DE2941310A1 - Verfahren zur herstellung eines stoffs mit bakteriostatischer aktivitaet - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines stoffs mit bakteriostatischer aktivitaet

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DE2941310A1 DE19792941310 DE2941310A DE2941310A1 DE 2941310 A1 DE2941310 A1 DE 2941310A1 DE 19792941310 DE19792941310 DE 19792941310 DE 2941310 A DE2941310 A DE 2941310A DE 2941310 A1 DE2941310 A1 DE 2941310A1
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Stoffs mit bakteriostatischer Aktivität.
Mehrere europäische schwefelhaltige Thermalquellen enthalten Mikroorganismen, die, wenn sie sich an einer schwach strörr.enden Stelle ansammeln, einen weißen bis hellgrauen gelatinösen Stoff bilden, welcher den Namen "Baregin" erhalten hat. Dieser Name kommt von den Thermalquellen von Bareges, einem französischen Thermalbad in den Pyrenäen. Das Baregin kann definiert werden als Ansammlung verschiedener Bakterien, die Schwefelwasserstoff binden, die an erhöhte Temperaturen gewöhnt sind und von denen einige dazu fähig sind, einen Schleim abzusondern, in welchem das Ganze eingehüllt ist. Im Baregin werden sowohl tote als auch lebende Elemente festgestellt.
Die therapeutischen Eigenschaften von Baregin sind seit lanaer Zeit bekannt. Sie wurden sehr früh zur Behandlung von rheumatischen Zuständen durch Massaqe wie auch zur Heilunq qewisser Hauterkrankunqen ausgenutzt. Bareqin hat auch Eingang in die Zusammensetzung kosmetischer Produkte für die Hautpflege gefunden.
Seine Erzeuqunq und Gewinnunq sind Geqenstand von Patenten, die vor allem auf der Kultivierung unter natürlichen Bedingungen durch verschiedene Berieselungsverfahren mit Quellwasser beruhen. Ein ähnliches Verfahren wird gegenwärtig von den Thermes Nationaux d'Aix-les-Bains in Frankreich verwendet. Die Anlage besteht aus einer vertikalen Betonmauer, die an ihrer Oberseite mit einer Rinne ausgerüstet ist. Das Thermalwasser, das über eine Leitung von der benachbarten Quelle herangeführt wird, ergießt sich in die Rinne und rieselt über die Oberfläche der
Mauer. An den Rauhstellen des Betons bleiben Bareginflocken
mit den Abmessungen in der Größenordnung eines Zentimeters hängen,
0 3 0 0 2 0 / 0 R 8 A
29Α1310
Ausgehend von diesen haftenden Flocken wächst ein gelatinöser Bareginfilm, der durch Abkratzen der Mauer mit einer harten Bürste periodisch geerntet wird. Die Temperatur des Wassers und des Raums, in welchem sich diese Mauer befindet, liegt in der Nachbarschaft der Temperatur des austretenden Quellwassers, d.h. also bei etwa 43 bis 47° C. Die Produktionsausbeute ist äußerst schwach. Sie liegt bei etwa 5 g Trockengewicht Baregin
2
je m und je Monat. Darüberhinaus unterliegt sie dein Fir.flu.'7 verschiedener Faktoren, welche von metereologischen Bedingungen abhängen.
Das Baregin war Geaenstand mikrobiologischer und biochemischer Studien. Durch diese wurde zwar der Stoffwechsel von H^S und von schwefelhaltigen Verbindungen aufgeklärt, sie haben jedoch keine Klärung des Ursprungs der therapeutischen Eigenschaften des Baregins gebracht. Unter den zahlreichen, in Baregin identifizierten Mikroorganismen wird der Beggiatoa häufig genannt. Jedoch war bei den seltenen durch Publikationen bekanntgewordenen Isolierungen von Beggiatoa niemals von Baregin ausgegangen worden, sondern stets von Schlamm und Abwässern. Darüberhinaus haben sich diese Isolierungen als lang und schwierig erwiesen. Außerdem hat die Kultivierung der isolierten Mikroorganismen nur sehr schwache Ausbeuten geliefert, unter anderem wegen ihrer schwachen Struktur und ihres sehr hohen Wassergehalts. Als charakteristisch kann ein publizierter Wert angesehen werden, wonach in 48 Stunden bei 28 C ohne Rühren in 1 Kulturmedium, das 2 g Hefeextrakt, 0,1g Natriumacetat und aktive Katalase enthält, 1,2 g Frischgewicht an Mikroorganismen produziert werden.
Durch die vorliegende Erfindung wird nun im industriellen Maßstab eine rentable Erzeugung eines Stoffs ermöglicht, der eine ähnliche bakteriostatische Aktivität wie Baregin besitzt.
Das erfindunqsqemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus vom Typ Begqiatoa in einem wäßrigen
030020/0594
Nährmedium unter aeroben Bedingungen und unter Rühren kultiviert und die Biomasse und/oder das Kulturmedium gewinnt.
Es wurde in der Tat festgestellt, daß eine Biomasse eines Mikroorganismus vom Typ Begqiatoa und sogar das Medium, in welchem sie erzeugt worden ist, eine bakteriostatische Aktivität besitzt. Es wurde außerdem festgestellt, daß die schwache Natur des Mikroorganismus kein Hindernis bei der intensiven Kultivierung in einem heftig gerührten Medium darstellt und daß er sich sogar vermehrt, wenn die Fäden, äie er bildet, in eine Anzahl von Bruchstücken zerbrochen werden. Es erqibt sich soqar ein Vorteil, wenn man ein Inokulum eines Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa vor der Beimpfung des Kulturmediums homogenisiert.
Es ist Absicht, wenn hier und in der folgenden Beschreibung der Ausdruck "Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa" und nicht der Ausdruck "Mikroorganismus der Gattung Beggiatoa" verwendet wird. Die Gattung Beggiatoa gehört zur Klasse der "gliding bacteria", welche den Myxobakterien der Familie der Beggiatoaceen zugeordnet werden (siehe Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Eighth Edition, Waverly Press, Baltimore, USA, 1974, Seiten 112-114). Wie man diesem Work entnehmen kann, welches auf diesem Gebiet Ansehen genießt, ist die Klassifizierung der Mikroorganismen dieser Gattung wegen der geringen sicheren verfügbaren Informationen etwas mit Vorsicht zu genießen. Es erscheint deshalb nicht angeraten, sich auf einen so präzisen wissenschaftlichen Ausdruck wie "Gattung" zu beschränken, wenn man die Unsicherheit der Klassifizierung der fraglichen Mikroorganismen kennt. Der Ausdruck "Mikroorganismen vom Typ Beqqiatoa" bezieht sich also hier auf fadenbildende Bakterien, welche für schwefelhaltige Sole und Wasser charakteristisch sind und deren ungefärbte Fäden - da sie aufeinander gleiten beweglich und aus Zellenketten gebildet sind, wie dies beispielsweise bei den Bakterien, die in die Gattung Beggiatoa klassifiziert werden, der Fall ist.
030020/OGBA
Vorzugsweise wird der Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa durch Isolation von Baregin gewonnen. Es wurde festgestellt, daß eine solche Isolierung auf eine spezielle Art möglich ist und daß die dabei erhältlichen Stämme kultivierbar sind und eine präzise feststellbare bakteriostatische Aktivität besitzen. Es wurde schließlich auch festgestellt, daß das Problem ihrer Konservierung in zufriedenstellender Weise gelöst werden kann.
Zur Isolierung eines Stamms kann man so vorgehen, daß man eine Probe von Baregin auf ein gelosehaltiges Nährmedium aufbringt, 5 bis 36 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 50 C inkubiert, eine Zone, wo die Fäden eines Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa frei von Verunreinigungen sind, herausschneidet, diese Zone auf ein mit dem ersten identisches Gelose enthaltendes Nährmedium aufbringt und die Operationen der Inkubation, des Herausschneidens und Wiedereinsetzens zwei- bis dreimal wiederholt.
Es wurden 8 Stämme isoliert, die am 12. Juli 1978 in der National Collection of Industrial Bacteria Aberdeen Schottland niedergelegt wurden und welche die Nummern NCIB 114 18 bis 114 25 erhalten haben. Es ist also möglich, das Verfahren beispielsweise mit mindestens einem dieser 8 Stämme durchzuführen.
Vorzugsweise besteht das für die Isolierung verwendete Gelose enthaltende Nährmedium aus 1 bis 4 g Hefeextrakt und 10 bis 20 g Agar je 1 Wasser.
Gleichfalls enthält das für die Kultivierung bevorzugte wäßrige Nährmedium 1 bis 4 g Hefeextrakt, 0,1 bis 0,3 g Kalziumchlorid und 0,2 bis 1 g Natrium- oder Ammoniumacetat ie 1 Wasser. Um die Kultur zu schützen, kann dem Medium beispielsweise Katalase in einer Menge von 5 bis 20 Internationalen Einheiten (IE) je ml zugesetzt werden. Der Mikroorganismus kann bei einer Temperatur von 20 bis 50° C während 5 bis 36 Stunden bei einem pH-Wert von 6 bis 8 kultiviert werden. Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung bei einer Temperatur von 30 bis 40° C während 8 bis 10 Stunden beim neutralen pH-Wert.
030020/0 5 84
Der Stoff mit bakteriostatischer Aktivität, der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten worden ist, kann im Rohzustand beispielsweise für Hautmassagen oder als Bestandteil von kosmetischen Produkten für die Haut verwendet werden. Die Biomasse kann auch in trockener Form konserviert werden. Sie wird vorzugsweise wegen ihrer schwachen Natur und ihres geringen Feststoffgehalts durch Lyophilisation getrocknet.
Die folgenden Beispiele, welche der Erläuterung dienen, gestatten ein besseres Verständnis der Natur und der Bedeutung der vorliegenden Erfindung. Der Name "Beggiatoa" wird dabei systematisch verwendet und soll im Sinne des Ausdrucks "Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa" verstanden werden.
Beispiel 1: Isolierung von Stämmen
Eine frische Bareginflocke von den Thermes Nationaux d'Aix-les-Bains wird in die Mitte einer Petri-Schale gebracht, die 20 ml Gelose enthaltendes Medium enthält, das nach folgendem Rezept hergestellt worden ist:
Hefeextrakt (Difco) 2 g
Agar (Bacto-Difco) 15 g
filtriertes Thermalwasser aus Aix 100 ml
destilliertes Wasser 900 ml.
Die Schale wird dann 30 Stunden lang in einen Wärmeschrank mit 30° C eingebracht. Eine Untersuchung mit einem schwach vergrößernden Mikroskop läßt die Anwesenheit von spiralenförmigen Strukturen, die für Beggiatoa charakteristisch sind, erkennen und zeigt eine Beweglichkeit der Mikroorganismen aufgrund deren Gleitfähigkeit. Einige sind sogar mit dem bloßen Auge sichtbar. Die mikroskopische Untersuchung zeigt außerdem Zonen, in denen die Beggiatoa-Fäden frei von Verunreinigungen erscheinen. Eine dieser Zonen wird mit einem sterilen Skalpell herausgeschnitten und auf eine frische Agarplatte der gleichen Zusammensetzung wie die erste gelegt, wobei darauf geachtet wird, daß die die Bxiqiatoa-Fäden aufweisende Oberfläche gegen die frische Oberfläche der neuen Agarplatte zu legen. Nun wird erneut 24 Stunden bei 30 C
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g 294131Q
inkubiert. Das Herausschneiden, Umsetzen und Inkubieren wird noch zweimal wiederholt. Auf diese Weise wird eine reine Beggiatoa-Kultur erhalten.
Beispiel 2; Konservierung der Stämme
Es werden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise 10 Stämme isoliert. Sie unterscheiden sich voneinander durch den Durchmesser ihrer Fäden, ihrer Schnelligkeit im Gleiten und der Form ihrer Kolonien auf Agar. Sie werden mit Erfolg auf drei verschiedenen Wegen während einer kurzen, einer mittleren oder einer langen Periode konserviert.
2.1.) Kurze Periode: Die Platte wird im Kühlschrank bei 4° C konserviert, wobei die Petri-Schale sorgfältig wasserdicht verschlossen wird. Der Stamm wird alle 10 Tage überführt, da der Agar eine Tendenz zum Eintrocknen zeigt.
2.2.) Mittlere Periode: Es wird ein halbflüssiges Medium mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Hefeextrakt 2 g
CaCl2 0,1 g
Natriumacetat 0,5 g
Agar 2 g
filtriertes Thermalwasser 1000 ml.
Nach Sterilisation des Mediums wird von Pilzen stammende Katalase in einer Menge von 10 ϊΕ/ml zugegeben. Die Katalaselösung wird vorher durch kalte Filtration durch ein Milipore-Filter mit mikroskopischen Poren von 0,22 μ sterilisiert.
Ein kleiner Würfel des Beggiatoa enthaltenden Agars wird in ein Reagenzglas eingebracht, das 10 ml Medium enthält. Dann wird bei 30° C inkubiert. Beggiatoa entwickelt sich im oberen Teil des Reagenzglases Man kann das Reagenzglas 3 Wochen bei 30° C stehenlassen. Hierauf wird die Kultur in einer Menge von 0,1 ml je Reagenzglas überführt.
2.3.) Lange Periode: Es wird eine 24-Stunden-Kultur in einem gerührten Medium in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise
030020/0 5
hergestellt. Hierauf wird sie zentrifugiert. Die Ausfällung wird mit einer sterilen Ringer-Lösung gewaschen. Dann wird die Ausfällung gefroren und lyophilisiert. Sie wird mehrere Monate im Kühlschrank in einem gut verschlossenen Behälter aufbewahrt. Bei Rehydratation sind die Fadenbruchstücke dazu fähig, sich zu entwickeln.
Beispiel 3: Kultivierung von Stämmen
3.1.) Inokulum: Ein kleiner Agarwürfel mit einer Kantanlänge von 5 mm wird aus einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Platte herausgeschnitten. Hierauf wird er in einen 500 ml fassenden Kolben eingebracht, der 100 ml des folgenden Mediums enthält: Hefeextrakt 4 g
Kalziumchlorid O,2 g
Ammoniumacetat . 1 g
filtriertes Thermalwasser lOOO ml.
Dieses Medium besitzt einen pH-Wert von 6,6. Der Kolben wird auf einen Orbitalschüttler befestiqt, der mit 150 U/min bei einem Kreisradius von 1,25 cm läuft. Der Kolben wird dort 16 Stunden bei 30° C belassen. Dann wird die erhaltene Kultur mit Hilfe eines Mischers vom Typ Sorvall-Omnimixer 15 bis 30 see unter sterilen Bedingungen homogenisiert. Die erhaltene Kultur stellt das Inokulum dar.
3.2.) Kultivierung: 5 ml des obigen Inokulums werden in einen 500 ml fassenden Kolben eingebracht, der 100 ml des gleichen Mediums enthält, wie es für die Herstellung des Inokulums verwendet worden ist. Der Kolben wird 24 Stunden bei 3O° C auf dem Orbitalschüttler inkubiert. Es werden 0,8 g Trockenmasse von Beggiatoa je 1 Kultur erhalten. Durch Wiederholung dieser Operation mit verschiedenen Stämmen und unter Veränderung der Bedingungen innerhalb der geeigneten Grenzen werden Ausbeuten zwischen ungefähr 0,5 und 2 g trockenem Beggiatoa je 1 Kultur erhalten.
3.3.) Kontrolle des Wachstums; Die klassische Methode der Nephelometrie, welche auf Bakterienkulturen anwendbar ist, ist
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bei Beggiatoa wegen seines Wachstums in Form von Flocken nicht anwendbar. Es wird deshalb eine an den betreffenden Fall angepaßte Methode verwendet. Es werden alle 2 Stunden Kulturproben entnommen und im Mischer vom Typ Sorball-Omnimixer homogenisiert. Ihre optische Dichte wird bei 600 nm auf einem Spektralfotometer abgelesen. Die homogenisierte Probe bildet nur sehr langsam ein Sediment und gestattet eine brauchbare Ablesung. Auf diese Weise wird ein Anhaltspunkt auf das Wachstum in direkter Abhängigkeit mit der Anzahl der Zellen erhalten.
3.4.) Bestimmung des Trockengewichts: Die klassische Trocknung im Ofen ergibt bei Beggiatoa keine reproduzierbaren Resultate. Der Grund hierfür ist vermutlich der sehr hohe Wassergehalt. Aus diesem Grunde werden zur Erzielung reproduzierbarer Resultate nicht weniger als 4OO ml Kultur durch Lyophilisation getrocknet.
3.5.) Bestimmung der bakteriostatischen Aktivität: Die klassische Methode der Bestimmung der bakteriostatischen Aktivität des Public Health Laboratory Service Committee, welche in British Med. J. 408 (1965) beschrieben ist, ergibt in diesem speziellen Fall keine zufriedenstellenden Resultate, aufgrund der Tatsache, daß dieser Test in einem Reagenzglas ausgeführt wird. Beggiatoa ist in der Tat äußerst aerob, weshalb die Sauerstoffkonzentration in einem Reagenzglas unzufriedenstellend ist. Die Methode wird deshalb angepaßt, indem in Schüttelkolben gearbeitet wird, um den Sauerstoffübergang zu verstärken.
Es werden 3 Kolben mit einem Fassungsvermögen von 50 ml vorbereitet, die jeweils 18 ml Nährbouillon (Nutrient Broth Difco) enthält. Die Kolben werden in der ersten und in der zweiten Serie jeweils mit 0,4 ml einer 24-Stunden-Kultur eines pathogenen Stamms inokuliert. Es werden die drei pathogenen Stämme Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Eschericia coli ATCC 11755 und Staphylococcus aureus ATCC 12600 verwendet.
Es werden Proben des bakteriostatischen Produkts hergestellt, indem eine Kultur zentrifugiert wird, die gemäß Beispiel 3, Ziffer 2, jedoch nur in 8 Stunden erhalten worden ist. Die erhaltene Biomasse wird zentrifugiert und wieder in einem Volumen
0 3 0020/0584
physiologischer Lösung suspendiert, das gleich dem Volumen des bei der Zentrifugierung verbleibenden Überstands ist. Die die Biomasse enthaltende Lösung und der Überstand werden jeweils in Proben von 2 ml unterteilt.
Den Kolben der ersten Reihe werden 2 ml physiologische Lösung, welche die homogenisierte Biomasse enthält, zugesetzt. Den Kolben der zweiten Reihe werden nur 2 ml der physiologischen Lösung zugegeben. Den Kolben der dritten Reihe, welche nicht mit einem Pathogen inokuliert worden sind, werden 2 ml der physioloqischen Lösunq, welche die homogenisierte Biomasse enthält, zugesetzt.
Die Kolben werden bei 37° C auf einem Orbitalschüttler inkubiert. Nach 16 Stunden wird ihre optische Dichte bei 600 nm gemessen. Die optischen Dichtemessungen der Kolben entsprechend den Reihen 1, 2 und 3 liefern entsprechende Parameter A, B und C. Die Differenz A-C, abgezogen von B und dann dividiert durch B und multipliziert mit 100 ergibt die bakteriostatische Aktivität der Biomasse in % Inhibierung.
Auf die gleiche Weise wird die bakteriostatische Aktivität des Überstands bestimmt, indem den Kolben der ersten und der dritten Reihe 2 ml überstand anstelle von 2 ml physiologischer Lösunq, welche die homogenisierte Biomasse enthält, zugegeben werden.
Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Pathogen Aktivität der
Biomasse
(% Inhibierung)		 Aktivität des
Uberstands
{% Inhibierung)
P. aeruginosa
S. aureus
E. coli		 70
100
70		 41
45
11
030020/0584
Beispiel 4; Vergleich
Zum Vergleich wird in der in Beispiel 3, Ziffer 5, beschriebenen Weise die bakteriostatische Aktivität von natürlichem Baregin bestimmt. Nach einer 16 Stunden dauernden Inkubation wird eine prozentuale Inhibierung von 100 %, 83 % und 96 % gegenüber P. aeruginosa, S. aureus und E. coli gefunden. Mit anderen Worten heißt das, die bakteriostatische Aktivität der gemäß der Erfindung hergestellten Biomasse ist nahezu genauso stark wie diejenige von Baregin. Dies stellt ein bemerkenswertes Resultat dar, wenn man bedenkt, daß die vorliegende Biomasse in einer guten Ausbeute im industriellen Maßstab hergestellt werden kann, während das Baregin nur langsam in sehr geringen Mengen erhältlich ist. Die Aktivität des gemäß der Erfindung erhaltenen Uberstands ist zwar geringer, ist aber trotzdem von Interesse.
Beispiel 5: Stämme NCIB
Es wurden 8 Stämme in der Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, isoliert und am 12. Juli 1978 in der National Collection of Industrial Bacteria (NCIB) in Aberdeen, Schottland deponiert. Sie haben, wie bereits erwähnt, die Nummern NCIB 114 18 bis 114 25 erhalten. Diese Stämme können aufgrund ihrer Wachstunsart, ihrer Morphologie bei Kultivieruna auf Aqar und in flüssiqem Medium wie auch ihrer bakteriostatischen Aktivität charakterisiert werden.
In der nachfolgenden Tabelle ist die optische Dichte der Kulturen angegeben, die nach 5 st, 10 st und 24 st bei Kultivierung jedes dieser Stämme in der in Beispiel 3, Ziffer 2 beschriebenen Weise erhalten worden ist. Weiterhin zeigt die Tabelle die bakteriostatische Aktivität der nach 8stündiger Kultivierung erhaltenen Biomasse gegenüber den 3 pathogenen Stämmen P. aeruginosa, S. aureus und E. coli. Die Morphologien sind gesondert für jeden Stamm anschließend angegeben.
030020/0584
Stamm
Nr. NCIB		 optische Dichte
nach 5 st nach 10 st		 0,713 nach 24 st Biomasse (g
Feststoff/1)		 Akti
(Si Inhi
P. aeruainosa		 vität
bierung)
S. aureus		 E. coli
114 18 0,621 0, 583 0,91
114 19 0,237 0,447 0,514 0,95 100 76 1OO
114 20 0,352 0,402 0,7O9 O,95 100 96 74
O
co		 114 21 0,147 0,364 0,646 0,95 100 96 44
O
O
NJ
η		 114 22 0,16O 0,496 0, 305 0,75 ICO 98 100
O 114 23 0,289 0,737 0,378 0,69 68 89 84
cc
JC"		 114 24 O,36O 0,981 0,587 0,59 73 87 25
114 25 0,217 0,838 1,11 57 80 27
0,395 1OO 91 90
CjO CD
29A1310
MORPHOLOGIEN
NCIB 114 18
Auf Agar: Bildet große isolierte Kolonien von 8 bis 15 mm Durchmesser mit einem weißen Zentrum und durchscheinenden Rändern. Untersuchung im Mikroskop (x 100): Die Kolonie besteht aus gut sichtbaren in dichter Weise gerollten Spiralen.
In Kulturflüssigkeit: homogene Kultur. Untersuchung im Mikroskop (x 400): Lange Fäden von 80 χ 1,8 μ, die manchmal von gut ausgeprägten kurzen Bazillen gebildet werden. Keine Aggregation. Sehr wenig bleibende Morphosen.
NCIB 114 19
Auf Agar: Bildet isolierte weiße Kolonien von 4 bis 8 mm Durchmesser mit diffusen Rändern. Dichte Strähnen erstrecken sich sternförmig radial bis zum Zentrum der Kolonien, erreichen aber nicht die Ränder. Untersuchung im Mikroskop (x 100): Die Ränder der Kolonie werden durch Fäden in dichten Spiralen gebildet. In Kulturflüssigkeit: homogene Kultur. Untersuchung im Mikroskop (x 400): Isolierte sehr kurze Fäden von 3,6 χ 0,9 μ, die durch sehr ausgeprägte Verengungen unterteilt sind. Keine bleibenden Morphosen. Bildet Aggregate.
NCIB 114 20
Auf Agar: Bildet isolierte flache und opake Kolonien von 2 bis 5 mm Durchmesser mit gefransten Rändern. Untersuchung im Mikroskop (x 100): Kolonien bestehen aus Fadenbruchstücken, welche schlecht entwickelte Spiralen bilden.
In Kulturflüssiqkeit: homogene Kultur. Untersuchung im Mikroskop (x 400): Keine Fäden. Lange Bazillen von 9 χ 1,4 μ, welche einige bleibende Morphosen enthalten.
NCIB 114 21
Auf Agar: Bildet gesonderte Kolonien von 4 bis 7 mm Durchmesser mit diffusen Rändern, sehr ähnlich wie beim Stamm NCIB 114 19,
OJO 0 20/0584
29A1310
jedoch weißer. Die Ränder der Kolonien sind durchscheinend. Untersuchung im Mikroskop (x 100): Keine Spiralen sichtbar. In Kulturflüssiqkeit: homogene Kultur. Untersuchung im Mikroskop (x 400): Bild ähnlich wie beim Stamm NCIB 114 20. Keine Fäden. Lange Bazillen von 18 χ 1,4 μ, die einige bleibende Morphoson enthalten. Keine Aggregate.
NCIB 114 22
Auf Agar: Bildet niemals isolierte Kolonien. Bedeckt die gesamte Oberfläche mit mycoiden durchscheinenden Strähnen. Untersuchung im Mikroskop (x 100): Strähnen sind aus mehreren Fäden gebildet. In Kulturflüssiqkeit: homogene Kultur, welche von der sechsten Stunde ab einige kleine Aggregate zeigt. Untersuchung im Mikroskop (x 4OO): Lange gesonderte Fäden von 90 χ 1,4 bis 1,8 μ. Fäden in langen Einheiten durch ausgeprägte Einschnürungen unter teilt. Sehr wenig bleibende
NCIB 114 23
Auf Agar: Ähnlich dem Stamm NCIB 114 22. Keine isolierten Kolonien. Dichte mycoide und besser sichtbare Strähnen. Untersuchung im Mikroskop (x 100): Strähnen besser ausgeprägt, da sie aus einer größeren Zahl von Fäden bestehen.
In Kulturflüssiqkeit: Bildet große Flocken (Aggregate). Untersuchung im Mikroskop (x 400): Fäden viel kürzer als beim Stamm NCIB 114 22 und durch sehr ausgeprägte Einschnürungen in Segmente unterteilt. Länge 9 bis 10 χ 1,8 μ. Bleibende Morphosen er" scheinen sehr schnell, bereits nach 5 st.
NCIB 114 24
Auf Aoar; Ähnlich dem Stamm NCIB 114 23. Keine isolierten Kolonien. Mycoide Strähnen. Untersuchung im Mikroskop (x 100): Strähnen werden aus einer großen Anzahl von Fäden gebildet. In Kulturflüssiqkeit: Bildet große Flocken (Aggregate). Untersuchung im Mikroskop (x 400): Lange Fäden von 140 χ 1,8 μ, die lange Bündel bilden. Keine sichtbaren Einschnürungen. Verzögert
030020/0584
die Bildung von bleibenden Morphosen nach 10 st.
NCIB 114 25
Auf Agar; Bildet opake isolierte Kolonien von 2 bis 6 mm Durchmesser. Untersuchung im Mikroskop (x 100): Kolonien bestehen aus Fäden, die aus isolierten Zellen gebildet sind und dichte Spiralen bilden.
In Kulturflüssiqkeit: homogene Kultur. Untersuchung im Mikroskop (x 400): Homogene kurze Fäden von 4 χ 1,4 p. Wenig bleibende Morphosen.
030020/0584

Claims (12)

PATENTANSPRÜCHE
1. ^erfahren zur Herstellung eines Stoffs mit bakteriostatischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus vom Typ Begqiatoa in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedinqunqen und unter Rühren kultiviert und die Biomasse und/oder das Kulturmedium gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa durch Isolation aus Baregin gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolation eines Stamms eine Probe von Bareqin auf ein gelosehaltiqes Nährmedium aufbringt, 5 bis 36 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 50° C inkubiert, eine Zone, wo die Fäd^n eines Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa frei von Verunreinigungen sind, herausschneidet, diese Zone auf ein mit dem ersten identisches Gelose enthaltendes Nährmedium aufbringt und die Operationen der Inkubation, des Kerausschneidens und Wiedereinsetzens zwei- bis dreimal wiederholt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa mindestens einer der 8 Stämme NCIB 114 18 bis NCIB 114 25 verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Beimpfung des wäßrigen Nähmiediums mit einem Inokulum des Mikroorganismus vom Typ Beggiatoa das Inokulum homogenisiert.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Jen Mikroorganismus bei 20 bis 50° C und 6 bis 8 während 5 bis 36 Stunden kultiviert.
man den Mikroorganismus bei 20 bis 50° C und einem pH-Wert von
3 0O20/OBB4
ORIGINAL INSPECTED
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus bei einer Temperatur von 30 bis 40° C und beim neutralen pH-Wert während 8 bis IO Stunden kultiviert,
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Biomasse gewinnt und lyophilisiert.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährniedium verwendet, welches 1 bis 4 g Hefeextrakt, 0,1 bis 0,3 g Kalziumchlorid und 0,2 bis 1 g Natrium- oder Ammoniumacetat je 1 Wasser enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Wasser aus einer schwefelhaltigen Thermalquelle verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein gelosehaltiges Nährmedium verwendet, welches 1 bis 4 g Hefeextrakt und 10 bis 20 g Agar je 1 Wasser enthält.
12. Stoff mit einer bakteriostatischen Aktivität, welcher durch das Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche hergestellt worden ist.
.,, !■ il ',' (J / Π η Ii A
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