocknet.

Erfindungsgemäß kann der Nikotingehalt von Tabak wesentlich, wirtschaftlich und selektiv vermindert werden, ohne daß der Tabak nachteilig beeinflußt wird. Bei dem Verfahren wird die Tabakbehandlungszeit nicht wesentlich verlängert. Es sind keine wesentlichen, zusätzlichen Energieleistungen erforderlich, da die Mikroorganismen ihre Energie fast nur von dem in dem Tabak enthaltenen Nikotin erhalten. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren tritt kein merklicher Verlust an Tabakmasse auf.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Entnikotinisierung von Tabak geschaffen, bei dem der Tabak mit einer besonderen Gruppe von Mikroorganismen bei geeigneten Temperatur-, Feuchtigkeits- und pH-Bedingungen inokuliert wird. Bei

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der vorliegenden Erfindung können solche Mikroorganismen verwendet werden, die Nikotin durch eine biochemische Umsetzung abbauen, wobei 3-Succinoylpyridin und andere Nebenprodukte gebildet werden. Das Entnikotinisierungsverfahren kann leicht zusammen mit bekannten Verfahren für die Aufbereitung von Tabak während der Herstellung von Rauchwaren verwendet werden.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak, bei dem Tabak zuerst während einer Zeit mit Dampf behandelt wird, die ausreicht, den Feuchtigkeitsgehalt des Tabaks auf mindestens 15 Gew.% einzustellen. Anschließend wird der Tabak mit Mikroorganismen inokuliert, die das Nikotin durch biochemische Mechanismen abbauen, wobei 3-Succinoylpyridin gebildet wird. Nach Zugabe der Mikroorganismen zu dem Tabak muß der Feuchtigkeitsgehalt bei einem Wert von mindestens 50 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Tabaks und des Wassers, gehalten werden.

Nach der Zugabe der Mikroorganismen zu dem Tabak muß die Temperatur so kontrolliert werden, daß sie zwischen etwa 20 und etwa 45⁰C gehalten wird, während der Anfangs-pH-Wert des Gemisches zwischen etwa 5 und etwa 8 gehalten wird. Der Tabak wird mit den Mikroorganismen während einer Zeit behandelt, die ausreicht, daß die Mikroorganismen auf das in dem Tabak enthaltene Nikotin einwirken können. Der Nikotingehalt des Tabaks wird dabei durch Abbau zu inter alia 3-Succinoylpyridin vermindert.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren geschaffen, mit dem eine wesentliche Verminderung im Nikotingehalt während relativ kurzer Behandlungszeiten erhalten wird. Verwendet man relativ kurze Behandlungszeiten, so treten keine wesentlichen Verluste an Tabakmasse auf.

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Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Tabak ergibt einen milden, angenehm schmeckenden Rauch. Der angenehme Geschmack der Rauchwaren, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Tabak enthalten, kann teilweise durch die Anwesenheit von Nikotinzersetzungsprodükten, insbesondere 3-Succinoylpyridin und 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin, in Mengen, die den Wohlgeschmack und den Duft ändern, bedingt sein.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders für die Behandlung von Burleytabak geeignet. Burleytabak besitzt normalerweise einen relativ hohen Nikotingehalt und ergibt einen recht herben bzw. strengen Rauch. Zur Verminderung dieser "Herbheit" bzw. "Strenge" wird Burleytabak normalerweise mit Casing-Zusammensetzungen behandelt. Wird Burleytabak nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt, so wird nicht nur der Nikotingehalt vermindert, sondern ebenfalls die Herbheit, und zwar in solchem Ausmaß, daß der Burleytabak in Rauchwaren ohne Casing verwendet werden kann.

Anhand der beigefügten Zeichnungen werden bevorzugte •erfindungsgemäße Ausführungsformen näher erläutert; es zeigen

Fig. 1 eine schematische Ansicht, in der eine bevorzugte erfindungsgemäße mikrobielle Behandlung dargestellt ist;

Fig. 2 eine schematische Ansicht, in der ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Inokulum dargestellt ist, das bei dem in Fig. 1 erläuterten erfindungsgemäßen Verrfahren verwendet werden kann.

Reine Kulturisolate von Bakterien, die Nikotin durch biochemische Mechanismen zersetzen, wobei 3-Succinoylpyridin gebildet wird, und die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können durch KuItür-Anreicherungsverfahren erhalten werden. Drei Bakterienspecies, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, wurden aus Zigarrentabak erhalten.

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500 g Zigarrentabak aus Puerto Rico werden mit Wasser auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 80% eingestellt. Der Tabak wird fest bzw. eng ubereinandergestapelt, mit Plastik umhüllt und kann über Nacht bei etwa 25⁰C inkubieren. Nach 18 Stunden werden von dem Tabak für die Bestimmung der Alkaloide Proben entnommen, und es erfolgt ein Umstapeln. Der Inkubations- und Umstapelungszyklus wird einige Tage weitergeführt, bis der Alkaloidgehalt im Tabak sehr niedrig ist.

Nach einigen Tagen werden 5 g des behandelten Zigarrentabaks in einen Kolben mit einer Nikotinbrühe gegeben. Unter Schütteln wird bei 30⁰C inkubiert. Die Nikotinbrühe enthält 0,02 g FeSO₄, 4 ml Nicotin, 2,0 g KH₂PO₄, 5,0 g KCl, 0,2 g MgSO₄, 0,1 g Hefeextrakt und 1 1 Wasser zur Einstellung des pH-Wertes der Brühe auf 6,8«

Eine anschließende Alkaloid-Analyse der Nikotinbrühe zeigt, daß das Nikotin abgebaut wurde. Nikotin wird zu der Brühe zur erneuten Einstellung des Nikotingehalts auf 4 mg/ml zugegeben. Die Brühe verarmt wieder an Nikotin. Frische Nikotinbrühevardmit Brühe von dem ersten Kolben inokuliert und wieder tritt eine Nikotinverarmung auf. Frisches Medium mit zusätzlichem Nikotin wird bei . . mehreren nachfolgenden Übertragungen verwendet.

Proben aus den Kolben mit der inokulierten Nikotinbrühe werden auf Nikotinagar der gleichen Zusammensetzung, wie die Nikotinbrühe, außer einer Zugabe von 1,5% Agar gestrichen. Es wird dann bei 30⁰C inkubiert. Die stärksten Kolonien von Bakterien, die sich auf dem Nikotinagar entwickelten, werden mehrere Male zur Herstellung reiner Stämme wieder aufgestrichen.

Aus den ursprünglichen Kolonien werden drei Stämme von Bakterien erhalten, die identifiziert und, beim U.S.Department

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of Agriculture . hinterlegt wurden (Northern Regial Research Laboratory, Peoria, Illinois). Ein Stamm, der in der vorliegenden Anmeldung als Isolat Cellulomonas sp. (NRRL B-8063) bezeichnet v/ird, hat unregelmäßige Kolonien. Ein anderer, der in der vorliegenden Anmeldung als Isolat Pseudomonas putida (NRRL B-8062) bezeichnet wird, besitzt glatte, milchartige Kolonien, und der dritte, der in der vorliegenden Anmeldung als Isolat Pseudomonas putida (NRRL B-8061) bezeichnet wird, hat glatte, weiße Kolonien.

Die Stämme NRRL B-8061 und NRRL B-8062 zeigen eine stärkere Nikotinabbauwirkung als der Stamm NRRL B-8063. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden als bevorzugte Mikroorganismen Pseudomonas putida (NRRL B-8061) verwendet, obgleich Pseudomonas putida (NRRL B-8062) in den meisten Eigenschaften sehr ähnlich ist. Die morphologischen und biochemischen Eigenschaften sind in den Tabellen I, II bzw. III für Pseudomonas putida (NRRL B-8061 und I¹IRRL B-8062) und Cellulomonas sp. (NRRL B-8063) angegeben.

Die Stämme NRRL B-8061, B-8062 und B-8063 werden in Einzelheiten beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch nicht auf die Verwendung dieser spezifischen Organismen beschränkt. Irgendwelche Mikroorganismen, die Nikotin nach biochemischen Mechanismen zersetzen bzw. abbauen, wobei 3-Succinoylpyridin gebildet wird, können verwendet werden. Selbstverständlich können die Mikroorganismen auch andere Nikotinzersetzungsprodukte außer 3-Succinoylpyridin bilden, und dieses muß nicht das einzige Abbauprodukt, das gebildet wird, sein.

Es ist wesentlich, daß die Mikroorganismen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, Nikotin zu 3-Succinoylpyridin abbauen. Es ist unerheblich, ob auch andere Abbauprodukte gebildet werden. Mikroorganismen, die Nikotin abbauen, ohne daß wesentliche Mengen an 3-Succinoyl-

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pyridin gebildet werden, wie solche, die Nikotin zu 6-Hydroxynicotin abbauen, sind für die vorliegende Erfindung nicht geeignet.

Tabelle I

Morphologische und biochemische Eigenschaften von Pseudomonas putida (NRRL B-8O6I)

A. Morphologie

Stäbchen, die in ihrer Form oval bis kurz sind, Durchmesser von 0,8 bis 1,0/u, 1,0 bis 2,2 /U lang, hauptsächlich kokkenförmig; sie bilden Paare und längere Filamente.

Form der Kolonie:

Nähragar: opalisierend, leicht dunkelgelb oder cremefarben gefärbt, flache, glatte Kanten.

Pepton-Hefeextraktagar: Aussehen sehr ähnlich wie beim Nähragar; es tritt gleichzeitig die Bildung eines diffusionsfähigen, gelben Pigments auf, das unter ultraviolettem Licht fluoresziert. Dieses Pigment wird insbesondere in Glucose enthaltenden Medien gebildet.

Nikotinagar: fadenförmig, opak, perlgrau, butterartige Konsistenz, glänzend.

Hirn-Herz-Infusionsagar: kreisförmig, bucklig bzw. vorgewölbt, gerunzelt, wellenförmig verlaufend, glitzernd, opak, perlgrau.

Wachstumsart in statischer Herz-Hirn-Infusionsbrühe: trübe, membranes Oberflächenwachstum, flockiges Sediment, starkes Wachstum.

Gramnegativ
■. Frei beweglich durch drei oder mehrere polare Flagella.

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B. Physiologie

Obligatorisch aerob; stark aerotaktisch.

Optimales Wachstum: 25 bis 30⁰C. Bereich: 12 bis 37⁰C.

Nitrat wird zu Nitrit reduziert; es bildet sich kein Gas.

Telluritreduktion: negativ.

Wachstum mit Benzoesäure als Substrat. Wachstum mit Citrat als einzige Kohlenstoffquelle, bildet ein fluoreszierendes, gelbes Pigment.

Kein Wachstum auf Trehalose oder mit Mandelsäure, 2-Hydroxypyridin oder Pyridin.

Hydrolyse von Arginin: positiv. Gelatine, Stärke, Cellulose, Casein und Harnstoff werden nicht hydrolysiert.

Milchsäure wird gebildet.

Oxidase wird gebildet.

Ammoniak wird gebildet.

Säure und Schwefelwasserstoff werden nicht gebildet.

Catalase ist vorhanden.

Acetylmethyl-carbinol und -Indol sind nicht vorhanden.

Lackmusmilch: alkalisch, dann reduziert.

Keine Hämolyse von Blutagar.

Säure, aber kein Gas aus: Adonit, Arabinose, Cellobiose, Dulcit, Fructose, Galactose, Mannose, Melibiose, Raffinose, Rhamnose, Salizin.

Wachstum ohne Säure- oder Gasbildung mit Lactose, Saccharose, Maltose, Glucose, Xylose, Dextrin, Glycerin, Mannit und Inosit.

Wachstum, aber keine Phenazinpigmentbildung auf Kings Medium A. Wachstum und fluoreszierendes Pigment aus Kings Medium B.

Wachstum mit Nicotin und Nicotinsäure als einzige Quellen für Kohlenstoff. Das UV-Spektrum der Wachstumsflüssigkeit zum Zeitpunkt der Pigmentierung zeigt die Akkumula-,tion von 2,5-Dihydroxypyridin bei beiden Substraten.

GC-Verhältnis: Schmelzpunktverfahren: 62,5. CsCl-Dichtegradientenzentrifugierung: 63,2.

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Pathogenizität: beim Meerschweinchen nicht-pathogen bei oraler Fütterung oder intraperitonealer Injektion. Quelle: Tabak.

Tabelle II

Morphologische und biochemische Eigenschaften von Pseudomonas putida (NRRL B-8062)

A. Morphologie

Stäbchen, in ihrer Form oval bis kurz, 0,8 bis 1,0px Durchmesser, 1,0 bis 2,2 /u lang; hauptsächlich kokkenförmig; sie bilden Paare und längere Filamente.

Form der Kolonie:

Nähragar: opalisierend, leicht dunkelgelb oder creme- ' farben gefärbt, flache, glatte Kanten.

Pepton-Hefeextraktagar: das Aussehen ist ähnlich wie auf dem Nähragar; begleitet von der Bildung eines diffusionsfähigen gelben Pigments, das unter ultraviolettem Licht fluoresziert. Dieses Pigment wird insbesondere in Medien, in denen Glucose vorhanden ist, gebildet.

Nikotinagar: filiform, opak, perlgrau, butterartige Konsistenz, glitzernd.

Hirn-Herz-Infusionsagar: kreisförmig, gerunzelt, wellenförmig, bucklig, glitzernd, opak, perlgrau.

Wachstumsart in statischer Hirn-Herz-Infusionsbrühe:

trübe, membranartiges Oberflächenwachsturn, flocki ges Sediment, starkes Wachstum.

Gramnegativ.

Frei beweglich durch drei oder mehr polare Flagella.

B. Physiologie

Obligatorisch aerob, Stark aerotaktisch. Optimales Wachstum: 25 bis 30⁰C, Bereich: 12 bis 37°C Nitrat wird zu Nitrit reduziert; es wird kein Gas gebildet.

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Telluritreduktion: negativ.

Wachstum mit Benzoesäure als Substrat. Wachstum mit Citrat als einzige Kohlenstoffquelle; ein gelbes, fluoreszierendes Pigment wird gebildet.

Kein Wachstum auf Trehalose oder mit Mandelsäure, 2-Hydroxypridin oder Pyridin.

Milchsäure wird gebildet.

Oxidase wird gebildet.

Ammoniak wird nicht gebildet.

Säure und Schwefelwasserstoff werden nicht gebildet.

Catalase ist vorhanden.

Acetylmethyl-carbinol und Indol sind nicht vorhanden« Lackmusmilch: alkalisch, dann Reduktion.

Keine Hämolyse von Blutagar.

Säure, aber kein Gas aus: Adonit, Arabinose, Cellobiose, Dulcit, Fructose, Galactose, Mannose, Melibiose, Raffinose, Rhamnose, SaIizin.

Wachstum, aber keine Phenazinpigmentbildung auf Kings Medium A. Wachstum und fluoreszierendes Pigment auf Kings Medium B.

Wachstum mit Nicotin und Nicotinsäure als einzige Kohlenstoff quellen. Ultraviolettes Spektrum der Wachstumsflüssigkeit zur Zeit der Pigmentierung zeigt eine Akkumulation von 2,5-Dihydroxypyridin bei beiden Substraten.

GC-Verhältnis: Schmelzpunktverfahren: 61,0. CsCl-Dichtegradientzentrifugierung: 62,0.

-.. Pathogenizität: nicht-pathogen bei Meerschweinchen bei .oraler Fütterung oder intraperitonealer Injektion.

Quelle: Tabak.

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Tabelle III

Morphologische und biochemische Eigenschaften von Cellulomonas sp. (NRRL B-8063)

A. Morphologie "

Zellen sind dünn, gebogene oder fast

vibrioide Stäbchen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 0,7 /U und einer Länge von 1,5 bis 2,5/U.

Form der Kolonie:

Nähragar: klein, gelb, flach, butterartige Konsistenz mit glatten Kanten.

Pepton-Hefeextraktagar: ähnliche Erscheinung wie auf Nähragar. Keine exozellularen Pigmente werden bei Wachstum auf verschiedenen Medien einschließlich von Nikotin gebildet.

Nicotinagar: filiform, opak, perlgrau, membranenartig, glanzlos.

Hirn-Herz-Infusionsagar: kreisförmig, bucklig, erkennbare Konturen, wellenförmig, glanzlos, opak, perlgrau.

Wachstumsart in statischer Hirn-Herz-Infusionsbrühe: trübe,- klebrig bzw. zähflüssig, geringelt, mäßiges Wachstum.

Grampositiv, solange jung, beim Erreichen des stationären Wachstums variabel.

Freibeweglich bei Drehbewegung; die Zellen besitzen eine oder zwei polare Flagella.

B. Physiologie

Fakultativ anaerob, obligatorisch aerob, wenn Nitrat vorhanden ist.

Optimales Wachstum: 28 bis 3O⁰C, Bereich: 15 bis 37⁰C.

Nitrat wird zu Nitrit reduziert und Stickstoffgas jtfird aktiv gebildet.

Wächst mit Nikotin und Benzoesäure als einzige Kohlenstoff quellen. Es wird kein Pigment gebildet. Die spektrale Prüfung von Wachstumsflüssigkeit von Nikotin zeigt kein Vorhandensein von Dipyridolen.

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Kein Wachstum mit Mandelsäure, 2-Hydroxypyridin oder Pyridin.

Keine Hydrolyse mit Gelatine, Stärke, Cellulose, Casein, Harnstoff oder Arginin.

Wächst mit Citrat als einzige Kohlenstoffquelle.

Telluritreduktion: negativ.

Keine Bildung von Schwefelwasserstoff.

Milchsäure, Oxidase und Ammoniak werden gebildet.

Catalase, positiv.

Indol ist vorhanden, schwach.

Acetylmethyl-carbinol ist nicht vorhanden.

Lackmusmilch: alkalisch, dann Reduktion.

Kein Pigment auf Kings Medium A oder B.

Wachstum ohne Säure- oder Gasbildung auf Glucose, Saccharose, Maltose, Fructose, Galactose, Raffinose, Xylose, Salizin, Adonit, Glycerin und Inosit.

Kein Wachstum auf Lactose.

Säure, aber kein Gas aus: Arabinose, Cellobiose, Mannose, Melibiose, Rhamnose, Dextrin, Dulcit und Mannit.

Keine Hämolyse von Blutagar.

GC-Verhältnis: Schmelzpunktverfahren: 69,2. CsCl-Dichtegradientzentrifugierung: 68,9.

Pathogenizität: bei der oralen Fütterung oder der intraperitonealen Injektion bei Meerschweinchen nicht-pathogen.

Quelle: Tabak.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in den Fig. 1 und 2 dargestellt. In Fig. 1 wird dargestellt, wie Tabak, beispielsweise Streifen aus \ Burleytabak, in einen Bedampfungszylinder 12 eingegeben wird, wo die Streifen der Einwirkung von Dampf ausgesetzt sind. Der Tabak wird bedampft, bis der Feuchtigkeitsgehalt auf minde-.stens 15 Gew.% und bevorzugt auf etwa 25% eingestellt ist.

Diese Vorbedampfungsstufe ermöglicht es, daß die Behandlung für die Verminderung des Nikotins schneller bei nie-

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drigeren Feuchtigkeitsgehalten abläuft,als.sie sonst sinnvoll wären. Der Grund dafür ist nicht bekannt, aber man nimmt an, daß durch die Vorbedampfung ein schnellerer Kontakt zwischen den Mikroorganismen und dem Nikotin im Tabak möglich wird.

Bei hohen Feuchtigkeitsgehalten in großtechnischem Betrieb können Änderungen im Feuchtigkeitsgehalt, die so gering sind wie 1 oder 2%, viele Kilogramm Wasser betragen. Da fast das gesamte, zugefügte Wasser anschließend aus dem Tabak entfernt werden muß, ist es offensichtlich, daß selbst relativ geringe Verminderungen im Feuchtigkeitsgehalt bei der technischen Durchführung große wirtschaftliche Vorteile ergeben. Die schnelle Verminderung im Nikotingehalt ist wirtschaftlich günstig, ... .; : da bei langen Behandlungszeiten der Tabake mit den Mikroorganismen ein Verlust an Tabakmasse auftritt.

Nach der Behandlung mit Dampf werden 10% der Streifen in die Körbe 14 der Extraktionseinrichtung gegeben, so daß man das Brühenmedium für die Zucht der Kultur erhält. Die Züchtung der Kultur wird in Einzelheiten im Zusammenhang mit Fig. 2 beschrieben.

Der Haupttabakstrom wird von dem Dampf behandlungs zylinder 12 durch einen ersten Zylinder 15, in dem das Inokulum angewendet wird, geleitet, wo ein Teil der Bakterien zu den Tabakstreifen zugegeben wird. Etwa 40 bis etwa 70 Gew.% und bevorzugt etwa 50 bis etwa 60 Gew.% des gesamten Inokulums werden in den ersten Inokulumanwendungszylinder gegeben. Durch die Verwendung eines wäßrigen Inokulums wird der Feuchtigkeitsgehalt des Tabaks auf mindestens 40 Gew.% und bevorzugt auf 50 Gew.% eingestellt, bezogen auf das Gesamtgewicht des Gemisches aus Tabak und Wasser.

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Aus dem ersten Anwendungszylinder werden die Streifen in eine Zwischen-Massenbehandlungsvorrichtung 16 gegeben, wo sie während kurzer Zeit von etwa 2 bis 10 Minuten gehalten werden. Die Zwischen-Masseiibehandlungsvorrichtung ermöglicht, daß das Wasser von den Streifen absorbiert wird, bevor sie in einen zweiten Inokulumanwendungszylinder 17 gebracht werden, wo der Rest der Bakterien zugegeben wird. Durch diese zweite Anwendung von wäßrigem Inokulum wird der Feuchtigkeitsgehalt des Tabaks auf mindestens 50 Gew.% und bevorzugt auf mindestens etwa 65 Gew.%_t beispielsweise auf etwa 65 bis etwa 75 Gew.%, eingestellt. Die Gesamtmenge an angewendeten Bakterien sollte mindestens 1 χ 10' Zellen/g, bezogen auf das Trockengewicht des Tabaks, betragen.

Von den zweiten Anwendungszylinder 17 werden die inokulierten Tabakstreifen zu der Stapelbehandlungsvorrichtung 18 geleitet. Die Behandlung ist nur eine statische,Behandlung bei aeroben Bedingungen bei den gewünschten Feuchtigkeits-, Temperatur- und pH-Werten. Manchmal ist es bevorzugt, zwischenzeitlich zu vermischen.

Die Tabakstreifen werden während etwa 1 bis etwa 10 Stunden, beispielsweise etwa 6 Stunden, in der Masse stehengelassen, so daß die Mikroorganismen Zeit haben, den Alkaloidgehalt des Tabaks wesentlich zu vermindern. Im allgemeinen wird eine Verminderung von etwa 50 Gew.% erreicht. In der Stapelmassenbehandlungsvorrichtung 18 werden der Feuchtigkeitsgehalt bei etwa 65 bis 75%_t der Anfangs-pH-Wert bei 6 bis 7,5 und die Temperatur bei 27 bis 32⁰C gehalten.

Zur Einstellung des Anfangs-pH-Wertes innerhalb der gewünschten Grenzen kann es erforderlich sein, eine geringe Menge eines alkalischen Materials, wie z.B. Ammoniumhydroxid-'oder Natriumhydroxidlösung, zu dem Tabak zu geben. Viele Tabakarten werden jedoch inhärent einen pH-Wert innerhalb · ■

des gewünschten Bereichs besitzen, und.dann ist eine Einstellung nicht erforderlich.

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Die 10% Seitenstrom-Tabak, die zuvor in die Körbe 14 der Extraktionsvorrichtung gegeben werden, werden zu dem gesamten Tabakstrom nach der Extraktion gegeben, wenn der Tabak von der Stapelmassenbehandlungsvorrichtung 18 in die Trockenvorrichtung 19 gegeben wird. Nach der Extraktion besitzt der Seitentabakstrom einen Alkaloidgehalt von etwa 0

Die Tabakstreifen werden in zwei Stufen (Trockenvorrichtungen 19 und 21) getrocknet, die durch eine Zwischenmassenbehandlungsvorrichtung 20 getrennt sind zur sicheren Einstellung des Feuchtigkeitsgleichgewichts. Nach der letzten Trocknungsstufe wird der behandelte Tabakstreifen in eine andere Massenbehandlungsvorrichtung gegeben und in den üblichen Tabakbehandlungskreislauf zurückgeführt.

Größere oder geringere Verminderungen in der. Tabaknikotinkonzentration werden erhalten, ·. wenn man die Behandlungsparameter ändert. Eine geringere Nikotinentfernung wird üblicherweise erreicht, indem man kürzere Zeiten in der Stapelmassenbehandlungsvorrichtung verwendet. Eine größere Nikotinentfernung kann erreicht werden, indem man das Inokulum konzentriert, bevor der Tabak damit behandelt wird, indem man längere Stapelmassenbehandlungszeiten verwendet oder indem man beide Maßnahmen kombiniert.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Ansammlung von Inokulum für die Herstellung des Inokulums, das in die Anwendungszylin der 15 und 17 gegeben wird, ist in Fig. 2 dargestellt. Die Inokulumanreicherung beginnt mit der Herstellung von Brühe in der Extraktionsvorrichtung 23. Die Streifen werden in die Körbe 14 der Extraktionsvorrichtung gegeben. Die Körbe 14 befinden sich in der Extraktionsvorrichtung 23. Heißes Wasser wird durch die Extraktionsvorrichtung 23 zirkuliert, die als Druckkochvorrichtung ausgebildet sein kann, bis der Alkaloidgehalt des Wassers 1,5 mg/ml erreicht. Die Brühe wird dann

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aus der Extraktionsvorrichtung in die Impftanks 25 und die Inokulumtanks 27 gepumpt.

Die Mikrobenkultur wird in Stufen aufgebaut. Die erste Stufe ist eine Kolbenkultur in einem Nährmedium, das Tabakbrühe enthält. Die Kulturen der Mikroorganismen werden in verschiedene Tabakbrühen und Näherstoffe enthaltende 6 1 Kolben gegeben und können in etwa 48 Stunden bis zur Reife wachsen. Diese Kolben werden dann zur Füllung der Tabakbrühe enthaltenden Impftanks 25 verwendet. Die Impftanks 25 haben etwa 3% des Volumens der Inokulumtanks 27.

Die KuI tür anreiche rung in den Impf tanks erfordert etwa 5 bis 8 Stunden. Nach Beendigung v/erden die Inokulumtanks 27 von den Impftanks beschickt und erneut wird eine Wachstumszeit von 5 bis 8 Stunden vorgesehen, bevor das Material zu den Tabakstreifen in den Anwendungszylindern 15 und 17 gegeben wird. Die Inokulumtanks 27 sind so gebaut, daß Inokulum in die Anwendungszylinder im Verlauf von etwa 4 Stunden zugeführt wird. Ein Reservetank 29 liefert, sofern erforderlich, gesondertes Inokulum.

Während der Inokulumanreicherung sollte die Brühe belüftet und gerührt werden. Eine genaue Kontrolle des pH-Werts ergibt eine gesteigerte Inokulumaktivität. Die Brühe sollte einen Anfangs-pH-Wert zwischen etwa 5 und 8, bevorzugt zwischen etwa 6,2 und 7,8, besitzen. Die Brühe sollte weiterhin zwischen etwa 10 und 45°C, bevorzugt zwischen etwa 28 und 32°C, gehalten werden.

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Die Brühe sollte eine Anfangsnikotinkonzentration von mindestens 0,1 mg/ml und bevorzugt von mindestens 1,5 mg/ml besitzen. Selbstverständlich sollte die Brühe keine Nikotinkonzentrationen aufweisen, die größer sind als die Mengen, die für die Mikroorganismen toxisch sind. Nikotinkonzentra-

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tionen über etwa 12 mg/ml bedingen ein wesentlich langsameres Wachstum der Mikroorganismen.

Es ist bevorzugt, das Inokulum, sobald es fertig ist, zu verwenden, damit ein Verlust an Aktivität vermieden wird. Das Inokulum besitzt die höchste Aktivität zu dem Zeitpunkt, wenn die Brühe im wesentlichen an Nikotin verarmt ist, d.h.wenn der Nikotingehalt der Brühe etwa 0,2 mg/ml beträgt. Der Sauerstoffbedarf der Mikroorganismen ist am höchsten, wenn das Nikotin vermindert ist. Der gelöste Sauerstoffgehalt ist somit ein guter Indikator dafür, ob eine wesentliche Verarmung an Nikotin vorhanden ist und das Inokulum für die Anwendung fertig ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zusammen mit den üblichen Tabakbehandlungsverfahren durchgeführt werden. Wird das erfindungsgemäße Verfahren zusammen mit üblichen Tabakaufbereitungsverfahren verwendet, so können die normalen Casing- bzw. Sossierstufen und die folgenden Trocknungsstufen zusammen mit der mikrobiellen Behandlung durchgeführt werden. Insbesondere kann das Casing- bzw. Sossier- bzw. Soßenmaterial (diese Ausdrücke werden synonym verwendet) mit dem mikrobiellen Inokulum vor der Behandlung in der Masse zugegeben werden. Ein solches Verfahren ist in Fig. 1 dargestellt, wo Inokulum und Casingmaterial bei 31 vermischt werden und in den Anwendungszylinder 15 und/oder den Anwendungs zylinder 17 gegeben werden. Durch ein solches Verfahren werden die nachfolgenden Casing- und Trocknungsstufen eliminiert, und aus diesem Grund ist es wirtschaftlich vorteilhaft.

Casinglösungen, die Materialien, wie Zucker, Sirup, Lakritze, Honig, Schokolade, aromatische Harze usw., enthalten, werden zu Burleytabak oder Tabakblättermischungen als Geschmacks- bzw. Aromastoffe und zur Milderung und Abstufung der Herbheit solcher Tabakarten zugegeben. In einigen Fällen kann ein Casing des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Tabaks nicht erforderlich oder nicht gewünscht sein.

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Beispielsweise wird normaler, herber Burleytabak durch die mikrobielle Behandlung gemildert, und so behandelter Tabak kann in Rauchwaren ohne Casing verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine Verbesserung

des in der deutschen Patentschrift (Patentanmeldung

P entsprechend der US-Anmeldung mit der

Serial Nr. 632 804, die am gleichen Tag wie die vorliegende Anmeldung eingereicht wird und bei der Geiss, Gregory, Newton und Gravely Erfinder sind) beschriebenen Verfahrens. Ein Verfahren zur Maximierung der Kulturaktivität wird in der deutschen Patentschrift . ... ... (Patentanmeldung P entsprechend der US-Serial Nr. 632 857, eingereicht am gleichen Tage wie die vorliegende Anmeldung, bei der Gravely, Geiss und Newton Erfinder sind) beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Verminderung des Nikotingehalts von Tabak und Tabakteilen wirksam. Verschiedene Formen des Tabaks bzw. verschiedene Sorten des Tabaks in verschiedenen Curinggraden und -stufen können verwendet werden. Beispielsweise kann das Verfahren mit Streifen, die keiner Redrying-,aber .einer-F-lue-curing-Behandlung-unterworfen -wurden, oder mit Burleystreifen, mit der Redrying- und der Flue-curing-Behandlung unterworfenen Streifen oder Burleystreifen Burleyrippen , der Flue-curing-Behandlung unterworfenen Rippen , Verarbeitungsmehl, Stocks, zerkleinertem Tabak und ihren Gemischen verwendet werden. Das Verfahren kann ebenfalls bei Nikotin enthaltenden Materialien verwendet werden, die zur Herstellung von Produkten, wie Tabakersatzmaterialien und rekonstituiertem Tabak, verwendet werden.

5 Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Tabak kann zur Herstellung von Tabakrauchwaren, wie Zigaretten, verwendet werden. Der Tabak ist besonders gut für die Herstellung von Tabakprodukten mit niedrigem Nikotingehalt geeignet. Wird der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Tabak

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in Tabakrauchprodulcte eingearbeitet, so ergeben diese Rauch mit verminderter Nikotinabgabe wie auch mit wünschenswerten Aroma- und Geschmackseigenschaften. Geringe Mengen an Nikotinabbauprodukten, insbesondere von 3-Succinoylpyridin und 6-Hydroxy-3-succinoylpyridin, wie sie inhärent in dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Tabak vorhanden sind, ergeben die wünschenswerten Rauchgeschmacksund -aromaeigenschaften.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel 1
Herstellung des Inokulums

Nikotinagar und Brühe

Nikotinagar wird nach der folgenden Rezeptur hergestellt:

Nikotin 4,0 ml

FeSO₄ 0,025 g

KH₂PO₄ 2,0 g

KCl 5,0 g

MgSO₄ 0,25 g

Hefeextrakt 0,1 g

Agar 15,0 g

destilliertes oder entionisiertes

Wasser bis zu 11

End-pH-Wert 6,8.

Das Medium wird 15 Minuten in einem Autoklaven bei 1,05 atü (15 psig) und 121⁰C sterilisiert. Nikotin wird üblicherweise zu dem Medium gerade vor der Verwendung zugegeben. Eine Brühe des obigen Mediums wird hergestellt, indem man kein Agar zugibt.

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Tabak-Nikotinbrühe

Ein Extrakt von Burleytabak wird folgendermaßen hergestellt: 100 g Burleytabak werden mit 1000 ml Wasser vermischt und in 'einem Autoklaven während 25 Minuten bei 1,05 atü und 121⁰C gekocht. Die entstehende Flüssigkeit wird entfernt und das Volumen wird auf die ursprüngliche Menge eingestellt. Ein gleiches Volumen an wäßriger Brühe , die 0,05 g FeSO^, 4,0 g KH₂PO^, 10,0 g KCl, 0,5 g MgSO^ und 0,2 g Hefeextrakt enthält, wird zu dem Burleytabakextrakt zugegeben. Das Medium wird 15 Minuten bei 1,05 atü und 121⁰C in einem Autoklaven sterilisiert. Gerade vor der Verwendung wird Nikotin bis zu einer Endnikotinkonzentration von 4,0 mg/ml zugegeben.Ein einer Flue-curing-Behandlung unterworfener Tabak kann in diesem Medium anstelle von Burleytabak verwendet werden.

Tabakextraktbrühe

Tabakextraktbrühe wird auf gleiche Weise, wie der Burleyextrakt, der bei der Tabak-Nikotin-Brühe verwendet wurde, hergestellt. Wasser kann oder kann nicht zugegeben v/erden, abhängig von der gewünschten Endnikotinkonzentration.

Inokulierung der Brühe

Die Mikroorganismen, wie der Stamm NRRL B-8061, werden auf Agarschrägkulturen während 24 bis 72 Stunden bei 30⁰C inkubiert. Die flüssigen Medien, z.B. die Tabak-Nikotinbrühe, werden mit sterilen Wasserwaschlösungen von Schrägkulturen inokuliert, die auf eine optische Dichte von 0,5, abgelesen bei 650 m/u auf einem Spektrophotometer, verdünnt wurdenc Eine 1%ige (Vol./Vol.) Inokulumrate der standardisierten Suspension wird für die Kulturfortpflanzung zu einem der Brühenmedien gegeben. Ein optimales Wachstum wird erreicht, wenn man 24 bis 48 Stunden bei 30⁰C und 220 U/min durch Rotieren bewegt.

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Beispiel 2

Eine Tabakextraktbrühe wird hergestellt, indem man die geeignete Menge an Burleystreifentabak (etwa 6,8 kg = 15 lbs Trockengewicht) in eine Extraktionsvorrichtung mit Drahtkörben gibt, die in die Extraktionsvorrichtung gestellt werden. Heißes Wasser (85 bis 90°) (etwa 113 bis 136 kg = 250 bis 300 lbs) wird dann durch die Drahtkröbe, die den Tabak, enthalten, umgewälzt, bis der Alkaloidgehalt 1,5 mg/ml erreicht. Ein rostfreier, zylindrischer Stahltank wird mit 90,7 kg (200 lbs) Tabakextraktbrühe beschickt.

P. putida (NRRL B-8061)-Inokulum wird in Tabakextrakt-Schüttelkolbenkultüren, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. 5,4 kg (12 lbs) Inokulum werden für die Beschickung der 90,7 kg Tabakextraktbrühe in den Tank verwendet. Der pH-Wert des Tankinhalts wird vor der Inokulierung auf 6 eingestellt. Nach der Inokulierung wird der Tankinhalt mit 111 U/min unter Verwendung eines Innenpropellers bewegt, der auf einer rostfreien Stahlwelle montiert ist, die von einer "LIGHTIN Mixer"-Vorrichtung (Modell ND1A) angetrieben wird. Die Belüftung erfolgt in einer Rate von 30,6 dnr(i,08 cu.ft.) Luft/min mit einem kreisförmigen, rostfreien Rohr mit vielen Öffnungen, das am Boden des Tanks angebracht ist. Der Tank wird bei einer Temperatur von 25 bis 30°C gehalten.

Nach 9stündigem Wachstum beträgt der Nikotingehalt des Tabakextraktbrühe-Inokulums 0,09 mg/ml. Dann wird ein Sprühzylinder verwendet für die Anwendung von P. putida fNRRL B-8061) ( 37,2 kg = 82 lbs) Inokulum auf 20,4 kg (45 lbs) bedampfte Burleystreifen, bis der Feuchtigkeitsgehalt des Tabaks 68 bis 7O?o erreicht. Der besprühte Tabak wird in einer Schichttiefe von etwa 15,3 cm (6 in.) während 5 Stunden bei 25⁰C in der Masse stehengelassen, wobei er mit einer Kunststofffolie bedeckt ist. Der Tabak wird auf einer Redrier-Trocken-

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vorrichtung mit endlosem Band bis auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 14,5% getrocknet. Bei dieser Behandlung wird der Alkaloidgehalt des Tabaks von 3,50% auf 1,65% erniedrigt. Die Wiegewerte zeigen, daß während dieses Verfahrens kein Verlust an Masse auftritt.

Beispiel 3

Eine Probe von Burleystreifenmischung wird durch einen Dampfzylinder geleitet, so daß der Feuchtigkeitsgehalt des Streifens auf 25% gebracht wird. P. putida (NRRL B-8O61)-Inokulum, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wird zu dem mit Dampf behandelten Tabak in einer Rate zugegeben, die gleich ist dem Doppelten des Tabaktrockengewichts. Zusätzliches Wasser wird ebenfalls auf den Tabak gesprüht, so daß der Feuchtigkeitsgehalt auf 75% eingestellt wird. Eine zweite Probe wird auf gleiche Weise wie die erste hergestellt, ausgenommen, daß die Dampfbehandlungsstufe nicht durchgeführt wird. Ausreichend Wasser wird mit dem Inokulum zu dieser Probe zugegeben, so daß der Feuchtigkeitsgehalt des Ansatzes auf 75% eingestellt wird. Nach der Inokulation wird der Tabak auf gleiche Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, in der Masse behandelt. Die Analysenergebnisse für die gesamten Alkaloide der Tabakprobe sind im folgenden aufgeführt.

Behandlungszeit % Gesamtalkaloide in % Gesamtalkaloide in der Masse(h) dem bedampften Tabak nicht bedampft

3,2 2,01

2,31 2,56

1,21

0(Beginn)	3,2
1	1,86
2	1,99
3	• 1,90
4	1,61
5	1,61
19	1,16

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z%

ISOI

Zur Erläuterung des optimalen Kulturwachstums wird P. putida (irRRL B-SO61) in Burley-Nikotininfusionsbrühe (250 ml/500 ml Kolben), wie in Beispiel 1 beschrieben, während 22 Stunden bei 3O⁰C unter Drehbewegung gezüchtet. Di"e Kultur wird zur Inokulation von 8 1 sterilisierter Burleyinischungextraktbrühe in einer Rate von 5% (Vol/Vol), die in einer 14 1 Fermentationsvorrichtung enthalten sind, verwendet, wo- · bei die Fermentationsvorrichtung an einen New Brunswick Scientific Microferm Fermentor (Modell Nr. MF-214) angeschlossen ist. Die Brühe wird mit 600 U/min bewegt und in einer Rate von 8000 ecm Luft/min bei 30⁰C belüftet. Die im folgenden aufgeführten Werte zeigen einen positiven Anstieg der Population und das Alkaloidabbaumuster während des Wachstums und die spezifischen Wachstumsbedingungen.

Probenbeschreibung	danach	Lebensfähig Zählung (Zellen/ml) (X 10°)	-	Alkaloid (mg/ml)	pH	Gelöster Sauerstoff (^'relativ)
vor der Inokulation	It		600	2,46	6,0	56
Inokulum	H	2	72	0,07	7,5	-
nach der Inokulation	Π		116	2,17	7,0	56
1 Std.	M		410	1,99	7,0	58
2 ^M	Il		560	1,84	7,0	55
3 "	It		230	1,83	7,1	52
4 «	Il	1	-	1,84	7,1	40
4,5"	Il		760	-	-	-
5 »	η	1	400	1,62	7,3	20
5,5"	3	000	1,27	7,4	22
6 »	3	-	0,72	7,4	8
6,5"		700	-	7,4	40
7 "	5	0,126	7,6	51

Beispiel 5

P. putida (NRRL B-6O6I) Inokulum wird gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt. Zur Erläuterung

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der Wirkung auf die maximale Kulturaktivität wird Burleytabak mit Inokulum aus einer 8 1 Kultur behandelt, wobei die Kultur ein Alter von O, 3,5, 5,75, 6 und 6,5 Stunden hat. Die Behandlung erfolgt, indem man 10 g geschnittenen Burleytabak mit 30 ml der Kultur gut vermischt und anschließend den Tabak in einer Glasschale ausbreitet, so daß er bei Zimmerbedingungen trocknen kann.

Zeitpunkt der Probenentnahme	Kulturwachstuin/Alkaloid- abbau	1 160	Stunden nach der Inokulierung:	43	- Alkaloidge halt (mg/ml)	PH	Tabakbehandlung in d.Burleymisch.
	Zellenkon.- zentration (x 10⁶)	0	52	1,84		nach d.Behandl, verbleib.Alkaloide
vor d.Inokulierung -	1	111	0,10	7,01
Inokulum	2	500		7,7
3	-	1,77
3,5	1 040	1,68	7,08	3,01
4	1 900	1,65	7,01
5		1,56	7,00
5,75	3 100	—	7,14
6	-	1,26	-	2,92
6,5	5 600	0,97	7,55
7	Wachstumsbedingunsen:	-	7,53
0,19	-	1,39
-	7,66	0,87
0,19	-	0,90
	7,85

Medium: 8 1 Burleyextraktbrühe (sterilisiert ) in einem 14 1 Fermentationsbehälter;

Bewegung: 600 U/min - angetriebener Schaft mit 2 Turbinenpropellern;

Belüftung: 8000 ecm Luft/min - (Luftversprühvorrichtung mit einer einzigen Düse);

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Temperatur: 3O⁰C;

Inokulumrate: 5% (Vol/Vol);

Antischaummittel: P-1200 (Dow);

pH-Kontrolle: (New Brunswick Scientific pH controller Modell Nr. PH 22) unter Verwendung 2n Natriumhydroxid und 2n Chlorwasserstoffsäure.

Beispiel 6

Eine Burleystreifenmischung wird hergestellt und in fünf Proben für die verschiedenen Behandlungen geteilt. Diese Behandlungen sind: (I) Casing, Kontrolle; (II) milder Nikotinabbau, kein Casing; (III) starker Nikotinabbau, kein Casing; (IV) milder Nikotinabbau mit Casing (Casingmaterial wird mit dem Inokulum zugegeben); und (V) milder Nikotinabbau, getrocknet, Casing und Redrying. Die Burleystreifenmischung wird, abhängig von der Behandlung, in Proben von 2,72 bis 7,62 kg (6 bis 16 Ib) abgewogen. Casing (Zucker usw.) wird in einer Rate von 47,4%, bezogen auf das Tabakgewicht, bei einem Feuchtigkeitsgehalt von 13% zugegeben.

P. putida (NRRL B-8O61) Inokulum wird,wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt. Die Inokulumrate bei allen Behandlungen entspricht dem Doppelten des trockenen Tabakgewichts. Je nach Bedarf wird Leitungswasser zu dem Inokulum oder zu dem Inokulum/Casing-Gemisch zugegeben, so daß man den gewünschten Feuchtigkeitsgehalt des Ansatzes (75,0%) erhält. Der Tabak wird mit Inokulum und/oder Casing durch Versprühen behandelt.

Nach der Inokulierung wird der Tabak 10,2 bis 13,3" cm (4 bis 6 in.) tief ausgebreitet und mit einer Polyäthylenfolie zur Verhinderung eines übermäßigen Feuchtigkeitsverlustes bedeckt. Der Tabak wird bei etwa 25,6⁰C (78°F) 3 bis 19 Stunden entsprechend dem folgenden Behandlungsschema in»der Masse behandelt.

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	~%	ndlunrren	X	2634	186
Zellen/ρ Trocken-^	Beha	XXX
gev.'ichx Tabak(;:1 O^) 1	XJ.	4,6	4	V	V
Ua.cn dem Besprühen			4
1 Std.	3,5				3,5
3 "	2,8	6,4		,1	2,8
5 "		17,5	3
19 "		19
Behandlungszeit in d. Kasse (Std.) 0	3		75		3
% Feuchtigkeit:		75	71
berechnet	75	71,7		75
tatsächlich	73,1		,6	73,1

Nach Beendigung der Behandlung besitzen die behandelten Burleytabake die folgenden Eigenschaften.

Nach der Behandlung

Gesamtalkaloide,% 2,47 2,13 0,76 1,98 1,68 reduz.Zucker 12,0 1,0 1,0 10,7 11,6 Tabak-pH-Wert - 7,0 8,3 6,2 7,0

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Claims

Patentansprüc he

1. Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak, dadurch gekennzeichnet, daß man Tabak mit Dampf während einer Zeit behandelt, die ausreicht, den Feuchtigkeitsgehalt des Tabaks auf mindestens 15 Gew.% einzustellen, den Tabak mit mindestens 1x10 Zellen an Mikroorganismen/g, bezogen auf das Trockengewicht des Tabaks, zum Abbau des Nikotins durch einen biochemischen Mechanismus, bei dem 3-Succinoyipyridin gebildet wird, inokuliert, den inokulierten Tabak so kontrolliert, daß

(a) ein Feuchtigkeitsgehalt von mindestens 50 Ge\i.%_t bezogen auf das Gesamtgewicht von Tabak und Wasser,

(b) eine Temperatur zwischen etv/a 20 und 45°C und

(c) ein Anfangs-p H -Viert zwischen etwa 5 und etwa 8 aufrechterhalten werden, die Mikroorganismen in Kontakt mit dem Tabak während einer Zeit hält, die ausreicht, daß die Mikroorganismen auf das in dem Tabak vorhandene Nikotin einwirken können, so daß der Nikotingehalt des Tabaks vermindert wird, und den Tabak zur Verminderung seines Feuchtigkeitsgehalts und zur Beendigung der Einwirkung der Mikroorganismen auf ihn trocknet.

2. Verfahren zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak, dadurch gekennzeichnet , daß man den Tabak mit Dampf während einer Zeit behandelt, die ausreicht, den Feuchtigkeitsgehalt des Tabaks auf mindestens 15 Gew.% zu bringen, den Tabak mit Mikroorganismen inokuliert, die das Nikotin durch biochemische Mechanismen, bei denen 3-Succinoylpyridin gebildet wird, abbauen, und ausreichend Wasser zugibt, so daß der Feuchtigkeitsgehalt des Tabaks mindestens 40 Gew.% beträgt, den Tabak während einer Zeit hält, die ausreicht, daß ein wesentlicher Teil des zugegebenen Wassers absorbiert wird, den Tabak mit einer zusätzlichen Menge an Mikroorganismen inokuliert, die v/irksam ist, das Nikotin durch biochemische Mechanismen, bei

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denen 3-Succinoylpyridin gebildet wird, abzubauen, wobei die zusätzliche Menge an Mikroorganismen ausreicht, so daß insgesamt mindestens 1 χ 10' Zellen an Mikroorganisrnen/g Tabak, bezogen auf das Trockengewicht, zugegeben werden, den inokulierten Tabak so reguliert, daß ' -

(a) ein Feuchtigkeitsgehalt von mindestens 50 Gew.Ja, bezogen auf das Gesamtgewicht an Tabak und Wasser,

(b) eine Temperatur zwischen etwa 20 und 45°C und

(c) ein Änfangs-pH-Wert zwischen etwa 5 und etwa 8 aufrechterhalten werden, die Mikroorganismen in Kontakt mit dem Tabak während einer Zeit hält, die ausreicht, daß die Mikroorganismen auf das in dem Tabak enthaltene Nikotin einwirken können, so daß der Nikotingehalt des Tabaks vermindert wird, und den Tabak zur Verminderung seines Feuchtigkeitsgehalts und zur Beendigung des Einflusses der Mikroorganismen auf ihn trocknet.

3* Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Anfangs-pH-Wert bei etwa 6 bis etwa 7,5 gehalten wird.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die Temperatur bei etwa 27 bis etwa 32⁰C gehalten wird.

5· Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß der Tabak mit den Mikroorganismen während einer Zeit von etwa 1 bis etwa 10 Stunden behandelt wird.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß der Feuchtigkeitsgehalt bei mindestens 65 Gew.% gehalten wird.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß Mikroorganismen

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aus der Gruppe Cellulomonas sp. und Pseudomonas putida verwendet werden.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet , daß der zu "behandelnde Tabak Burleytabak ist.

9. Rauchware, dadurch gekennzeichnet, daß sie Tabak enthält, der gemäß einem Verfahren nach mindestens
einem der Ansprüche 1 bis 8 behandelt wurde, wobei der behandelte Tabak keinem Casing-Verfahren unterworfen wurde.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Casingmaterial mit den Mikroorganismen vor der Inokulierung des Tabaks vermischt wird.

11. Rauchware, dadurch gekennzeichnet , daß sie Tabak enthält, der nach dem Verfahren von Anspruch 10 bearbeitet wurde.

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