LU81771A1

LU81771A1 - Procede de production d'une substance presentant une activite bacteriostatique

Info

Publication number: LU81771A1
Application number: LU81771A
Authority: LU
Inventors: D Shepherd; F Maillard
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1978-11-01
Filing date: 1979-10-10
Publication date: 1980-01-24
Also published as: GR73004B; FI65448C; IL58451A0; JPH0336517B2; GB2034687A; BE879360A; FI65448B; DE2941310C2; FR2440403A1; IT7950674A0; US4419449A; AU5226479A; AT365234B; JPS56109589A; CA1123355A; MX5937E; SE7908516L; DE2941310A1; IL58451A; DK149781B

Description

v s

La présente invention a pour objet un procédé de production d'une substance présentant une activité bactériostatique.

Plusieurs sources thermales sulfureuses européennes 5 contiennent des microorganismes qui forment,lorsqu'ils s'accumulent dans un endroit oü le courant est faible, une substance gélatineuse blanche à gris clair qui a reçu le nom de "barégine", en référence aux eaux thermales de Barèges, station thermale française des Pyrénées. La barégine peut être 10 définie comme une association de diverses bactéries fixant l'hydrogène sulfureux, adaptées à des températures élevées, dont certaines sont capables de sécréter un mucilage dans lequel l'ensemble est enrobé. On rencontre dans la barégine autant d'éléments morts que vivants.

15 Les propriétés thérapeutiques de la barégine ont été reconnues depuis longtemps et elle a été utilisée très tôt pour le traitement d'affections rhumatismales par massage, ainsi que pour soigner certaines maladies cutanées. Elle est entrée dans la composition de produits cosmétiques pour les 20 soins de la peau.

Sa production et sa récolte ont fait l'objet de brevets portant surtout sur la culture en conditions » naturelles, par différents procédés de ruissellement de l'eau de source. Un procédé similaire est utilisé actuellement 25 aux Thermes Nationaux d'Aix-les-Bains en France. Le dispositif consiste en un mur vertical en béton muni à son sommet d'une gouttière·. L'eau thermale, amenée par canalisation de la source toute proche, se déverse dans la gouttière et ruisselle le long des parois du mur. Les flocons de barégine 30 présentant des dimensions de l'ordre du cm s'accrochent aux aspérités de béton. Un film gélatineux de barégine croît à partir des flocons accrochés et est récolté périodiquement par grattage du mur avec une brosse dure. La température de l'eau et du local oü est installé ce mur est voisine de la température 35 d'émergence à la source, à savoir environ 43-47°C. Le rendement de la production est extrêmement faible. Il se monte à environ s 2 2 Λ 5 g de poids sec de barégine par m et par mois. De .plus, il est soumis aux variations de divers facteurs dépendant des conditions métérologiques.

La barégine a fait l'objet d'études microbiologiques et biochimiques. Celles-ci ont mis en évidence le métabolisme de l'E^S et des composés soufrés mais n'ont pas élucidé l'origine des propriétés thérapeutiques de la barégine. Parmi les nombreux microorganismes identifiés dans la barégine, le Beggiatoa est souvent cité. Cependant, les rares isolements de Beggiatoa connus par des publications n'ont jamais été effectués à partir de barégine mais à partir de boues et d'eaux usées. De plus, ces isolements se sont avérés longs et difficiles et la culture des microorganismes isolés n'a donné que des rendements très faibles étant donné, entre autres, leur fragilité et leur très forte teneur en eau.

On peut considérer comme caractéristique une valeur publiée de 1,2 g de poids frais de microorganismes produits en 48 h à 28°C, sans agitation, par litre d'un milieu de culture contenant 2 g d'extrait de levure, o,l g d'acétate de sodium ainsi que de la catalase active.

La présente invention doit permettre une production rentable à l'échelle industrielle d'une substance présentant une activité bactériostatique analogue à celle de la barégine.

Le procédé selon la présente* invention est caractérisé par le fait que l'on cultive un microorganisme du type Beggiatoa dans un milieu nutritif aqueux, en conditions aérobies, sous agitation, et l'on recueille la biomasse et/ou le milieu de culture.

On a constaté en effet qu'une biomasse de microorganisme du type Beggiatoa et même le milieu dans lequel on l'a produite présentent une activité bactériostatique. On a constaté également que la fragilité du microorganisme n'est pas un obstacle à sa culture intensive en milieu vigoureusement agité et qu'il se multiplie même si les filaments qu'il forme sont brisés en de nombreux fragments. C'est ainsi que l'on a Λ 3 » même avantage à homogénéiser un inoculum du microorganisme du type Beggiatoa avant d'en ensemencer le milieu de culture.

C'est intentionnellement que l'on utilise ici et dans la suite du présent exposé l'expression "microorganisme du type Beggiatoa" plutôt que "microorganisme du genre Beggiatoa". Le genre Beggiatoa appartient à la classe des "gliding bacteria", ordre des myxobactérales/ famille des Beggiatoaceae" (cf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,Eighth Edition, Waverly Press, Baltimore, U.S.A., 1974, pages 112-114). Comme on peut le lire dans ce dernier ouvrage qui fait autorité en la matière, la classification des microorganismes de ce genre est quelque peu sujette à caution étant donné le petit nombre d'informations sûres à disposition. Il serait inopportun de se limiter à un terme scientifique aussi précis que le "genre" lorsqu'on connaît la précarité de la classification des microorganismes en question. Par l'expression "microorganisme du type Beggiatoa" il faut donc comprendre ici des bactéries filamenteuses caractéristiques des sols et des eaux sulfureuses dont les filaments incolores sont mobiles par glissement et sont formés de cellules en chaîne, telles que les bactéries classées dans le genre Beggiatoa par exemple.

De préférence, on obtient le microorganisme du type 1 Beggiatoa en l'isolant de la barëgine. On a constaté qu'un tel isolement est possible en s'y prenant d'une certaine manière et que les souches qu'il permet d'obtenir sont cultivables et présentent précisément une activité bactêriostatique.

On a constaté enfin que même le problème de leur conservation peut trouver des solutions satisfaisantes.

Pour isoler une souche, on peut déposer un échantillon de barégine sur un milieu nutritif gélosé, incuber 5 à 36 h à une température de 25 à 50°C, découper une zone où les filaments d'un microorganisme du type Beggiatoa sont libres de contaminants, déposer cette zone sur un milieu nutritif gélosé identique au premier et répéter les opérations d'incubation, découpage et repiquage 2 à 3 fois.

4 C'est ainsi que l'on a isole les 8 souches déposées le 12 juillet 1978 à la collection nationale de bactéries industrielles (NCIB) d'Aberdeen en Ecosse et qui ont reçu les No NCIB 114 18 à 114 25. On peut donc mettre en oeuvre le présent procédé avec au moins l'une de-ces huit souches, par exemple.

De préférence, le milieu nutritif gélosé utilisé pour l'isolement est composé de 1 à 4 g d'extrait de levure et 10 à 20 g d'agar par litre d'eau.

De même, le milieu nutritif aqueux préféré pour la culture contient 1 à 4 g d'extrait de levure, 0,1 à 0,3 g de chlorure de calcium et 0,2 à 1 g d'acétate de sodium ou d'ammonium par litre d'eau. Pour protéger la culture, on peut aussi ajouter de la catalase au milieu, à raison de 5 à 20 unités internationales (UI) par ml, par exemple. On peut cultiver le microorganisme à une température de 20 à 50°C durant 5 à 36 h, à un pH de 6 à 8. De préférence, on le cultive à une température de 30 à 40°C durant 8 à 10 h, à pH neutre.

La substance présentant une activité bactériostatique obtenue par le procédé selon la présente invention peut être utilisée telle quelle pour des massages cutanés, ou comme composant d'un produit cosmétique pour la peau, par exemple.

La biomasse peut être conservée sous forme séchée. On la sèche de préférence par lyophilisation étant donné sa fragilité et sa faible teneur en matière sèche.

Les exemples ci-après, donnés à titre d'illustration, permettront de mieux comprendre la nature et la portée de la présente invention. Le nom "Beggiatoa" y est systématiquement utilisé à la place et doit y être compris dans le sens de l'expression "microorganisme du type Beggiatoa".

EXEMPLE 1 (-isolement des souches)

Un flocon de barégine fraîche prélevée au Thermes Nationaux d'Aix-les-Bains est déposé au centre d'une boîte —J* 5 de Pétri contenant 20 ml de milieu gélosé préparé selon la recette suivante :

Extrait de levure (Difco) 2 g Agar (Bacto-Difco) 15 g

Eau thermale d'Aix filtrée 100 ml Eau distillée 900 ml

On place la boîte à l'envers dans une étuve à 30°C durant 30 h. On l'examine alors au microscope, à faible grossissement, pour détecter la présence de structures en spirales * caractéristiques du Beqqiatoa et résultant de la mobilité par glissement de ces microorganismes. Certains sont même visibles à l'oeil nu. L'examen microscopique révèle également des zones dans lesquelles les filaments de Beggiatoa semblent libres de contaminants. On découpe une de ces zones au scalpel stérile et on la dépose sur une plaque d'agar vierge de même composition que la première, en prenant soin de déposer la surface contenant les filaments de Beqqiatoa contre la surface vierge de la nouvelle .»plaque d'agar. On incube à nouveau à 30°C durant 24 h. On répète l'opération de découpage, repiquage et incubation deux fois encore. On obtient une culture pure de Beggiatoa.

EXEMPLE 2 (conservation des souches)

On isole une dizaine de souches de la manière décrite à l'exemple 1. Elles diffèrent les unes des autres par le diamètre de leurs filaments, leur vitesse de glissement et la forme de leurs colonies sur agar. On les conserve avec succès de trois manières différentes selon qu'il s'agit du court, du moyen ou du long terme.

2.1. ) â court terme : On conserve la plaque au réfrigérateur à 4°C, en ayant soin d'étanchëifier la boîte de Pétri. On transfère la souche tous les dix jours, car l'agar a tendance à sécher.

2.2. ) à moyen terme : On prépare un milieu semi-liquide présentant la composition suivante : ’ 6 s

Extrait de levure 2 g

CaCl2 0,1 g

Acétate de sodium 0,5 g

Agar 2 g

Eau thermale filtrée 1000 ml Après stérilisation du milieu, on y ajoute de la catalase fongique, à raison de 10 Ul/ml. On a stérilisé au préalable la solution de catalase par filtration à froid sur un filtre Millipore à pores microscopiques de 0,22 μ.

On dépose un petit cube d'agar contenant le Beggiatoa dans un tube contenant 10 ml de milieu. On incube à 30°C.

Le Beggiatoa se développe dans la partie supérieure du tube.

On peut laisser le tube 3 semaines à 30°C. On transfère ensuite la culture à raison de 0/1 ml par tube.

2.3.) â long terme : On prépare une culture de 24 h en milieu agité de la manière décrite à l'exemple 3. On la centrifuge. On lave le culot à la solution de Ringer stérile. On congèle et on lyophilise le culot. On le conserve plusieurs mois au réfrigérateur, dans un récipient bien fermé. Dès réhydratation, les fragments de filaments sont capables de se développer.

EXEMPLE 3 (Culture des souches) 3,1. Inoculum

On découpe un petit cube d'agar de 5 mm de côté dans une plaque obtenue de la manière décrite à l'exemple 1, On le dépose dans un flacon de 500 ml contenant 100 ml du milieu suivant :

Extrait de levure 4 g

Chlorure de calcium 0,2 g

Acétate d'ammonium 1 g

Eau thermale filtrée 1000 ml

Ce milieu présente un pH de 6,6. On place le flacon sur un agitateur orbital tournant à 150 tours/mn pour un rayon de giration de 1,25 cm. On l'y laisse 16 h à 30°C. On homogénéise Ί la culture obtenue à l'aide d'un mélangeur Sorvall~0mn:*-m^xer; durant 15 à 30 s en conditions stériles. La culture homogénéisée constitue l'inoculum.

3.2. Culture

On introduit 5 ml de l'inoculum ci-dessus dans un flacon de 500 ml contenant 100 ml du même milieu que celui -utilisé pour préparer l'inoculum. On incube le flacon 24 h à 30°C sur l'agitateur orbital. On obtient 0/8 g de matière sèche de Beggiatoa par litre de culture. En répétant l'opération avec diverses souches et en variant les conditions dans les limites permises, on obtient des rendements compris entre environ 0,5 et 2 g de Beggiatoa sec par litre de culture.

3.3. Contrôle de la croissance

La méthode classique de néphélométrie appliquée aux cultures bactériennes n'est pas utilisable pour le Beggiatoa à cause de son type de croissance en flocons. On l'adapte au cas particulier. On prélève des échantillons de culture toutes les 2 hgures et on les homogénéise au mélangeur Sorvall-Omni-mixer. On lit leur densité optique à 600pm sur un spectrophoto-mètre. L'échantillon homogénéisé ne sëdimente -· que très lentement et permet une lecture fiable. On obtient ainsi une indication sur la croissance en relation directe avec le nombre de cellules.

3.4. Détermination du poids sec

Le séchage classique au four ne donne pas des résultats reproductibles pour le Beggiatoa.C'est vraisemblablement dû à sa teneur en eau très élevée. C'est pourquoi/ afin d'obtenir des résultats reproductibles, on ne sèche pas moins de 400 ml de culture par lyophilisation.

3.5. Détermination de l'activité bactériostatique

La méthode classique d'évaluation de l'activité bactériostatique du Public Health Laboratory Service Committee, décrite dans le British Med. J. 408 (1965) ne donne pas des résultats satisfaisants dans le cas particulier, du fait que 8 le test se fait en tubes. En effet, le Begqiatoa est très strictement aérobie et la concentration d’oxygène régnant dans un tube à essais est insuffisante. On adapte donc la méthode et l'on travaille en flacons agités pour augmenter le transfert d'oxygène.

On prépare trois séries de flacons de 50 ml contenant chacun 18 ml de bouillon nutritif (Nutrient Broth Difco). On inocule les flacons de la 1ère et de la 2ëme série avec chacun 0,4 ml d'une culture de 24 h d'une souche pathogène. On utilise trois souches pathogènes, à savoir Bseudomonas aeruginosa AICC 10145 ,Eschericia coli AICC 11755 et Staphylococcnis aureus AICC 12600.

On prépare des échantillons de produit bactëriosta-tique en centrifugeant une culture obtenue de la manière décrite à l'exemple 3, chiffre 2, mais en 8 h seulement.

La biomasse centrifugée est homogénéisée et remise en suspension dans un volume de solution physiologique égal au volume de surnageant restant de la centrifugation. La solution physiologique contenant la biomasse et le surnageant sont chacun divisés en échantillons de 2 ml.

Aux flacons de la 1ère série on ajoute 2 ml de solution physiologique contenant la biomasse homogénéisée.

Aux flacons de la 2ème série on ajoute 2 ml de solution physiologique sèule. Aux flacons de la 3ème série, qui n'ont pas v été inoculés avec un pathogène, on ajoute 2 ml de solution physiologique contenant la biomasse homogénéisée.

On incube les flacons à 37°C sur un agitateur orbital. On mesure leur densité optique à 600 nm après 16 h.Les mesures de densités optiques des flacons correspondants des séries 1,2 et 3 fournissent les paramètres respectifs A,B et C. La différence A-C soustraite de B puis divisée par B et multipliée par 100 donne l'activité bactériostatique de la biomasse en % d'inhibition.

On procède de la même manière pour déterminer l'activité bactériostatique du surnageant, en ajoutant aux flacons de la 1ère et de la 3ème série 2 ml de surnageant au lieu de 2 ml de solution physiologique contenant la biomasse « 9 homogénéisée.

Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous :

Agent pathogène Activité bianasse Activité surnageant (% inhibition) {% inhibition) P. aeruginosa 70 41 S. aureus 100 45 E. coli 70 11

Exemple 4(comparatif) A titre de comparaison, on détermine de la manière décrite à l'exemple 3, chiffre 5, l'activité bactériostatique de la barégine naturelle. On trouve, en % d'inhibition, après 16 h d'incubation, 100%, 83 % et 96 % vis-à-vis respectivement de P. aeruginosa, S. aureus et E. coli. En d'autres termes, l'activité bactériostatique de la biomasse selon la présente invention est presque aussi forte que celle de la barégine.

C'est un résultat remarquable si l'on considère que la présente biomasse peut être produite avec un bon rendement à l'échelle industrielle, alors que la barégine ne peut s'obtenir que lentement et en très faibles quantités. L'activité du surnageant selon la présente invention, quoique moindre, ne manque pas d'intérêt non plus.

** 10 EXEMPLE 5 (souches NCIB) 8 souches ont été isolées de la manière décrite à l'exemple 1, déposées le 12 juillet 1978 à la National Collection of Industrial Bacteria (NCIB) à âberdeen en Ecosse et ont reçu comme indiqué plus haut les Nos NCIB 114 18 à 114.25. Ces souches peuvent être caractérisées par leurs qualités de croissance, leur morphologie en culture sur agar et en milieu liquide ainsi que .leur activité bactériostatique.

Le tableau ci-dessous donne la densité optique des cultures que l'on a obtenues après 5 h, 10 h et 24 h en cultivant chacune de ces souches de la manière décrite à l'exemple 3 chiffre 2, les biomasses obtenues après 24 h,ainsi que l'activité bactériostatique des biomasses obtenues après 8 h de culture, vis-à-vis des trois souches pathogènes P. aeruqinosa,S. aureus et E. Coli.

. Les morphologies sont indiquées ensuite séparément pour chaque souche.

Souche Densité optique Biomasse (g Activité

No.NCIB après 5 h après 10 h après 24 h matière sèche/1) (% inhibition) P. aeruginosa S. aureus E. Coli * 114 18 0,237 0,713 0,583 0,91 100 76 100 114 19 0,352 0,621 0,514 0,95 100 96 74 114 20 0,147 0,447 0,709 0,95 100 96 44 114 21 0,160 0,402 0,646 0,95 100 98 100 114 22 0,289 0,364 0,305 0,75 68 89 84 114 23 0,360 0,496 0,378 0,69 73 87 25 114 24 0,217 0,737 0,587 0,59 57 80 27 114 25 0,395 0,981 0,838 1,11 100 91 90

U

Morphologies NCIB 114 18

Sur acrar : Forme de grandes colonies isolées, de 8 à 15 mm de diamètre, avec un centre blanc et des bords translucides. Examen au microscope (x 100) : La colonie est formée de spirales bien visibles enroulées de manière serrée. en culture liquide : Culture homogène. Examen au microscope (x 400) : Longs filaments de 80 x Informés parfois de bacilles courts bien distincts. Pas d'agrégation. Très peu d'inclusions réfractiles.

NCIB 114 19

Sur agar : Forme des colonies blanches isolées de 4 à 8 mm de diamètre avec des bords diffus. Des cordons épais s'étendent radialement, en étoile’, depuis le centre de la colonie mais n'atteignent pas les bords. Examen au microscope (x 100) s Les bords de la colonie sont formés de filaments en spirales serrées.

en culture liquide : Culture homogène. Examen au microscope (x 400) : Filaments isolés très courts de 3,6 x 0,9μ divisés par des constrictions très nettes. Pas d'inclusions réfractaires. Forme des agrégats.

NCIB 114 20 * sur agar : Forme des colonies isolées plates et opaques de 2 à 5 mm de diamètre avec des bords à frange. Examen au microscope (x 100) s Colonies constituées de fragments de filaments formant des spirales mal développées. en culture liquide :Culture homogène. Examen au microscope ( x 400) ; Pas de filaments. Longs bacilles de 9 x 1,4μ contenant quelques inclusions réfractiles.

NCIB 114 21 sur agar : Forme des colonies séparées de 4 à 7 mm de diamètre avec des bords diffus, très semblables à celle de la souche NCIB 114 19 mais plus blanches. Les bords des colonies sont translucides.

Examen au microscope (x 100) : Pas de spirales visibles.

* 12 en culture liquide : Culture homogène. Examen au microscope (x 400) : Image semblable à celle présentée par la souche NCIB 114 20. Pas de filaments, longs bacilles de 18 x 1,4 y contenant quelques inclusions réfractiles.

Pas d'agrégats.

NCIB 114 22 sur agar : Ne forme jamais de colonies isolées. Couvre toute la surface avec des cordons translucides mycoides. Examen au microscope (x 100) : Cordons formés de plusieurs filaments. en culture liquide : Culture ‘homogène présentant quelques petits agrégats dès la sixième heure. Examen au microscope (x 400) : *

Longs filaments séparés de 90 x 1,4 à 1,8 μ . Filaments divisés en longues unités par des constrictions nettes. Très peu d'inclusions réfractiles.

NCIB 114 23 sur agar : Semblable à la souche NCIB 114 22. Pas de colonies isolées. Cordons mycoides denses et mieux visibles. Examen au microscope (x'100) : Cordons plus distincts .parce que constitués d'un plus grand nombre de filaments. en culture liquide : Forme de gros flocons (agrégats). Examen au microscope ( x 400) : Filaments beaucoup plus courts que ceux de la souche NCIB 114 22 et divisés en segments par des constrictions très nettes. Longueur de 9 - 10 x 1,8μ ' Des inclusions réfractiles apparaissent très vite, dès après 5h. NCIB 114 24 sur agar : Semblable à la souche NCIB 114 23. Pas de colonies isolées. Cordons mycoxdes. Examen au microscope (x 100) :

Cordons formés d'un grand nombre de filaments. en culture liquide : Forme de gros flocons (agrégats). Examen au microscope ( x 400) ; Longs filaments de 140 x Ι,δ^ν gui forment de longs faisceaux. Pas de constrictions visibles. Développement tardif, après 10 h, d'inclusions réfractiles.

* 13 % NCIB 114 25 sur agar : Forme des colonies isolées opaques de 2 à 6 mm de diamètre. Examen au microscope ( x 100) : Colonies constituées de filaments faits de cellules isolées et formant des spirales serrées.

en culture liquide : Culture homogène. Examen au microscope (x 400) : Filaments homogènes courts de 4 x 1,4 μ . Peu d'inclusions réfractiles.

* %

Claims

1. Procédé de production d’une substance présentant une activité bactériostatique, caractérisé par le fait que l'on cultive un microorganisme du type Begqiatoa dans un milieu nutritif aqueux, en conditions aérobies, sous agitation , et l'on recueille la biomasse et/ou le milieu de culture.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé * par le fait que l'on obtient le microorganisrae du type Beggiatoa en l'isolant de la barégine.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que , pour isoler une souche, on dépose un échantillon de barégine sur un milieu nutritif gélosé, on incube 5 à 36 h à une température de 20 à 50°C, on découpe une zone où les filaments d'un microorganisme du type Beggiatoa sont libres de contaminants, on dépose cette zone sur un milieu nutritif gélosé identique au premier et l'on répète les opérations d'incubation, découpage et repiquage 2 à 3 fois.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme du type Beggiatoa est au , moins l'une des 8 souches NCIB 114 18 à NCIB 114 25.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé * par le fait qu'avant d'ensemencer le milieu nutritif aqueux avec un inoculum du microorganisme du type Beggiatoa on homogénéise 1'inoculum.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on cultive le microorganisme à une température de 20 à 50°C durant 5 à 36 h , à un pH de 6 à 8.

7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé * par le fait que l'on cultive le microorganisme à une tempéra ture de 30 à 40°C durant 8 à 10 h, à pH neutre. * « V 15 «

8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on recueille la biomasse et qu'on la lyophilise.

9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le milieu nutritif aqueux contient 1 à 4 g d'extrait de levure, 0,1 à 0,3 g de chlorure de calcium et 0,2 à 1 g d'acétate de sodium ou d'ammonium par litre d'eau.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé parle fait que l'eau est une eau thermale sulfureuse. • *

11. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le milieu nutritif gélosé est composé de 1 à 4 g d'extrait de levure et 10 à 20 g d'agar par litre d'eau.

12. Substance présentant une activité bactëriostati-que obtenue par le procédé selon l'une des revendications précédentes.