DE1642578A1 - Herstellungsverfahren fuer Kollagenase - Google Patents
Herstellungsverfahren fuer KollagenaseInfo
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Description
A 43 5 Fr/21
899 Lindau (Bodensee) Ihre Nachricht vom Meine Nachricht vom . Rennerle 10 Postfach 365
•26;' 6; 1967
Agricultural Biologioals Corporation, 35 tüilbur Street,
Lynbrook, Wbω York /USA -
Herstellungsverfahren für Kollagenase,
Diese Erfindung betrifft Kollagenase und l/erfahren zur
Herstellung dBssBlben. Genauer betrifft diese Erfindung
ein neuartiges Kollagenase, das ausgezeichnets Eigenschaften zum Entfernen von nekrotischem Gewebe hat«
Der Heilungsprozeß bei infektierten Lüunden, Hautgeschwüren,
l/erbrennungBn zweiten und dritten Grades und anderen Zuständen, welche Hautverletzungen beim Menschan und anderen
■■- 2 -■■ 209811/132 5
08 4374 patent d nach VfembMrtlna Bayer. Staatibank Lindau (B) Nr. 1582 Manchen _e_BAU
Säugstieren erzeugen, ist gewöhnlich recht langsam. Eine
der Eigenschaften solcher Uerletzungen ist das l/orhandensein
von totem Gewebe an der Verletzungsstelle. Es, ist
nötig, diBses tots Gewebe zu entfernen, um eine gesunde Grundlage für das Wachstum neuen Gewebes zu schaffen.
Das Entfernen dieseB toten Gewebes kann entweder durch
chirurgisches oder enzymatisches Zerlegen' beschleunigt
werden« Chirurgisches Zerlegen hat den Nachteil, daß es recht schmerzhaft ist, wenn alles tote Gewebe weggeschnitten wird und das lebende Gewebe freiliegt. Dennoch
ist es wesentlich, dass alles tote Gewebe entfernt uird,
um das Heilen der Verletzung und das Wachsen neuen Gewebes
zu erleichtern. Enzymatisches Zerlegen bietet
ein weniger schmerzvolles und zufriedenstellBnderes
Verfahren zum Entfernen toten Gewebes. Wirksames enzy—
matischBs Zerlegen erfordert das Entfernen nicht nur
des offensichtlich nBkrDtischen Gewebes, sondern auch
jenes Piaterials, geuöhnlich an der PheriphsriB der !ilunca,
welches, 'während es offensichtlich lebensfähig ist, ilacn —
k'linische-Wekrose enthält.
Das BäügetiergBwebe, uelchBs das UerschorfEn aller lüekrose
verhindert und PJekrose entwickelt, ist Bindegeiuebe oder
Kollagen, Dies ist Bin Protein, welches gegen alle Säuijp;- '
tiarenzyme widerstandsfähig ist, so dass das Uerschorfen.
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SADORfQJNAL
von langsamen DenatorierungsvorgängEn abhängig ist,; welche
das Kollagen in eine neue Form bringen, welche dann durch
lokale oder organische Enzyme zersetzt uerden kann, Um
dann das nicht denatorierts Kallagen schneller zu entfernen,
muß der Pat'isnt mit einem Rollagenase versehen
werden, d. h.r einem Enzym, welches nicht denaturiertes
Kollagen zersetzen wird.
Die Dringlichkeit des Entfernens der [\lekrose bezieht sich
auf zwei wichtige Faktoren. Erstens ist diese Nekrose geneigt, mikrobische Infektion zu beschleunigen. Zum andern
verhindert dieses tote und abstsrhende Geuebe* das Einleiten
der Heilungsprozesse, ujelche beim Menschen Granulation
und Epithelisation sind.
Die Ueruendüng von Kollagenase als ein Material zum Zerlegen
biurde schon früher bBabsichtigt. Jedoch dia bisher
bekannten Kallagenasen sind nicht so wirkungsvolle Zersetzstoffe gewesen uie das neuartige Kollagenase dieser
Erfindung. In einigen Fällen besaßsn die bisher bekannten
Kallagenasen nur kollagenass Wirksamkeit, ohne uesentlichB
LJirksanikeit gegen dis andeEn vorhandenen Proteine«
Eine-Aufgabe dieser Erfindung ist, ein neuartiges Kollagenase
zu schaffen, welches als Zersetzungsmittel wirkungsvoller ist,
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als das gegenwärtig bekannteKollagenase*.'
Eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist, ein nicht giftiges
Kollagenase-, zu schaffen, welches im wesentlichen keine Nebeneffekte
bewirkt, ■
Eine weitere Aufgabedät, ein neuartiges Herstellungsverfahren für das neuartige Kollagenase dieser Erfindung zu
schaffen.
Eine weitere Aufgabe ist, eine örtliche Salbe zu schaffen,
die das neuartige Kollagenase dieser Erfindung enthält zum
Auftragen auf Hautverletzungen', , ■
Ei.ne weitere Aufgabe ist, ein injizierbarBs kallagenase
zu schaffen, welches bei der Zersetzung van Bindegewebe in den inneren Teilen des Körpers wirksam ist.
Eine weitere Aufgabe ist, ein neuartiges Kailagenase zu
schaffen, welches das Wachstum von Bakterien verhindert.
Das neuartige Koliagenase dieser Erfindung wird als ein"
l/erarbeitungspradukt dej? Fermentation einer neulich entdeckten
Art von Clastridium-Histolytikum hergestellt,
welches keine Flagellen hat und deshalb nicht bswegungs-
2OäÖ1 17132 5
$AD ORiGlNAL
fähigist. Disss neue Zucht van Clastridium-Hystalytikum
ist als sin Flutat in einer Kultur von konventionellem
mit FlagsllBn versehenem ClostridiumJ-Histalytikum isoliert
worden und ist in der American Typs Culture
Collection als ATCC l\lr; 2100D depaniert warden.
ÜbBrraschBndBruBisB hat das durch diese neua Zucht van
Mikroorganismen hergestelltβ Kailagenase unerwartet
hervorragsnda Eigenschaften als,ZersBtZungsuirkstaff.
DiBSBs neue Kollagenase räumt wirkung β voll alles BiBkratiBche
Gbubbe aus und einen kleinen umgabenden Bereich
von gemischtem,- lebenden und toten Gewebe, wobei sowohl
Kollagen als auch andere Proteine angegriffen werden·
Dibs hinterläßt eins reins Oberfläche, auf welcher das
Wachstum nsuan, gesunden Gewebes eingeleitet werden kann.
Das neue Kollagenase dieser Erfindung besitzt eine Hemmwirkung
auf das Wachstum von Flikrobsn. Dieses neue Kollagenase
verhindert in Konzentrationen gröeser als etwa
0,1 mg/ml das Wachstum verschiedenBr Mikroben, solche
wie Plikrokokakken und Organismen der Gattung Clostridium. ;
Das Uerdünnen von KollagenasB auf Konzentrationen von
/0,1 mg/ml oder weniger erlaubt das" Wachstum dieser Bakterien.
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DiB Zucht von Glostridium-Histolytikum, uslche das neue
Kollagenase dieser Erfindung ergibt, unterscheidet sich
van dem gewöhnlichen Clastridium-Histolytikum, das in
"Manual of Determinative Bacteriology von Bergey (siebte
Auflage 1957, Seite 690 bis 691)" beschriebsn morden ist,
in dem diB neue Zucht keinB Flagellen enthält und deshalb
nicht bewegung Bfähig ist.
Das Gären gemäss dieser Erfindung wird unter Bedingungen
durchgeführt, welche für das Wachstum vcm Clastridium-Histalytikum
üblich sind. Das Gären uird bei etwa 32° bis 37 °C (vorzugsweise 37 0C) für 21 bis 26 Stunden in
einem Währbaden durchgeführt, welcher eiweißartige Stoffe enthält, salche uie trypsinbehancfeltes Saja und Protease-ρeptau
als auch Vitamine und nineralsalze, solche wie
nagnesiumsulfat, Kaliumphosphat einbasisch, Kaliumphosphat
ziüeibasisch und Ferrosulfat. Das eiueiflartige Material
dient als Quelle von souohl Währkohlenstoff als auch i\lährstickstaff.
Der bevorzugte pH-lüert des Gärmittels liegt
zwischen 6,5 und 7,5, Andere Gärmittel für das Wachstum
von Clastridium-Histalytikum sind im Fachgebiet bekannt
und diese können gegen das oben beschriebene Mittel ausgetauscht werden, Dae Gärgefäß wird mit einer Kultur van
Clastridium-Histolytikum ATCC Nr. 21DD0 geimpft, wobsi
konventionellB Impftechniken veruendet werden. Uar dem
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Impfen wird das Gärgefäß und sein Inhalt in einem .Autoklaven
für 30 Minuten auf erhöhter Temperatur und erhöhtem Druck gehalten, beispielBWeise bei 121 0C und 1,055 kp/cm
(15 psi) und wird dann auf Zimmertemperatur gekühlt, um das Mittel zu sterilisieren.
Die Gärflüssigkeit wird zentrifugiert, um" die Zellen des
.Mikroorganismus von der Flüssigkeit zu trennen. Die reine
zentrifugierte Flüssigkeit wird dann in eine gesättigte
wässrige Lösung von Ammoniümsulfat geschüttet, um das
Kollagenase auszufällen. Diese Ammoniumsulfatlösung wird
auf einer niedrigen Temperatur gehalten, nicht über 6 C,
und gewöhnlich auf etwa k C. Diese Lösung Bnthält etwa
5GO g Salz per Liter, wobei die genaue Menge variiert, abhängig hauptsächlich von der"in der gesättigten Lösung
enthaltenen Menge bei der bestimmten Arbeitstemperatur, die gewählt wird. Das KoHagenase-Material verbleibt über
einen beträchtlichen Zeitraum in dieser Ammoniumsulfatläsung,
etwa 18 Stunden, bei einer Temperatur, welche 6 C
nicht übersteigen darf. Der Wiederschlag wird nach herkömmlichen
Techniken gefiltert oder zentrifugiert» Das Kollagenase wird gekühlt, in dialytische Röhren gefüllt,
die im allgemeinen aus Cellophan sind und gegen rinnendes
blasser etwa 2k Stunden dialysiert, um Salz zu entfernen. ·
Das l/orhandenBein von Ammoniak in dem gereinigten Abwasser
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-8 - :Λ - ■■' - :■'-.:■
kann durch den lUesslBr-üJirkstaff bestimmt werden. DIb :
Dialyse wird fortgesetzt bis der Wessler-Test negativ
ist,
DaB dialyeierte Enzym wird gefroren und dann dem Gefriertrocknen
ausgesetzt. Dies wird ausgeführt durch Übertragen des Enzyms von. der dialytischen Röhre in Schalen, in welchendas
Gefrieren und das Geflertroeknen stattfindet, ·
Der Gefriertrockner wird auf einem Druck von D ,25 Thorr
(250 microns) Dder weniger gehalten. Obwohl die Temperaturen beim Gefriertrocknen weitgehend variieren können,
wird.die Arbeitsweise beschleunigt, wenn.eine verhältnismässig
hohe Temperatur, etwa 21 C, aufrechterhalten wird;
Die Zeit in dem Gefriertrockner beträgt im allgemeinen etwa 18 Stunden. Das dem Gefriertrocknen ausgesetzte Material
wird von den Trockenschalen entfernt und in Polyäthylenbeutel gebracht*
Das durch Gefriertrocknen erhaltene Kollagenaseprodukt
muss sterilisiert werden. Die Erfinder haben festgestellt,
dass dies mit geringen Köllagenaseveriusten
wirkungsvoll durch bestrahlen geschehen kann. Kobalt 60
ist die bevorzugte Strahlungsquelle, obwohl andere radioaktive Isotope verwendet werden können. Die Bestrahlung
kann auch mit. Röntgenstrahlen durchgeführt werden, obwohl
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diss keina bevorzugte Verfahrensweise ist.
Bestrahlung gemäss dieser Erfindung setzt das mit Lösungsmittel
versehene Kollagenase einer GesamtstrahlungsmBnge von mindestens 2,5 Negarad und vorzugsweise ·Bt.ua 4,5 bis j
5,5 fiegarad aus. Die Dosierung darf etwa 7 Flagarad nicht
: j
übersteigen, da höhere Düsen die Enzyme zersetzen können'· :
Die Bestrahlung wird mit herkömmlichBr Apparatur ausgeführt.
Die zu bestrahlenden Enzyme befinden sich in den obsn erwähnten PolyMthylan-BBUteln, Deiche in einem solchen Abstand angeordnet sind, dass die Strahlungsintensität durch den Beutel ziemlich gleichmässig ist'. Die
GesamtbestrablungszBit beträgt etua 120 bis 16D Stunden, ■
wenn die Strahlungsintensität in der Grössenördnüng von
stua D,03 bis Ü,D4 nagarad pro Stunde liegt.
Das gemäss dieser Erfindung hergestellte Kollagenase kann, ·
uenn geuünscht, auf andere Weise sterilisiert uerden, bei- :
spielsueise durch Filtrieren.
Das sterilisiertβ Material wird souahl auf KollagenasB-aktivität,
als auDh auf pratBOlytischB Aktivität geprüft, wobei der Minhydrin-Test bziu. dar AzoDüll-Test variuendet
iuirde Bekannte Standärd-Uarsuehsverfahren werden zur Durchführung
dieser TeBts verwendet. Beispielsweise werden die
IG -
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- und Ninhydrin-Testv/erf ahren durchgeführt, wie
sis bsi Nandl st al, 3» Clin. Invest. 32, 1323 oben,
beschrieben uordBn sind, Daa Material wird auch auf
Sterilität geprüft.
BBim Sterilitätstest wird daa Enzym auf 0,1 mg/ml verdünnt,
Binige des Enzyms in zwei Sätze von Röhren gebracht,
van denen einer einen Nährboden und eine kleine Anzahl (beiapielaueiBB etwa 5 bia 10) labensfähigsr mikrabischBr
Zellen enthält und der andere den Nährboden,
aber keine Zellen enthält. Für diesen Zueck werden typische
UBrauchsmikrDarganismBn, solche uie flikrokokokken verwendete
lüenn das Kollagenase steril ist, wird Wachstum in den
Röhren stattfinden, die Zellen enthalten, aber nicht in den Röhren, in die keine Zallan zugefügt wurden. Daa
UerdünnBn des Enzyms auf etwa 0,1 mg/ml oder wenigBT ist
wesentlich bsi dar Durchführung des StBrilitätstBStBB,
da das Enzym in grösaeran Konzentrationen das Wachstum
von "NikrDorganismBn hsmmen kann.
Das KollagsnaaB diasBr Erfindung wird zweckdienlich als
sine örtliche Salbe aufgetragen. Zu diesBm Zwsck wird
KollagEnasB in Binen kanvantionellen Salbenträger eingebracht,
einen solchen wie l/aseline, in Kanzsntrationen
von etwa 0,1 bia etwa 0,2 Gewichtsprozent KollagenasB.
- 11 -
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1842578
Eins bevorzugte SaIbB Enthält 0,5 % KollagenasB bezogenauf
das Gewicht der"Vaseline. Die Salben diesBT Erfindung können, wenn gewünscht, auch Antibiotika enthalten,
um Infektionen" an der VerletzüngsstBlle zu bekämpfen.
Kollagenase-Salbe dieser. Erfindung wird direkt auf die
Verletzung aufgetragen. Der Bereich wird vorzugsweise
zuerst gereinigt, um alle Stoffe zu "entfernen, welche
dia Wirkung des ■ Kollagenase' beeinträchtigen können-. Dies
kann mit einem sterilen Gazebausch geschehen, der mit
sterilem .Id aas er oder Puffer mit einem pH-uJert von 7, D
bis 7,5 getränkt ist.' Die Salbe wird auf sinen Gazeüberzug
-gegeben-,■ welcher direkt auf die Uerletzung gelegt
wird« Das Aufbringen der Salbe geschieht täglich
oder jeden zweiten Tag. DiB Gaze, die dis Salbs enthält,
wird in bevorzugter ulBise mit einem sterilen Überzug bedeckt.
Die ZersBfeungswirksamkBit von KollagEnasa dieser Erfindung
kann durch kontrollierte Experimente an Versuchstieren, solchen wie Reerschweinehen, demonstriert warden. Für
Versuchszwecke werden Brandwunden von vorherbestimmter Intensität auf den Versuchstieren hergestellt. Das Aufbringen einer KollagenasB-SalbB dieser Erfindung auf die
verbrannten Fläch en-.ergibt ein ungewöhnlich wirksames Zersetzen
von verbranntem Gewebe.
- 12 - 209611/-132S
Die SaIbB dieser Erfindung hat sich bei Raumtemperatur
über einen Zeitraum von 48 Ulochen als haltbar erwiesen.
Das.Enzym ist jedoch wärmeempfindlich und Temperaturen
beträchtlich über der Raumtemperatur sollten vermieden
werden. Um eine langB Lagerfähigkait sicherzustellen,
sollte die Salbe bei einer Temperatur nicht über IW C
gelagert werden.
Kollagenase kann als Injektion verwendet ujarden, um
interne Verschorfung und Reabsorption von physiologisch
antagonistischem Geuiebe zu Erleichtern. BeispielsueisB
uerdsn InjBktianslösungEn uaruendet, um
das l/erschorfen von operablen UorstBherdrüsen zu beschlBunigsn,
deren LBbensfMhigkBit durch Injektion von flüssigem StiG'kstaff zerstört morden ist, um das Stroma
von Tumormassen zu zerstören und die Kallagenmatrix von übBrmäßigen Kalziumahlagerungsn aufzulösen. GBeignete
In j Bktionsläsungen enthalten etuia 0,2 bis 5 Gewa-%
Kollagenase in physiologischer Salzlösung.
Das gernäss dieser Erfindung hBrgsstellte Kollagenase
hat eine kombinierte Aktivität von proteolytischem Enzym
und KollagenasB, uelche es beim Zersetzen von GeuebB unerreicht
wirksam macht, DieBBs Kollagenase kann allein verwendet werden zum wirksamen Zersetzen von nekrotischem
- 13 - 209811/1325
und abstBrbendem GB.tdebe, während bisher bekanntes Kollage—
nass, ω Bh π Ba ail el η verwendet wurde, achiachtare Resultate
ergab» Die gemeinsame Verwendung von bisher bekanntem
Kollagenase und ainatn protaülytischani Enzym stellt kBin
VBrläBlIchBB DirksamBB Ζβγββϊζβπ dar, UBil'diö ziusi Enzyme
häufig unvereinbar sind"; V
Durch das'KollagBnasB diBser Erfindung.uardsn kBlnB Wabsnuirkungen
verursacht'· LeichtB Entzündung von umgBbBxidem
Geujabe entsteht gBlBgantlich, sonst sind keins Wabanuirkungen
bBobachtst UDrden.
KDllagenase diessr Erfindung v&rhindBrt das Wachstum van
MikraarganiBmBn, uenn bs in KonzEntratianan von atua 1 mg/ml
Ddar grössBr vorhandBn ist." In viBlen Fällen, bBsondara
wenn baktBrielle Infektion nicht eingesetzt hat, ist die
l/eruendung van Antibiütika in l/erbindung mit dem neuartigen
KollagBnase nicht nötig*« Das gagBnuiMrtigB KollaganasB
kann jedoch, luann/f gBUÜnacht, mit einem Antibiotikum verwendet
iiiardsn« Die Erfinder haben auch entdacktj daaa
die üJachstumshBmmBigenachaftBn das gagBnuiärtigBn Kollagenasa
Beine Uerdünnung ,auf Btua 0,1 mg/ml odsr ueniger
erfordern, indem StBrilitätavBrauchB, uis obsn beschrieben,
durchgeführt ijurdan.
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DiBSB Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf spezielle
Ausführungeformen davon ausführlicher beschrieben, wia
in den folgenden Beispielen dargestsllt wird;"
Eina Zuht von Clostridium-Histolytikum ATCG Wr". 21DDG
wird verwendet, einen Nährboden zu impfen, der 3 Geiae-%
tripsinbehandeltsa Sojaöl, 1 GBu'i-% Prateosapepton und
Ausgleichsusasser enthält, einen pH-UIart zwischen 6,5 und.
7,5 aufweist, welcher vorher in einem Autoklaven bei
121,5 0C und 1 ,,D55 kp/cm (15 psi) Druck mshr als 15
Minuten stariliaisrt wurde1, worauf das Abkühlen auf
Raumtemperatur erfolgte,. Das Volumen jeden Keim-Glaskolbens ist 250 mit« Die Keim-Glaskalben werden für hQ
Stunden auf 37 0C gehalten. Am Ende dieses Zeitraumes
werden Proben des Fermentatianamittels mikroskopisch
auf Reinheit geprüft und diB protBolytischa Aktivität
wird durch die Azocall-Methade gemessen, dia unten ba-8chriBban
wird.
Zehn Litar von FBrmBntationsmittBl ist hargBstallt mit
folgender ZusammensBtzung:
2098 11/1325
tripsinbBhahdBltBs Sojaöl 1,5%
PrDteOBBpepton ' 5,0 $
. 19,2 g
" 9Dg
24
UitaminkonzBntrat* 5DmI
FbSD.-Lösung (0,120 Gbu.-JO 60 ml
pH-üJert 6,5 bis 7,5 |
Acht Liter des obigen Mittels werden in ain zehn Li'tsr·
Gärgefäß gebracht»
* 100 ml dieses Konzentrats enthalten:
PantöthenssurBS Kalzium 20 mg
WikotinaiurB 20 mg
Pyridoxin 20 mg
PimBlinsäurB 20 mg
Thiamin 20"mg
Riboflavin 2,0 mg
Das Gärgefäß" uiird im ,Autoklavan für 30 flinutan auf 121,5 0C
2
und 1,055 kp/cm (15 psi) gshaltEn und auf RaumtempBratur abgekühlt. Es uird dann mit den Kulturen von Clastridium-Histolytikum in den Glaskolben geimpft und für 21 bis
und 1,055 kp/cm (15 psi) gshaltEn und auf RaumtempBratur abgekühlt. Es uird dann mit den Kulturen von Clastridium-Histolytikum in den Glaskolben geimpft und für 21 bis
- iß--" 209811/1325
Stunden auf" 37 DC gehalten-^ Die Zellen werden dann van
der- FlÜBsigkeit getrennt, indem letztere bei 10 000 LJ/mln
zentrifugiert wird, bis man eine reine Flüssigkeit erhält.
DiB Flüssigkeit wird dann in eine Ausfälltrommel geschüttet, die eine gesättigte Lööung von wässrigem Ammoniumsulfat
(ungefähr 5Ö0 g pro Liter) bei i» 0C enthält und
10 -Minuten" lang gründlich umgerührt'. Die Aüsfälltrammel
und ihr Inhalt wird für 18 Stunden auf k 0C gehalten;"
Der Miederschlag uird dann gefiltert, gesammelt und in
eine dialytische Cellaphanrähre gebracht und für 24
Stunden gegen laufendes üjasser dialysiert'." Während der
letzten Stunde uiird dem Wasser erlaubt mit der Röhre
in Berührung zu bleiben»' Das üJaseer uird mit WeselBr'a
Reagenz stuf Ammoniak geprüft« ΙιΙβππ die Reaktiüfi positiv
ipt, wird die Dialyse'für weitere drei Stunden fortgesetzt und das üjasser wieder mit Nessler'a Reagenz geprüft»
LJenn die Reaktion negativ ist, wird der dialysierte
Wiederechlag in löBUngsmittelaufnehmende Schalen
aus roetfreiem Stahl.geleert, gefroren und in einen Gefriertrockner
gebracht;» Der Gefriertrockner wird auf
einem Druck nicht grosser als 0,25 Thorr (250 microns)
und einer Temperatur von 21 0C gehalten. Die GefriertrockenzBit
beträgt ungefähr 18 Stunden. Das im Gefriertrockner behandelte Material wird entfernt, leicht gemahlen
und in Polyäthylen-Beutel gebracht. Ein Beutel wird für
\ - 17 - 209811/132 5
jBde Schale ve-ruendet* jeder- Beutel enthält ainsn Durchschnitt
van 35 Gramm von im Gefriertrockner behandelten Kollagenaae'.'
Das Enzym uirti durch Bestrahlung stBriliaiart, umbai aina
Kobalt 6D-Strahlung9quallB ueruendBt tjird·- Ein Paar von
Beuteln und Ljenn gBUJÜnscht zusätzliche kleine Probatailchsn,
mit einem Gesamtgewicht von atua 75 g werden in einen-Behälter van 1D8 mm (4 1/4 inch) DurchmBsaBr und
127 mm (5 inch) Höhe gebracht; Dar BBhälter uird in ainar
Uorrichtung beatrahlt, ijalche βΙπβπ abgeachirmtan BerBich,
eine Kobalt eB-StrahlungaquBllB und einen Drehtisch anthält,
der um einB vertikale AchsB rundiertj dia durch diB
StrahlungsquBllB varläuft. In ainern typiachan Lauf wird
ein mit Enzym gefüllte1 Behälter auf ainem Drehtisch aufgBnomman,
uobai sich seine Basis 177,8 mm (7 inch) obBrhalb
das Badens der Abachirmung und seine Achse 127 mm
(5 inch) von der Quelle bBfindBn'i' Die DurchsahnittshahB
daa BehMltBra oberhalb das Bodens ist dieselbeule diB
Hüha dar Quallai' In ainam typischan Lauf tuurde der BBhälter
inagasamt 142 Stunden bestrahlt, uobBi ar eine
Durchachnittadoaia von 5,D Piegarad erhiät, «deiche von
4,77 Plagarad am Bodan des Behälters bis 5,25 nagarad in
der nitte variierte.
20 8811713 2 5
i. 18 -
Probe von KollaganasB wird nach dar Baatiahlung auf
KollaganaBB-Aktivität, PratBasB-Aktivität und Sterilität
geprüft'.
KollagBnaaaprUfung„ ' ,
=3 r; a a=.=ss =: = a a = = = a ss =: = =
Wicht dBnaturiBrtBs Kollagan wird für daB KallagariäaB
wie f'Dlg-t hergestBll-t: . -.
Eine Rinder-AchillBa-SBhnB uird von ainain frisch ge—
schlachteten TIbt ganomniBn, van Fatt und Unregelmäßigkeiten
bafrait und dann in Stücke von atuä 6 mm
im Quadrat geschnitten· Diese Stücke uerden nacheinandBr
in drei Lösungen van uMssrigam dibaaiacham Kaliumphasphat
der KBrnmasaB 15 bBi B 0C drai Taga lang in jede Lösung
getaucht', Wach dem dritten Eintauchen wird die Sehna
2k StundBn lang in Leitungswasser gelegt. Die gBuaschenB
Sahne wird dann nacheinander in di-Bi 25 %— ige uäasriga
KaliumchloridlösungBn getaucht, uobsi sia drei Tage in
jBdar Lösung varblaibt. Wach dem drittsn Tränken mit
Kaliumchlarid uird dia Sehne βΙπβ üJocha lang in Löitungaujasser
gelegt, wobei das üJaasar täglich gewechselt wird.
Die abBn schwimmende Lösung wird auf das Vorhandensein
von Cbloridionan geprüft8 wobai der Silbernitrat-Test
angawendBt wird* Die üJassarwaschung wird fortgesetzt,
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bis der Test negativ ist,- All die obige Bearbeitung idird
bei einer Temperatur von nicht höher als 6 D duTDHgeführti
Am Ende der Waschung uird Überschüssiges Wasser auage'- ■
lassen und die Sehnenulirf el werden lyophil gemacht.
25 mg von geschnittenBm nicht· denaturiertem Kollagen uirti
in eine UersuchsröhrB gebracht und 0,1 ml βϊπβγ 0,1 %-igen
wässrigen Lösung des lyophilen Enzyms und 5 TnI eines "
Puffers werden beigemengt« Der Puffer hat die folgende
ZuBammBnßBtzung:
drei (Hydroxymethyl) AminomBthan, 0,2 Π 50 ml
HCl, 0,2Π 4 4,2 ml
Kalziumazetat, 0,02 Π 100 rhi ·
dBBtilliertes ülaseer q.s* auf 200 ml
Eine i<öhtrollröhrB A uird horgeatellt uie oben, ausge- t
nomniBn, dasB das Enzym ueggelasBen uiird. Eine zueite
KontrollTÖhre B ujird hergestellt uie oben, ausgenommen,
das Weglassen des KollagenB (Rohre B enthalt Enzym).
Eine dritte'KantToiiröhre C uird hergestellt wie oben,
ausgenommen, dass 0,1 ml von 0,1 %-igBm; Tf ipsin (Armour.
Pharmaceutical Go«, Kankakee, 111«) anstelle des Kollagenäse
bBigemengt tdird. Jede dar vier Rühren wird für
24 Stunden auf 37 0C ermörmt« Nach /dem Eruörmen werden
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0,5 ml der reinen oben schwimmenden Flüssigkeit van jeder
Rühre dekandiert und in einen 10 ml Messkolben gebracht.
In jeden Messkolben werdsn 1 ml von,. 1 %-iger wässriger
Ninhydrinlösung und 1 ml von 5 %-iger wässriger Puridinlösung
beigemengt-. Die Messkalben werden für 20 Minuten
in ein Wasserbad gebracht. Genügend destilliertes Wasser
wird beigemengt, um ein Gesamtvolumen von 10 ml zu ergeben
und die Test-Lösungen werden in einem FataelEktrischsn-Klett-Kolarimeter
bei 570 Millimikron gegen die Kantrolle abgelesen. Die Kallagenaseaktivität wird in C-Einheiten
ausgedrückt. Eine C-Einheit stellt die berechnete optische
Dichteableeung dar, die erreicht wird, wenn ein Milligramm
van Enzym auf 25 mg von Kollagen unter den abigen Bsdingungen
einwirkt. Das Kollagenase muss eine minimale Aktivität
von itO 000 C-Einheiten per Gramm haben, sonst wird es
ausgeschieden, '
Proteaseprüfung.
"Azocoll", Bin Dsckpudarpräparat, das an einen Azo-Farb-Btoff
gBbunden ist, wird hergestellt nach dem l/erfahren
von Oakley et al«, Journal of Patliology and Bacteriology,
Band LUIII1 HIr, 2, .Seiten .227, 232 (19Ί6). Proteolytische
Enzymaktivität bei Uerwendung von Azacoll-Reagenz wird
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bestimmt na&h. dem Herfahren .von; fiandl et. al., Journal ,of
Clinical Investigation» 32, 1323: .(Λ953-) «01b iiruieasB-aktivität
.darf nicht weniger a,ls %QGQ_ Q-Ein.heite,n be- ■
tragen,; sonst wird das Enzym ausgeschieden., ... ,. ..
Eine :SalbEj wird hargsstellt durch Kischen vpn . 5 .Gramm. , ,
Kollag-enasB, das präpariert. ist, yia. es
in Beispiel 1 bBSDhrieb,en taird,, mit 995 Gramm weiBer
tfaselirce. . . , ... . .-......._ ■
Eins Salbe uiird hergestallt durch Wi sehe η der
Bestandteile:
KollagenasB (Beispiel 1) . 5 Gramm
-''Strep-CombiotiD" (Pfizer) ' : ;,; IQ Gramm
üIbxBb UaBBlina · . - BB5. Gr.a,mm;
"Strep-Combiatic" ist ein pärentsraies gnti:bio.tiktiin in
EinhBitadoBierLfng und enthäit 0,5 ;g Strep to my Z in, ,3QD QQQ
-22 -
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ο η _
Einheiten Prokain-Penicillin G und 1OD DOD Einheiten von
gepuffertem Penicillin-G^ hergestellt durch■■■ Charles Pfizer
& Co., Kfew· York, Ri. Y. Es wird: der Salbe einverleibt, üki,
nicht spezifisches Zersetzen zu v:ermeldenv , ·- : :-,· .
Beispiel k · ' : ' :·;·:-.
■■■■■■;■■■■. ■- ■■·'■■ ' '■'· ."·' '"
20 neerisDhtijeinchen ira Gelaicht von 5QQ bis ßOD Βγητπγπ: :
uurden mit Watriumpentobarbit'al PB' ■anäs't'hetisie'rt. "" -"
Beide Seiten der Tiere 'wurden mit einer Blektrischen ■'
Haarschneidemaschine geschoren und dann rasiert.Ein·
kreisFöriniger Bereich von 5 era Durchmesser wurde auf
jeder Seite tangierend an eine Liriie markiert, die parallel und in einem Abstand von 13 cm (i/2 inch) zum
Rückgrat des Tieres verlief.·Ein 125 ml-Becher van *
[iJasaer tjurde auf SD C erhitzt, aias mit einem gerade
unter die Oberfläche des Wassers getauchtem Quecksilber-Thermdmeter'
gemessen wurde. Der markierte Bereich des*
Tieres wurde für 20 Sekunden mit der OiSerflache des
Wassers in Berührung gebracht. Der gebrannte BersiDh '
wurde mit denaturiertem Äthylalkohol gereinigt, welcher dann verdampfen konnte. ' "
Eine Testsalbe wurdB hergestallt, wie"in Beispiel 3'
- 23 - 209811/1325
beschrieben und eine KantrollsalbB, bsstBhend1 aus
Vaseline und Strep-Cambiotic in den Mengen, wie in.
Beispiel 3, aber phne Kollägena-se, wurde bewertet,
Unn den ZO in dieser Untersuchung verwendeten TisrBn
wurden 16 Tiere auf einer Seite mit Kollagenase- Salbe
behandelt und auf der anderen Seite mit KantrollsalbB,
!/□π diesen erhiBlten θ die KollagenaseaaXbe auf die ,
rGchte Seite. Zuei Tiere wurden auf beiden Ssitsn mit
l<Dllagenase-SalbB b.ehandelt und zuei Tiere Erhielten
Kantrollsalbe auf bsidsn ättent'.
Die Salben wurden täglich auf jedes WeTsuchstier aufgetragen.
Die Salben wurden auf Gazekissen verteilt, welche
in Berührung mit der Wunde gebracht wurden. Diese wurden mit einem Klebstreifen am Umfang an der Stelle
befestigt und eine zusätzliche Streifanlange wurde um
den Macken des Tieres gewunden, um ein Losreißen zu
verhindern. Die Salben wurden mit einem Kode versBhen,
so dass die Person, die sie auflegte, nicht wußte, ob
sie eine Kollagenase-Salbe oder eine Kontrollsalbe auflegte. Die Reihenfolge, in welcher die Tiere beobachtet
wurden, wurde täglich verändert. Uor jeder Beobachtung
wurde die LJundB mit einem in Wasser getauchten Baumwollbausch leicht abgerieben. Die Behandlung auf diese Weise
- 2n - 2098 11/1325
- 2k -
wurde 96 Stunden durchgeführt. Am Ende dieser Zeit wurden
die Tiere beobachtet und der Prozentsatz der Zersetzung
ujurde durch Hessen des zersetzten Bereiches bestimmt«Die
Prozentsätze der Zersetzung bei Verwendung sowohl von
Kollagenase- als auch Kontrollsalben und die Differenzen zwischen diesen Prozentsätzen der Zersetzung für die
Tiere, die Kollagenase-Salbe auf einer Seite"und Kontrollsalbe
auf der anderen Seite erhielten, sind in der
folgenden Tabelle I wiedergegeben.
T a b el 1 e I .
Tier-I\!r. Seite die Kalla— % dar Zersetzung · Differenz
genäse erhielt linke S. rechte S.
8-1 | links | 90 | D' | 90 |
8-2 | rechts | D | 100 | 100 |
8-3 | links | 95 | 25 | 70 |
9-1 | rechts | Ȇ | 95 | 95 |
9-2 | rechts | ,0 | 70 | 70 |
9-3 | links | 8D | ' 0 | 80 |
■g-ii | rechts | 10 | 100 | 90 |
9-5 | links | 15 | 0 | 15 |
10-1 | links | 95 | 20 | 75 |
10-2 | rechts | 3D | 90 | 60 |
" 25 " 2098 11/1325
10-3 | '-links |
1D- it | rechts |
10-5 | links |
10-6 | rechts |
10-7 | links |
10-8 | rechts |
10-9 | beide |
10-10 | beide |
10-11 | keitne |
10-12 | keine |
95 | 30 | 65 |
O | 95 | 95 |
75 | 15 | 60 |
5 | 95 | 90 |
m,: | 15 | 75 |
D | 70 | 70 |
90 | 70 | — |
0 | 5 | |
20 | 0 | _ |
Obtiiohl diese Erfindung soüiohl in der Beschreibung
als auch in Beispielen unter Hinweis auf spezifische
Einzelheiten und AusfQhrungsforniBn beschrieben uorden ist, versteht es sich, dass diese nur
der Ueranschaulichung und nicht der Begrenzung dienen und dass der Bereich der frfindung nur durch die bei— gefügten Ansprüche bestimmt- üiird;
der Ueranschaulichung und nicht der Begrenzung dienen und dass der Bereich der frfindung nur durch die bei— gefügten Ansprüche bestimmt- üiird;
Patentansprüche
- 26 -
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Claims (1)
- Pat ent ansprüche■j I Verfahren zur Herstellung von Kollagenase., gekennzeichnet durch das Züchten van Zellen einer nicht beweglichen und nicht Flagellen enthaltenden Zucht von Clostridiurn-Histolyticum unter an- Wf ' aeroben Bedingungen in einem Fermsntationsrnedium, das'PJahrungsquellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, das Aufspeichern der Zellen und das Gewinnen,von Kalla— genäse von dem Nährboden·2', Verfahren nach Anspruöh 1, d a d u r c h gekennzeichnet,, dass das Kollagenase durch Ausfällen mit einem anorganischen Salz und nachfolgender Dialyse des Wiederschlages gewonnen wird.3» l/erfahren nach Anspruch 1, dad u r c h g e k" e η η ζ e ich η e t, dass das gewonnene Kollagenaee mit einer radioaktiven Strahlungsquelle bestrahlt wird, bis eB steril ist«it. Verfahren nach Anspruch 3, dad u r c h g a kennzeichne t, dass die radioaktive Strahlungsquelle Kobalt 60 ist.- 27 -2 0 9811/1325■- 27■-5. Verfahren nach Anspruch 3, d a durch g e kennzeichnet, dass die Gesamtbestrahlungsmenge tjonigstens 2,5 Megarad beträgt.6. Verfahren nach Anspruch 1 f. d a d u r c h g e kennzeichnet, dass die Zucht von Clastridium-Histolyticum ATCC l\)r. 210DD ist.7. Είπε Enzymatische Zusammensetzung mit prateolytischem Enzym- und KallagBnasB-Aktiuität, dis uirksam ist, nekra-^ tisches und absterbendes GeuebB zu zersetzen, welches nicht denaturiertes Knllagen enthält, g e k e η η ζ β i c h η β t d u r c h a) üJasserlöslichkeit, b) die Ausfällbarksit aus uässriger Lösung, durch Ammoniumsulfat, c) Beständigkeit bei Temperaturen unter etua lh C und UnbEständigksit bsi erhöhten Temperaturen und d) Wirksamkeit zum Verhindern des Ulachstums von Mikroorganismen in Konzentrationen von wenigstens etwa 1mg/ml.209811/1325
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---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 |