DE1642578A1

DE1642578A1 - Herstellungsverfahren fuer Kollagenase

Info

Publication number: DE1642578A1
Application number: DE19671642578
Authority: DE
Inventors: Wegman Edwin H; Chiulli Angelo J
Original assignee: Advance Biofactures Corp
Current assignee: Advance Biofactures Corp
Priority date: 1966-07-08
Filing date: 1967-06-29
Publication date: 1972-03-09
Also published as: BR6791131D0; US3705083A; DE1642578B2; GB1192937A; DE1642578C3; JPS4924669B1

Description

DR.-ING. DIPL.-1NG. G. RIEBLING 1 6 42 PATENTANWALT Mein Zeichen

A 43 5 Fr/21

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899 Lindau (Bodensee) Ihre Nachricht vom Meine Nachricht vom . Rennerle 10 Postfach 365

•26;' 6; 1967

Agricultural Biologioals Corporation, 35 tüilbur Street, Lynbrook, Wbω York /USA -

Herstellungsverfahren für Kollagenase,

Diese Erfindung betrifft Kollagenase und l/erfahren zur Herstellung dBssBlben. Genauer betrifft diese Erfindung ein neuartiges Kollagenase, das ausgezeichnets Eigenschaften zum Entfernen von nekrotischem Gewebe hat«

Der Heilungsprozeß bei infektierten Lüunden, Hautgeschwüren, l/erbrennungBn zweiten und dritten Grades und anderen Zuständen, welche Hautverletzungen beim Menschan und anderen

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Fernschreiber: Sprechzeit .,'-,^■•^Bankkonto: Potticheckkonto: _n

08 4374 patent d nach VfembMrtlna Bayer. Staatibank Lindau (B) Nr. 1582 Manchen _e_BAU

Säugstieren erzeugen, ist gewöhnlich recht langsam. Eine der Eigenschaften solcher Uerletzungen ist das l/orhandensein von totem Gewebe an der Verletzungsstelle. Es, ist nötig, diBses tots Gewebe zu entfernen, um eine gesunde Grundlage für das Wachstum neuen Gewebes zu schaffen. Das Entfernen dieseB toten Gewebes kann entweder durch chirurgisches oder enzymatisches Zerlegen' beschleunigt werden« Chirurgisches Zerlegen hat den Nachteil, daß es recht schmerzhaft ist, wenn alles tote Gewebe weggeschnitten wird und das lebende Gewebe freiliegt. Dennoch ist es wesentlich, dass alles tote Gewebe entfernt uird, um das Heilen der Verletzung und das Wachsen neuen Gewebes zu erleichtern. Enzymatisches Zerlegen bietet ein weniger schmerzvolles und zufriedenstellBnderes Verfahren zum Entfernen toten Gewebes. Wirksames enzy— matischBs Zerlegen erfordert das Entfernen nicht nur des offensichtlich nBkrDtischen Gewebes, sondern auch jenes Piaterials, geuöhnlich an der PheriphsriB der !ilunca, welches, 'während es offensichtlich lebensfähig ist, ilacn — k'linische-Wekrose enthält.

Das BäügetiergBwebe, uelchBs das UerschorfEn aller lüekrose verhindert und PJekrose entwickelt, ist Bindegeiuebe oder Kollagen, Dies ist Bin Protein, welches gegen alle Säuijp;- ' tiarenzyme widerstandsfähig ist, so dass das Uerschorfen.

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SADORfQJNAL

von langsamen DenatorierungsvorgängEn abhängig ist,; welche das Kollagen in eine neue Form bringen, welche dann durch lokale oder organische Enzyme zersetzt uerden kann, Um dann das nicht denatorierts Kallagen schneller zu entfernen, muß der Pat'isnt mit einem Rollagenase versehen werden, d. h._r einem Enzym, welches nicht denaturiertes Kollagen zersetzen wird.

Die Dringlichkeit des Entfernens der [\lekrose bezieht sich auf zwei wichtige Faktoren. Erstens ist diese Nekrose geneigt, mikrobische Infektion zu beschleunigen. Zum andern verhindert dieses tote und abstsrhende Geuebe* das Einleiten der Heilungsprozesse, ujelche beim Menschen Granulation und Epithelisation sind.

Die Ueruendüng von Kollagenase als ein Material zum Zerlegen biurde schon früher bBabsichtigt. Jedoch dia bisher bekannten Kallagenasen sind nicht so wirkungsvolle Zersetzstoffe gewesen uie das neuartige Kollagenase dieser Erfindung. In einigen Fällen besaßsn die bisher bekannten Kallagenasen nur kollagenass Wirksamkeit, ohne uesentlichB LJirksanikeit gegen dis andeEn vorhandenen Proteine«

Eine-Aufgabe dieser Erfindung ist, ein neuartiges Kollagenase zu schaffen, welches als Zersetzungsmittel wirkungsvoller ist,

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als das gegenwärtig bekannteKollagenase*.'

Eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist, ein nicht giftiges Kollagenase-, zu schaffen, welches im wesentlichen keine Nebeneffekte bewirkt, ■

Eine weitere Aufgabedät, ein neuartiges Herstellungsverfahren für das neuartige Kollagenase dieser Erfindung zu schaffen.

Eine weitere Aufgabe ist, eine örtliche Salbe zu schaffen, die das neuartige Kollagenase dieser Erfindung enthält zum Auftragen auf Hautverletzungen', , ■

Ei.ne weitere Aufgabe ist, ein injizierbarBs kallagenase zu schaffen, welches bei der Zersetzung van Bindegewebe in den inneren Teilen des Körpers wirksam ist.

Eine weitere Aufgabe ist, ein neuartiges Kailagenase zu schaffen, welches das Wachstum von Bakterien verhindert.

Das neuartige Koliagenase dieser Erfindung wird als ein" l/erarbeitungspradukt dej? Fermentation einer neulich entdeckten Art von Clastridium-Histolytikum hergestellt, welches keine Flagellen hat und deshalb nicht bswegungs-

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$AD ORiGlNAL

fähigist. Disss neue Zucht van Clastridium-Hystalytikum ist als sin Flutat in einer Kultur von konventionellem mit FlagsllBn versehenem ClostridiumJ-Histalytikum isoliert worden und ist in der American Typs Culture Collection als ATCC l\lr; 2100D depaniert warden.

ÜbBrraschBndBruBisB hat das durch diese neua Zucht van Mikroorganismen hergestelltβ Kailagenase unerwartet hervorragsnda Eigenschaften als,ZersBtZungsuirkstaff. DiBSBs neue Kollagenase räumt wirkung β voll alles BiBkratiBche Gbubbe aus und einen kleinen umgabenden Bereich von gemischtem,- lebenden und toten Gewebe, wobei sowohl Kollagen als auch andere Proteine angegriffen werden· Dibs hinterläßt eins reins Oberfläche, auf welcher das Wachstum nsuan, gesunden Gewebes eingeleitet werden kann.

Das neue Kollagenase dieser Erfindung besitzt eine Hemmwirkung auf das Wachstum von Flikrobsn. Dieses neue Kollagenase verhindert in Konzentrationen gröeser als etwa 0,1 mg/ml das Wachstum verschiedenBr Mikroben, solche

wie Plikrokokakken und Organismen der Gattung Clostridium. ; Das Uerdünnen von KollagenasB auf Konzentrationen von /0,1 mg/ml oder weniger erlaubt das" Wachstum dieser Bakterien.

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DiB Zucht von Glostridium-Histolytikum, uslche das neue Kollagenase dieser Erfindung ergibt, unterscheidet sich van dem gewöhnlichen Clastridium-Histolytikum, das in "Manual of Determinative Bacteriology von Bergey (siebte Auflage 1957, Seite 690 bis 691)" beschriebsn morden ist, in dem diB neue Zucht keinB Flagellen enthält und deshalb nicht bewegung Bfähig ist.

Das Gären gemäss dieser Erfindung wird unter Bedingungen durchgeführt, welche für das Wachstum vcm Clastridium-Histalytikum üblich sind. Das Gären uird bei etwa 32° bis 37 °C (vorzugsweise 37 ⁰C) für 21 bis 26 Stunden in einem Währbaden durchgeführt, welcher eiweißartige Stoffe enthält, salche uie trypsinbehancfeltes Saja und Protease-ρeptau als auch Vitamine und nineralsalze, solche wie nagnesiumsulfat, Kaliumphosphat einbasisch, Kaliumphosphat ziüeibasisch und Ferrosulfat. Das eiueiflartige Material dient als Quelle von souohl Währkohlenstoff als auch i\lährstickstaff. Der bevorzugte pH-lüert des Gärmittels liegt zwischen 6,5 und 7,5, Andere Gärmittel für das Wachstum von Clastridium-Histalytikum sind im Fachgebiet bekannt und diese können gegen das oben beschriebene Mittel ausgetauscht werden, Dae Gärgefäß wird mit einer Kultur van Clastridium-Histolytikum ATCC Nr. 21DD0 geimpft, wobsi konventionellB Impftechniken veruendet werden. Uar dem

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Impfen wird das Gärgefäß und sein Inhalt in einem .Autoklaven für 30 Minuten auf erhöhter Temperatur und erhöhtem Druck gehalten, beispielBWeise bei 121 ⁰C und 1,055 kp/cm (15 psi) und wird dann auf Zimmertemperatur gekühlt, um das Mittel zu sterilisieren.

Die Gärflüssigkeit wird zentrifugiert, um" die Zellen des .Mikroorganismus von der Flüssigkeit zu trennen. Die reine zentrifugierte Flüssigkeit wird dann in eine gesättigte wässrige Lösung von Ammoniümsulfat geschüttet, um das Kollagenase auszufällen. Diese Ammoniumsulfatlösung wird auf einer niedrigen Temperatur gehalten, nicht über 6 C, und gewöhnlich auf etwa k C. Diese Lösung Bnthält etwa 5GO g Salz per Liter, wobei die genaue Menge variiert, abhängig hauptsächlich von der"in der gesättigten Lösung enthaltenen Menge bei der bestimmten Arbeitstemperatur, die gewählt wird. Das KoHagenase-Material verbleibt über einen beträchtlichen Zeitraum in dieser Ammoniumsulfatläsung, etwa 18 Stunden, bei einer Temperatur, welche 6 C nicht übersteigen darf. Der Wiederschlag wird nach herkömmlichen Techniken gefiltert oder zentrifugiert» Das Kollagenase wird gekühlt, in dialytische Röhren gefüllt, die im allgemeinen aus Cellophan sind und gegen rinnendes blasser etwa 2k Stunden dialysiert, um Salz zu entfernen. · Das l/orhandenBein von Ammoniak in dem gereinigten Abwasser

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kann durch den lUesslBr-üJirkstaff bestimmt werden. DIb ^: Dialyse wird fortgesetzt bis der Wessler-Test negativ ist,

DaB dialyeierte Enzym wird gefroren und dann dem Gefriertrocknen ausgesetzt. Dies wird ausgeführt durch Übertragen des Enzyms von. der dialytischen Röhre in Schalen, in welchendas Gefrieren und das Geflertroeknen stattfindet, · Der Gefriertrockner wird auf einem Druck von D ,25 Thorr (250 microns) Dder weniger gehalten. Obwohl die Temperaturen beim Gefriertrocknen weitgehend variieren können, wird.die Arbeitsweise beschleunigt, wenn.eine verhältnismässig hohe Temperatur, etwa 21 C, aufrechterhalten wird; Die Zeit in dem Gefriertrockner beträgt im allgemeinen etwa 18 Stunden. Das dem Gefriertrocknen ausgesetzte Material wird von den Trockenschalen entfernt und in Polyäthylenbeutel gebracht*

Das durch Gefriertrocknen erhaltene Kollagenaseprodukt muss sterilisiert werden. Die Erfinder haben festgestellt, dass dies mit geringen Köllagenaseveriusten wirkungsvoll durch bestrahlen geschehen kann. Kobalt 60 ist die bevorzugte Strahlungsquelle, obwohl andere radioaktive Isotope verwendet werden können. Die Bestrahlung kann auch mit. Röntgenstrahlen durchgeführt werden, obwohl

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diss keina bevorzugte Verfahrensweise ist.

Bestrahlung gemäss dieser Erfindung setzt das mit Lösungsmittel versehene Kollagenase einer GesamtstrahlungsmBnge von mindestens 2,5 Negarad und vorzugsweise ·Bt.ua 4,5 bis j 5,5 fiegarad aus. Die Dosierung darf etwa 7 Flagarad nicht

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übersteigen, da höhere Düsen die Enzyme zersetzen können'· : Die Bestrahlung wird mit herkömmlichBr Apparatur ausgeführt. Die zu bestrahlenden Enzyme befinden sich in den obsn erwähnten PolyMthylan-BBUteln, Deiche in einem solchen Abstand angeordnet sind, dass die Strahlungsintensität durch den Beutel ziemlich gleichmässig ist'. Die GesamtbestrablungszBit beträgt etua 120 bis 16D Stunden, ■ wenn die Strahlungsintensität in der Grössenördnüng von stua D,03 bis Ü,D4 nagarad pro Stunde liegt.

Das gemäss dieser Erfindung hergestellte Kollagenase kann, · uenn geuünscht, auf andere Weise sterilisiert uerden, bei- ^: spielsueise durch Filtrieren.

Das sterilisiertβ Material wird souahl auf KollagenasB-aktivität, als auDh auf pratBOlytischB Aktivität geprüft, wobei der Minhydrin-Test bziu. dar AzoDüll-Test variuendet iuirde Bekannte Standärd-Uarsuehsverfahren werden zur Durchführung dieser TeBts verwendet. Beispielsweise werden die

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- und Ninhydrin-Testv/erf ahren durchgeführt, wie sis bsi Nandl st al, 3» Clin. Invest. 32, 1323 oben, beschrieben uordBn sind, Daa Material wird auch auf Sterilität geprüft.

BBim Sterilitätstest wird daa Enzym auf 0,1 mg/ml verdünnt, Binige des Enzyms in zwei Sätze von Röhren gebracht, van denen einer einen Nährboden und eine kleine Anzahl (beiapielaueiBB etwa 5 bia 10) labensfähigsr mikrabischBr Zellen enthält und der andere den Nährboden, aber keine Zellen enthält. Für diesen Zueck werden typische UBrauchsmikrDarganismBn, solche uie flikrokokokken verwendete lüenn das Kollagenase steril ist, wird Wachstum in den Röhren stattfinden, die Zellen enthalten, aber nicht in den Röhren, in die keine Zallan zugefügt wurden. Daa UerdünnBn des Enzyms auf etwa 0,1 mg/ml oder wenigBT ist wesentlich bsi dar Durchführung des StBrilitätstBStBB, da das Enzym in grösaeran Konzentrationen das Wachstum von "NikrDorganismBn hsmmen kann.

Das KollagsnaaB diasBr Erfindung wird zweckdienlich als sine örtliche Salbe aufgetragen. Zu diesBm Zwsck wird KollagEnasB in Binen kanvantionellen Salbenträger eingebracht, einen solchen wie l/aseline, in Kanzsntrationen von etwa 0,1 bia etwa 0,2 Gewichtsprozent KollagenasB.

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Eins bevorzugte SaIbB Enthält 0,5 % KollagenasB bezogenauf das Gewicht der"Vaseline. Die Salben diesBT Erfindung können, wenn gewünscht, auch Antibiotika enthalten, um Infektionen" an der VerletzüngsstBlle zu bekämpfen. Kollagenase-Salbe dieser. Erfindung wird direkt auf die Verletzung aufgetragen. Der Bereich wird vorzugsweise zuerst gereinigt, um alle Stoffe zu "entfernen, welche dia Wirkung des ■ Kollagenase' beeinträchtigen können-. Dies kann mit einem sterilen Gazebausch geschehen, der mit sterilem .Id aas er oder Puffer mit einem pH-uJert von 7, D bis 7,5 getränkt ist.' Die Salbe wird auf sinen Gazeüberzug -gegeben-,■ welcher direkt auf die Uerletzung gelegt wird« Das Aufbringen der Salbe geschieht täglich oder jeden zweiten Tag. DiB Gaze, die dis Salbs enthält, wird in bevorzugter ulBise mit einem sterilen Überzug bedeckt.

Die ZersBfeungswirksamkBit von KollagEnasa dieser Erfindung kann durch kontrollierte Experimente an Versuchstieren, solchen wie Reerschweinehen, demonstriert warden. Für Versuchszwecke werden Brandwunden von vorherbestimmter Intensität auf den Versuchstieren hergestellt. Das Aufbringen einer KollagenasB-SalbB dieser Erfindung auf die verbrannten Fläch en-.ergibt ein ungewöhnlich wirksames Zersetzen von verbranntem Gewebe.

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Die SaIbB dieser Erfindung hat sich bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 48 Ulochen als haltbar erwiesen. Das.Enzym ist jedoch wärmeempfindlich und Temperaturen beträchtlich über der Raumtemperatur sollten vermieden werden. Um eine langB Lagerfähigkait sicherzustellen, sollte die Salbe bei einer Temperatur nicht über IW C gelagert werden.

Kollagenase kann als Injektion verwendet ujarden, um interne Verschorfung und Reabsorption von physiologisch antagonistischem Geuiebe zu Erleichtern. BeispielsueisB uerdsn InjBktianslösungEn uaruendet, um das l/erschorfen von operablen UorstBherdrüsen zu beschlBunigsn, deren LBbensfMhigkBit durch Injektion von flüssigem StiG'kstaff zerstört morden ist, um das Stroma von Tumormassen zu zerstören und die Kallagenmatrix von übBrmäßigen Kalziumahlagerungsn aufzulösen. GBeignete In j Bktionsläsungen enthalten etuia 0,2 bis 5 Gew_a-% Kollagenase in physiologischer Salzlösung.

Das gernäss dieser Erfindung hBrgsstellte Kollagenase hat eine kombinierte Aktivität von proteolytischem Enzym und KollagenasB, uelche es beim Zersetzen von GeuebB unerreicht wirksam macht, DieBBs Kollagenase kann allein verwendet werden zum wirksamen Zersetzen von nekrotischem

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und abstBrbendem GB.tdebe, während bisher bekanntes Kollage— nass, ω Bh π Ba ail el η verwendet wurde, achiachtare Resultate ergab» Die gemeinsame Verwendung von bisher bekanntem Kollagenase und ainatn protaülytischani Enzym stellt kBin VBrläBlIchBB DirksamBB Ζβγββϊζβπ dar, UBil'diö ziusi Enzyme häufig unvereinbar sind"; V

Durch das'KollagBnasB diBser Erfindung.uardsn kBlnB Wabsnuirkungen verursacht'· LeichtB Entzündung von umgBbBxidem Geujabe entsteht gBlBgantlich, sonst sind keins Wabanuirkungen bBobachtst UDrden.

KDllagenase diessr Erfindung v&rhindBrt das Wachstum van MikraarganiBmBn, uenn bs in KonzEntratianan von atua 1 mg/ml Ddar grössBr vorhandBn ist." In viBlen Fällen, bBsondara wenn baktBrielle Infektion nicht eingesetzt hat, ist die l/eruendung van Antibiütika in l/erbindung mit dem neuartigen KollagBnase nicht nötig*« Das gagBnuiMrtigB KollaganasB kann jedoch, luann/f gBUÜnacht, mit einem Antibiotikum verwendet iiiardsn« Die Erfinder haben auch entdacktj daaa die üJachstumshBmmBigenachaftBn das gagBnuiärtigBn Kollagenasa Beine Uerdünnung ,auf Btua 0,1 mg/ml odsr ueniger erfordern, indem StBrilitätavBrauchB, uis obsn beschrieben, durchgeführt ijurdan.

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DiBSB Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf spezielle Ausführungeformen davon ausführlicher beschrieben, wia in den folgenden Beispielen dargestsllt wird;"

Beispiel 1

Eina Zuht von Clostridium-Histolytikum ATCG Wr". 21DDG wird verwendet, einen Nährboden zu impfen, der 3 Geia_e-% tripsinbehandeltsa Sojaöl, 1 GBu'i-% Prateosapepton und Ausgleichsusasser enthält, einen pH-UIart zwischen 6,5 und. 7,5 aufweist, welcher vorher in einem Autoklaven bei 121,5 ⁰C und 1 ,,D55 kp/cm (15 psi) Druck mshr als 15 Minuten stariliaisrt wurde¹, worauf das Abkühlen auf Raumtemperatur erfolgte,. Das Volumen jeden Keim-Glaskolbens ist 250 mit« Die Keim-Glaskalben werden für hQ Stunden auf 37 ⁰C gehalten. Am Ende dieses Zeitraumes werden Proben des Fermentatianamittels mikroskopisch auf Reinheit geprüft und diB protBolytischa Aktivität wird durch die Azocall-Methade gemessen, dia unten ba-8chriBban wird.

Zehn Litar von FBrmBntationsmittBl ist hargBstallt mit folgender ZusammensBtzung:

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tripsinbBhahdBltBs Sojaöl 1,5%

PrDteOBBpepton ' 5,0 $

H₂O ■-'-"- ■-' BOD nig

. 19,2 g

" 9Dg

₂₄

UitaminkonzBntrat* 5DmI

FbSD.-Lösung (0,120 Gbu.-JO 60 ml

pH-üJert 6,5 bis 7,5 |

Acht Liter des obigen Mittels werden in ain zehn Li'tsr· Gärgefäß gebracht»

* 100 ml dieses Konzentrats enthalten:

PantöthenssurBS Kalzium 20 mg

WikotinaiurB 20 mg

Pyridoxin 20 mg

PimBlinsäurB 20 mg

Thiamin 20"mg

Riboflavin 2,0 mg

Das Gärgefäß" uiird im ,Autoklavan für 30 flinutan auf 121,5 ⁰C

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und 1,055 kp/cm (15 psi) gshaltEn und auf RaumtempBratur abgekühlt. Es uird dann mit den Kulturen von Clastridium-Histolytikum in den Glaskolben geimpft und für 21 bis

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Stunden auf" 37 ^DC gehalten-^ Die Zellen werden dann van der- FlÜBsigkeit getrennt, indem letztere bei 10 000 LJ/mln zentrifugiert wird, bis man eine reine Flüssigkeit erhält. DiB Flüssigkeit wird dann in eine Ausfälltrommel geschüttet, die eine gesättigte Lööung von wässrigem Ammoniumsulfat (ungefähr 5Ö0 g pro Liter) bei i» ⁰C enthält und 10 -Minuten" lang gründlich umgerührt'. Die Aüsfälltrammel und ihr Inhalt wird für 18 Stunden auf k ⁰C gehalten;" Der Miederschlag uird dann gefiltert, gesammelt und in eine dialytische Cellaphanrähre gebracht und für 24 Stunden gegen laufendes üjasser dialysiert'." Während der letzten Stunde uiird dem Wasser erlaubt mit der Röhre in Berührung zu bleiben»' Das üJaseer uird mit WeselBr'a Reagenz stuf Ammoniak geprüft« ΙιΙβππ die Reaktiüfi positiv ipt, wird die Dialyse'für weitere drei Stunden fortgesetzt und das üjasser wieder mit Nessler'a Reagenz geprüft» LJenn die Reaktion negativ ist, wird der dialysierte Wiederechlag in löBUngsmittelaufnehmende Schalen aus roetfreiem Stahl.geleert, gefroren und in einen Gefriertrockner gebracht;» Der Gefriertrockner wird auf einem Druck nicht grosser als 0,25 Thorr (250 microns) und einer Temperatur von 21 ⁰C gehalten. Die GefriertrockenzBit beträgt ungefähr 18 Stunden. Das im Gefriertrockner behandelte Material wird entfernt, leicht gemahlen und in Polyäthylen-Beutel gebracht. Ein Beutel wird für

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jBde Schale ve-ruendet* jeder- Beutel enthält ainsn Durchschnitt van 35 Gramm von im Gefriertrockner behandelten Kollagenaae'.'

Das Enzym uirti durch Bestrahlung stBriliaiart, umbai aina Kobalt 6D-Strahlung9quallB ueruendBt tjird·- Ein Paar von Beuteln und Ljenn gBUJÜnscht zusätzliche kleine Probatailchsn, mit einem Gesamtgewicht von atua 75 g werden in einen-Behälter van 1D8 mm (4 1/4 inch) DurchmBsaBr und 127 mm (5 inch) Höhe gebracht; Dar BBhälter uird in ainar Uorrichtung beatrahlt, ijalche βΙπβπ abgeachirmtan BerBich, eine Kobalt eB-StrahlungaquBllB und einen Drehtisch anthält, der um einB vertikale AchsB rundiertj dia durch diB StrahlungsquBllB varläuft. In ainern typiachan Lauf wird ein mit Enzym gefüllte¹ Behälter auf ainem Drehtisch aufgBnomman, uobai sich seine Basis 177,8 mm (7 inch) obBrhalb das Badens der Abachirmung und seine Achse 127 mm (5 inch) von der Quelle bBfindBn'i' Die DurchsahnittshahB daa BehMltBra oberhalb das Bodens ist dieselbeule diB Hüha dar Quallai' In ainam typischan Lauf tuurde der BBhälter inagasamt 142 Stunden bestrahlt, uobBi ar eine Durchachnittadoaia von 5,D Piegarad erhiät, «deiche von 4,77 Plagarad am Bodan des Behälters bis 5,25 nagarad in der nitte variierte.

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Probe von KollaganasB wird nach dar Baatiahlung auf KollaganaBB-Aktivität, PratBasB-Aktivität und Sterilität geprüft'.

KollagBnaaaprUfung„ ' ,

=3 r; a a=.=ss =: = a a = = = a ss =: = =

Wicht dBnaturiBrtBs Kollagan wird für daB KallagariäaB wie f'Dlg-t hergestBll-t: . -.

Eine Rinder-AchillBa-SBhnB uird von ainain frisch ge— schlachteten TIbt ganomniBn, van Fatt und Unregelmäßigkeiten bafrait und dann in Stücke von atuä 6 mm im Quadrat geschnitten· Diese Stücke uerden nacheinandBr in drei Lösungen van uMssrigam dibaaiacham Kaliumphasphat der KBrnmasaB 15 bBi B ⁰C drai Taga lang in jede Lösung getaucht', Wach dem dritten Eintauchen wird die Sehna 2k StundBn lang in Leitungswasser gelegt. Die gBuaschenB Sahne wird dann nacheinander in di-Bi 25 %— ige uäasriga KaliumchloridlösungBn getaucht, uobsi sia drei Tage in jBdar Lösung varblaibt. Wach dem drittsn Tränken mit Kaliumchlarid uird dia Sehne βΙπβ üJocha lang in Löitungaujasser gelegt, wobei das üJaasar täglich gewechselt wird. Die abBn schwimmende Lösung wird auf das Vorhandensein von Cbloridionan geprüft₈ wobai der Silbernitrat-Test angawendBt wird* Die üJassarwaschung wird fortgesetzt,

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bis der Test negativ ist,- All die obige Bearbeitung idird bei einer Temperatur von nicht höher als 6 D duTDHgeführti Am Ende der Waschung uird Überschüssiges Wasser auage'- ■ lassen und die Sehnenulirf el werden lyophil gemacht.

25 mg von geschnittenBm nicht· denaturiertem Kollagen uirti in eine UersuchsröhrB gebracht und 0,1 ml βϊπβγ 0,1 %-igen wässrigen Lösung des lyophilen Enzyms und 5 TnI eines "

Puffers werden beigemengt« Der Puffer hat die folgende ZuBammBnßBtzung:

drei (Hydroxymethyl) AminomBthan, 0,2 Π 50 ml

HCl, 0,2Π 4 4,2 ml

Kalziumazetat, 0,02 Π 100 rhi ·

dBBtilliertes ülaseer q.s* auf 200 ml

Eine i<öhtrollröhrB A uird horgeatellt uie oben, ausge- t

nomniBn, dasB das Enzym ueggelasBen uiird. Eine zueite KontrollTÖhre B ujird hergestellt uie oben, ausgenommen, das Weglassen des KollagenB (Rohre B enthalt Enzym). Eine dritte'KantToiiröhre C uird hergestellt wie oben, ausgenommen, dass 0,1 ml von 0,1 %-igBm^; Tf ipsin (Armour. Pharmaceutical Go«, Kankakee, 111«) anstelle des Kollagenäse bBigemengt tdird. Jede dar vier Rühren wird für 24 Stunden auf 37 ⁰C ermörmt« Nach /dem Eruörmen werden

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0,5 ml der reinen oben schwimmenden Flüssigkeit van jeder Rühre dekandiert und in einen 10 ml Messkolben gebracht. In jeden Messkolben werdsn 1 ml von,. 1 %-iger wässriger Ninhydrinlösung und 1 ml von 5 %-iger wässriger Puridinlösung beigemengt-. Die Messkalben werden für 20 Minuten in ein Wasserbad gebracht. Genügend destilliertes Wasser wird beigemengt, um ein Gesamtvolumen von 10 ml zu ergeben und die Test-Lösungen werden in einem FataelEktrischsn-Klett-Kolarimeter bei 570 Millimikron gegen die Kantrolle abgelesen. Die Kallagenaseaktivität wird in C-Einheiten ausgedrückt. Eine C-Einheit stellt die berechnete optische Dichteableeung dar, die erreicht wird, wenn ein Milligramm van Enzym auf 25 mg von Kollagen unter den abigen Bsdingungen einwirkt. Das Kollagenase muss eine minimale Aktivität von itO 000 C-Einheiten per Gramm haben, sonst wird es ausgeschieden, '

Proteaseprüfung.

"Azocoll", Bin Dsckpudarpräparat, das an einen Azo-Farb-Btoff gBbunden ist, wird hergestellt nach dem l/erfahren von Oakley et al«, Journal of Patliology and Bacteriology, Band LUIII₁ HIr, 2, .Seiten .227, 232 (19Ί6). Proteolytische Enzymaktivität bei Uerwendung von Azacoll-Reagenz wird

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bestimmt na&h. dem Herfahren .von; fiandl et. al., Journal ,of Clinical Investigation» 32, 1323_: .(Λ953-) «01b iiruieasB-aktivität .darf nicht weniger a,ls %QGQ_ Q-Ein.heite,n be- ■ tragen,; sonst wird das Enzym ausgeschieden., ... ,. ..

Eine :SalbEj wird hargsstellt durch Kischen vpn . 5 .Gramm. , ,

Kollag-enasB, das präpariert. ist, yia. es in Beispiel 1 bBSDhrieb,en taird,, mit 995 Gramm weiBer tfaselirce. . . , ... . .-......._ ■

Eins Salbe uiird hergestallt durch Wi sehe η der Bestandteile:

KollagenasB (Beispiel 1) . 5 Gramm

-''Strep-CombiotiD" (Pfizer) ' _{: ;},_; IQ Gramm üIbxBb UaBBlina · . - BB5. Gr.a,mm;

"Strep-Combiatic" ist ein pärentsraies gnti:bio.tiktiin in EinhBitadoBierLfng und enthäit 0,5 ;g Strep to my Z in, ,3QD QQQ

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ο η _

Einheiten Prokain-Penicillin G und 1OD DOD Einheiten von gepuffertem Penicillin-G^ hergestellt durch■■■ Charles Pfizer & Co., Kfew· York, Ri. Y. Es wird^: der Salbe einverleibt, üki, nicht spezifisches Zersetzen zu v^:ermeldenv , ·- ^: :-,· .

Beispiel k · ' ^: ' :·;·:-.

■■■■■■;■■■■. ■- ■■·'■■ ' '■'· ."·' '"

20 neerisDhtijeinchen ira Gelaicht von 5QQ bis ßOD Βγητπγπ^{: :} uurden mit Watriumpentobarbit'al PB' ■anäs't'hetisie'rt. "" -" Beide Seiten der Tiere 'wurden mit einer Blektrischen ■' Haarschneidemaschine geschoren und dann rasiert.Ein· kreisFöriniger Bereich von 5 era Durchmesser wurde auf jeder Seite tangierend an eine Liriie markiert, die parallel und in einem Abstand von 13 cm (i/2 inch) zum Rückgrat des Tieres verlief.·Ein 125 ml-Becher van * [iJasaer tjurde auf SD C erhitzt, aias mit einem gerade unter die Oberfläche des Wassers getauchtem Quecksilber-Thermdmeter' gemessen wurde. Der markierte Bereich des* Tieres wurde für 20 Sekunden mit der OiSerflache des Wassers in Berührung gebracht. Der gebrannte BersiDh ' wurde mit denaturiertem Äthylalkohol gereinigt, welcher dann verdampfen konnte. ' "

Eine Testsalbe wurdB hergestallt, wie"in Beispiel 3'

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beschrieben und eine KantrollsalbB, bsstBhend¹ aus Vaseline und Strep-Cambiotic in den Mengen, wie in. Beispiel 3, aber phne Kollägena-se, wurde bewertet,

Unn den ZO in dieser Untersuchung verwendeten TisrBn wurden 16 Tiere auf einer Seite mit Kollagenase- Salbe behandelt und auf der anderen Seite mit KantrollsalbB, !/□π diesen erhiBlten θ die KollagenaseaaXbe auf die , rGchte Seite. Zuei Tiere wurden auf beiden Ssitsn mit l<Dllagenase-SalbB b.ehandelt und zuei Tiere Erhielten Kantrollsalbe auf bsidsn ätten_t'.

Die Salben wurden täglich auf jedes WeTsuchstier aufgetragen. Die Salben wurden auf Gazekissen verteilt, welche in Berührung mit der Wunde gebracht wurden. Diese wurden mit einem Klebstreifen am Umfang an der Stelle befestigt und eine zusätzliche Streifanlange wurde um den Macken des Tieres gewunden, um ein Losreißen zu verhindern. Die Salben wurden mit einem Kode versBhen, so dass die Person, die sie auflegte, nicht wußte, ob sie eine Kollagenase-Salbe oder eine Kontrollsalbe auflegte. Die Reihenfolge, in welcher die Tiere beobachtet wurden, wurde täglich verändert. Uor jeder Beobachtung wurde die LJundB mit einem in Wasser getauchten Baumwollbausch leicht abgerieben. Die Behandlung auf diese Weise

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wurde 96 Stunden durchgeführt. Am Ende dieser Zeit wurden die Tiere beobachtet und der Prozentsatz der Zersetzung ujurde durch Hessen des zersetzten Bereiches bestimmt«Die Prozentsätze der Zersetzung bei Verwendung sowohl von Kollagenase- als auch Kontrollsalben und die Differenzen zwischen diesen Prozentsätzen der Zersetzung für die Tiere, die Kollagenase-Salbe auf einer Seite"und Kontrollsalbe auf der anderen Seite erhielten, sind in der folgenden Tabelle I wiedergegeben.

T a b el 1 e I .

Tier-I\!r. Seite die Kalla— % dar Zersetzung · Differenz genäse erhielt linke S. rechte S.

8-1	links	90	D'	90
8-2	rechts	D	100	100
8-3	links	95	25	70
9-1	rechts	»Ü	95	95
9-2	rechts	,0	70	70
9-3	links	8D	' 0	80
■g-ii	rechts	10	100	90
9-5	links	15	0	15
10-1	links	95	20	75
10-2	rechts	3D	90	60

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10-3	'-links
1D- it	rechts
10-5	links
10-6	rechts
10-7	links
10-8	rechts
10-9	beide
10-10	beide
10-11	kei_tne
10-12	keine

95	30	65
O	95	95
75	15	60
5	95	90
*m,:*	15	75
D	70	70
90	70	—
0	5
20	0	_

Obtiiohl diese Erfindung soüiohl in der Beschreibung als auch in Beispielen unter Hinweis auf spezifische Einzelheiten und AusfQhrungsforniBn beschrieben uorden ist, versteht es sich, dass diese nur
der Ueranschaulichung und nicht der Begrenzung dienen und dass der Bereich der frfindung nur durch die bei— gefügten Ansprüche bestimmt- üiird;

Patentansprüche

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Claims

Pat ent ansprüche

■j I Verfahren zur Herstellung von Kollagenase., gekennzeichnet durch das Züchten van Zellen einer nicht beweglichen und nicht Flagellen enthaltenden Zucht von Clostridiurn-Histolyticum unter an- Wf ' aeroben Bedingungen in einem Fermsntationsrnedium, das'

PJahrungsquellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, das Aufspeichern der Zellen und das Gewinnen,von Kalla— genäse von dem Nährboden·

2', Verfahren nach Anspruöh 1, d a d u r c h gekennzeichnet,, dass das Kollagenase durch Ausfällen mit einem anorganischen Salz und nachfolgender Dialyse des Wiederschlages gewonnen wird.

3» l/erfahren nach Anspruch 1, dad u r c h g e k" e η η ζ e ich η e t, dass das gewonnene Kollagenaee mit einer radioaktiven Strahlungsquelle bestrahlt wird, bis eB steril ist«

it. Verfahren nach Anspruch 3, dad u r c h g a kennzeichne t, dass die radioaktive Strahlungsquelle Kobalt 60 ist.

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5. Verfahren nach Anspruch 3, d a durch g e kennzeichnet, dass die Gesamtbestrahlungsmenge tjonigstens 2,5 Megarad beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 _f. d a d u r c h g e kennzeichnet, dass die Zucht von Clastridium-Histolyticum ATCC l\)r. 210DD ist.

7. Είπε Enzymatische Zusammensetzung mit prateolytischem Enzym- und KallagBnasB-Aktiuität, dis uirksam ist, nekra-^ tisches und absterbendes GeuebB zu zersetzen, welches nicht denaturiertes Knllagen enthält, g e k e η η ζ β i c h η β t d u r c h a) üJasserlöslichkeit, b) die Ausfällbarksit aus uässriger Lösung, durch Ammoniumsulfat, c) Beständigkeit bei Temperaturen unter etua lh C und UnbEständigksit bsi erhöhten Temperaturen und d) Wirksamkeit zum Verhindern des Ulachstums von Mikroorganismen in Konzentrationen von wenigstens etwa 1mg/ml.

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