DD147251A5

DD147251A5 - Verfahren zur herstellung eines stoffs mit bakteriostatischer aktivitaet

Info

Publication number: DD147251A5
Application number: DD79216588A
Authority: DD
Inventors: Francois Maillard; David Shepherd
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1978-11-01
Filing date: 1979-10-31
Publication date: 1981-03-25
Also published as: GR73004B; FI65448C; IL58451A0; JPH0336517B2; GB2034687A; BE879360A; FI65448B; DE2941310C2; FR2440403A1; IT7950674A0; US4419449A; AU5226479A; AT365234B; JPS56109589A; CA1123355A; MX5937E; SE7908516L; DE2941310A1; IL58451A; DK149781B

Abstract

Vorgeschlagen wird ein Verfahren zur Herstellung eines Stoffs mit bakteriostatischer Aktivitaet. Hierzu wird ein Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa in einem waeszrigen Naehrmedium unter aeroben Bedingungen und unter Ruehren kultiviert, worauf die Biomasse und/oder das Kulturmedium gewonnen werden.

Description

Verfahren zur Herstellung eines Stoffes mit balcteriostatischer Aktivität

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Stoffs mit bakteriostatischer Aktivität,

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Hehrere europäische schwefelhaltige Thermalquellen enthalten Mikroorganismen, die, wenn sie sich' an einer schwach strömenden Stelle ansammeln, einen weißen bis hellgrauen gelatinösen Stoff bilden, welcher den !Tarnen "Baregin" erhalten hat. Dieser Harne kommt von den Thermalquellen von Bareges, einem französischen Thermalbad in den Pyrenäen, Das Baregin ktinn definiert werden als Ansammlung verschiedener Bakterien, die Schwefelwasserstoff binden, die an erhöhte Teinpers.turen gewöhnt sind und von denen einige dazu fähig sind, einen , Schleim abzusondern, in welchem das Ganze eingehüllt ist» Im Baregin werden sowohl tote als auch lebende Elemente festgestellt.

Die therapeutischen Eigenschaften von Baregin sind seit langer Zeit bekannt. Sie wurden sehr früh zur. Behandlung von rheumatischen Zuständen durch Massage wie auch zur Heilung gewisser Hauterkrankungen.ausgenutzt. Baregin hat auch Eingang in die Zusammensetzung kosmetischer Produkte für die Hautpflege gefunden.

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Seine Erzeugung und Gewinnung sind Gegenstand von Patenten, die vor allem auf der Kultivierung unter natürlichen Be- . dingungen durch verschiedene Berieselungsverfahren mit Quellwasser .beruhen« Ein ähnliches Verfahren wird gegenwärtig· von den Thermes Hationaux d'Aix-les-Bains in Prankreich verwendet. Die Anlage besteht aus einer vertikalen Betonmauer, die an ihrer Oberseite mit einer Rinne ausgerüstet ist. Das Thermalwasser,. das über eine Leitung von der benachbarten Quelle herangeführt wird, ergießt sich in die Rinne und rieselt über die Oberfläche der Mauer« An den Rauhstellen des Betons bleiben Bareginflocken mit den Abmessungen in der Größenordnung eines Zentimeters hängen*

Ausgehend von diesen haftenden Flocken, wächst ein gelatinöser Bareginfilm, der durch Abkratzen der Hauer mit einer harten Bürste periodisch geerntet wird. Die Temperatur des Wassers und des Raums, in welchem sich diese Mauer befindet, liegt in der Nachbarschaft der Temperatur des austretenden Quellwassers, d. h. also bei etwa 43 bis 47 °C_e Die Produktionsausbeute ist äußerst schwach« Sie liegt bei etwa 5 g

Trockengewicht Baregin je m und je Monat« Darüber hinaus unterliegt sie dem Einfluß verschiedener Paktoren, welche von meteorologischen Bedingungen .abhängen«

Das Baregin war Gegenstand mikrobiologischer und biochemischer Studien. Durch diese wurde zwar der Stoffwechsel von .HpS und von schwefelhaltigen Verbindungen aufgeklärt, sie haben jedoch keine Klärung des Ursprungs der therapeutischen-Eigenschaften des Baregins gebracht. Unter den zahlreichen, in Baregin identifizierten Mikroorganismen wird der Beggiatoa häufig genannt« Jedoch war .bei den seltenen durch Publikationen bekanntgewordenen Isolierungen von 'Beggiatoa niemals von

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Baregin ausgegangen worden, sondern stets von Schlamm und Abwässern. Darüber hinaus haben sich diese Isoliei-ungen als lang und schwierig erwiesen« Außerdem hat die Kultivierung der isolierten Mikroorganismen nur sehr schwache Ausbeuten geliefert, unter anderem ihrer schwachen Struktur und ihres sehr hohen Wassergehalts wegen. Als charakteristisch kann ein publizierter Wert angesehen werden, wonach in 48 Stunden bei 28 C ohne Rühren in 1 1 Kulturmedium, das 2 g Hefeextrakt, 0,1 g Natriumacetat und aktive Katalase enthält, 1,2 g Pri'schgewicht an Mikroorganismen produziert v/erden.

Ziel der Erfindung

Durch die vorliegende Erfindung wird nun im industriellen Maßstab eine rentable Erzeugung eines Stoffs ermöglicht, der eine ähnliche bakteriostatische Aktivität wie Baregin besitzt,

Darlegung de3 Wesens der^Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa in einem wäßrigen ITährmedium unter aeroben Bedingungen und unter Rühren kultiviert und die Biomasse und/oder das Kulturmedium gewinnt.

Es wurde in der Tat festgestellt, daß eine Biomasse eines Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa und sogar das Medium, in '· welchem sie erzeugt worden ist, eine bakteriostatische Aktivität besitzt. Es wurde außerdem festgestellt, daß die schwa- ' ehe Natur des Mikroorganismus kein Hindernis bei der intensiven Kultivierung in einem heftig gerührten Medium darstellt und daß er sich sogar vermehrt, wenn die Fäden, die er bildet,

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in eine Anzahl von Bruchstücken zerbrochen werden· Es ergibt sich sogar ein Vorteil, wenn man ein Inokulum eines Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa vor der Beimpfung des Kulturmediums homogenisiert«

Es ist Absicht, wenn hier und in der folgenden Beschreibung der Ausdruck "Mikroorganismus' vom Typ Beggiatoa" und nicht der Ausdruck "Mikroorganismus der Gattung Beggiatoa" verwendet wird·'Die Gattung Beggiatoa gehört zur Klasse der "gliding" bacteria", welche den Myxobakterien der Familie der Beggiatoaceen zugeordnet werden (siehe Bergey's Manual of Determinaktive Bacteriology, Eighth Edition, WaverIy Press, Baltimore, USA, 1974» Seiten 112-114)» V/ie man diesem Werk entnehmen kann, welches auf diesem Gebiet Ansehen genießt, ist die Klassifizierung der Mikroorganismen dieser Gattung wegen der geringen sicheren verfügbaren Informationen etwas mit Vorsicht zu genießen«, Es erscheint deshalb nicht angeraten, sich auf einen so präzisen wissenschaftlichen Ausdruck wie "Gattung" zu beschränken, wenn man die Unsicherheit der Klassifizierung der fraglichen Mikroorganismen kennt«, Der Ausdruck "Mikroorganismen vom Typ Beggiatoa" bezieht sich also hier auf fadenbildende Bakterien, welche für schwefelhaltige Sole und V/ässer charakteristisch sind und deren ungefärbte Fäden - da sie aufeinander gleiten - beweglich und aus Zellenketten gebildet sind, wie dies beispielsweise bei den Bakterien, die in die Gattung Beggiatoa klassifiziert werden, der Pail ist»

Vorzugsweise wird, der Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa durch Isolation von Baregin gewonnen· Es .v;urde festgestellt, daß eine solche Isolierung auf eine spezielle Ai*t möglich ist und daß die dabei erhältlichen Stämme.kultivierbar sind und eine

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präzise feststellbare bakteriostatische Aktivität besitzen· Es wurde schließlich auch festgestellt, daß das Problem ihrer Konservierung in zufriedenstellender Weise gelöst.werden kann.

Zur Isolierung eines Stamms kann man so~vorgehen, daß man eine Probe von Baregin auf ein gelosehaltiges iTährmedium aufbringt, 5 bis 36 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 50 ⁰C inkubiert, eine Zone, wo die Fäden eines Llikroorganismus vom Typ Beggiatoa frei von Verunreinigungen sind, herausschneidet, diese Zone auf ein mit dem ersten identischen Gelose enthaltendes Nährmedium aufbringt und die Operationen der Inkubation, des Herausscheidens und Wiedereinsetzens zweibis dreimal wiederholt«

Es wurden 8 Stämme isoliert, die am 12. Juli 19178 in der National Collection of Industrieal Bacteria Aberdeen Schottland niedergelegt wurden und welche die Hummern NCIB 114 18 bis 114 25 erhalten haben« Es ist also möglich, das Verfahren beispielsweise mit mindestens einem dieser 8 Stämme durchzuführen« . ·

Vorzugsweise besteht das für die Isolierung verwendete Gelose enthaltende Uährinedium aus 1 bis 4 g Hefeextrakt und 10 bis 20 g Agar je 1 Wasser.

Gleichfalls enthält das für die Kultivierung bevorzugte wäßrige Nährme'dium 1 bis 4 g Hefeextrakt, 0,1 bis 0,3 g Kalziumchlorid und 0,2 bis 1 g Natrium- oder·Amraoniumacetat je 1 Wasser. Um die Kultur zu schützen, kann dem Medium beispielsweise Katalase in einer Menge von 5 bis 20 Internationalen Einheiten (IE) je ml zugesetzt werden« Der Mikroorganismus kann bei einer Temperatur von 20 biß '30 ⁰C während 5 bis

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36. Stunden bei einem pH-Y/ert von 6 bis 8 kultiviert werden. Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung bei einer Temperatur von 30 1 pH-Wert,

von 30 bis 40 C während 8 bis 10 Stunden beim neutralen

Der Stoff mit bakteriostatischer Aktivität, der durch das erfinduiigsgemäße Verfahren er aalt en worden ist, kann im Rohzustand beispielsweise für Hautmassagen oder als Bestandteil von kosmetischen Produkten für die Haut verwendet 'wordene Die Biomasse kann auch in trockener Form konserviert werden. Sie wird vorzugsweise wegen ihrer schwachen Ilatur und ihres geringen Feststoffgehalts durch Lyophilisation getrocknet.

Die folgenden Beispiele, welche der Erläuterung dienen, gestatten ein besseres Verständnis der Nat irr und der Bedeutung der vorliegenden Erfindung» Der Harne "Beggiatoa" wird dabei systematisch verwendet und soll im Sinne des Ausdrucks "illikroorganismus vorn Typ Beggiatoa" verstanden werden.

b ei s ρ i el

Isolierung von Stämmen

Eine frische Bareginflocke von den Thermes ITationaux d'Aix-les-Bains wird in die Mitte einer Petri-Schale gebracht, die 20 ml Gelose enthaltendes Medium enthält, das nach folgendem Rezept hergestellt worden ist:

Hefeextrakt (Difco) . 2g

Agojr (Bacto-Difco) 15 g

filtriertes Thermalwasser aus Aix ; " 100 ml destilliertes Wasser ^v 900 ml.

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Die Schale wird dann 30 Stunden lang in einen Wärmeschrank mit 3Q C eingebracht. Eine Untersuchung mit einem schwach vergrößernden Mikroskop läßt die Anwesenheit von spiralenförraigen Strukturen, die für Beggiatoa charakteristisch sind, erkennen und zeigt eine Beweglichkeit der Mikroorganismen aufgrund deren Gleitfähigkeit, Einige sind sogar mit dem bloßen Äuge sichtbar. Die mikroskopische Untersuchung zeigt außerdem Zonen, in denen die Beggiatoa-Päden frei von Verunreinigungen erscheinen. Eine dieser Zonen wird mit einem sterilen Skalpell herausgeschnitten und auf eine frische Agarplatte der gleichen Zusammensetzung wie die erste gelegt, wobei darauf geachtet wird, die Beggiatoa-Fäden aufweisende Oberfläche gegen die frische Oberfläche der neuen Agarplatte zu legen. Nun wird erneut 24 Stunden bei 30 C inkubiert. Das Herausschneiden, Umsetzen und Inkubieren wird noch zweimal wiederholt. Auf diese Weise wird eine reine Beggiatoa-Kultur erhalten. . -

Be i s p.i e_l „ Jj?1

Es 'Werden in der in Beispiel 1 beschriebenen V/eise 10 Stämme isoliert. Sie unterscheiden sich voneinander durch den Durch-' messer ihrer Fäden, ihrer Schnelligkeit im Gleiten und der Form ihrer Kolonien auf Agar. Sie werden mit Erfolg auf drei verschiedenen V/egen während einer kurzen, einer mittleren oder einer'langen Periode konserviert«

2 «1 .·) Kur ze Periode:.

Die Platte wird im Kühlschrank bei 4 '⁰C konserviert, wobei diePetrischale sorgfältig wasserdicht verschlossen wird. Der Stamm wird alle 10 lage überführt, da der Agar eine

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Tendenz zum Eintrocknen zeigt« .

2,2.) Mittlere Periode: .

Es wird ein Iialbflüssiges Medium mit der folgenden Zusammen» setaung hergestellt:

Hefeextrakt 2g

CaCl₂ . 0,1 g .

Natriumacetat 0,5 g

Agar . 2g

filtriertes Therrnalwasser 1000 ml·

Nach Sterilisation des Mediums wird von Pilzen stammende Kataläse in einer Menge von 10 ΙΕ/ml zugegeben« Die Katalaselösung wird vorher durch kalte Filtration durch ein Milipore-Filter mit mikroskopischen Poren von 0,22 p. sterilisiert*

Ein kleiner Würfel des Beggiatoa enthaltenden Agars wird in ein Reagenzglas eingebracht, das 10 ml Medium enthalte Dann wird bei 30 C inkubiert_β Beggiatoa entwickelt sich im oberen Teil des Reagenzglases» Man kann das Reagenzglas 3 Wochen bei 30 C stehenlassen« Hierauf wird di< von 0,1 ml je Reagenzglas überführt.

30 C stehenlassen« Hierauf wird die Kultur in einer Menge

Es wird eine 24~Stunden~Kultur in einem gerührten Medium in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise hergestellt« Hierauf wird sie zentrifugiert« Die Ausfällung wird mit einer sterilen Ringer-Losung gewaschen» Dann wird die Ausfällung gefroren und lyophilisiert» Sie wird, mehrere Monate im Kühlschrank in einem gut verschlossenen Behälter aufbewahrt» Bei

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Rehydratation sind die Fadenbruchstücke dazu fähig, sich zu entwickeln«

Beispiel ßj

Kultivierung von Stämmen3 β 1 e)

Ein kleiner Agarwürfel mit einer Kantenlänge von 5 mm wird aus einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Platte herausgeschnitten. Hierauf wird er in einen 500 ml fassenden Kolben eingebracht, der 100 ml des folgenden Mediums enthält:

Hefeextrakt 4 g

Kalziumchlorid 0,2 g

Anmioniumacetat 1 g

filtriertes Thermalwasser 1000 ml.

Dieses" Medium besitzt einen pH-V.'ert von 6.6» Der Kolben wird auf einen Orbitalschüttler befestigt, der mit 150 U/min bei einem Kreisradius von 1,25 cm läuft. Der Kolben wird dort 16 Stunden bei 30 ⁰C belassen· Dann wird die erhaltene Kultur mit Hilfe eines Mischers vom Typ Sorvall-Omnimixer 15 bis 30. see unter sterilen Bedingungen homogenisiert. Die erhaltene Kultur stellt das Inokulum dar.

3«2») Kultivierung:

5 ml des obigen Inokulums werden* in einen 500 ml fassenden . Kolben eingebracht, der 100 ml des -gleichen Mediums enthält, .· wie es für die Herstellung des Inokulums verwendet worden ist₄ Der Kolben wird 24 Stunden bei 30 0 auf dem Orbitalschüttler· inkubiert* Es werden 0,8 g Trockenmasse von Beggiatoa je 1 Kultur erhalten« Durch Wiederholung dieser üpero/tion mit

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verschiedenen Stämmen und unter Veränderung der Bedingungen innerhalb der geeigneten Grenzen werden Ausbeuten zwischen ungefähr 0,5 und 2 g trockenem Beggiatoa je 1 Kultur erhalten, . ' '

3.3.) Kj3ηtrp.lle desJ^achstumgJL

Die klassische Methode der nephelometrie, welche auf Bakterienkulturen anwendbar ist, ist bei Beggio,toa wegen seines Wachstums in Form von !'locken nicht anwendbar. Es wird doshalb eine an den betreffenden Pail angepaßte Methode verwendet. Es werden alle 2 Stunden Kultiirproben entnommen "und im Mischer vom Typ Sorball-Omnimixer homogenisiert« Ihre optische Dichte wird bei 600 nm auf einem Spektralfotometer abgelesen* Die homogenisierte Probe bildet nur sehr langsam ein Sediment und gestattet eine brauchbare Ablesung. Auf diese Weise wird ein Anhaltepunkt auf das Wachstum in direkter Abhängigkeit mit der Anzahl der Zellen erhalten.

3*4«) B°^s^j£EiIHiS_A£^G Trockengewichts:

Die klassische Trocknung im Ofen ergibt bei Beggiatoa keine reproduzierbaren Resultate» Der Grund hierfür ist vermutlich der sehr hohe Wassergehalt* Aus diesem Grunde werden zur Erzielung reproduzierbarer Resultate nicht weniger als 400 ml Kultur durch Lyophilisation getrocknet«

3«5 ©) Bestiinmung der _ijbakt_-ei^iq3tatisclien_>jUcl;i - ·

Die klassische Methode, der Bestimmung der bakteriostatischen Aktivität des Public Health Laboratory Service Committee, welche in British Med. J₆ 408 (19-65) beschrieben-ist_s ergibt in diesem speziellen Pail keine zufriedenstellenden Resultates, aufgrund der Tatsache, daß dieser Test in einem Reagenzglas

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ausgeführt wird». Beggiatoa ist 'in der At äußerst aerob, weshalb die Sauerstoffkonzentration in einem Reagenzglas unzufriedenstellend ist. Die Methode wird deshalb angepaßt, indem in Schüttelkolben gearbeitet wird, um den Sauerstoffübergang zu verstärken·

Es werden 3 Kolben mit einem Passungsvermögen von 50 ml vorbereitet, die jeweils 18 ml Nährbouillon (Nutrient Broth Difco) enthält. Die Kolben v/erden in der ersten und in der zweiten Serie jeweils.mit 0,4 ml einer 24-Stunden-Kultur eines pathogenen Stamm3 inokuliert· Es v/erden die drei pathogenen Stämme Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Eschericia coli ATCC 11755 und Staphylococcus aureus ATCC 12600 verwendet·

Es werden Proben des bakterio3tatischen Produkts hergestellt, indem eine Kultur zentrifugiert wird, die gemäß Beispiel 3» . Ziffer 2, jedoch nur in. 8 Stunden erhalten worden ist. Die er-' haltene Biomasse wird zentrifugiert und wieder in einem Volumen physiologischer Lösung suspendiert, das gleich dem Volumen des bei dor Zentrifugierung verbleibenden "Überstands ist. Die die Biomasse enthaltende Lösung und der Überstand werden jeweils in Proben von 2 ml unterteilt« .

Den Kolben der ersten Reihe werden 2 ml physiologische Lösung, welche die homogenisierte Biomasse enthält, zugesetzte Den Kolben der zweiten Reihe werden nur 2 ml der physiologischen Lösung zugegeben· Den Kolben der dritten Reihe, welche nicht mit einem Pathogen inokuliert worden sind, werden 2 ml der physiologischen Lösung, welche die homogenisierte Biomasse enthält, zugesetzt.

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Die Kolben werden bei 37 G auf einem Orbitalschüttler inkubiert· lach 16 Stunden wird ihre optische Dichte bei 600 nm gemessen« Die optischen Dichtemessungen der Kolben entsprechend den Reihen 1, 2 und 3 liefern entsprechende Parameter A, .B und 0, Die Differenz A-G, abgezogen von B und dann dividiert durch B und multipliziert mit 100 ergibt die balcteriostatische Aktivität der Biomasse in % Inhibierung»

Auf die gleiche Weise wird die bakteriostatis'che Aktivität des Überstands bestimmt, indem den Kolben der ersten und der dritten Reihe 2 ml Überstand anstelle von 2 ml physiologischer Lösung, welche die homogenisierte Biomasse enthält, zugegeben v/erden. .

Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt·

Pathogen Aktivität der Aktivität des

Biomasse Überstands

. (% Inhibierung.) {%

P₆ aeruginosa 70 41

S. aureus 100 45

Ξ, coli 70 - 11

Beispiel 4«.

Vergleich. ·

Zum Vergleich wird in der in Beispiel 3j Ziffer 5» beschriebenen V/eise die bakteriostatisciie Aktivität von natürlichem Baregin bestimmt, Nach einer 16'Stunden dauernden

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Inkubation wird eine prozentuale Inh.ibie.rung von 100 %_t 83 % und 96 % gegenüber P, aeruginosa, S, aureus und E, coli gefunden. Mit anderen Worten heißt das, die bakteriostatische Aktivität der gemäß der Erfindung 'hergestellten Biomasse ist nahezu genauso stark wie diejenige von Baregin, Dies . stellt ein bemerkenswertes Resultat dar, wenn man bedenkt, daß die vorliegende Biomasse in einer guten Ausbeute im industriellen Maßstab hergestellt werden kann, während das Baregin nur langsam in sehr geringen Mengen erhältlich ist. Die Aktivität des gemäß der Erfindung erhaltenen Überstands ist zwar geringer, ist aber trotzdem von Interesse,

Beispiel ^j?.;.

,Stämme, IjGIB

Es wurden 8 Stämme in der V/eise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, isoliert und am 12. Juli 1978 in der National Collection of Industrial Bacteria (ITCIB) in Aberdeen, Schottland deponierte Sie haben, wie bereits erwähnt, die Nummern NCIB 114 18 bis 114 25 erhalten. Diese Stämme können aufgrund ihrer Y/achs turns art, ihrer Morphologie bei Kultivierung auf Agar und in flüssigem Medium wie auch ihrer bakt erio st a/bische-n Aktivität charakterisiert werden.

In der nachfolgenden Tabelle ist die optische Dichte der Kulturen angegeben, die nach 5» 10 und 24 'Stunden'bei Kultivierung jedes dieser Stämme, in der .in Beispiel 3» Ziffer 2 beschriebenen Weise erhalten .worden ist. Weiterhin zeigt die Tabelle die bakteriostatir/che Aktivität der nach Sstündiger Kultivierung erhaltenen Biomasse gegenüber den pathogenen Stämmen P* aeruginosa,. 0, aureus und S, coli. Die Morphologien sind gesondert für jeden Stamm anschließend p/n/ ;'("·.·>· eben,- .

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MORPHOLOGIEN

3JCIB

Auf Agars

Bildet große isolierte Kolonien von 8 bis 15 min Durchmesser mit einem weißen Zentrum und durchscheinenden Rändern· Untersuchung im Mikroskop (x 100): Die Kolonie besteht aus gut sichtbaren in dichter Weise gerollten Spiralen* Iii Jvultur f lüssig

homogene Kultur» Untersuchung im Mikroskop (x 400); Lange Fäden von 80 χ 1,8/α, die manchmal von gut ausgeprägten kurzen Baaellen gebildet werden« Keine Aggregation» Sehr wenig bleibende Iviorphosen»

Auf Agar:

Bildet isolierte weiße Kolonien von 4 bis 8 mm Durchmesser mit diffusen-Rändern· Dichte Strähnen erstrecken sich sternförmig radial bis sum Zentrum der Kolonien, erreichen aber nicht die Ränder_β Untersuchung im Mikroskop (x 100): Die Ränder der Kolonie werden durch Paden in dichten Spiralen gebildet.

homogene Kultur· Untersuchung im Mikroskop (x 400); Isolierte sehr kurze Pädon von 3?6 χ 0,9 /u, die durch sehr ausgeprägte Verengungen unterteilt sind· Keine bleibenden Morphosen» Bildet Aggregate«

U)Q -16- 15.2,1930

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ICIB 114 20

Auf Agar: . .

Bildet isolierte flache und opake Kolonien von 2 bis 5'mm Durchmesser mit gefransten Rändern»- Untersuchung im Mikroskop (x 100): Kolonien bestehen aus Padenbruchstücken, welche schlecht entwickelte Spiralen bilden«

In KuIturf liisslgkej.t^

homogene Kultur· Untersuchung im Mikroskop (x 400): Keine Fäden« Lange Bazillen von 9 x 1,4/Uj welche einige bleibende Morphosen enthalten»

Bildet gesonderte Kolonien von 4 bis 7 mm Durchmesser mit diffusen Rändern, sehr ähnlich wie beim Stamm UCIB 114 19, jedoch weißer· Die Ränder der Kolonien sind durchscheinend. Untersuchung im Mikroskop (x 100): Keine Spiralen sichtbar.

homogene Kultur» Untersuchung .im Mikroskop (x 400): Bild ähnlich wie beim Stamm NCIB 1.14 20* Keine Fäden« Lange Bazillen von 18 χ 1,4/u, die einige bleibende Morphosen enthalten» Keine Aggregate« .

Bildet niemals isolierte Kolonien. Bedeckt die gesamte Oberfläche mit mycoiden durchscheinenden Strähnen« Unter suchung' im Mikroskop (x 100): Strähnen .sind aus mehreren Fäden gebildet«

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homogene Kultur, welche von der sechsten Stunde ab einige kleine Aggregate zeigt« Untersuchung im Mikroskop (x 400); Lange- gesonderte Fäden von 90 χ 1,4 bis 1,8/u. Fäden in langen Einheiten durch ausgeprägte Einsclinürungen unter teilt» Sehr wenig bleibende Morphosen*

Auf Agar I_-

Ähnlich dem Stamm NGIB 114 22» Keine isolierten Kolonien* Dichte mycoide und besser sichtbare Strähnen*- Untersuchung im Mikroskop (x 100): Strähnen besser ausgeprägt, da sie aus einer größeren Zahl, von Fäden bestehen©

In Kulturflüssigkeit:

Bildet große Flocken (Aggregate)« Untersuchung im Mikroskop (x 400): Fäden viel kürzer als beim Stamm IJCIB 114 22 Lind durch sehr ausgeprägte Einschnürungen in Segmente unterteilte Länge 9 bis 10 χ 1,8/u. Bleibende Morphosen erscheinen sehr schnell, bereits nach 5 Stunden·

!9,ELJUiL²J; · ^:

Auf'

Ähnlich dem Stamm HCIB 114 23« Keine isolierten Kolonien* Mycoide Strähnen* Untersuchung im Mikroskop (x 100): Strähnen werden aus einer großen Anzahl von Fäden gebildet*

Bildet große Flocken (Aggregate). Untersuchung im Mikroskop' (x 400): Lange Fäden von 140 χ 1,8^.1, die lange Bündel bildens Keine sichtbaren Einschnürungen« Verzögert die Bildung von bleibenden Morphosen nach 10 Stunden-«

^Pö -18- 15.2.1980

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UOIB 114 25 ·

Auf. Agar;_

Bildet opake isolierte Kolonien von 2 bis 6 ram Durchmesser. Untersuchung im Mikroskop (x 100): Kolonien bestehen aus Päden, die aus isolierten Zellen gebildet sind und dichte Spiralen bilden«

homogene Kultur₀ Untersuchung im Mikroskop (x 400): Homogene kurze Fäden von 4 x 1,4/λ» Wenig bleibende Morphosen«,

Claims

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1. Verfahren zur Herstellung eines Stoffs mit bakteriosta- tischer Aktivität, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa in einem wäßrigen Nährmedium miter aeroben Bedingungen und unter Rühren kultiviert und die Biomasse und/oder das Kulturmedium gewinnt.

2« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man den Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa durch Isolation aus Baregin gewinnt·

3β Verfahren nach "Punkt 2„ gekennzeichnet, dadurch, daß man zur Isolation eines Stamms eine Probe von Baregin auf ein gelosehaltiges Nährmedium aufbringt, 5 bis 36 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 50 C inkubiert, eine.

Zone, wo die Fäden eines Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa frei von Verunreinigungen sind, herausschneidet, diese Zone auf ein mit dem ersten identisches Gelose enthaltendes Hährmcdium aufbringt und die Operationen der Inkubation, des llerausschneidens und V/icdereinsetzens zwei- bis dreimal wiederholt«

4« Verfuhren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa mindestens einer der 8 Stämme ITGIB 114 18 bis NGIB 114 25 verwendet wird.

5* Verfahren nach Punkt 1_} gekennzeichnet dadurch, daß man vor der Beimpfung des wäßrigen iJährinediums mit einem Inokulum dos Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa das Inokulum homogenisiert«

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6, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man den Mikroorganismus bei 20 bis 50 ⁰G und einem pH-Wert von 6 bis 8 während 5 bis 36 Stunden kultiviert.

7· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurchj daß man den Mikroorganismus bei einer Temperatur von 30 bis 40 ⁰C und beim neutralen pH-Wert während 3 bis 10 Stunden kultiviert·

8, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man die Biomasse gewinnt und lyophilisiert«

9« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man ein.

Nährmedium verwendet, welches 1 bis 4 .S Hefeextrakt, 0,1 bis 0,3 g Kalziumchlorid und 0,2 bis 1 g Hatrium- oder Amrnoniumacetat je 1 Wasser enthält,

Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man Wasser aus einer schwefelhaltigen Thermalquelle verwendet*

11« Verfahren nach Punkt 3_S gekennzeichnet dadurch, daß man ein gelosehaltigcs ITährrnedium verwendet, welches 1 bis 4 g Hefeextrakt und 10 bis 20 g Agar je 1 Wasser enthält.