BE1023862B1 - Conidies aeriennes et resistantes de souches de champignons filamenteux et leur procede d'obtention - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé d'obtention de conidies ou spores de souches de champignons filamenteux, aux conidies ou spores obtenues et à leurs applications agronomiques et agro-alimentaires.

Description

Conidies aériennes et résistantes de souches de champignons filamenteux et leur procédé d'obtention

Objet de l'invention [0001] La présente invention se rapporte au domaine de la lutte biologique, ou bio-contrôle, de nuisibles de cultures, et a trait en particulier à des conidies ou des spores, aériennes et résistantes, de souches de champignons filamenteux, en particulier des conidies ou des spores de Pseudozyma de Trichoderma ou de Pénicillium sous forme de poudre, ainsi qu'à leur procédé d'obtention et leurs applications, en tant qu'agent de lutte biologique ou dans 1'agroalimentaire.

Arrière-plan technologique à la base de l'invention [0002] La lutte biologique, encore appelée bio contrôle, est une méthode connue pour la protection des végétaux contre par exemple des nuisibles, ravageurs de culture, comme les insectes, les acariens ou les nématodes, la protection ou le traitement contre des maladies, en particulier les maladies fongiques, bactériennes ou virales, ou une méthode de lutte contre les mauvaises herbes, plantes adventices, par l'utilisation, soit d'organismes vivants antagonistes, soit de produits biodégradables constitutifs de ces organismes, ou bien de métabolites produits par ces organismes, appelés agents de lutte biologique.

[0003] Comme cette lutte met en jeu des organismes vivants, comme des prédateurs tels les nématodes, arthropodes, vertébrés, ou mollusques, ou à des agents pathogènes, tels des bactéries ou champignons, ou encore à des substances naturelles herbivores, ou phytophages, ou à des constituants ou métabolites produits par ces organismes vivants, elle présente l'avantage de se faire sans recours à des pesticides chimiques.

[0004] En effet, avec toute la problématique provoquée par les pesticides chimiques sur l'environnement, il y a un intérêt croissant à exploiter des nouvelles matières biologiques, ou des nouveaux organismes vivants, tels que par exemple des champignons filamenteux, ou leurs métabolites primaires ou secondaires, pour le contrôle des parasites, des mauvaises herbes et/ou des maladies.

[0005] De plus, il est à noter que, pour ce qui concerne en particulier la lutte biologique fongique, cette dernière s'articule autour de multiples disciplines, telle que la pathologie de la souche utilisée, l'écologie, la physiologie, la production de masse, la formulation et les stratégies d'application.

[0006] Il existe un grand nombre de souches de champignons, en particulier des champignons filamenteux, qui ont un grand intérêt agroalimentaire et agronomique, en particulier comme agents de bio-contrôle, notamment comme fongicides, mais qui ne sont pas encore pleinement exploitées en raison de la difficulté à les faire sporuler en culture liquide.

[0007] Par exemple, Pseudozyma flocculosa est une souche connue de champignon phyllosphère épiphyte, faisant partie de la classe des Basidiomycètes et appartenant à l'ordre des Ustilaginale.

[0008] Sa classification définitive a été établie en 1995 par Boekhout sur la base d'analyses approfondies sur le plan génétique. Actuellement, ce champignon est classé dans le genre Pseudozyma apparenté aux Ustilaginales du phylum des Basidiomycètes (Boekhout 1995) . La taxonomie complète de ce champignon est consignée dans le tableau 1.

Tableau 1. Description taxonomique de Pseudozyma flocculosa (Taxonomy ID: 84751).

[0009] Ce champignon est reconnu comme agent de lutte biologique très efficace contre le blanc induit par

Erysiphe poligoni, de plusieurs plantes dont le rosier et le concombre.

[0010] Par ailleurs, le genre Trichoderma est également connu pour regrouper un ensemble de champignons qui se retrouvent couramment dans le sol, sur le bois mort, les débris végétaux et la partie aérienne des plantes.

[0011] De nombreuses espèces de Trichoderma se sont avérés efficaces comme agents biologiques contre par exemple Pythium, Phytophthora cinnamomi, Rhizoctonia solanir Sclerotium rolfsiie et Cryphonectria parasitica. Ces champignons pathogènes causent d'importants dégâts dans les cultures fruitières, légumières, en serre et ornementales.

[0012] Les performances de Trichoderma atroviride comme agent de lutte biologique est due en partie à la production d'endochitinase et il a également été montré que ce champignon intervient, selon divers mécanismes et à divers niveaux, dans la stimulation de la croissance racinaire par l'utilisation de minéraux fertilisants et la stimulation des défenses naturelles des plantes.

[0013] Par ailleurs, il est connu que les champignons des divisions de Zygomycètes, Ascomycètes et Basidiomycètes produisent des spores asexuées appelées conidies, leur permettant une propagation végétative rapide. Par contre, chez les Deutéromycètes, dits aussi champignons imparfaits, le cycle sexuel n'a jamais été observé et la reproduction se fait uniquement par voie asexuée, via la production de conidies.

[0014] Les conidies ou spores sont les principaux moyens de protection, et de conservation, des génomes fongiques, grâce à leur résistance aux traitements de conditionnement et aux conditions environnementales hostiles, telles que les températures extrêmes, les rayons ultraviolets et les faibles valeurs d'humidité relative. A titre d'exemple, une partie des conidies ou spores d'Aspergillus niger maintiennent leur capacité de germination après passage dans un autoclave pendant une heure à 120°C (Morozova et al 2001) .

[0015] En outre, la production de ces spores asexuées, ou conidies, est essentielle dans le cycle de vie de nombreux champignons. Elle forme le principal moyen de dispersion pour le génome fongique dans des conditions environnementales défavorables.

[0016] De nombreux obstacles restent à surmonter afin de pouvoir commercialiser des agents de lutte biologique fongique à base de champignons filamenteux, notamment du fait de leur faible aptitude à être stocké sur des longues périodes, en particulier à cause de la faible viabilité des conidies ou spores issues d'une fermentation liquide.

[0017] De nombreux champignons, y compris les filamenteux, peuvent être cultivés dans des milieux liquides, c'est-à-dire au cours d'une phase de fermentation dite liquide. Toutefois, la fermentation liquide est particulièrement problématique.

[0018] Dans cet environnement liquide, selon les espèces, les Hyphomycètes peuvent être amenés à se développer sous des formes diverses, y compris, les organismes hyphes unicellulaires à paroi mince, quelques formes dénommées blastospores, et les conidies ou spores submergées. Ces dernières sont obtenues soit directement à partir de blastospores microcycles, par conidiation, ou soit à partir de cellules conidiogènes qui se forment sur les hyphes submergées.

[0019] En général, la méthode préférée pour la production de conidies ou spores à grande échelle est la culture submergée en raison d'une part de sa bonne rentabilité, sa courte durée de production, et la disponibilité de tous les matériaux nécessaires pour une fermentation liquide.

[0020] Malgré tous ses avantages, les conidies ou spores produites par cette technique ont une trop courte durée de vie dans des conditions environnementales défavorables. C'est pourquoi, la plupart des agents de biocontrôle, à base de conidies ou spores submergées, nécessitent une utilisation immédiate sur les plantes et les terrains infestés par les ravageurs, qu'ils soient fongiques ou d'insectes.

[0021] Il est également possible de produire des conidies par fermentation sur un support ou un substrat solide, dite aussi phase ou fermentation solide.

[0022] Bien que la fermentation solide soit connue depuis longtemps, elle n'a jamais connu un véritable essor industriel et a souvent été délaissée pour la culture en milieu liquide.

[0023] La fermentation solide présente plusieurs difficultés pour ce qui concerne de nombreuses espèces de champignons. Paecilomyces fumosoroseus, par exemple, a besoin de lumière pour une production optimale de conidies aériennes (Wraight et al. 2001), et la production efficace de conidies de cette souche de champignon nécessite donc une culture en surface, ou une agitation périodique des supports ou substrats solides particulaires, pour augmenter l'exposition à la lumière. Les conidies ou spores de Verticillium se développent, quant à elles, en globules collantes produites à des densités relativement faibles sur une croissance d'hyphes, alors que celles d'aschersonia doivent être produites en circonvolutions, ou sous forme de fosses dans un stroma dense.

[0024] Par ailleurs, l'augmentation de la température et le changement de pH durant la phase de croissance végétative est un problème critique dans le domaine de fermentation solide (Smits et al. 1998).

[0025] L'intérêt pour la fermentation en milieu solide n'est pas nouveau, pourtant ce mode de culture n'a jamais été développé à cause des difficultés de contrôle des paramètres physico-chimiques de la culture. En effet, la production massive de conidies ou spores doit être initiée à un stade de développement végétatif du mycélium, durant lequel il faut non seulement maintenir les conditions optimales de croissance (température, aération, humidité, pH) , mais également contrôler la différenciation du mycélium et empêcher un phénomène de sporulation précoce qui peut réduire fortement le rendement de production (Raimbault & Durand 1980) .

[0026] De plus, le problème d'évacuation de la chaleur, produite lors de la fermentation solide, semble particulièrement difficile à résoudre. En effet, la chaleur dégagée par les réactions métaboliques, lors de la phase de croissance végétative, peut être délétère si la température dépasse les seuils limites permis. Il en est de même pour l'évolution du pH qui est quasiment impossible à réguler en l'absence de circulation de liquide (Pandey 2003).

[0027] A ces difficultés, liées à la fermentation s'ajoute un autre inconvénient, aussi important, lié au fait qu'en fin de culture on se trouve avec des conidies ou spores mélangées à de grandes quantités de mycélium et de résidus du support ou substrat solide, ce qui peut réduire la qualité du produit final obtenu et les possibilités d'application de celui-ci, notamment dans le domaine agroalimentaire.

Etat de la technique [0028] La demande de brevet W02009/037399 décrit un procédé de production de conidies ou spores, et de leurs métabolites, sur un support, ou substrat, solide par une fermentation classique, la phase de croissance se faisant également sur un tel support. Le milieu solide doit comporter un support ou substrat solide adéquat, c'est-à-dire un support ou substrat absorbant de faible densité et pratiquement non fermentable, mais imprégné d'un milieu de culture approprié à la croissance des conidies ou spores de champignons. Le procédé consiste en l'application d'un stress hydrique durant la phase de production des spores.

[0029] La demande de brevet EP2390345 décrit la production de métabolites et autres molécules d'intérêt par fermentation en milieu solide sur de multiples supports ou substrats solides, tels que de la biomasse végétale, en particulier des produits agricoles comme des céréales, des sous-produits de l'industrie agroalimentaire forestière, papetière ou des boues d'épuration.

[0030] Le brevet US 4 837 155 décrit une méthode de production de la souche Trichoderma en phase liquide et en condition aérobie à des températures comprises entre environ 25°C et environ 30°C et à un pH compris entre environ 5,8 et environ 7,0, pour générer à partir d'un inoculant, une densité de conidies d'au moins 5 x 108 par ml, mais sans aucune phase de maturation sur support solide.

[0031] Le document EP0223809 décrit un procédé de production de conidies ou spores de champignons filamenteux dans un fermenteur à disques rotatifs en phase liquide.

[0032] Il est aussi connu d'obtenir un compostage accéléré grâce à une combinaison d'une fermentation liquide et solide générant une grande quantité de biomasse sur un support non inerte fermentable, qui sera dégradé par le développement des souches et qui peut devenir un compost comprenant des conidies de Trichoderma sp.

[0033] Ainsi, il apparaît que les procédés connus de l'état de technique effectuent toutes les étapes de production de souches de champignons, ou de métabolites issus de ces souches de champignons, soit uniquement en phase liquide, soit uniquement en phase solide sur un substrat adéquat.

Buts de l'invention [0034] La présente invention vise à obtenir des souches de champignons filamenteux présentant un intérêt agronomique ou agroalimentaire, utilisables sous forme solide, en particulier sous forme d'une poudre, ainsi qu'un nouveau procédé d'obtention de ces souches, en particulier sous forme de poudre et qui ne présentent pas les inconvénients de l'état de la technique.

[0035] En particulier, la présente invention vise à fournir des souches de champignons filamenteux qui soient aisément manipulables, présentent une viabilité améliorée, en particulier après des longues durées de conservation, et éventuellement d'une haute pureté, c'est dire des souches essentiellement dépourvues de contaminants et/ou de résidus du support de culture, afin de pouvoir les utiliser pour des applications agronomiques ou agroalimentaires, en particulier pour la préparation de fromages ou de charcuteries.

[0036] Un autre but de la présente invention est d'obtenir un procédé d'obtention desdits champignons filamenteux, de préférence sous forme de poudre de conidies ou spores ou de leurs métabolites primaires ou secondaires, en particulier un procédé qui soit rapide, de conception simple, qui présente un rendement efficace et dont les paramètres physico-chimiques de chaque étape soient aisément contrôlables.

[0037] Un denier but de l'invention vise à obtenir un support ou substrat solide adéquat pour la maturation de conidies ou spores de champignons filamenteux.

Eléments caractéristiques de l'invention [0038] La présente invention concerne un procédé d'obtention de conidies ou spores de souches de champignons filamenteux comprenant les étapes suivantes : croître des champignons filamenteux durant une première phase de croissance mycélienne en phase liquide, pour générer une biomasse mycélienne, mélanger ladite biomasse mycélienne obtenue avec un support solide inerte, générer des conidies ou spores durant une seconde phase de maturation de ladite biomasse mycélienne sur ledit support solide inerte, éventuellement sécher les conidies ou les spores obtenues, et éventuellement extraire une ou plusieurs molécules d'intérêt des conidies ou des spores obtenues.

[0039] Dans le procédé de l'invention, le support solide inerte est le son d'une céréale, en particulier du son de blé, de préférence un tissu dans lequel les cellules du son de la céréale formant le support solide inerte sont dépourvues de leurs fractions fermentescibles, en particulier d'amidon.

[0040] Dans le procédé de l'invention, la phase de maturation génère une concentration en conidies ou spores comprise, de préférence entre 3xE+08 et 5xl09 conidies/g pour Pseudozyma flocculosa, et entre lE+09 et 5xl010 conidies/g, pour Trichoderma atroviride et entre 5xE+8 et lxE+10 conidies/g de conidies de Trichoderma harzianum.

[0041] Dans le procédé de l'invention, la durée d'obtention des conidies ou des spores est avantageusement inférieure à trois semaines, de préférence inférieure à deux semaines, plus particulièrement inférieure à une semaine.

[0042] Selon l'invention, le champignon filamenteux est de préférence du genre Pseudozyma sp. , en particulier Pseudozyma flocculosa, du genre Tricoderma sp. , en particulier Trichoderma harzianum, Trichoderma atroviride, Trichoderma hamatum, et Trichoderma viride, du genre Penicilum sp. , en particulier Penicilium camemberti et

Penicilium nalgiovense, du genre Metarhizium sp. ou du genre Bauveria sp.

[0043] Un autre aspect de l'invention concerne les conidies ou les spores de souches de champignons filamenteux obtenues par le procédé de l'invention, résistantes à la dessiccation et se conservant à l'état sec durant une période supérieure à trois mois, de préférence comprise entre trois mois et vingt-quatre mois, voire plus de vingt-quatre mois, à une température ambiante, c'est à dire une température comprise entre environ 15°c et environ 30°C, plus particulièrement une température comprise entre environ 20°C et environ 30°C.

[0044] L'invention concerne aussi les conidies ou des spores de souches de champignons filamenteux matures, du genre Pseudozyma sp. , en particulier Pseudozyma flocculosa, dont la fraction cytoplasmique est chargée de réserve et enrichie en mélanine.

[0045] Un autre aspect de l'invention concerne une poudre de conidies ou spores de l'invention, en particulier une poudre de conidies ou de spores obtenue par le procédé de 1'invention.

[0046] L'invention concerne aussi des compositions alimentaires, en particulier des charcuteries et des fromages comprenant les conidies, les spores ou la poudre de conidies ou de spores de l'invention.

[0047] Un dernier aspect de l'invention concerne l'utilisation des conidies, les spores ou de la poudre de conidies ou de spores de l'invention contre la prolifération de nuisibles, en particulier des champignons, des bactéries, des virus ou des insectes, de plantes ou de fruits, pour favoriser la croissance des plantes, en particulier la croissance des racines de plantes, la germination et le taux de croissance cellulaire desdites plantes. De préférence, cette plante ou ce fruit est choisi parmi le groupe constitué par le rosier, les cucurbitacées, en particulier le concombre, la courge ou le melon, la tomate, la fraise, la framboise, la groseille, la vigne, le raisin la pomme, le pommier, la poire, le poirier, la prune, le prunier et la pomme de terre.

[0048] Un dernier aspect de la présente invention concerne l'utilisation des conidies, des spores ou la poudre de conidies ou de spores de l'invention pour la préparation de compositions alimentaires, en particulier des charcuteries et des fromages.

[0049] La présente invention sera décrite dans la description détaillée ci-dessous en référence aux figures présentées à titre d'illustrations non limitatives de 1'invention.

Brève description des figures [0050] La figure 1 représente schématiquement la procédure de production de poudre de conidies ou spores selon l'invention combinant avantageusement une première étape fermentation en phase liquide générant de la biomasse mycélienne suivie d'une seconde étape de maturation, dite phase de sporulation, en phase solide.

[0051] La figure 2 en A) est une observation au microscope binoculaire G:40x et qui représente la structure d'une particule de son de blé ayant subi un curetage enzymatique. Ces cellules sont vidées de leurs contenus et acquièrent une structure alvéolaire en nid d'abeilles fortement aérée ; en B) et C) sont des coupes histologiques d'environ 50 pm d'un tissu imprégné dans une résine époxy, après une fixation au glutaraldehyde et au tétroxyde d'osmium et une révélation au bleu de toluidine B) est la coupe transversale d'une particule de son avant traitement enzymatique. Les cellules sont chargées de réserves, et C) est la coupe transversale d'une particule du dérivé du son formant le support ou substrat solide inerte de l'invention et utilisé dans le procédé de l'invention. Les cellules sont vidées de leurs contenus suite aux traitements enzymatiques successifs, cette nouvelle structure du support ou substrat solide inerte l'invention est propice à une grande capacité d'absorption de liquides.

Description détaillée de l'invention [0052] De nombreuses souches de champignons ne sporulent que faiblement, de façon aléatoire et non stable dans le temps en culture liquide, ce qui représente un frein majeur à leur commercialisation et leurs applications.

[0053] Le procédé selon la présente invention combine, pour la première fois, une première étape dite de croissance pour générer une biomasse mycélienne en milieu ou en phase liquide et une seconde étape dite de maturation en milieu ou en phase solide sur un support ou substrat solide inerte adéquat, qui soit naturel, c'est-à-dire obtenu à partir de matière biologique renouvelable, ou qui soit de synthèse, en particulier des billes de gel de dextrane ou d'agarose ou un dérivé plastique du pétrole, de préférence recyclable, tel que du polystyrène expansé sous forme de billes ou sous une forme alvéolaire adéquate.

[0054] En effet, ce support ou substrat solide doit présenter les caractéristiques suivantes : être inerte, non dégradable et sans nutriments, c'est-à-dire non ou peu fermentable et donc non ou peu accessible au développement bactérien et à la dégradation bactérienne ; présenter une structure alvéolaire, très aérée propice à des échanges gazeux optimaux et à l'évaporation de l'eau, c'est à dire un substrat ou support solide ayant des cellules ou alvéoles vides avec des diamètres compris entre environ 2 pm et environ 1000 pm, de préférence entre environ 10 pm et environ 500 pm ; présenter une grande capacité d'absorption et de rétention de liquides, en particulier de l'eau ; c'est à dire avoir la capacité d'absorber entre environ 5 fois et environ 15 fois, de préférence entre environ 8 fois et environ 10 fois, plus particulièrement environ 9 fois son propre poids en ces liquides.

[0055] De préférence, ce substrat ou support solide inerte d'origine végétale, comprend essentiellement des tissus, dont les cellules ont conservées leurs parois, mais dont l'amidon et les fractions des cellules les plus accessibles à une fermentation et au développement bactérien (cellulose et hémi-cellulose) ont été éliminés. Ce substrat ou support solide inerte peut se présenter sous forme de billes ou de fibres, et être produit à partir de déchets végétaux, tels que de la paille, de la sciure de bois, de la pulpe de betterave, de grognons d'olives, de la pulpe de café, de la bagasse de canne à sucre et leur mélanges.

[0056] Avantageusement, ce substrat ou support solide inerte est un dérivé de céréales, de préférence un dérivé du blé, ou de riz, plus particulièrement de son de blé ou de riz, qui se trouve dépourvu de toute trace d'amidon et d'une grande partie de sa fraction fibreuse cellulosique et hémi-cellulosique, en particulier suite à un traitement enzymatique séquentiel de ce son de blé qui présentera les caractéristiques susmentionnées et dont des coupes histologiques sont représentées dans les figures 2A à 2C. Ce substrat ou support solide inerte de l'invention, en particulier ce dérivé du son de blé, est utilisé comme support ou substrat solide inerte pour une seconde étape dite de maturation, en l'absence de nutriments, de plusieurs espèces des champignons filamenteux, en particulier des conidies ou spores de Pseudozyma flocculosa, de Trichoderma Atroviride, Trichoderma Hazianum, Pénicillium camemberti et Pénicillium nalgiovense, Beauveria bassiana et Metarhizium anisopliae, ou d'autres espèces de champignons filamenteux.

[0057] L'utilisation du substrat ou support solide inerte selon l'invention présente l'avantage d'apporter des solutions aux problèmes majeurs que connaît la fermentation en milieu solide. L'inoculation massive d'un tel dérivé de céréales, en particulier d'un tel dérivé de son de blé, et la faible teneur en eau du mélange, mais surtout le fait que ce dérivé de céréales, en particulier ce dérivé du son de blé, soit aussi dépourvu de nutriments, y compris de toute partie fermentescible présente dans les cellules du tissu végétal comme de l'amidon, permet de réduire considérablement les contaminations microbiennes, en particulier bactérienne, en phase solide.

[0058] Selon l'invention, la combinaison de deux modes ou étapes de cultures successifs, à savoir une première phase ou fermentation liquide, suivie d'une seconde phase de maturation en phase solide sur un tel substrat ou support solide inerte adéquat tel que sus-décrit, permet de contrôler avantageusement les paramètres de croissance et de les maintenir à leurs valeurs optimales, sans générer de risques liés aux croissances excessives obtenues dans les procédés de l'état de la technique et présentant les inconvénients de générer des modifications importantes de la température et du pH.

[0059] En effet, tel que décrit dans la figure 1, la première phase de croissance végétative, dite phase liquide 1, d'une durée généralement comprise entre environ deux jours et environ quatre jours, génératrice de chaleur et d'acides organiques, est réalisée en un fermenteur selon des conditions (température, pH, choix et quantité des nutriments ajoutés, stress induit ou non, ...) bien connues de l'homme de l'art et adaptables en fonction du type de champignon filamenteux produit. Le mycélium de la souche de ce champignon filamenteux génère massivement une biomasse 2. Les paramètres physicochimiques suivis du fermenteur sont de préférence les suivants: - Température : maintenue entre environ 20°C et environ 4 0 ° C . - Vitesse d'agitation : comprise entre environ 70 rpm et environ 250 rpm, avec une P02 supérieur à 30%, de préférence supérieur à 50% et plus particulièrement supérieur à 80%. - pH : maintenu entre environ 4 et environ 7.8 (pas de régulation de pH nécessaire dans cette production). - Pas de stress induit durant la fermentation. - Plusieurs milieux de culture connus de l'homme de l'art peuvent être utilisés comme: - MAI (extrait de malt 10 g). - MA2 (Extrait de malt 20 g) . - MEA (Extrait de malt 20 g, Extrait de levure 2 g) - YMPD (Extrait de malt 5 g, Extrait de levure 3 g,

Dextrose 15 g, peptone de soja 6 g) [0060] La biomasse 2 obtenue est ensuite récoltée et mélangée, comme représenté par l'étape 3 de la figure 1, avec un substrat ou support solide inerte, de préférence constitué d'un dérivé de son de blé dépourvu d'amidon, pour subir une étape de maturation 4 en phase solide d'une durée généralement comprise entre environ deux jours et environ neuf jours, mais variable en fonction du type de champignon filamenteux utilisé, afin de générer ces conidies ou ces spores. Ces conidies ou spores peuvent ensuite avantageusement être soumis à une étape de séchage 5, généralement d'une durée comprise entre environ un jour et environ huit jours, et une étape de génération des conidies ou spores aériennes 6, avant un éventuel traitement final de séparation ou purification du produit final obtenu sous forme d'une poudre de conidies ou de spores. Comme le substrat ou le support solide inerte selon l'invention est avantageusement non fermentescible, la phase de maturation 4 ne nécessite pas de régulation de pH et le peu de chaleur produite en phase solide peut être facilement contrôlée, via une ventilation. En outre, ce procédé est particulièrement efficace et génère de manière avantageuse une grande quantité de ces conidies ou ces spores dans des délais courts, de préférence de moins de trois semaines, de moins de deux semaines, de moins d'une semaine, voire de quelques jours. De manière optionnelle, le procédé de l'invention peut aussi comporter une étape d'extraction et de purification de métabolites primaires ou secondaires ou de toute molécule d'intérêt produits par ces conidies ou spores, en particulier des enzymes, telles que des amylases, des phosphatases, des protéases, des vitamines, des alcaloïdes, des acides organiques, des arômes, des pigments, des lactones, de la mélanine ou des antibiotiques.

[0061] Par conséquent, la présente invention apporte une solution aux problèmes de la culture sur substrat ou support solide, y compris à l'inconvénient éventuel de l'hétérogénéité du produit final obtenu sous forme de poudre. En effet, il est possible qu'en fin d'étape de séchage 5, on se retrouve avec des conidies aériennes mélangées à de grandes quantités de mycélium et de résidus de support solide, par exemple le son de blé dépourvu d'amidon, qui sont éliminés, voire recyclés pour une nouvelle étape de maturation, par une étape de séparation ou de purification supplémentaire.

[0062] Un autre aspect de l'invention concerne les conidies ou spores obtenues par le procédé de l'invention, en particulier des conidies ou spores de Pseudozyma flocculosa, dont la fraction cytoplasmique est complètement transformée et se charge de vésicules de réserve, et dont les mitochondries et ribosomes sont non détectables ce qui n'a jamais été observé auparavant en mode de culture liquide des mêmes souches de champignons filamenteux qui sont généralement enrichies en mitochondries et en ribosomes libres marqueurs d'une activité métabolique et synthèse protéique intense, non propice à une conservation.

[0063] L'analyse par microscopie à fluorescence révèle également qu'en employant le procédé de l'invention, les conidies ou spores obtenues produisent une substance fluorescente, il s'agit d'une accumulation à la surface de la conidie ou spore de mélanine, ce qui serait un mode de protection contre les rayons ultraviolets. Cette caractéristique n'a jamais été observée auparavant chez les conidies ou spores produites en mode de culture liquide. Au contraire, les conidies ou spores issues du milieu submergé présentent un amincissement de leur paroi.

[0064] Par ailleurs, une autre caractéristique structurale est l'aspect essentiellement concave de la forme extérieure de la conidie ou de la spore obtenue, qui est spécifique à son haut degré de maturation, en lien avec le mode de dissémination des conidies ou spores par voie aérienne. Ces caractéristiques présentent des avantages en termes de récolte, de purification et de dispersion des conidies ou spores. En particulier, l'étape finale de séparation et de purification du produit final sous forme de poudre, présente l'avantage de réduire considérablement la présence de possibles contaminants, tels que du mycélium ou des résidus du support ou substrat solide inerte utilisé.

Exemples

Exemple 1 : Production de conidies de Pseudozyma flocculosa [0065] Pour la production de conidies ou spores de Pseudozyma flocculosa, des mycéliums issus de la fermentation liquide sont mis à maturation avec le support ou substrat solide inerte de l'invention, qui est un dérivé du son de blé.

[0066] L'étape de la conidiation ou d'obtention de conidies, ou de sporulation, de deux à sept jours est suivie d'une étape de séchaqe pour obtenir une concentration finale de conidies ou spores de Pseudozyma flocculosa après maturation d'environ de 3xE+08 à 5xl09 conidies/g. Des tests de protection de plantes ou de lutte biologique contre des nuisibles de plantes, effectués avec ces conidies ou spores ont montré une efficacité similaire à celle obtenue avec des conidies ou spores obtenues par les procédés de l'état de la technique.

Exemple 2: Production de Trichoderma harzlanum et

Trlchderma atroviride [0067] L'étape de fermentation liquide de deux jours est suivie d'une étape de condition sur le dérivé du son pendant quatre à huit jours, pour obtenir une concentration finale, après maturation, d'environ lE+09 à 3xl010 conidies/g, de conidies de Trichoderma atroviride et de 5xE+8 à lxE+10 conidies/g de conidies de Trichoderma harzianum. Références

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Claims (24)

1. REVENDICATIONS

   1. Procédé d'obtention de conidies de souches de champignons filamenteux comprenant les étapes suivantes : croître des champignons filamenteux durant une première phase de croissance mycélienne en phase liquide, pour générer une biomasse mycélienne, mélanger ladite biomasse mycélienne obtenue avec un support solide inerte, et générer essentiellement sans fermentation des conidies et/ou des spores durant une seconde phase de maturation de ladite biomasse mycélienne sur ledit support solide inerte.
2. 2. Le procédé selon la revendication 1, comprenant en outre une étape de séchage des conidies.
3. 3. Le procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre une étape d'extraction d'une ou de plusieurs molécule(s) d'intérêt des conidies.
4. 4. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support solide inerte est du son d'une céréale.
5. 5. Le procédé selon la revendication 4 dans lequel la céréale est du blé.
6. 6. Le procédé selon la revendication 4 ou la revendication 5, dans lequel les cellules du son de la céréale formant le support solide inerte, sont dépourvues de leur fraction fermentescible, en particulier d'amidon.
7. 7. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la phase de maturation génère une concentration en conidies comprise entre 3xE+08 conidies/g et 5xl09 conidies/g pour Pseudozyma flocculosa, et entre lE+09 conidies/g et 5xl010 conidies/g, pour Trichoderma atroviride et entre 5xE+8 conidies/g et lxE+10 conidies/g de conidies de Trichoderma harzianum.
8. 8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dont la durée d'obtention des conidies est inférieure à 3 semaines, de préférence moins de deux semaines, plus particulièrement moins de 1 semaine.
9. 9. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le champignon filamenteux est du genre Pseudozyma sp. , en particulier Pseudozyma flocculosa.
10. 10. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 8, dans lequel le champignon filamenteux est du genre Trichoderma sp. , en particulier Trichoderma harzianum, Trichoderma atroviride, Trichoderma hamatum et Trichoderma viride
11. 11. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 8, dans lequel le champignon filamenteux est du genre Pénicillium sp. , en particulier Penicilium camemberti et Penicilium nalgiovense.
12. 12. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 8, dans lequel le champignon filamenteux est choisi parmi le groupe constitué par Metarhizium sp. et Bauveria sp.
13. 13. Conidies de souches de champignons filamenteux obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, résistantes à la dessiccation et se conservant à l'état sec à température ambiante, durant une période supérieure à un mois ou deux mois, de préférence durant une période comprise entre trois mois et vingt-quatre mois.
14. 14. Conidies et/ou spores de souches de champignons filamenteux matures du genre Pseudozyma sp. , en particulier de Pseudozyma flocculosa, dont la fraction cytoplasmique est chargée de réserves et riche en mélanine.
15. 15. Conidies de souches de champignons filamenteux selon la revendication 14 est obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
16. 16. Poudre de conidies et/ou des spores selon l'une quelconque des revendications précédentes 13 à 15.
17. 17. Composition alimentaire comprenant les conidies ou la poudre de conidies selon l'une quelconque des revendications précédentes 13 à 16.
18. 18. Composition alimentaire selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi le groupe constitué par les charcuteries et les fromages.
19. 19. Utilisation de conidies ou d'une poudre de conidies selon l'une quelconque des revendications précédentes 13 à 16, contre la prolifération de nuisibles de plantes ou de fruits.
20. 20. Utilisation de conidies ou d'une poudre de conidies selon l'une quelconque des revendications précédentes 13 à 16, pour favoriser la croissance de plantes.
21. 21. Utilisation selon la revendication 20, pour favoriser la croissance des plantes, en particulier la germination et le taux de croissance cellulaire et racinaire de plantes.
22. 22. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes 19 à 21, dans laquelle la plante ou le fruit est choisi parmi le groupe constitué par le rosier, les cucurbitacées, en particulier, le concombre, la courge ou le melon, la tomate, la fraise, la framboise, la groseille, la vigne, le raisin, la pomme, le pommier, la poire, le poirier, la prune, le prunier et la pomme-de-terre.
23. 23. Utilisation de conidies ou d'une poudre de conidies selon l'une quelconque des revendications précédentes 13 à 16 pour la préparation d'une composition alimentaire.
24. 24. Utilisation selon la revendication 23, dans laquelle la composition alimentaire est choisie parmi le groupe constitué par les charcuteries et les fromages.