HU180030B - Process for producing material of bacteriostatic activity - Google Patents
Process for producing material of bacteriostatic activity Download PDFInfo
- Publication number
- HU180030B HU180030B HU79NE622A HUNE000622A HU180030B HU 180030 B HU180030 B HU 180030B HU 79NE622 A HU79NE622 A HU 79NE622A HU NE000622 A HUNE000622 A HU NE000622A HU 180030 B HU180030 B HU 180030B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- beggiatoa
- agar
- biomass
- hours
- culture
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/10—General cosmetic use
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Birds (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás bakteriosztatikus hatású anyag előállítására.
Európában számos mikroorganizmusokat tartalmazó kénes gyógyforrás található, melyekben a mikroorganizmusok a gyenge vízáramlású helyeken felhalmozódva világosszürke, zselatinszcrű, „baregin”-nek nevezett anyagot képeznek. Az elnevezés egy Pireneusokban levő francia ásványvízforrásra, a barages-i hőforrásra utal. A baregin magas hőmérsékletnek ellenálló és hidrogcnszulfidot megkötni képes különböző baktériumok összességeként határozható meg. E baktériumok közül néhány egy nyálka kiválasztására képes, mely az egész baktériumtelep burkoló bevonatául szolgál. A baregin legalább annyi élettelen, mint élő alkotóelemet tartalmaz.
A baregin gyógyászati hatásai már jóideje ismertek, és régóta használják reumás betegségek masszázsánál és bizonyos bőrbetegségek kezelésénél. Ezenkívül bőrápoló kozmetikai készítmények alkotórészeként használatos.
A baregin előállítása és összegyűjtése több szabadalom tárgyát képezi, mely eljárások különböző, forrásvizet csörgedeztetö technikákat valósítanak meg természetes körülmények között (itt utalunk a 7 429 J06 számú francia szabadalmi leírásra). 25
Jelenleg egy hasonló eljárást használnak a franci^-, országi Thermes Nationaux d’Aix-les-Bains-ben. Az alkalmazott berendezés egy felső részén vízvezető csatornával ellátott függőleges betonfalból áll. A közeli 30
180930 forrásból csővezetéken odavezetett forró forrásvíz folyik a vízvezető csatornába, és a fal mentén lecsörgedezik.
Az egy centiméteres nagyságrendű baregin-pelyhek hozzátapadn-k a beton durva részeihez. Az odatapadt 5 baregin-pclyhekből zselatinszerű film képződik, melyet időközönként kemény kefével lekaparnak a falról és összegyűjtenek. A falat beépítve tartalmazó épület és a víz hőmérséklete közel van a forrás hőmérsékletéhez, azaz 43—47 °C-os. A kitermelés rendkívül alacsony. 10 Havonta, és négyzetméterenként körülbelül 5 g száraz baregint nyernek ki. Ezenfelül a kitermelést számos meteorológiai körülménytől függő tényező változása is befolyásolja.
A bareginnel mikrobiológiai és biokémiai tanulmá15 nyokban foglalkoztak. Itt utalunk a következő publikációkra: L. Faust és R. S. Wolfe, Enrichment and Cultivation of Beggiatoa alba, J. Bact., 81, 99—106. (1961); Sh. D. Burton és R. Y. Morita, Effect of Catalase and Cultural Conditions on Growth of Beggiatoa, J. Bact. 20 88, 1755—1761. (1964); és Μ. M. Joshi és J. P. Hollis.
Rapid Enrichment of Beggiatoa from Soil, J. appl. Bact., 40, 223—224 (1976). Ezek a tanulmányok a kénhidrogén és kéntartalmú vegyületek anyagcseréjét taglalják, de nem világítanak rá a baregin gyógyászati tulajdonságainak eredetére. A bareginben azonosított számos mikroorganizmus között gyakran említik a Beggiatoa nevű mikroorganizmust. Mindazonáltal a publikációkból ismert kevés elkülönítési eljárásban a Beggiatoát sohasem bareginből, hanem iszapokból és használt vizekből nyerik ki. pzetifelüj ezek az eljárások
-1180030 munkaigényesnek és nehézkesnek bizonyultak, és az elkülönített mikroorganizmusok tenyésztése — többek között törékenységük és magas víztartalmuk miatt — csak nagyon gyenge hozamokat eredményezett. Jellemzőnek tekinthető egy közzétett kitermelési érték, miszerint 1 liter 2 g élesztőkivonatot, 0,1 g nátrium-acetátot és aktív katalázt tartalmazó 28 °C-os, keverés nélküli táptalajból 48 óra alatt 1,2 g mikroorganizmust nyertek ki.
Jelen találmány egyik célja, hogy lehetővé tegye a bareginhez hasonló bakteriosztatikus hatású anyag gazdaságos, ipari méretekben történő előállítását.
A bakteriosztatikus anyagot a találmány szerinti eljárással úgy állítjuk elő, hogy vizes táptalajban, keverés és aerob körülmények biztosítása mellett az NCTB 114 18—114 25 szám alatt letétbe helyezett, Beggiatoa típusú mikroorganizmus törzsek legalább egyikét 5—36 órán keresztül, 20 C’ és 50 °C közötti hőmérséklettartományban, 6 és 8 közötti pH-crtcken tenyésztjük, mikoris a vizes táptalaj mikroorganizmussal való beoltása előtt az oltóanyagot kívánt esetben homogenizáljuk, majd a biomasszát és/vagy a táptalajt összegyűjtjük és kívánt esetben a biomasszát kifagyasztással szárítjuk.
A találmány szerinti eljárásra az jellemző, hogy Beggiatoa típusú mikroorganizmusokat tenyésztünk vizes táptalajban keverés és aerob körülmények biztosítása mellett, és a biomasszát és/vagy a táptalajt összegyűjtjük.
Megállapítást nyert, hogy a Beggiatoa típusú mikroorganizmusok biomasszája, de még az azt tartalmazó közeg is bakteriosztatikus hatással rendelkezik. Azt is megállapítottuk, hogy a mikroorganizmusok törékenysége nem jelent akadályt az erősen kevert közegben történő intenzív tenyésztés számára, minthogy a mikroorganizmusok még akkor is szaporodnak, ha szálaik számos fragmenssé töredeznek szét. így, a Beggiatoa típusú mikroorganizmusokból álló oltóanyag táptalajba történő beoltása előtti homogenizálása még előnyös is lehet.
A leírásban ezentúl szándékosan inkább a „Beggiatoa típusú mikroorganizmus” kifejezést használjuk a „Beggiatoa törzsbe tartozó mikroorganizmus” helyett. A Beggiatoa törzs a „csúszó baktériumok” osztályába, a nyálkabaktériumok rendjébe és a Beggiatoaceae családba tartozik. [Lásd Bergey’s Mannal of Determinative
Bacteriology, 8. kiadás, Waverly Press, Baltimore, USA 45 (1974), 112—114. old.] Mint az említett, szakmabeli tekintélynek örvendő munkából is látható, megbízható információk hiánya miatt ennek a mikroorganizmus törzsnek az osztályozása meglehetősen bizonytalan.
A kérdéses mikroorganizmusok osztályozásának ezen 50 bizonytalansága tükrében helytelen lenne olyan precíz szakkifejezés, mint a „törzs” használata. Ezért, jelen találmány szövegösszefüggéseiben a „Beggiatoa típusú mikroorganizmus” kifejezés alatt a kéntartalmú talajokra és vizekre jellemző szálszerű baktériumokat értjük, 55 melyekre az jellemző, hogy a színtelen szálak — az osztályozás Beggiatoa törzsbe tartozó baktériumaihoz hasonlóan — csúszva mozognak és sejtek láncolataiból épülnek fel.
A Beggiatoa típusú mikroorganizmus előnyösen bare- 60 ginből történő elkülönítéssel nyerhető ki. Megállapítást nyert, hogy egy bizonyos eljárás alkalmazásával lehetséges az említett elkülönítés és, hogy ezzel az eljárással kinyert törzsek tenyészthetők és bakterioszta íikus hatással rendelkeznek. Megállapítottuk végül, hogy a törzsek megőrzésének problémája is kielégítő módon megoldható.
Egy törzs elkülönítése céljából egy baregin-mintát agar-agart tartalmazó táptalajra helyezünk, és 5—36 5 órán keresztül inkubáljuk 25—50 °C-os hőmérséklettartományban. Ezután a Beggiatoa típusú mikroorganizmus-szálak egy szennyeződésmentes területét kivágjuk, és ismét ráhelyezzük egy az elsővel azonos összetételű, — agar-agart tartalmazó táptalajra. Az inkubá10 lás, a kivágás és a másodlagos baktériumtenyésztés műveletei kétszer vagy háromszor megismételhetők.
Ezt az eljárást alkalmaztuk annak a 8 törzsnek az elkülönítésére, melyeket az NC113 114 18-tól 114 25-ig terjedő sorszámok alatt 1978. július 12-én helyeztünk 15 letétbe a skóciai Aberdeenben levő Natíonal Coílection of Industrial Bacteria (NCIB)-ben.
Ennek megfelelően, a találmány szerinti eljárás ezen 8 törzs legalább egyikének a felhasználásával hajtható végre.
Az elkülönítésnél alkalmazott agar-agart tartalmazó táptalaj 1 liter vízre számítva 10—20 g agar-agart tartalmaz.
Hasonlóképp, a mikroorganizmusok tenyésztésénél alkalmazott vizes táptalaj 1 liter vízre számítva előnyö25 sen 1—4 g élesztőkivonatot, 0,1—0,3 g kalcium-kloridot és 0,2—1 g nátrium- vagy ammónium-acetátot tartalmaz. Előnyösen kéntartalmú termálvizet használunk.
A tenyészet megóvása érdekében a táptalajhoz katalázt is hozzáadhatunk, például milliliterenként 5—20 30 nemzetközi egység (international unit, IU) mennyiségben. A mikroorganizmust 5—36 órán keresztül tenyészthetjük 20 °C és 50 C közötti hőmérséklettartományban, 6 pH és 8 pH-értékek között. Előnyös a tenyésztést 8—10 órán keresztül, 30—40 cC-on és semleges 35 pH-értéken végezni.
A találmány szerinti eljárással nyert bakteriosztatikus hatású anyag bőrmasszázsnál használható fel, vagy pedig bőrkozmetikai készítmények alkotórészeként. A biomassza szárított formában tartósítható. A mikroorga40 nizmusok törékenysége és alacsony száraz anyagtartalma miatt a szárítást előnyösen kifagyasztással végezzük.
A következő, bemutatás célját szolgáló példák lehetővé teszik, hogy jobban megértsük a találmány lényegét. A példákban a „Beggiatoa típusú mikroorganizmus” kifejezés helyett rendszeresen a vele azonosnak értendő „Beggiatoa” elnevezést használjuk.
1. példa (a törzsek elkülönítése)
Thermes Nationaux d’Aix-les-Bains-ből származó friss baregin-pelyhet egy petricsésze közepébe helyezünk el, melyben 20 ml agar-agart tartalmazó, alábbi összetételű táptalaj van:
élesztőkivonat (Difco)2 g agar-agar (Bacto—Difico)15 g
Aix-ből származó szűrt termálvíz 100ml desztillált víz 900ml
A csészét felfordítva 30 órán át egy 30 °C-os kemencében tartjuk. Ezután a Beggiatoát jellemző spirál alakú képződmények — melyek a mikroorganizmusok csúszó mozgásának eredményeképp keletkeznek — jelenlétének kimutatása céljából mikroszkopikus (kis 65 nagyítású) vizsgálatot h'jtunk végre. A képződmények néha szabad szemmel is láthatók. A mikroszkopikus vizsgálat feltár olyan zónákat, melyekben a Beggiatoa szálak szennyeződésmentesnek látszanak. Steril szikével kivágjuk az egyik ilyen zónát, és az előzővel azonos összetételű friss táptalajra helyezzük, miközben ügyelünk arra, hogy a Beggiatoa szálakat tartalmazó felület az új csészében is tiszta felületre kerüljön. Ezután ismét 24 órás, 30 °C-os inkubálás következik. A kivágás, a másodlagos baktériumtenyésztés és az inkubálás műveleteket még kétszer megismételjük. Végül tiszta Beggiatoa tenyészetet nyerünk.
2. példa (a törzsek tartósítása)
Tíz törzset különítünk el az 1. példában ismertetett módon. A törzsek a szálak átmérőiben, a csúszási sebességükben és az agar-agar táptalajain levő telepeik alakjaiban térnek el egymástól. Attól függően, hogy rövid-, közép- vagy hosszútávú tartósítást szeretnénk el- 20 érni, három különböző módszer alkalmazható.
2.1. Rövidtávú tartósítás: a gondosan lezárt petri- csészét 4 C-os hűtőszekrényben tartjuk. Mivel az agaragar hajlamos a kiszáradásra, a törzseket legalább 10 naponként át kell helyezni. 25
2.2. Középtávú tartósítás: elkészítünk egy alábbi öszszetételű fél-folyadék halmazállapotú táptalajt:
| élesztőkivonat | 2 | g |
| kalcíum-klorid | 0,1 | g |
| nátrium-acetát | 0,5 g | |
| agar-agar | 2 | g |
| szűrt termálvíz | 1000 | ml |
Λ táptalajhoz a sterilizálást követően hozzáadunk milliliterenként 10 nemzetközi egység (IU) gomba- 35 katalázt. A katalázoldatot előzőleg 0,22 mikrométer átmérőjű mikroszkopikus pórusokkal rendelkező Millipore szűrőn történő hideg szűréssel sterilizáljuk.
A Beggiatoát tartalmazó kis kockányi agar-agart 10 ml táptalajt tartalmazó tubusba helyezzük, és 31 °C 40 hőmérsékleten inkubáljuk. A Beggiatoa a tubus felső részén indul fejlődésnek. A csövet 3 héten keresztül tartjuk 30 °C-on. Ezután a tenyészetet 0,1 ml-es részletekben tubusokba helyezzük.
2.3. Hosszútávú tartósítás: a 3. példában leírt módon 45 kevert táptalajban egy 24-órás tenyészetet állítunk elő. Centrifugálás után a kivált részt steril Ringer-oldattal mossuk, majd megfagyasztjuk és fagyasztással szárítjuk. Szorosan záró konténerben több hónapig tároljuk hűtőszekrényben. Újrahidratáláskor a szálak fragmensei fejlődőképesek.
3. példa (a törzsek tenyésztése)
3.1. Oltóanyag
Az 1. példában leírt módon kikészített mintából kivágunk egy kis kockányi (5 mm3) agar-agart, melyet egy 500 ml-es edénybe helyezzük, melyben 100 ml alábbi összetételű táptalaj van:
élesztőkivonat kalcium-klorid ammónium-acetát szűrt termálvíz g
0,2 g g 1000 ml
A közeg pH-értéke 6,6. Az edényt 1501/perc fordulatszámú 1,25 cm-es íherciasugarú forgó keverőbe helyezzük, és 16 órán keresztül keverjük 30 °C-on. A kapott tenyészetet steril körülmények között Sorvall Omni5 mixerben 15—30 percig homogenizáljuk. A homogenizált tenyészet alkotja az oltóanyagot.
3.2. Tenyésztés
A fenti oltóanyag 5 ml-ét egy 500 ml-es edénybe helyezzük, amely az oltóanyag előállításához használt táptalajból 100 ml-t tartalmaz. Az edényt 24 óráig inkubáljuk forró keverőben 30 °C-on. A tenyészet egy liternyi mennyiségéből 0,8 g száraz Beggiatoát nyerünk.
Az eljárást több törzzsel megismételjük, miközben a körülményeket az említett határok között változtatjuk, és így a tenyészet egy liternyi mennyiségéből 12,5 g és 2 g közötti súlyú száraz Beggiatoát termelünk ki.
3.3. A növekedés mérése
A pehelyszerű növekedése miatt a Beggiatoa esetében a hagyományos zavarosságvizsgálati eljárás közvetlenül nem alkalmazható, hanem azt adaptálni kell az adott esethez. Sorvall Omnimixerrel homogenizált tenyészetből két óránként mintákat veszünk. A minták optikai sűrűségét spektrofotométerrel határoztuk meg 600 nmen. A homogenizált minta lassú leülepedése megbízható eredmények leolvasását teszi lehetővé. Az így kapott 30 növekedési adat közvetlen kapcsolatban van a sejtek számával.
3.4. A száraz súly meghatározása
A Beggiatoa szokásos kemencében történő szárítása nem szolgáltat reprodukálható eredményeket. Ez valószínűleg a nagyon magas víztartalma miatt van. Ezért a reprodukálható eredmények érdekében fagyasztásos eljárással sohasem szárítunk 400 ml-nél kisebb menynyíségű tenyészetet.
3.5. A bakteriosztatikus aktivitás meghatározása
A bakteriosztatikus aktivitás kiértékelésének a Public Health Laboratory Service Committee által kifejlesztett és ismertetett [British Medical Journal, 408 (1965)] hagyományos eljárása a Beggiatoa esetében nem vezet kielégítő eredményekhez, mert a vizsgálatot tubusokban végzik el. Minthogy a Beggiatoa szigorúan 50 aerob körülményeket igényel, a vizsgálati tubusban levő oxigénkoncentráció nem kielégítő. Ennek megfelelően a módszert tökéletesíteni kell, és az oxigén átáramoltatása érdekében kevert edényeket kell alkalmazni.
Elkészítettünk egy olyan sorozatot, ahol 50 ml-es edényekbe 18—18 ml baktérium-táptalajt (Nutrient Broth Difco) helyeztünk. Az első és a második sorozat edényeit kórokozó törzsek 24 órás tenyészeteinek 0,4 mles mennyiségeivel oltottuk be. Három kórokozó törzset használtunk, nevezetesen a Pseudomonas aeruginosa 60 ATCC 10 145, az Escherichia coli ATCC 11 755 és a Staphyllococcus aureus ATCC 12 600 törzseket.
Bakteriosztatikus minták előállítását a 3.2. példában ismertetett módon végeztük el azzal a különbséggel, hogy a tenyészetet csak 8 órán keresztül centrifugáltuk. 65 A centrifugált biomasszát homogenizáltuk, majd a
-3180030 centrifugálás után maradt felszínen úszó fázis mennyiségével egyenlő mennyiségű fiziológiás oldattal szuszpendáltuk. Mind a biomasszát tartalmazó fiziológiás oldatot, mind a felszínen úszó folyadékot 2 ml-es mintákra osztottuk.
Az első sorozat edényeibe 2 ml homogenizált biomaszszát tartalmazó fiziológiás oldatot adagoltunk. A második sorozat edényeihez csak 2—2 ml fiziológiás oldatot adtunk. A harmadik sorozat edényeihez, melyeket nem oltottunk be kórokozókkal, 2—2 ml homogenizált biomasszát tartalmazó fiziológiás oldatot adtunk.
Az edényeket forgó keverőben inkubáltuk 37 °C-on. Optikai sűrűségüket 16 óra eltelte után határoztuk meg 600 nm-en. Az első, második és harmadik sorozatnak megfelelő optikai sűrűségmérések adatait rendre az A, B és C paraméterek képviselik. Az A—C különbséget B-ből kivonjuk, a különbséget elosztjuk B-vel, és a hányadost 100-zal megszorozzuk, és így százalékos inhibícióként megkapjuk a biomassza bakteriosztatikus aktivitását.
A felszínen úszó fázis bakteriosztatikus aktivitását hasonlóképpen határozzuk meg, azaz az első és a harmadik sorozat edényeihez a homogenizált biomassza fiziológiás oldata helyett a felszínen úszó fázisból adunk 2—2 ml-t.
Az alábbi táblázat szemlélteti az eredményeket:
| A biomassza | A felszínen úszó | |
| Kórokozó | aktivitása | fázis aktivitása |
| (%-os inhibíció) | (%-os inhibíció) | |
| P. aeruginosa | 70 | 4. |
| S. aureus | 100 | 45 |
| E. coli | 70 | 11 |
4. példa (összehasonlítás)
Összehasonlítás céljából a 3.5. példában ismertetett módszerrel meghatározzuk a természetes baregin bakte5 riosztatikus aktivitását. 16 órás inkubálás után a P. aeruginosa, az S. aureus és az E. coli törzsekkel szembeni százalékos inhibíció rendre 100%, 83% és 96%.
Az adatok szerint tehát, a találmány szerinti eljárással előállított biomassza bakteriosztatikus aktivitása majd10 nem ugyanolyan erős, mint a bareginé. Ez lényeges eredménynek számít, ha összevetjük a találmány szerinti eljárással előállított biomassza magas kitermelést biztosító ipari előállíthatóságát a baregin alacsony kitermelést biztosító, lassú kinyerhetőségével. A találmány 15 szerinti eljárásban a felszínen úszó fázis aktivitása —jóllehet kisebb — nemkevésbé érdekes.
5. példa (NCIB törzsek) törzset különítettünk el az 1. példában ismertetett módon. Ezt a 8 törzset 1978. július 12-én helyeztük letétbe a skóciai Aberdeenben levő National Collection of Jndustrial Bacteria (NCIB)-ben, és ahogy említettük 25 már az NCIB 114 18-tól az NCIB 114 25-ig terjedő sorszámokat kapták. Ezek a törzsek növekedésképességükkel, agar-agaron és folyékony táptalajban levő tenyészetük morfológiájával és bakteriosztatikus aktivitásukkaljellemezhetők.
A 3.2. példában ismertetett módon 5, 10 és 24 órán át tenyésztett fent említett nyolc törzs és a 24 óra után nyert biomassza optikai sűrűségét, valamint a 8 órás tenyésztéssel nyert biomasszák P. aeruginosa, S. Aureus és E. coli kórokozó törzsekkel szembeni bakterioszta35 tikus aktivitását szemlélteti az alábbi táblázat. A törzsek morfológiáját külön ismertetjük.
| Törzs NCIB száma | Optikai sűrűség | Biomassza | Aktivitás (%*os inhibíció) | ||||
| 5 ó után | 10 ó után | 24 ó után | (g szárazanyag,'liter) | P. aeruginosa | S. aureus | E. coli | |
| 114 18 | 0,237 | 0,713 | 0,583 | 0,91 | 100 | 76 | 100 |
| 114 19 | 0,352 | 0,621 | 0,514 | 0,95 | 100 | 96 | 74 |
| 114 20 | 0,147 | 0,447 | 0,709 | 0,95 | 100 | 96 | 44 |
| 114 21 | 0,160 | 0,402 | 0,646 | 0,95 | 100 | 98 | 100 |
| 114 22 | 0,289 | 0,364 | 0,305 | 0,75 | 68 | 89 | 84 |
| 114 23 | 0,360 | 0,496 | 0,378 | 0,69 | 73 | 87 | 25 |
| 114 24 | 0,217 | 0,737 | 0,587 | 0,59 | 57 | 80 | 27 |
| 114 25 | 0,395 | 0,981 | 0,838 | 1,11 | 100 | 91 | 90 |
Morfológia
NCIB 114 18:
Agar-agaron- fehér közepű, áttetsző szélű, 8—15 mm átmérőjű elkülönült telepeket alkot. Mikroszkopikus vizsgálat (100-szoros nagyítás): a telepet tisztán kivehető, szorosan összecsavarodott spirálok alkotják.
Folyékony tenyészetben: homogén tenyészet. Mikroszkopikus vizsgálat (400-szoros nagyítás): 1,8 X 80 mikrométeréi,’Hosszú szálak, melyeket alkalmilag rövid, egymástól elhatárolható baktériumok alkotnak. Nincsenek aggregációk. Nagyon kevés fénytörő zárvány.
NCIB 114 19:
Agar-agaron: diffúz határú, 4—8 mm átmérőjű, fehér színű elkülönült telepeket alkot. A telep közepéről csillag alakú, sugárirányú rostok indulnak ki, de nem érik el a telep határát. Mikroszkopikus vizsgálat (100szoros nagyítás): a telep határait szorosan összecsavarodott szálak alkotják.
-4180030
Folyékony tenyészetben: homogén tenyészet. Mikroszkopikus vizsgálat (400-szoros nagyítás): nagyon világos zsugorodások által szabdalt, nagyon rövid, 3,6X0,9 mikrométeres elkülönült szálak. Nincsenek fénytörő zárványok. Aggregátumokat alkot.
NCIB 114 20:
Agar-agaron: „rojtozott” szegélyű 2—5 mm átmérőjű, áttetsző elkülönült telepeket alkot. Mikroszkopikus vizsgálat (100-szoros nagyítás): a telepeket szálak fragmensei alkotják gyengénfejlett spirálok formájában.
Folyékony tenyészetben: homogén tenyészet. Mikroszkopikus vizsgálat (400-szoros nagyítás): nincsenek szálak. Kevés fénytörő zárványt tartalmazó, 9X1,4 mikrométeres, hosszú baktériumok.
NCIB 114 21:
Agar-agaron: az NCIB 114 19 számú törzshöz hasonló, csak annál fehérebb, diffúz szegélyű, 4—7 mm átmérőjű elkülönült telepeket alkot. A telepek szegélyei áttetszők. Mikroszkopikus vizsgálat (100-szoros nagyítás): nincsenek látható spirálok.
Folyékony tenyészetben: homogén tenyészet. Mikroszkopikus vizsgálat (400-szoros nagyítás): az NCIB 114 20 számú törzshöz hasonló kép. Nincsenek szálak. Kevés fénytörő zárványt tartalmazó, 18X1,4 mikrométeres, hosszú baktériumok. Nincsenek aggregátumok.
NCIB 114 22:
Agar-agaron: sohasem alkot elkülönült telepeket. Az egész felületet áttetsző nyálkás rostok borítják Mikroszkopikus vizsgálat (100-szoros nagyítás): a rostokat több szál alkotja.
Folyékony tenyészetben: a hatodik óra után néhány kisméretű aggregátumot tartalmazó tenyészet. Mikroszkopikus vizsgálat (400-szoros nagyítás): 90X1,4X1,8 mikrométeres hosszú, elkülönült szálak. A szálakat jól elhatárolható zsugorodások hosszú egységekre osztják Kevés fénytörő zárvány.
NCIB 114 23:
Agar-agaron: az NCIB 114 22 számú törzshöz hasonló. Nincsenek elkülönült telepek. Sűrű és tisztábban kivehető nyálkás sávok. Mikroszkópiás vizsgálat (100szoros nagyítás): határozottabban elhatárolható rostok, mivel azokat több szál alkotja.
Folyékony tenyészetben: nagy pelyhek (aggregátumok). Mikroszkopikus vizsgálat (400-szoros nagyítás) világosan kivehető zsugorodások által szegmensekre osztott, az NCIB 114 22 számú törzsnél sokkal rövidebt szálak. Méretük 9—10X1,8 mikrométer. 5 óra után gyorsan megjelenő fénytörő zárványok.
NCIB 114 24:
Agar-agaron: az NCIB 114 23 számú törzshöz hasonló. Nincsenek elkülönült telepek. Nyálkás rostok. Mikroszkopikus vizsgálat (100-szoros nagyítás): a rostokat sok szál alkotja.
Folyékony tenyészetben: nagy pelyhek (aggregátumok). Mikroszkopikus vizsgálat (400-szoros nagyítás): hosszú kötegeket alkotó, 140X1,8 mikrométeres hoszszú szálak. Nincsenek látható zsugorodások. Idővel (10 óra után) fénytörő zárványok keletkeznek.
NCIB 114 25:
Agar-agaron: 2—6 mm átmérőjű, áttetsző, elkülönült telepeket alkot. Mikroszkopikus vizsgálat (100-szoros 20 nagyítás): a telepeket szoros spirálokat képező, elkülönült sejtekből álló szálak alkotják.
Folyékony tenyészetben: homogén tenyészet. Mikroszkopikus vizsgálat (400-szoros nagyítás): 4X1,4 mikrométeres, rövid, homogén szálak. Kevés fénytörő 25 zárvány.
Claims (5)
- Szabadalmi igénypontok30 1. Eljárás bakteriosztatikus hatású anyag előállítására, azzal jellemezve, hogy vizes táptalajban, keverés és aerob körülmények biztosítása mellett a Beggiatoa típusú mikroorganizmus törzsek legalább egyikét (NCIB 114 18—414 25 szám) 5—36 órán keresztül, 20 °C és35 50 °C közötti hőmérséklettartományban, 6 és 8 közötti pH-értéken tenyésztjük, mikoris a vizes táptalaj mikroorganizmussal való beoltása előtt az oltóanyagot kívánt esetben homogenizáljuk, majd a biomasszát és/vagy a felszínen úszó fázist összegyűjtjük és kívánt 40 esetben a biomasszát kifagyasztással szárítjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmust 8—10 órán keresztül tenyésztjük 30 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, semleges pH-értéken.45
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a biomasszát összegyűjtjük és kifagyasztással szárítjuk.
- 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy egy liter50 vízre számítva 1—4 g élesztőkivonatot, 0,1-0,3 g kalcium-kloridot és 0,2—1,0 g nátrium- vagy ammónium-acetátot tartalmazó vizes táptalajt használunk.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy vízként kéntartalmú termálvizet55 használunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH1123078A CH634877A5 (fr) | 1978-11-01 | 1978-11-01 | Procede de preparation d'une substance presentant une activite bacteriostatique. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU180030B true HU180030B (en) | 1983-01-28 |
Family
ID=4371398
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU79NE622A HU180030B (en) | 1978-11-01 | 1979-10-29 | Process for producing material of bacteriostatic activity |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4419449A (hu) |
| JP (1) | JPS56109589A (hu) |
| AT (1) | AT365234B (hu) |
| AU (1) | AU528629B2 (hu) |
| BE (1) | BE879360A (hu) |
| CA (1) | CA1123355A (hu) |
| CH (1) | CH634877A5 (hu) |
| CS (1) | CS213399B2 (hu) |
| DD (1) | DD147251A5 (hu) |
| DE (1) | DE2941310C2 (hu) |
| DK (1) | DK149781C (hu) |
| ES (1) | ES485566A1 (hu) |
| FI (1) | FI65448C (hu) |
| FR (1) | FR2440403A1 (hu) |
| GB (1) | GB2034687B (hu) |
| GR (1) | GR73004B (hu) |
| HK (1) | HK11384A (hu) |
| HU (1) | HU180030B (hu) |
| IL (1) | IL58451A (hu) |
| IT (1) | IT1164025B (hu) |
| LU (1) | LU81771A1 (hu) |
| MX (1) | MX5937E (hu) |
| MY (1) | MY8400264A (hu) |
| NL (1) | NL7908024A (hu) |
| SE (1) | SE443996B (hu) |
| SG (1) | SG34583G (hu) |
| SU (1) | SU1090263A3 (hu) |
| ZA (1) | ZA795509B (hu) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2700172B1 (fr) * | 1992-07-20 | 1995-07-13 | Oreal | Procede de culture de bacteries filamenteuses non photosynthetiques et non fructifiantes. |
| FR2693654B1 (fr) * | 1992-07-20 | 1994-08-26 | Oreal | Médicament, notamment immunomodulateur, contenant des enveloppes ou fractions d'enveloppes de bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes, et sa préparation. |
| FR2719768B1 (fr) * | 1994-05-10 | 1996-06-14 | Oreal | Utilisation d'extraits de bactéries filamenteuses comme agents cosmétiques contre le vieillissement cutané. |
| FR2721208B1 (fr) * | 1994-06-16 | 1996-08-02 | Oreal | Composition à usage topique contenant un antioxidant et un extrait bactérien, et utilisation de cette composition. |
| FR2738485B1 (fr) * | 1995-09-07 | 1997-11-14 | Oreal | Utilisation d'au moins un extrait d'au moins une bacterie filamenteuse non photosynthetique en tant qu'antagoniste de substance p |
| JP3949720B2 (ja) * | 1995-09-07 | 2007-07-25 | ロレアル | 非光合成糸状細菌からの抽出物の使用とそれを含む組成物 |
| FR2746642B1 (fr) * | 1996-03-27 | 1998-05-15 | Oreal | Composition apaisante comprenant un extrait bacterien |
| FR2746646B1 (fr) * | 1996-03-27 | 1998-05-15 | Oreal | Composition apaisante comprenant un extrait vegetal et un extrait bacterien |
| FR2762782B1 (fr) * | 1997-05-05 | 1999-06-11 | Oreal | Composition comprenant un milieu de culture de micro-organisme et utilisation |
| FR2879452B1 (fr) * | 2004-12-21 | 2007-07-06 | Oreal | Utilisation d'un extrait de bacterie filamenteuse non photosynthetique non fructifiante en tant qu'agent modulant l'adhesion de microorganismes cutanes |
| FR2915898B1 (fr) * | 2007-05-10 | 2009-06-12 | Oreal | Procede de preparation d'actifs sur eau thermale et compositions les contenant |
| FR2918886B1 (fr) * | 2007-07-17 | 2010-01-08 | Oreal | Utilisation d'au moins un extrait bacterien cultive sur eau thermale pour le traitement des peaux, muqueuses et cuirs chevelus sensibles |
| FR2918885B1 (fr) * | 2007-07-17 | 2009-08-28 | Oreal | Utilisation d'extrait de bacterie cultivee sur eau thermale pour diminuer les poches et/ou les cernes perioculaires |
| FR2918884B1 (fr) * | 2007-07-17 | 2010-01-15 | Oreal | Utilisation d'extraits bacteriens cultives sur eau thermale comme agent anti-rougeur |
| FR2918883B1 (fr) * | 2007-07-17 | 2010-01-15 | Oreal | Utilisation d'un extrait bacterien cultive sur une eau thermale pour le traitement des peaux seches |
| FR2918887B1 (fr) * | 2007-07-17 | 2009-08-28 | Oreal | Utilisation d'au moins un extrait bacterien cultive sur eau thermale pour la chute des cheveux |
| GB2474041A (en) * | 2009-10-02 | 2011-04-06 | Omorovicza Cosmetics Ltd | Cosmetic composition comprising thermal mineral water |
| FR2965277B1 (fr) * | 2010-09-23 | 2012-10-19 | Thermanence Bio | Procede et installation de production en masse de plancton, dit thermal, sur au moins un support de culture dispose a l'interieur d'un bassin comportant au moins une entree et une sortie de fluide |
| WO2013186253A1 (en) * | 2012-06-13 | 2013-12-19 | Eucodis Bioscience Gmbh | Catalase in growth media |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1372620A (fr) * | 1963-08-07 | 1964-09-18 | Fr Des Cosmetiques Biolog Soc | Produit utilisable en cosmétologie, sa préparation et ses applications |
| FR1536017A (fr) * | 1967-09-06 | 1968-08-09 | Nouvelles compositions cosmétiques à base de dérivés planctoniques | |
| LU70601A1 (hu) * | 1974-07-24 | 1976-05-31 | ||
| FR2283223A1 (fr) * | 1974-08-26 | 1976-03-26 | Synthelabo | Procede de culture industrielle de sulfuraires en vue, notamment, d'une utilisation dermatologique et cosmetologique |
-
1978
- 1978-11-01 CH CH1123078A patent/CH634877A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1978-12-06 FR FR7834334A patent/FR2440403A1/fr active Granted
-
1979
- 1979-10-10 LU LU81771A patent/LU81771A1/fr unknown
- 1979-10-11 BE BE0/197605A patent/BE879360A/fr not_active IP Right Cessation
- 1979-10-11 DE DE2941310A patent/DE2941310C2/de not_active Expired
- 1979-10-12 AT AT0667579A patent/AT365234B/de not_active IP Right Cessation
- 1979-10-12 DK DK431979A patent/DK149781C/da active
- 1979-10-15 IL IL58451A patent/IL58451A/xx not_active IP Right Cessation
- 1979-10-15 GR GR60260A patent/GR73004B/el unknown
- 1979-10-15 SE SE7908516A patent/SE443996B/sv not_active IP Right Cessation
- 1979-10-15 FI FI793195A patent/FI65448C/fi not_active IP Right Cessation
- 1979-10-16 ZA ZA00795509A patent/ZA795509B/xx unknown
- 1979-10-17 GB GB7936050A patent/GB2034687B/en not_active Expired
- 1979-10-26 IT IT50674/79A patent/IT1164025B/it active
- 1979-10-29 AU AU52264/79A patent/AU528629B2/en not_active Ceased
- 1979-10-29 CA CA338,662A patent/CA1123355A/fr not_active Expired
- 1979-10-29 MX MX798459U patent/MX5937E/es unknown
- 1979-10-29 HU HU79NE622A patent/HU180030B/hu not_active IP Right Cessation
- 1979-10-30 JP JP14040979A patent/JPS56109589A/ja active Granted
- 1979-10-30 CS CS797378A patent/CS213399B2/cs unknown
- 1979-10-31 DD DD79216588A patent/DD147251A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-10-31 SU SU792836784A patent/SU1090263A3/ru active
- 1979-10-31 ES ES485566A patent/ES485566A1/es not_active Expired
- 1979-11-01 NL NL7908024A patent/NL7908024A/nl not_active Application Discontinuation
-
1981
- 1981-02-02 US US06/230,421 patent/US4419449A/en not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-06-17 SG SG345/83A patent/SG34583G/en unknown
-
1984
- 1984-02-09 HK HK113/84A patent/HK11384A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-12-30 MY MY264/84A patent/MY8400264A/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU180030B (en) | Process for producing material of bacteriostatic activity | |
| Wong et al. | Identification of Pseudomonas tolaasi: the white line in agar and mushroom tissue block rapid pitting tests | |
| Park et al. | Pathogenic Microörganisms: A Practical Manual for Students, Physicians, and Health Officers | |
| Kulp et al. | Comparative study of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus bulgaricus | |
| Muir et al. | Manual of bacteriology | |
| Goadby | The mycology of the mouth: a text-book of oral bacteria | |
| Russell | The isolation of typhoid bacilli from urine and feces with the description of a new double sugar tube medium | |
| Torrey et al. | Cultural methods for the gonococcus | |
| Hewlett | A Manual of bacteriology | |
| Knaysi | Morphological and Cultural Studies of Bacillus megatherium with special Reference to Dissociation | |
| Peckham | THE INFLUENCE OF ENVIRONMENT UPON THE BIOLOGICAL PROCESSES OF THE VARIOUS MEMBERS OF THE COLON GROUP OF BACILLI: An Experimental Study. | |
| Wolbach et al. | A critical Review of the Bacteriology of Human and Rat Leprosy | |
| Reed | A manual of bacteriology for agricultural and general science students | |
| Khikmatovna | CHARACTERISTICS OF MICROORGANISMS ISOLATED FROM THE GASTROINTESTINAL TRACT OF FISH | |
| Bulleid | A text-book of bacteriology for dental students | |
| Al-hassan et al. | Physicochemical Properties, Isolation and Identification of Pseudomonas Aeruginosa from the Skin of Some Selected Pond Grown Catfish from Gwagwalada Area Council Abuja | |
| Newton | Marine spore forming bacteria | |
| SU721487A1 (ru) | Штамм N563 ,используемый дл вы влени лизогенных штаммов молочнокислых стрептококков | |
| Park et al. | Pathogenic microörganisms: a practical manual for students, physicians and health officers | |
| Hewlett | A manual of bacteriology clinical and applied | |
| Harden | The fermentation of sugars by Bacillus coli communis and allied organisms | |
| Jordan | An attempt to grow tubercle bacilli within the single-celled organism Colpidium campylum | |
| KETRON | THE ACNE BACILLUS: VARIATIONS IN THE CULTURAL AND MORPHOLOGIC CHARACTERISTICS | |
| RU2213140C2 (ru) | Штамм бактерий bifidobacterium infantis 37b для приготовления биологически активных добавок, регулирующих микрофлору кишечника у детей раннего возраста | |
| RU2068880C1 (ru) | Способ выделения листерий из пищевых продуктов |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |