JPS60188066A - 新コラゲナ−ゼ、デイスコリシン及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は不溶性コラ−ダン溶解活性を有する新コラゲナ
ーゼ「ディスコリシン」及ヒその製造法に関する 不溶性コラーゲン分解活性を有するコラゲナーゼとして
は従来クロストリジウム・ヒストリカムの生産する酵素
が最もよく知られている。本菌のコラゲナーゼは種々の
生化学的研究に研究試薬として幅広く使用されているだ
けでなく、最近では椎間板コラーゲンを分解することに
よる腰痛、椎間板ヘルニア等の疾患の治療にも利用でき
るようになった。しかしながら、本菌はガス壊［菌とし
て古くから知られている嫌気性の病原菌であシ、毒素を
生産する。従って、コラゲナーゼの大量生産には嫌気性
細菌で−あるため大量培養が困難であシ、シかも危険な
毒素を生産するという点で適さない。そこで本発明者は
優れた特性を有し、しかも大量生産が容易で経済性のあ
る微生物の生産するコラゲナーゼを広く探索し、ストレ
プトミセス属の培養液から新規コラゲナーゼを発見し、
本発明を完成した。

すなわち、本発明は生化学研究及び椎間板ヘルニアをは
じめとするコラーゲンに原因のある多くの疾患の治療に
有用な微生物の生産する新規コラゲナーゼを提供するも
のでちる。

本酵素は未変性及び変性のコラーゲンを溶解することが
示された。以下本酵素をディスコリシフ　（ｄｉｓｅｏ
ｌｙｓｉｎ　）と称する。

本発明は、−！だ放線菌を培養して坩養物からディスコ
リシンを採取する方法、特にストレプトミセス属菌を培
養して培養物からディスコリシンを採取する方法に関す
るものである。

本発明に用いうる微生物は、ストレプトミセス属に属す
るディスコリシン生産菌であシ、本発明によシ特に有効
であると認められた菌株は例えばストレプトミセス（Ｓ
ｔｒ＠ｐｔｏｒｒ＋７ｃａｓｅｐ、）　Ｃ−５１株であ
る。本菌株は通産省工業技術院微生物工業技術研究所に
受託番号微工研狛寄第７４６９号として寄託した。

本菌株は本発ツ」者によシ沼津市太平の土壌から分離さ
れたもので、その菌学的特徴は下記の通シである。

（１）形　態 栄養菌糸の球状あるいは桿状への分断はみられない。気
菌糸及び胞子鎖は波状からゆるいラセン状をなし、２０
個以上の胞子をシγ↑生する。すなわち、Ｒｅｔｌｎａ
ｃｕｌｕｍ−Ａｐｅｒｔｕｍ　（ＲＡ　）タイプと５ｐ
ｌｒａタイプの中間の性質を櫓する。

走査型電子顕微鏡観察によると胞子は伏型で０．６〜ｏ
、　ｓ　ｘ　ｉ、　ｏ〜１，２ｍμで、胞子表面はスム
ースタイプである。子のう、菌核及び遊走子等の器官は
みられない。

（２）細胞壁の特徴 細胞壁はＬＬ型シアミノピメリン＆（ＬＬ−ＤＡＰ　）
及びグリシンを含有し、菌体構成糖に特徴はみられない
。

（３）　生育状態 各種寒天培地上における生育状態は表１の如くであった
。

以下傘白 （４）生理的性質 生育温度は１０〜４０℃にあυ、至適生育温度は２８℃
付近にあった。デンプン分解能、脱脂牛乳のペゾトン化
能及び凝固能及びゼラチンの液化能（グルコース・ペゾ
トンゼラチン培地上）はすべて陽性であった。一方、メ
ラニン様色素の生成能、硝酸還元能、硫化水素生成能、
セルロース分解能は認められなかった。

（５）　炭素源の同化性 Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニット、
Ｄ−フルクトースを極めて良く利用した。Ｄ−キシロー
ス、イノシトールも次いで利用したが、Ｌ−ラムノース
、ラフィノース、シュークロース、セルロース分解能さ
れないか、又は利用性が極めて低かった。

以上の性状を要約すると本菌株はストレプトミセス属−
に総し、Ｇｒａｙ　５ｅｒｉｅｓのＲＡまたはＲＡＳタ
イプ、胞子表面は平滑で、メラニン陰性（ｎｏｎ　−ｃ
ｈｒｏｍｏｇｅｎｉｅ　）タイプであると結論される。

上記以外のストレプトミセス属でもディスコリシン生産
能を示すものであれば、その変種或いは変異株を問わず
使用し得ることはいうまでもない。

ディスコリシンはディスコリシンを生産する菌株を放線
菌の培養法として公知の培養法によシ好気的に培養して
培養物中に生産せしめられる。ディスコリシン生産菌は
１０〜４０℃で生育するが、ディスコリシンの生産には
通常２５〜３５℃が好寸しい。ディスコリシンな生産す
るストレプトミセス属ｍを培養するためには放線菌その
他の微生物の培養に公知の栄養源を利用することができ
る。例えば、グルコース、デンプン、デキストリン、グ
リセリン、シュクロース等を炭素源として利用できる。

これらの炭素源の中でグルコース及ヒシュークロースハ
ティスコリシン生産に好ましい炭素源である。

ディスコリシンを生産するため、放線菌その他の微生物
の発育のため公知の窒素源はすべて利用できる。例えば
、ベゾトン、肉エキス、酵母、酵母エキス、大豆粉、落
花生粉、コーン・ステイープ・リカー、米ぬか、ゼラチ
ン、各種魚粉、無機窒素等を利用できる。

ディスコリシン生産菌の培養でディスコリシンを生産さ
せる場合、必要とするときは、無機塩、金属塩を加える
。また必要とするときは、ｙｌｌ金管微量加えることも
できる。

ディスコリシンはその生゛産菌を好気的に培養してＫＬ
ｔられるが、通常用いられる好気培養法、例えは、固体
培養法、振とり培養法、通気攪拌培養法が用いられる。

培養成いは培地滅相中消泡を必扱とするときは、シリコ
ンオイル、界面活性剤等の消泡剤が使用できる。

培養温度は２５〜３５℃が好ましい。

ディスコリシンの活性はコ２−グンを溶解する以下の方
法で検定できる。即ち、（１，０６７Ｍリン酸バッファ
ー（ＰＨ７，４）（０，４５％のＮｈＣＬを金山）５ｄ
、ディスコリシン溶液１−と仔牛アキレス鍵コラーゲン
２５■を３７℃で１８時間反応させる（コントロールに
は酵素液を加えない）。反応後反応液をろ過してそのろ
液の０．２−をニンヒドリン試系２．０−に加え、２０
分間沸とう水中で加熱する。その後流水中で冷却し、液
量を水で１０ｍ１に調整し、１５分後に波長６００ｍμ
で吸光度を測定する。Ｌ−ロイシンを標準とする標準曲
線から反応中遊離したアミノ酸量をめる。これによりデ
ィスコリシンの生理活性がめられる。

培養はディスコリシンが実質的に蓄積する１で続け、本
物質の培養物からの抽出分離は後記実施例が示すごとく
、本発明者によって明らかにされた本物質の性状にもと
づいて、種々の方法を適当に組合わせることにょシ行い
うる。すなわち、硫安等にょる塩析法、アセトン、メタ
ノール等有機溶媒による沈澱法、各種イオン交換体によ
るクロマトグラフィー、釉々の担体によるグルろ適法、
種々の電気泳動法、限外ろ適法、凍結乾燥法、透析法、
クロマトフオーカシング等である。これらの手段を組合
わせ、また反復使用することにより培養物からディスコ
リシンは単離される。

次にディスコリシンの理化学的性状及び生物活性を示す
。

（１）　分子ｉ　６ｏ、０００〜７０，０００　（８Ｄ
Ｓ　？　＋）　１クリルアミド電気泳動による） （２）ディスク電気泳動で活性のある２本のバンドを与
える。

（３）等電点　ｐＨ４，８とｐＨ４，９（焦点電気泳動
による） （４）　元素分析値　Ｃ：約４３％、Ｈ：約７％、Ｎ：
約１３％（５）　紫外部吸収スペクトル　第１図（６ン
　赤外部吸収スペクトル　第２図（７）硫安飽和　４５
〜８０％で沈澱する（８）　イオン交換体ＤＥＡＮセル
ロースに吸着される （９）　不溶性天然コラーゲン、変性コラーゲン、ゼラ
チンを分解するがカゼインには極めて作用しにくい。

叫　不溶性コラーゲン分解の至適ｐＨが７．６〜８．０
にある。

圓　ＫＤＴＡで活性が阻害を受ける。

α２　不溶性コラ−ダンに対する分解活性はクロストリ
ジウム・ヒストリカムの生産するコラゲナーゼと同等も
しくは若干高い。

０３）　マウス経口による急性毒性（ＬＤｓｏ）は１ｆ
／に９以上である。

ディスコリシンはコラーゲンの分解を必要とする各種の
生化学的、生理・薬理学的研究に広く利用できる。さら
にディスコリシンはコラーゲンに異常の原因がある各種
疾患、例えば椎間板ヘルニア、ペーロニ病（海綿体炎）
、一部の肝疾患等の予防と治療にも広く利用できる。例
えは、麻酔下にあるイヌを腹部切開し、触診により椎間
板（Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｌｓｃ　）を確
認しながら、背部腹膜を通して注射法により椎間板の中
心部にある弾力性半円板（ｎｕｅｌｅｕａ　ｐｕｌｐｏ
ｓｕｓ　）にディスコリシン溶液（Ｏ：０Ｓ−）を投与
した。投与１週間後にイヌを殺して椎間板を観察した結
果、椎間板１個につきディスコリシン１００単位（ＡＢ
Ｃ単位単位上以上投与ものでは弾力性半円板が有意に溶
解していた。なお、重篤な毒性、副作用は認められなか
った。

以上の如く、ディスコリシンはコ２−グンに異常のある
疾患に効果のあることが認められ、医薬、医薬部外品ま
たは食品添加物として使用することができる。

ディスコリシンは経口的または非経口的に例えはカプセ
ル剤、錠剤、注射剤等の形で投与することができる。投
与量は年令、症状、体重等によシ異なるが、通當は成人
に対して１日１〜１００ｑを１〜３回に分けて投与量れ
る。しかし、必要に応じてそれ以上の量またはそれ以上
の回数投与することかできる。

次に本発明の実施例を示すが、本発明により上述の如き
諸性質が明らかにされた以上、これらの知見に基づき、
培養物−またはその関連物からのディスコリシンの採取
には諸種の修飾手段が可能である。本発ゆ］は実施例に
限定されるものでなく、すでに記載された知見から容易
に推定されるすべての方法を含むものである。

実施例１ シュークロース１％、ペゾトン１％、ゼラチン０．３％
、酵母エキス０．２％、Ｎａ２Ｈｐ０４０．２％、Ｎａ
２ＣＯ３０，２５％、ＭｇＳＯ４−７Ｈ，００，０４％
からなる培地１５Ｌを３０１容量のシャーにとυ、滅菌
後ストレプトミセスＣ−５１株を接種して３０℃で３０
時間好気的に培養した。

培養終了後ろ液（１２ｔ’）を得て、これに硫安を加え
て４５〜８０％飽和で沈澱となる画分を集めた。これを
溶解して１０　ｍＭ　）　リス・塩酸バッファー（ＰＨ
７，５）　７４　ｍＭ　ＣａＣｌ２に対して透析し、Ｄ
ＥＡＦ、セルロースカラム（３，２ｘ２６ｃｍ）に吸着
せしめた。同ノくツファー及び同バッファーにｌ　Ｍ　
ＮａＣ７を加えたもの各１ｔからなるグラジェント系に
よシ同　□カラムを展開してディスコリシン画分を採取
した。本画分を１０ｍＭクエン酸（Ｎａ）バッファー（
ＰＨ７，０）　／　４　ｍＭ　ＣａＣ４に対して透析し
、同バッファー条件下にあるＤＥＡＥセルロースカラム
（２，ＯＸ２６ｍ〕に吸Ｎぜしめた。次いで、同バッフ
ァー及び１０　ｍＭクエン酸（Ｎａ　）バッファー（Ｐ
Ｈ４，０）　７４　ｍＭＣｈ　Ｃ４各１ｔから成るグラ
ジェント法によυカラムを展開して主要活性画分を採取
した。

本活性画分を０．２　ｍＭ　ＣａＣｌ２に対して透析し
てから凍結乾燥し、精製ディスコリシン５１巧（タンノ
Ｑりとして）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はディスコリシンの紫外部吸収スペクトル、第２
図は同物質の赤外部吸収スペクトルである。 以上 ２２＋１　２６０　３００　３４０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を有する新コラダナーゼ、ディ
   スコリシン。 （１）　分子量　６０，０００〜７０，０００゜（２）
   　ディスク電気泳動でコラダナーゼ活性のある２本のバ
   ンドを与える。 （３）　等電点　ｐＨ４，８及び４．９（焦点電気泳動
   法による） （４）　元素分析値　Ｃ約４３％、Ｈ約７％、Ｎ約１３
   ％。 （５）　紫外部吸収スペクトル　第１図（６）　赤外部
   吸収スペクトル　第２図（７）　硫安飽和４５〜８１％
   で沈澱する。 （８）　イオン交換体Ｄ　ＥＡＲセルロースに吸着され
   る。 （９）　不溶性コラーゲン、変性コラーゲンに分解する
   がカゼインには極めて作用しにくい。 叫　不溶性コラーゲン分解の至適ｐｉｔが７．６〜８．
   ０にある。 ＱＩ　ＥＤＴ人で活性が阻害を受ける。 ２、　ストレゾトミセス属に属するディスコリシン生産
   菌を培養し、培養液からディスコリシンを採取すること
   を特徴とする新コラゲナーゼ、ディスコリシンの製造法
   。 ３、　ディスコリシン生産菌がストレプトミセスＣ−５
   １株である特許請求の範囲第２項記載の製造法。