CN105039205A - 尼古丁降解菌Pseudomonas sp.MHJY8及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尼古丁降解菌Pseudomonas？sp.MHJY8(保藏时间为2015年1月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC？NO：M？2015072)及其筛选方法和应用。本发明的尼古丁降解菌Pseudomonas？sp.MHJY8筛选方法，建立了尼古丁降解菌Pseudomonas？sp.MHJY8筛选的培养基配方，初筛培养基中特别添加了山药，并对微量元素的配制进行了创新。通过本发明技术体系筛选出的菌株Pseudomonas？sp.MHJY8的尼古丁降解活性较高，是良好的诱变育种野生出发菌株，另外，从土壤中筛选的Pseudomonas？sp.MHJY8更容易定殖土壤，有利于与烟草栽植生产相结合。该功能菌株进一步丰富了降解尼古丁野生菌的基因遗传资源，存在较大的开发应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8及其筛选方法和应用。
背景技术
尼古丁(Nicotine)，又称烟碱，是重要的生物碱之一，主要存在于茄科植物中，烟草的尼古丁含量占其总植物碱含量的95％以上，是影响烟草品质的关键性指标之一。通过主动或被动吸烟摄入人体内的尼古丁产生的危害广泛而深刻，不提倡甚至禁止吸烟已经成为全世界的共识。随着人们对健康关注度的不断提高和我国禁烟令适用范围的不断扩大，如何有效控制和降低烟叶中的尼古丁含量，是烟草种植农户和卷烟生产企业无法规避的重要问题，有关方面的研究必将再次成为一个热点。
大量的文献报道表明，实现对烟草中尼古丁含量的精确控制是极为困难的。结合烟草种植和卷烟生产工艺特点和现状，通过生物降解的方法仍然是最为可行的策略，国外很早就开始了运用微生物降解尼古丁的研究与实践，并取得了一定的成效。截至目前，通过微生物降解尼古丁的实践普遍存在的问题是：高效降解尼古丁的野生菌株遗传资源匮乏，株型相对单一；大部分菌种活性偏低，实际开发利用潜力不足；很多具有尼古丁降解能力菌株的生理特性不能很好的与烟草栽植现状和卷烟生产工艺相衔接；高活性的尼古丁降解专利菌株偏少，理论研究与实际应用衔接不够。
资料显示，尼古丁降解效率最高的菌株主要存在于节杆菌属Arthrobacter和假单胞菌属Pseudomonas中，隶属于其它分类单元的菌种资源活性普遍偏低，难以到达实用效果。本发明通过大量的实验实践，筛选出一株具有高效降解尼古丁能力的菌株，进一步丰富了降解尼古丁野生菌株遗传资源，存在较大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的之一是为解决尼古丁降解菌种较少，降解效率低等难题，提供一种尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8及其筛选方法和应用。
本发明提供一种尼古丁降解菌，所述尼古丁降解菌为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8，保藏时间为2015年1月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCCNO：M2015072。尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8序列如SEQIDNO：1所示。
本发明还提供一种上述尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8在降解尼古丁中的应用。
本发明再提供一种尼古丁降解菌的筛选方法，包括以下步骤，
尼古丁降解菌初筛：称取土壤样品5g，无菌操作加入装有45ml生理盐水和玻璃珠的250ml锥形瓶中，震荡30min，使样品中的菌体均匀分散，静置30s使其自然沉淀，取上层菌悬液进行10倍系列梯度稀释至10-6，取0.1ml稀释度为10-3～10-6的稀释液分别涂布于尼古丁降解菌初筛培养基，于30℃倒置培养48h；
尼古丁降解菌初筛菌株划线纯化：用接种环从上述尼古丁降解菌初筛培养基中挑取生长良好、特征典型的单菌落，在同一所述尼古丁降解菌初筛培养基上进行划线纯化，连续进行3次，将纯化菌株接种于LB斜面培养基上，4℃保藏。
进一步的，所述尼古丁降解菌初筛培养基为取酵母提取物2g，山药4g(市售新鲜山药，去皮，研碎)，K2HPO413g，KH2PO44g，(NH4)2SO40.2g，NaCl5g，琼脂粉20g，微量元素混合液10ml，蒸馏水定容至1000ml，自然pH，培养基121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃时，无菌操作条件下用0.22μm滤膜规格的针头过滤器加入尼古丁1g，混匀，即得。
进一步的，所述微量元素混合液为取MgSO4·7H2O1g，MnSO4·H2O0.4g，CuCl2·2H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.02g全部溶解于70ml0.1mol/LHCl溶液中，蔬菜汁(市售V8蔬菜汁)定容至100ml，即得。
进一步的，所述尼古丁降解菌液体培养基为不加琼脂的尼古丁降解菌初筛培养基。
进一步的，所述LB斜面培养基为取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，先用900ml蒸馏水溶解，然后用5mol/LNaOH溶液将pH调至7.0，再用蒸馏水定容至1000ml。
进一步的，所述尼古丁降解菌为上述的尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8。
进一步的，所述的尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8可用于降解尼古丁。
本发明的有益效果在于：本发明的尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8及其筛选方法和应用，建立了尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8筛选的培养基配方，初筛培养基中特别添加了山药，并对微量元素的配制进行了创新。因为山药含有丰富的天然活性多糖，V8蔬菜汁含有丰富的微量元素和生长因子，二者对提高菌体细胞活性和弱势菌株的生长具有很好的辅助作用，培养基的创新对其它菌株的筛选也具有良好的借鉴意义。通过本发明技术体系筛选出的菌株Pseudomonassp.MHJY8的尼古丁降解活性较高，是良好的诱变育种野生出发菌株，另外，从土壤中筛选的Pseudomonassp.MHJY8更容易定殖土壤，有利于与烟草栽植生产相结合。该功能菌株进一步丰富了降解尼古丁野生菌的基因遗传资源，存在较大的开发应用潜力。
附图说明
图1所示为本发明尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8的电镜照片。
图2所示为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8菌株生长与尼古丁降解率关系曲线图。
图3所示为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8基于16SrDNA基因序列的系统发育树。
图4所示为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8菌株16SrDNA序列扩增结果。
具体实施方式
下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
1)用于筛选的材料
土壤样品：采自漯河市烟草公司烟草种植基地。
尼古丁降解菌初筛培养基：酵母提取物2g，山药4g，K2HPO413g，KH2PO44g，(NH4)2SO40.2g，NaCl5g，琼脂粉20g，微量元素混合液10ml(将MgSO4·7H2O1g，MnSO4·H2O0.4g，CuCl2·2H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.02g全部溶解于70ml0.1mol/LHCl溶液中，V8蔬菜汁定容至100ml，即得微量元素混合液)，蒸馏水定容至1000ml，自然pH。培养基121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃时，无菌操作条件下用0.22μm滤膜规格的针头过滤器加入尼古丁1g，混匀，即得尼古丁降解菌初筛培养基。
尼古丁降解菌液体培养基：为不加琼脂的尼古丁降解菌初筛培养基。
LB斜面培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，先用900ml蒸馏水溶解，同时用5mol/LNaOH溶液将pH调至7.0，再用蒸馏水定容至1000ml。
2)尼古丁降解菌的筛选方法及结果
称取土壤样品5g，无菌操作加入装有45ml生理盐水和玻璃珠的250ml锥形瓶中，震荡30min，使样品中的菌体均匀分散，静置30s使其自然沉淀。取上层菌悬液进行10倍系列梯度稀释至10-6。分别取0.1ml稀释度为10-3～10-6的稀释液分别涂布于尼古丁降解菌初筛培养基，于30℃倒置培养48h。
初筛菌株的划线纯化：用接种环从上述尼古丁降解菌初筛培养基中挑取生长良好、特征典型的单菌落，在同一尼古丁降解菌初筛培养基上进一步划线纯化，连续进行3次。共获得8株纯化菌株，4℃保藏于LB斜面培养基并编号，分别为MHJY1、MHJY2、MHJY3、MHJY4、MHJY5、MHJY6、MHJY7、MHJY8。如图1所示，为本发明尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8的电镜照片。
3)初筛选纯化菌株尼古丁降解能力测定
分别将MHJY1、MHJY2、MHJY3、MHJY4、MHJY5、MHJY6、MHJY7、MHJY8纯化菌株接入尼古丁降解菌液体培养基(尼古丁质量浓度为1g/L)，在30℃、200r/min条件下摇床培养48h。同时以不接种菌株的尼古丁降解菌液体培养基作为空白对照。
发酵液于10000r/min离心10min，以0.05mol/LHCl溶液作参比，测定发酵液在259nm处的吸光值，发酵液中尼古丁的降解率计算公式为：
尼古丁降解率＝(初始尼古丁含量－发酵培养后尼古丁含量)/初始尼古丁含量×100％
8株菌的尼古丁降解能力见表1。比较可知，大部分纯化菌株尼古丁降解能力普遍较低，只有编号MHJY8的尼古丁降解活性最高，达到91.75％，具有较大应用潜力，故将其作为下一步研究菌种。
表1各纯化菌株的尼古丁降解能力
| 编号 | 初始尼古丁含量(g/L) | 发酵培养后尼古丁含量(g/L) | 尼古丁降解率(％) |
| MHJY1 | 1.08 | 0.67 | 37.96 |
| MHJY2 | 1.16 | 1.04 | 10.34 |
| MHJY3 | 0.98 | 0.71 | 27.55 |
| MHJY4 | 1.04 | 0.63 | 39.42 |
| MHJY5 | 0.99 | 0.53 | 46.46 |
| MHJY6 | 0.89 | 0.53 | 40.44 |
| MHJY7 | 1.11 | 0.62 | 44.14 |
| MHJY8 | 0.97 | 0.08 | 91.75 |
4)MHJY8菌株生长曲线与尼古丁降解率之间的关系
将MHJY8菌株接种于200ml含0.2％尼古丁的液体培养基中，在30℃、200r/min条件下摇床培养，摇培过程中每隔6h取样一次，于600nm波长下检测培养液的吸光度，同时检测培养液259nm波长下的尼古丁含量，菌株生长曲线与尼古丁降解率之间的关系，如图2所示。
5)MHJY8菌株的鉴定
A.MHJY8菌落特征
菌株MHJY8为直型杆菌，不呈螺旋状，具鞭毛，不产芽孢，在LB斜面培养基上菌落扁平，表面光滑，边缘整齐。
B.MHJY8菌株的生化指标测定
测定方法参考朱旭芬编著的《现代微生物学实验技术》和范丽主编的《微生物学基础与实验技术》，鉴定参考东秀珠等编著的《常见细菌系统鉴定手册》。
测定结果显示，革兰氏染色阴性，好氧，具运动性，甲基红试验、VP反应和柠檬酸试验均呈阴性，也不产硫化氢，接触酶阳性。初步鉴定为假单胞菌属Pseudomonassp.。
C.MHJY8菌株的16SrDNA鉴定
将MHJY8菌株接于LB液体培养基，37℃，200r/min摇床培养12h，获取菌液。采用TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkitVer.2.0试剂盒提取基因组DNA。
采用的16SrDNAPCR扩增引物为：
正向引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
反向引物，1492R：5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′
引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
PCR扩增体系(20μl)：10×ExTaqPCRbuffer2μl，dNTP(10mmol/mL)1.6μl，正向和反向引物(20μm/mL)各0.8μl，DNA模板1μl，0.5UExTaqDNA聚合酶0.2μl，ddH2O13.6μl。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，50℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环30次；72℃最终延伸10min。扩增结果如图4所示，扩增片段长度为1.5kb左右。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后切胶，采用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionkitVer.3.0试剂盒进行胶回收，回收产物与TaKaRapMDTM18-TVecter载体连接，将重组质粒转化于DH5α大肠杆菌感受态细胞，37℃过夜培养，经蓝白斑筛选，阳性克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8序列如SEQIDNO：1所示。
图3为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8基于16SrDNA基因序列的系统发育树，如图3所示，采用DNAMAN软件对菌株16SrRNA序列进行整理，通过NCBI的blast在线分析功能进行同源性搜索，并用MEGA5.05软件中的ClustalX程序进行多序列比对，然后用Neighbor-Joining方法选择Bootstrap为1000个重复构建系统发育进化树。
本发明的尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8及其筛选方法和应用，建立了尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8筛选的培养基配方，初筛培养基中特别添加了山药，并对微量元素的配制进行了创新。因为山药含有丰富的天然活性多糖，V8蔬菜汁含有丰富的微量元素和生长因子，二者对提高菌体细胞活性和弱势菌株的生长具有很好的辅助作用，培养基的创新对其它菌株的筛选也具有良好的借鉴意义。通过本发明技术体系筛选出的菌株Pseudomonassp.MHJY8的尼古丁降解活性较高，是良好的诱变育种野生出发菌株，另外，从土壤中筛选的Pseudomonassp.MHJY8更容易定殖土壤，有利于与烟草栽植生产相结合。该功能菌株进一步丰富了降解尼古丁野生菌的基因遗传资源，存在较大的开发应用潜力。
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
Claims (8)
1.一种尼古丁降解菌，其特征在于，所述尼古丁降解菌为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8，保藏时间为2015年1月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCCNO：M2015072。
2.一种尼古丁降解菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤，
尼古丁降解菌初筛：称取土壤样品5g，无菌操作加入装有45ml生理盐水和玻璃珠的250ml锥形瓶中，震荡30min，使样品中的菌体均匀分散，静置30s使其自然沉淀，取上层菌悬液进行10倍系列梯度稀释至10-6，取0.1ml稀释度为10-3～10-6的稀释液分别涂布于尼古丁降解菌初筛培养基，于30℃倒置培养48h；
尼古丁降解菌初筛菌株划线纯化：用接种环从所述尼古丁降解菌初筛培养基中挑取单菌落，在同一所述尼古丁降解菌初筛培养基上进行划线纯化，连续进行3次，将纯化菌株接种于LB斜面培养基上，4℃保藏。
3.如权利要求2所述的尼古丁降解菌的筛选方法，其特征在于，所述尼古丁降解菌初筛培养基为取酵母提取物2g，山药4g，K2HPO413g，KH2PO44g，(NH4)2SO40.2g，NaCl5g，琼脂粉20g，微量元素混合液10ml，蒸馏水定容至1000ml，培养基121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃时，无菌操作条件下用0.22μm滤膜规格的针头过滤器加入尼古丁1g，混匀，即得。
4.如权利要求3所述的尼古丁降解菌的筛选方法，其特征在于，所述微量元素混合液为取MgSO4·7H2O1g，MnSO4·H2O0.4g，CuCl2·2H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.02g全部溶解于70ml0.1mol/LHCl溶液中，定容至100ml，即得。
5.如权利要求2-4任一项所述的尼古丁降解菌的筛选方法，其特征在于，所述尼古丁降解菌液体培养基为不加琼脂的尼古丁降解菌初筛培养基。
6.如权利要求2所述的尼古丁降解菌的筛选方法，其特征在于，所述LB斜面培养基为取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，先用900ml蒸馏水溶解，然后用5mol/LNaOH溶液将pH调至7.0，再用蒸馏水定容至1000ml。
7.如权利要求2所述的尼古丁降解菌的筛选方法，其特征在于，所述尼古丁降解菌包括权利要求1所述的尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8。
8.一种权利要求1所述的尼古丁降解菌的应用，其特征在于，所述的尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8用于降解尼古丁。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4011141A (en) * | 1975-11-17 | 1977-03-08 | Brown & Williamson Tobacco Corporation | Process for maximizing the growth and nicotine degrading activity of microorganisms |
| CN101016528A (zh) * | 2007-01-22 | 2007-08-15 | 山东大学 | 一株可代谢尼古丁的恶臭假单胞菌及其应用 |
| CN102037848A (zh) * | 2009-10-16 | 2011-05-04 | 虞泓 | 添加山药促进培养拟黑虫草菌丝体有效药用成分的方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4011141A (en) * | 1975-11-17 | 1977-03-08 | Brown & Williamson Tobacco Corporation | Process for maximizing the growth and nicotine degrading activity of microorganisms |
| CN101016528A (zh) * | 2007-01-22 | 2007-08-15 | 山东大学 | 一株可代谢尼古丁的恶臭假单胞菌及其应用 |
| CN102037848A (zh) * | 2009-10-16 | 2011-05-04 | 虞泓 | 添加山药促进培养拟黑虫草菌丝体有效药用成分的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| S.N. WANG ET AL.: "Biodegradation and detoxification of nicotine in tobacco solid waste by a Pseudomonas sp.", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 * |
| 刘杨惠等: "假单胞菌代谢尼古丁研究进展", 《广州化工》 * |
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