JPS6147515B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はデキストラン合成阻害作用、虫歯の予
防・治療作用等を有する新生理活性物質及びその
製造法に関する。

口腔内細菌が蔗糖から不溶性デキストランを合
成し、それが細菌と共に沈着して歯垢を形成する
ことが虫歯の原因の一つであることが知られてい
る。そこで本発明者は虫歯の原因菌によるデキス
トランの合成を阻害することにより、虫歯を予防
し、或いは治療することができるものとの考えに
基き、微生物培養液中のデキストラン合成阻害物
質を広く探索し、アスベルギルス属の培養液から
新規生理活性物質を発見し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は微成物の生産する虫歯の予
防・治療剤として有用な物質を提供するものであ
る。

この物質は代表的なう蝕原性細菌であるストレ
プトコツカス・ミユータンスによるプラーク形成
を阻害することが示された。以下この物質をムタ
ステイン（Mutastein）と称する。

本発明は、またカビを培養して培養物からムタ
ステインを採取する方法、特にアスペルギルス属
菌を培養して培養物からムタステインを採取する
方法に関するものである。

本発明において用いる微生物は、アスペルギル
ス属に属するムタステイン生産菌であり、本発明
者により特に有効であると認める菌株は例えばア
スペルギルス・テレウス（Aspergillus
terreus）M3328である。本菌株は通産省工業技
術院微生物工業技術研究所に受託番号微工研菌寄
第5891号（FERM−PNo.5891）として寄託し、
さらに、受託番号微工研条寄第101号（FERM
BP−101）として、動許手続上の微生物の寄託の
国際的承認に関するブダペスト条約による国際寄
託へ移管した。

本菌株は本発明者により東京都武蔵野市の土壌
から分離されたもので、その菌学的特徴は次に記
載する通りである。

集落の性質 生育速度：25℃ではポテトデキストロース、ツア
ペツクドツクス及びコーンミールの各寒天培地
における集落直径は各々2.8、3.5、及び4.3cmで
生育ややすみやかである。37℃では３種の培地
においていづれも生育抑制的〜きわめて抑制的
である。生育好適温度は24〜28℃である。前記
培地ではPH２〜８で生育するが、好ましい生育
範囲はPH３〜７である。

生育パターン： ポテトデキストロース寒天培地：25℃では基
底菌糸層はやや薄く、放射状の浅い溝を持つ。
淡かつ色〜茶かつ色、ビロード状、分生子頭形
成多数、分泌液は淡いこはく色、集落裏面は深
黄色〜かつ色。37℃では基底菌糸層は山岳状に
高くもり上り、放射状の溝をもつ、淡かつ色、
ピロード状、中心部は羊毛状、分生子頭形成
少、濃いこはく色の分泌液、集落裏面は濃赤か
つ色。

ツアペツクドツク寒天培地：25℃では基底菌
糸層は平たん、淡かつ色〜かつ色、ビロード状
で中心部はフエルト状〜羊毛状、分生子頭形成
はやや不良、分泌液はこはく色、集落裏面はか
つ色。37℃ではポテトデキストロース37℃と類
似。

コーンミール寒天培地：25℃では基底菌糸層
きわめて薄く平たん、ほとんど無色、所々にか
つ色分生子頭が散在、集落裏面も無色。

顕微鏡的性質 分生子世代： 分生子頭：長円筒形、赤かつ色、スライド培養で
は80〜150×30〜50μ集落上では実体顕微鏡下
で400〜500×50μ。

分生子柄：50〜180×4.0〜5.4μ、大部分は多少
屈曲、滑面、無色、先端が肥大して頂のうを形
成。

頂のう：直径８〜9.5μの半球形、上部約1/2より
メトレを生ず、生育途中のものは数本のメトレ
を生じ、半球形には至らず。

メトレ：４×２μ位、無色。

フイアライド：5.5×２μ位、無色。

分生子：フイアロイド型分子、長く連鎖、直径
1.9〜2.4μ、球形、滑面。

以上の集落及び顕微鏡的性質より本菌株をアス
ペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）
と同定した。

アスペルギルス・テレウスの菌学的特徴は次の
文献、すなわち、宇田川俊一、椿啓介ほか著：菌
類図鑑下巻、1039〜1040頁、1978年（講談社サイ
エンテイフイク）、C.Thom、M.B.Church：
American Journal of Botany、５巻、85頁、
1918年に記載されている。

上記以外のアスペルギルス属でもムタステイン
生産能を示すものであれば、その変種或いは変異
株を問わず、使用し得ることはいうまでもない。

ムタステインはムタステインを生産する菌株を
カビの培養法として公知の培養法により好気的に
培養して培養中に生産せしめられる。たとえば、
ムタステイン生産菌株はポテト・デキストロー
ス・アガー培地に継代培養され、ムタステインの
生産のためにこの寒天培地上発育菌体を直接生産
倍地に接種して倍養できる。また生産培地に発育
させた菌体を新しい生産培地に倍養して、そこに
ムタステインを生産させることができる。

ムタステイン生産菌は７〜35℃で発育するが、
ムタステインの生産には通常20〜30℃が好まし
い。ムタステインを生産するアスペルギルス属菌
を培養するためには、カビその他の微生物の培養
に公知の栄養源を利用することができる。例え
ば、グルコース、マルトース、デキストリン、デ
ンプン、ラクトース、サツカロース、グリセリン
等を炭素源として利用できる。これらの炭素源の
中でグルコースおよびグリセリンはムタステイン
生産に好ましい炭素源である。

ムタステインを生産するため、カビその他微生
物の発育のため公知の窒素源はすべて利用でき
る。例えば、ペプトン、肉エキス、酵母、酵母エ
キス、大豆粉、落花生粉、コーンステイープリカ
ー、米ぬか、無機窒素源等を利用できる。

ムタステイン生産菌の培養でムタステインを生
産させる場合、必要とするときは、無機塩を加え
る。また必要とするときは、重金属の微量を加え
ることもできる。

ムタステインはその生産菌を好気的に培養して
得られるが通常用いられる好気培養法、例えば、
固体培養法、振とう培養法、通気撹拌養法が用い
られる。培養或いは倍地滅菌中消泡を必要とする
ときは、シリコンオイル、界面活性剤等の消泡剤
が使用できる。培養温度は20〜30℃が好ましい。

ムタステインの生理活性はプラーク形成をみる
以下の方法で検定できる。すなわち、試験管に培
地10mlをとり、これにニクロム線（20ケージ）を
入れてう蝕原性細菌（虫歯菌）Streptococcus
mutansを接種し、37℃で、生育させる。一定時
間後（例えば48時間後）にニクロム線に付着した
プラーク量を測定する。ムタステイン無添加の対
照と一定量のムタステインを加えたものにつきプ
ラーク量を比較することによりムタステインの生
理活性が求められる〔R.M.McCabe、P.H.
Keyes、A.Howell、Jr.、Arch.Oral.Biol.、12
巻、1653〜1656頁、1967年〕。

培養はムタステインが実質的に蓄積されるまで
続け、本物質の培養物からの抽出分離は、後記実
施例に示すごとく、本発明者によつて明らかにさ
れた本物質の性状にもとづいて、種々の方法を適
当に組合せることによつて行い得る。すなわち、
硫安等による塩析法、PHの調節によるPHの沈澱分
画法、各種のイオン交換クロマトグラフ法、種々
の担体を用いたゲル過法、種々の電気泳動法、
限外過法、凍結乾燥法、透析法、各種有機溶媒
による抽出処理法等である。これらの手段を適当
に組み合わせ、また反復使用することにより培養
物からムタステインは単離される。

次にムタステインの理化学的性状及び生物学的
性質を示す。

(1) 分子量は20万以上であり、セフアデツクスＧ
−100及びセフアロース6Bのゲル過によりボ
イド・ボリユームに溶出される。

(2) 紫外線吸収スペクトル：第１図 (3) 赤外線吸収スペクトル：第２図 (4) タンパク質の性質を有し、約10％の糖を含有
する。

(5) 水及び塩類溶液に可溶であるが、硫安飽和約
30％で塩析される。またアセトン、エタノー
ル、酢酸エチル、ベンゼンに不溶。

(6) PH７以上の緩衝液に溶液するが、PH３〜3.5
で沈澱を生ずる。

(7) PH９、100℃、10分の熱処理に対して安定。

(8) 元素分析値 Ｃ：約44％、Ｈ：約７％、Ｎ：約12％ (9) 呈色反応 フエノール硫酸呈色反応（橙）、フオーリン
呈色反応（青）。

(10) Streptococcus mutans6715株を用いた前記
プラーク形成をみる生理活性試験において10μ
ｇ／ml以上でプラーク形成を抑制する。

(11) マウス経口による急性毒性（LD₅₀）は１ｇ/
Kg以上である。

ムタステインの動物を用いた歯垢形成に対する
効果を種々の方法によつて検討した結果、その有
効性が確認された。たとえば、一群５匹のゴール
デンハムスターをStreptococcus mutans6715株
で感染し、高蔗糖飼料（diet2000）〔H.V.
Jordan、P.H.Keyes、Archs、Oral.Biol.、９
巻、377〜384頁、1964年〕で飼育した。これと並
行して他の一群には更に１％のムタステインを添
加した飼料を与えた。両群共３週間飼育後に歯垢
形成量と歯のう蝕程度を比較した結果、ムタステ
イン投与群はムタステインを投与しない対照群に
くらべて有意に歯垢形成量が減少し、また歯のう
蝕程度も軽減されていた。

以上のごとく、ムタステインは歯垢形成および
う蝕に対する抑制作用を有し、たとえば虫歯の予
防・治療剤として医薬、医薬部外品または食品添
加物に使用することができる。

ムタステインは経口的または非経口的に例えば
カプセル剤、錠剤、注射剤等の形で投与すること
ができる。通常は経口剤が好適である。投与量は
年令、症状、体重等によつて異なるが、通常は成
人に対し１日約１〜1000mgを１〜３回に分けて投
与される。しかし必要に応じてそれ以上の量また
はそれ以上の回数投与することができる。

次に本発明の実施例を示すが、本発明によつて
上述の如き諸性質が明らかにされた以上、これら
の知見に基づいて、培養物またはその関連物から
ムタステインの採取には諸種の修飾手段が可能で
ある。本発明は実施例に限定されるものではな
く、すでに記載された知見から容易に推定される
すべての方法を含むものである。

実施例 １ グルコース１％、デン粉２％、ソイビーンミー
ル２％、リン酸一加理0.1％、硫酸マグネシウム
（MgSO₄・7H₂O）0.05％を含む培地にアスペルギ
ルス・テレウスM3328を接種して温度25℃で９日
間好気的に培養した。得られた培養液（3.6
）、を硫安飽和30％として生成した沈澱を遠心
分離により集め５ｍＭリン酸バツフアー（PH
7.1）に対して十分析した。次いで、透析内液を
稀塩酸でPH3.5として生成した沈澱を遠心分離に
より集め、0.1M食塩を含む５ｍＭリン酸バツフ
アー（PH6.9）に対して十分透析した。この内液
を0.1M食塩を含む同バツフアーで調製したセフ
アロース6Bのカラムにのせ、展開して活性画分
を採取した。この活性画分を蒸溜水に対して十分
透析した後、凍結乾燥により淡白色の精製ムタス
テイン（タンパクとして1.8ｇ）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はムタステインの紫外線吸収スペクト
ル、第２図は同物質の赤外線吸収スペクトルであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有する新生理活性物質
   ムタステイン。 (1) 分子量は20万以上であり、セフアデツクスＧ
   −100及びセフアロース6Bのゲル過によりボ
   イド・ボリユームに溶出される。 (2) 紫外線吸収スペクトル：第１図 (3) 赤外線吸収スペクトル：第２図 (4) タンパク質の性質を有し、約10％の糖を含有
   する。 (5) 水及び塩類溶液に可溶であるが、硫安飽和約
   30％で塩析される。またアセトン、エタノー
   ル、酢酸エチル、ベンゼンに不溶。 (6) PH７以上の緩衝液に溶解するが、PH３〜3.5
   で沈澱を生ずる。 (7) PH９、100℃、10分の熱処理に対して安定。 (8) 元素分析値 Ｃ：約44％、Ｈ：約７％、Ｎ：約12％ (9) 呈色反応 フエノール硫酸呈色反応（橙）、フオーリン
   呈色反応（青）。 ２ アスペルギルス属に属するムタステイン生産
   菌を培養し、培養液からムタステインを採取する
   ことを特徴とする新生理活性物質ムタステインの
   製造方法。 ３ ムタステイン生産菌がアスペルギルス・テレ
   ウスM3328である特許請求の範囲第２項記載の製
   造法。