NL7908024A - Werkwijze voor het bereiden van een stof met bacteriostatische werking. - Google Patents

Description

*

V

v TO 3531

Merkwijze voor hst bereiden van een stof met bacteriostatische werking.

3e uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een stof met een bacteriostatische werking.

Terschillende Europese zwavelbevattende thermische bronnen bevatten microörganismen die wanneer zij zich op een plaats op-5 hopen waar de stroming gering is een witte tot lichtgrijze ge- latineuze stof vormen, die de naam baregine heeft gekregen naar analogie van de warme bronnen van Barsges, een Franse badplaats uit de Pyreneeën. Het baregine kan worden omschreven als een associatie van verschillende bacteriën die zwavelwaterstof bin-10 den, aangepast aan hoge temperaturen, waarvan enkele in staat zijn een slijm af te scheiden waarin het geheel is ingebed. Men vindt in het baregine zowel dode al3 levende elementen.

Men heeft reeds lang de therapeutische eigenschappen van het baregine ingezien; het is reeds vroeg gebruikt voor de be-15 handeling van rheumatische aandoeningen door massage, alsmede voor het behandelen van bepaalde huidziekten. Het is een bestanddeel van cosmetische produkten voor de huidverzorging.

Haar bereiding en winning vormen het onderwerp van octrooien die vooral betrekking hebben op het kweken onder na-20 tuurlijke omstandigheden volgens verschillende werkwijzen van stroming van het bronwater. Een soortgelijk procédé wordt tegenwoordig toegepast bij de nationale thermische bronnen van Aix-les-3ains in Erankrijk. 3e inrichting bestaat uit-een verticale betonnen muur, die aan zijn bovenzijde van een goot is 25 voorzien. Het bronwater, toegevoerd door een leiding van de na bij gelegen bron stort zich uit in de goot en stroomt langs de wanden van de muur. 3e bareginevlokken met afmetingen van de orde van 1 cm hechten zich aan de uitsteeksels van het beton.

Een gelatineuze film van baregine groeit uit de aangehechte 50 vlokken aan en wordt periodiek gewonnen door afkrabben van de 7908024 •r 2 · * muur met een harde horstel. De temperatuur van het water en van de ruimte waarin deze muur is geplaatst ligt dicht hij de temperatuur waarbij het water de hron verlaat, te weten ongeveer 43-47°C. Het produktierendement is bijzonder klein. Het he-5 draagt tot ongeveer 5 g droog gewicht baregine/m /maand. Het is bovendien onderworpen aan variaties van verschillende factoren, afhankelijk van de meteorologische omstandigheden.

Het baregine is het onderwerp geweest van microbiologische en biochemische studies. Deze hebben het metabolisme van de H^S 10 en van de zwavelverbindingen verklaard, maar hebben niet de oorsprong van de therapeutische eigenschappen van het baregine opgehelderd. Onder de talloze in het baregine geïdentificeerde microörganismen wordt de Eeggiatoa vaak aangehaald. Echter zijn de zeldzame isoleringen van Beggjatoa, bekend uit de publica-15 ties, nimmer geschied uit baregine maar uit slib en gebruikt water. Bovendien zijn deze isoleringen lang en moeilijk gebleken en het kweken van de geïsoleerde microörganismen heeft slechts zeer geringe rendementen gegeven, gezien onder andere hun broosheid en hun zeer hoog watergehalte. Men kan als ken-20 merkend beschouwen een gepubliceerde waarde van 1,2 g gewicht vers geproduceerde microörganismen in 48 uren bij 28°C, zonder roeren, per liter kweekmedium, dat 2 g gistextract, 0,1 g na-triumacetaat alsmede actieve katalase bevat.

Volgens de onderhavige uitvinding is het mogelijk een ren-25 dabele produktie op industriële schaal te verschaffen van een stof met een bacteriostatische activiteit analoog aan die van het baregine.

De werkwijze volgens de uitvinding is hierdoor gekenmerkt, dat men een microörganisme van het type Eeggiatoa kweekt in een 30 waterig voedingsmedium onder aerobe omstandigheden, onder roe ren, en men de celmassa en/of het kweekmedium wint.

Men heeft namelijk vastgesteld dat een celmassa van micro-organismen van het type Eeggiatoa en zelfs het milieu waarin men deze heeft geproduceerd, een bacteriostatische activiteit 35 vertonen. Men' heeft eveneens vastgesteld dat de broosheid van 7908024 + 3' * * het microörganisme geen he zwaar inhoudt voor zijn intensieve cultuur in een krachtig geroerd medium en dat het zich zelfs vermenigvuldigt als de filamenten, dat het vormt, in talrijke fragmenten worden verbroken. Aldus heeft het zelfs voordeel een 5 entsel van het microorganisms van het type Beggiatoa te homoge niseren alvorens er mede het kweekmedium te enten.

Met opzet wordt hier en in het vervolg de term "microörga-nisme van het type Beggiatoa" gebruikt en niet "microörganisme van het genus Beggiatoa'1. Het genus Beggiatoa behoort tot de 10 klasse der "gliding bacteria", orde der myxobacterales, familie der Beggiatoaceae" (vergelijk Sergey's Manual of Determinative Bacteriology, Eighth Edition, Waveriy Press, Baltimore, TJ.S.A., 197A, biz. 112-114}. Zoals men in laatstgenoemd werk dat op dit gebied autoriteit bezit, kan lezen, is bij het klassificeren 15 van microörganismen van dit genus enige voorzichtigheid geboden, daar slechts weinig zekere informatie beschikbaar is. Het zou ongeschikt zijn zich te beperken tot een zodanig wetenschappelijk nauwkeurig vaststaande term als genus als men de gevoeligheid van de klassificering van de microörganismen in kwestie 20 kent. Onder de uitdrukking "microörganisme van het type

Beggiatoa" dienen hier derhalve te worden verstaan draadvormige bacteriën, kenmerkend voor de zwavelhoudende bodems en wateren, waarvan de niet-gekleurde filamenten beweeglijk zijn door glijden en bestaan uit cellen in ketens, zoals b.v. de bacteriën ga-25 klasseerd in het genus Beggiatoa.

Bij voorkeur verkrijgt men het microörganisme van het type Beggiatoa door het uit het baregine te isoleren. Men stelt vast, dat een dergelijke isolering mogelijk is door op een bepaalde wi.jze te werk te gaan en dat de daarmede verkregen stammen kun-30 nen worden gekweekt en een bacteriostatische activiteit vertonen.

Tenslotte heeft men vastgesteld, dat zelfs het probleem van hun bewaring bevredigende oplossingen kan vinden.

Om een stam te isoleren kan men een monster baregine op een agar-voedingsmedium aanbrengen, incuberen van 5-36 uren bij 35 seri temperatuur van A 5 - 5Q°0, een zone uitsnijden waar de fila- 7908024 4 yt meuten van een microörganisme van het type Beggiatoa vrij zijn van verontreinigingen, deze zone aanbrengen op een met het eerste identiek agar-bevattend voedingsmedium en de handelingen van incuberen uitsnijden en overenten twee- tot driemaal herha-5 len. Aldus heeft men de 8 stammen geïsoleerd die op 12 juli 1978 werden gedeponeerd bij de Nationale collectie van Industriële bacteriën (N.C.I.B.) van Aberdeen, Schotland en die de nummers N.C.I.B. 11418-11425 hebben verkregen. De onderhavige werkwijze kan derhalve worden uitgevoerd met b.v. ten minste 10 een van deze 8 stammen.

Bij voorkeur bevat het voor het isoleren toegepaste agar-bevattende voedingsmedium 1-4 g gistextract en 10-20 g agar per liter water. * -

Evenzo bevat het voor het kweken geprefereerde waterige 15 voedingsmedium 1-4 g gistextract, 0,1-0,3 g calciumchloride en 0,2-1 g natriumacetaat of ammoniumacetaat per liter water. Om de kweek te beschermen kan men ook katalase aan het milieu toevoegen in een hoeveelheid van b.v. 5-20 internationale eenheden (ü.I.) per cm^. Men kan hst microörganisme kweken bij een tem-20 peratuur 'van 20-50°C gedurende 5-36 uren bij een pH van 6-8. t

Bij voorkeur kweekt men het bij een temperatuur van 30-40°C gedurende 8-10 uren bij neutrale pH.

De met de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding verkregen stof met bacteriostatische werking kan b.v. als zodanig 25 worden toegepast voor huidmassages, of als bestanddeel van een cosmetisch huidpreparaat. De celmassa kan in gedroogde vorm worden bewaard. Men droogt haar bij voorkeur door lyofiliseren gezien haar broosheid en haar laag gehalte aan droog materiaal. De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van onder-30 staande voorbeelden. De naam "Beggiatoa" wordt hierin systema tisch toegepast en dient te worden verstaan in de zin van de uitdrukking "microörganisme van het type Beggiatoa".

Voorbeeld I (isolering van de stammen)

Een vlok verse baregine, afgenomen van de nationale bron-35 nen van Aix-l.es-Bains wordt in het midden geplaatst van een 7908024 5 petrischaal, bevattend. 20 ow? agar-bevattend milieu, bereid volgens onderstaand recept: gistextract (Oifco) 2 g agar (3acto-3ifco) 1 5 g 5 bronwater van Aix, gefiltreerd 100 cm^ gedestilleerd water 900 cm'.

Men plaatst de schaal ondersteboven in een broedstoof bi.j 30“0 gedurende 30 uren. Men onderzoekt haar vervolgens onder een microscoop met geringe vergroting op de aanwezigheid van 10 structuren met kenmerkende spiralen van Beggiatoa en afkomstig van de beweeglijkheid door glijden van deze microörganismen. Enkele ervan zijn zelfs zichtbaar met het blote oog. Het microscopisch onderzoek openbaart eveneens zonen, waarin de filamenten van Beggiatoa vrij schijnen van verontreiniging. Men snijdt 15 één van deze zonen uit met een steriel mes en plaatst haar op een maagdelijke agar-plaat van dezelfde samenstelling als de eerste waarbij men ervoor zorgt het oppervlak dat de filamenten van Beggiatoa bevat, te plaatsen tegen het maagdelijke oppervlak van de nieuwe agar-plaat. Men incubeart opnieuw bij $0°0 9q gedurende 24. uren. Men herhaalt de bewerking van uitsnijden, overenten en in cube ren 'nog tweemaal. Men krijgt een zuivere culture van Beggiatoa.

Voorbeeld II (bewaren van de stammen)

Men isoleert een tiental stammen op de wijze beschreven in voorbeeld I. Zij verschillen van elkaar door de diameter van 25 hun lilaaenten, hun glijsnelheid en de vorm van hun kolonies op agar. Men bewaart hen met succes op drie verschillende wijzen, afhankelijk van het feit of het korte, middelmatige of lange +srmijn betreft.

2.1 Korte termijn: Men bewaart de plaat in de koelkast bij ^ A°C, waarbij men er voor zorgt de petrischaal af te dichten.

2'en brengt de stam om de 10 dagen over omdat de agar de neiging heaft uit te drogen.

2.2 Middelmatige termijn: Men bereidt een half-vloeibaar jailieu van de volgende samenstelling: 35 7908024 6 * gistextraot 2 g

CaClg 0,1 g natriumacetaat 0,5 g agar 2 g 5 gefiltreerd, bronwater 1000 cm'*.

ffa steriliseren van het milieu voegt men er schimmel-kata-lase aan toe in een hoeveelheid van 10 U,I./cm^. Men steriliseerde de katalase-oplossing eerst door filtratie in de koude op een Millipoor-filter met microscopische poriën van 0,22yu.

10 Men plaatst een kleine agar-kubus die Beggiatoa bevat in een buis die 10 cm^ medium bevat. Men incubeert bij 30°C. De Beggiatoa ontwikkelt zich in het bovendeel van de buis. Men kan de buis 3 weken op 30°C bewaren. Men brengt de cultuur vervol-gens over in een hoeveelheid van 0,1 cm per buis.

15 2.3· Lange termijn: Men bereidt een vultuur van 24 uren in een medium, geroerd op de wijze, beschreven in voorbeeld III. Men cetrifugeert het. Men was de afzetting met steriele Ringer-oplossing. Men bevriest en lyofiliseert het sediment. Men bewaart het verschillende maanden in de koelkast in een goed ge-„ 20 sloten vat. Reeds vanaf de rehydratatie zijn de filamentfrag- menten in staat zich te ontwikkelen.

Voorbeeld III (kweken van de stammen) 3.1. Sntsel

Men snijdt een kleine kube agar van 5 mm ribbe uit uit een 25 plaat, verkregen op de wijze, beschreven in voorbeeld I. Men 3 3 plaatst haar in een fles van 500 cm , dia 100 cm van het onderstaande medium bevat: gistextraot 4 g calciumchloride 0,2 g 30 ammoniumacetaat 1 g gefiltreerd bronwater 1000 cm'*.

Dit medium bezit een pH van é,6. Men plaatst de fles op een planeetroerder, roterend met 150 omw/min bij een omwente-lingsstraal van 1,25 cm. Men laat haar daarin 16 uren bij 30°C. 35 Men homogeniseert de verkregen kweek met behulp van een menger 7908024 e 7

Sorvall-Omni-mixer gedurende 15-39 seconden onder steriele omstandigheden. De gehomogeniseerde kweek vormt het entsel.

3.2. Pultuur

Men "brengt 5 cm^ van het boven beschreven entsel in een x 3 5 fles van 500 cm'- die 100 cm van hetzelfde medium bevat als dat, gebruikt voor het bereiden van het entsel. "en incubeert de fles 24 uur bij 50°C op een planeetroerder. Men verkrijgt 0,3 g droog materiaal Bsggiatoa per liter kweekvloeistof. Door herhalen van de bewerking met verschillende stammen en door de 10 omstandigheden binnen de toelaatbare grenzen te variëren, ver krijgt men rendementen tussen ongeveer 0,5 en 2 g Beggiatoa droog per liter kweek.

3.3. P.egeling van de groei

De klassieke nefelometrische methode, toegepast op bacte-15 rie-cultures is niet bruikbaar voor Beggiatoa vanwege zijn type in vlokken te groeien. Men past deze methode aan op dit bijzondere geval. Men neemt monsters van de kweek om de 2 uren af en homogeniseert hen met de menger Sorvall-Omni-mixer. Men leest hun optische dichtheid bij 600 nm op een spectrofotometer. Eet 20 gehomogeniseerde monster set zich slechts zeer langzaam af en maakt een betrouwbare aflezing mogeiijk. Men verkrijgt aldus een*indicatie over de groei in rechtstreekse relatie met het aantal cellen.

3.4. 3enaling van het drooggewioht 25 3e klassieke droogmethode in de oven geeft geen reprodu ceerbare resultaten voor Beggiatoa. Dit is hoogstwaarschi.inl-i een gevolg van zijn zeer hoog watergehalte. Daarom droogt men ter verkrijging van reproduceerbare resultaten niet minder dan 400 cm^ kweek door lyofiliseren.

30 3·5· Benaling van de bacteriostatischs activiteit

De klassieke evalueringsmethode van de bacteriostatische activiteit van the Public Health Laboratory Service Comités, beschreven in British Medical -Journal, 409 (1965) geeft geen bevredigende resultaten in dit bijzondere geval vanwege het 35 feit dat de proef in buizen wordt uitgevoerd. Beggiatoa is na- 7908024 # 8 melijk zeer streng aëroob en de zuurstofconcentratie die in een proefbuis aanwezig is is onvoldoende. Men past derhalve de methode aan en men werkt in .geroerde flessen om de overdracht van zuurstof te bevorderen.

5 Men bereidt drie reeksen flessen van 50 cm^ elk bevattend 18 cm^ voedingsbouillon (Natrient Broth Difco). Men ent de flessen van de eerste en de tweede reeks elk met 0,4 cm^ van een kweek van 24 uren van een pathogene stam. Men gebruikt drie pathogene stammen, te weten Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, 10 Bsoherioia ooli ATCC 11755 en- Staphylococcus aureus ATCC 12600.

Men bereidt monsters van het bacteriostatische produkt door centrifugeren van een kweek, verkregen op de wijze als beschreven in voorbeeld III, nr. 2, doch slechts in 8 uren. De gecentrifugeerde celmassa wordt gehomogeniseerd en gehersuspen-15 deerd in een volume fysiologische oplossing gelijk aan het vo lume bovenstaande vloeistof achterblijvend na het centrifugeren. De fysiologische oplossing die de celmassa en de bovenstaands vloeistof bevat worden elk verdeeld in monsters van 2 cm^.

Aan de flessen van de eerste reeks voegt men toe 2 cm^ 20 fysiologische oplossing die de gehomogeniseerde celmassa bevat.

Aan de flessen van de tweede reeks voegt men toe 2 cm^ van alleen de fysiologische oplossing. Aan de flessen van de derde 3 reeks die niet zijn geënt met een pathogeen voegt men toe 2 cm fysiologische oplossing die de gehomogeniseerde celmassa bevat. 25 Men. incubeert de flessen bij 37°C op een planeetroerder.

Men bepaalt hun optische dichtheid bij éOO nm na 16. uren. De bepalingen van de optische dichtheden van de flessen overeenko-' mend met de reeksen 1, 2 en 3 verschaffen de parameters A, B respectievelijk C, Het verschil van A - C onttrokken aan B ver-30 volgens gedeeld door B en vermenigvuldigd met 100 geeft de bac teriostatische activiteit van de oelmassa in $ remming.

Men gaat op dezelfde wijze te werk voor het bepalen van de bacteriostatische activiteit van de bovenstaande vloeistof door aan de flessen van de eerste en derde reeks 2 cm^ van de boven-33 staande vloeistof in plaats van 2 cm^ van de fysiologische op- 7908024 9 ' t s« lossing, die de gehomogeniseerde biomassa bevat, toe te voegen.

Be resultaten zijn samengevat in onderstaande tabel,

Pathogene bacterie Activiteit Activiteit celmassa bovenstaande 5 (f> remming) vloeistof (f? remming) ?, aeruginosa 70 41 S, aureus 100 45 Ξ, coli 70 11 10 Toorbeeld IT (vergelijkend)

Ter vergelijking bepaald men op de wijze, beschreven in voorbeeld III, nr. 5 de bacteriostatische activiteit van het natuurlijke baregins. Ven vindt in f3 remming na 16 uren incu-beren, 100^, 83fi) 96^ tegenover respectievelijk P, aeruginosa, 15 3, aureus en S, coli. Tiet andere woorden is de bacteriostati- sche activiteit van de celmassa volgens de onderhavige uitvinding nagenoeg even groot als die van het baregine. Bit is een opmerkelijk resultaat als men in aanmerking neemt, dat de onderhavige celmassa kan worden geproduceerd met een goed rende-20 ment op industriële schaal, terwijl het baregine slechts lang zaam en in zeer geringe hoeveelheden wordt verkregen, Be activiteit van de bovenstaande vloeistof volgens de uitvinding ofschoon kleiner, ontbeert evenmin belang,

Voorbeeld 7 (stammen 2T.C.I.3,) 25 t stammen werden geïsoleerd, op de wijze beschreven in voorbeeld I, gedeponeerd op 12 juli 1978 in de National Collection of Industrial Bacteria (U.C.I.B.) te Aberdeen in Schotland en hebben, zoals reeds vermeld, de nrs. ÏT.O.I.B. 11418-11425 ontvangen. Deze stammen kunnen worden gekenmerkt door hun $0 groeieigenschappen, hun morfologie bij het kweken op agar en in vloeibaar milieu alsmede door hun bacteriostatische activiteit.

Onderstaande tabel vermeldt de optische dichtheid van kweken die men verkrijgt na 5 uren, 10 uren en 2k uren door kweken 7908024 10 ¥ f van elk dezer stammen op de wijze, beschreven in voorbeeld in, nr. 2, de celmassa's verkregen na 24 uren, alsmede de bacterio-statische activiteit van de celmassa's verkregen na 8 uren kweken, tegenover drie pathogene stammen P. aeruginosa, 5 aureus 5 en E. col'i. De morfologieën zijn vervolgens gescheiden aange geven voor elke stam.

* % 7908024 f 11 Ή ooe— <3- o oo cm om σ\ 1— v « 33

-P

•H iö « Φ d d -P -Η ® •H S ^ > 3 d MO M3 vO 00 O O 1-

Hffld C— O CA CT\ GO 00 00 CA

-P U

o · < ^ τη d m o d •Hl £

ShOOOOOO^· c— o

® O O O O MO E— UA O

Φ v1 r1 t~ t— T” * P-i i—l j—1 d Ï3Q d m O d §2 O Ή t- LTl tT\ LEA UA CA CA v- «sfnP o\ o. o o p o ir\t- Ητ3Φ ·»·1·»·1·1·2·^ r—ï -POOOOOOO^-

® 5c d o ' S

f4 d d κ-\·<3-σΝνοΐΓιαο!>-οο co o ^ o t~- co na

SJ- ιΓ\ [TA C— \Q NA NA UA CO

CM

o o o o o o o o d •Ö d •r4 - ... _____ ____________ ,^____ ______ α) Λ -P f4 Λ 2 o d •H ArC“C'J'TVCt'’-

T30 t-CM-^TOOCA-NMCO

t- E~- MO •d" ^ NA rf i·— CA

XI d oooooooo o d w_________ •rï -p P4 fn o d d f— CMC— OCAOC~- <0\

NA Lf\ -tT MO COM3 1- CA tf\ CM NA i— 1— CM NA CM NA

»» fn »S 1· Λ Λ Λ d oooooooo d 7908024

inPO CO CA O t- CM NA "3- UA

d· t-t-CMCMCMCMCMCM

f—! S· 2 d O r-T-T-T- — ^1-1- 4^ · ^^^— ^—· t— v- T- co !s - t 12 f

Morfologieën K.G.I.B. 114-13

Op Agar: vormt grote geïsoleerde kolonies van 8-15 mm diameter met een wit centrum en doorschijnende randen. Microscor 5 pisch onderzoek (x 100); De kolonie Bestaat uit goed zichtbare stijf gewonden spiralen.

In vloeibare cultuur; Homogene cultuur. Microscopisch onderzoek: (x 4OO): Lange filamenten van 80 x 1,8 ju. vaak gevormd uit korte zeer duidelijke bacillen. Geen aggregering. Weinig 10 lioht-brekende inclusies.

N.C.I.B. II419

Op agar: vormt geïsoleerde witte kolonies met 4-8 mm diameter met diffuse randen. Dikke strengen strekken zich radiaals-gewijze straalvormig uit, vanaf het centrum van de kolonie maar 15 bereiken de randen niet. Microscopisch onderzoek (x 100): De randen van de kolonie bestaan uit filamenten stijf gewonden spiralen.

In vloeibare cultuur: homogene cultuur. Microscopisch onderzoek (x 400): geïsoleerde zeer korte filamenten van 3,6 x 20 0,9jx verdeeld door zeer duidelijke samensnoeringen. Geen on smeltbare inclusies. Vorming van aggregaten.

H.C.I.B. 11420

Op agar: Vorm van geïsoleerde kolonies plat en ondoorschijnend van 2-5 mm diameter met randen met franje. Microscopisch 25 onderzoek (x 100): Kolonies, bestaande uit fragmenten van fila menten gevormd uit weinig ontwikkelde spiralen,

In vloeibare cultuur: homogene cultuur. Microscopisch onderzoek (x 400): Geen filamenten. Lange bacillen van 9 x 1>4yU, die enkele lichtbrekende inclusies bevat.

50 ff.C.I.B. 11421

Op agar: Vormt gescheiden kolonies van 4-7 mm diameter met diffuse randen, sterk gelijkend op die van stam IT.C.I.B. H419 maar witter. De randen van de kolonies zijn doorschijnend. Microscopisch onderzoek: (x 100): Geen zichtbare spiralen.

35 In vloeibare cultuur: homogene cultuur. Microscopisch on- 7908024 15

Tm derzoek (x 4.00): Beeld soortgelijk aan dat ran "stam IT.C.I.B.

11420. Geen filamenten, lange "bacillen van 18 x 1,4 j, die enkels licht-brekende inclusies "bevatten. Geen aggregaten.

't n t T5 11422 5 On agar: 7ormt nimmer geïsoleerde kolonies. Bedekt het ge hele oppervlak met doorschijnende mycoide strengen, Microsco-pisch onderzoek (x 100): strengen gevormd uit verschillende filamenten.

In vloeibare cultuur: homogene cultuur met enkele kleine 10 aggregaten vanaf het zesde uur. Microscopisch onderzoek (x 400): lange gescheiden filamenten van 90 x 1,4 x 1,8 j. Filamenten verdeeld in lange eenheden door duidelijke insnoeringen. Zeer weinig licht-brekende inclusies.

M.C.I.3. 11425 15 Op agar: Gelijkend op stam IT.C.I.B. 11422. Geen geïsoleer de kolonies. Lichte en 7reinig zichtbare mycoide strengen. Microscopisch onderzoek (x 100) duidelijker strengen omdat deze bestaan uit een groter aantal filamenten.

In vloeibare cultuur; vorm van grote vlokken (aggregaten).

20 Microscopisch onderzoek (x 400)s 7eel kortere filamenten dan t die van stam IT.C.I.3. 11422 en in segmenten verdeeld door zeer duidelijke insnoeringen. Lengte van 9-10 x 1,8 jl. Lichtbrekende inclusies verschijnen zeer snel reeds na 5 uren.

IT.C.I.3. 11424 25 Qo agar: Gelijkend op stam IT.C.I.3. 11423. Geen geïsoleer de kolonies. Mycoide strengen. Microscopisch onderzoek (x 100):

Strengen gevormd uit een groot aantal filamenten.

In vloeibare cultuur: vormt grote vlokken (aggregaten).

Microsoopisoh onderzoek (x 400): Lange filamenten van 140 x 30 1,8^i, die lange bundels vormen. Geen zichtbare insnoeringen.

Late ontwikkeling na 10 uren, licht-brekende inclusies.

IT.C.I.3. 11425

Op agar: 7ormt geïsoleerde ondoorschijnende kolonies van 2 x 6 mm diameter. Microscopisch onderzoek (x 100): Kolonies 35 bestaande uit filamenten gevormd uit geïsoleerde cellen en 7908024 * vr Η nauwe spiralen vormend.

In vloeibare cultuur; homogene cultuur. Microscopisch onderzoek (x 400)5 korte homogene filamenten van 4 x 1,4 ƒ1· Weinig lichthrekende inclusies.

α 1 7908024

Claims (6)

1, Terkwijze voor het bereiden van een stof met bacterio-statische activiteit, met het kenmerk, dat men een microörga-nisme van het type Beggiatoa kweekt in een waterig voedingsme-dium onder aerobe omstandigheden en onder roeren en men de cel- 5 massa an/of het kweekmilieu wint.

2. Tverkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het microörganisme van het type 3eggiatoa verkrijgt door het uit haregine te isoleren. 3« Merkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men 10 voor het isoleren van een stam een monster haregine afzet op een agar-hevaitend voedingsmedium, incubeert 5-36 uur bij een temperatuur van 20-50°C, een zone uitsnijdt, waar de filamenten van een microörganisme van het type 5eggiatoa vrij zijn van verontreinigingen, men deze zone afzet op een agar-bevattend 15 voedingsmedium, dat identiek is aan het eerstgenoemde en men de be?;erkingen van incuberen, uitsnijden en overenten 2-3 malen herhaalt. i. Merkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het microörganisme van ,het type Beggiatoa ten minste één der 8 stam-20 men Ιί.Ο.Ι.Ξ. 11413 tot :1.0.1.3. 11425 is. 5. ’."erkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men alvorens het waterige voedingsmedium te enten met een entsel van het microörganisme van het type Beggiatoa men het entsel homogeniseert.

6. Merkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men Λ het microörganisme kweekt bij een temperatuur van 20-50 0 gedurende 5-5° uren bij een pE van 0-8. 7. '.Terkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het microörganisme kweekt bij een temperatuur van 30-40°0 gedu- 50 rende 18 uren bij neutrale pE. 8. ï’erkwijze volgens conclusie 1 , met het kenmerk, dat men de eeimassa wint en deze lyofiliseert. 9. “erkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het. waterige voedingsmedium 1-4 g gistextract, 0,1-0,3 g calcium- 7908024 Λ chloride en 0,2-1 g natrium- of ammoniumaoetaat per liter water "bevat.

10. Werkwijze volgens conclusie 9> met het kenmerk, dat het water een zwavelhoudend bronwater is.

11. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het agar-bevattende voedingsmedium bestaat uit 1-4 g gistextract en tot 20 g agar per liter water,

12. Stof met bacteriostatische activiteit verkregen volgens de werkwijze van conclusies 1-11. 7908024