SU1756349A1 - Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм SереDоNIсUм - продуцент полисахарида, индуцирующего образование интерферона - Google Patents

Abstract

Использование: полисахарид может быть использован в профилактике и лечении опухолевых процессов, а также различных иммунодефицитных состо ний. Сущность изобретени : Штамм Corynebacterlum sepedonicum ВНИИА 1857  вл етс  продуцентом полисахарида, индуцирующего образование интерферона с высокой активностью. Штамм Corynebacterlum sepedonicum выделен из клубней картофел . При росте на жидкой синтетической среде , в которой в качестве источника азота используетс  хлористый аммоний, а углерода - глюкоза (стоимость 1 л среды составл ет 16 коп), клетки синтезируют полисахарид, обладающий способностью индуцировать образование интерферона лейкоцитами периферической крови человека , а также культурами мышиных фибробластов. Полисахарид состоит из следующих моносахаридов: рамнозы и галактозы. Кисла  природа полисахарида обусловлена присутствием пировИног- радной кислоты. 2 ил. 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к микробиологии , а именно к штаммам микроорганизмов, используемых в микробиологической и медицинской промышленности дл  получени  иммуномодул торов, в частности полисахаридов , обладающих способностью индуцировать образование интерферона в клетках человека и животных.

Известен продуцент полисахарида Bacterium prodlgiosum, получившего название гфодигмозан, который про вл етинтер- ферониндуцирующее действие,

Выращивание указанного продуцента проводитс  на среде, содержащей дорогосто щие реактивы - м со-пептонный бульон , м со-пептонный агар. Стоимость 1 л среды дл  выращивани  В. prodlglosum составл ет 2 руб.

Дл  получени  продигиозона густой смыв культуры В. prodlgiosum штамм К обрабатывают многократно 0,5 М раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) при 4°С. Объединенные экстракты тщательно освобождают от взвешенных частиц на центрифуге при 10-12 тыс. об/мин и осаждают на холоду шестью объемами охлажденного этанола с добавлением насыщенного спиртового раствора уксуснокислого натри  из расчета 33 мл/л. После полного выпадени  осадок отдекл ют на центрифуге и подверо

СА

ю

гэют диализу в течение 3-сут в проточной водопроводной воде и 24 ч в дистиллированной воде, После диализа препарат подвергают лиофильной сушке. В нем обнаружены следующие моносахариды; глюкоза, галактоза , манноза. глкжозамин.

Продигиозан  вл етс  токсичным, максимально переносима  доза в опытах на белых мышах составл ла 0,125-5,0 мг/кг, ЛДбО равн лась 2-2,5 мг/кг, активность 16-64 ед. ,

Недостатками известного продуцента  вл ютс : выращивание продуцента осуществл етс  на дорогосто щих средах; низка  активность продигиозана; токсичность про- дигиозана.

Целью изобретени   вл етс  получение нового штамма - продуцента полисахарида, про вл ющего активность индуктора интерферона .

Новый штамм С. sepedonicum HMB 7694, обладающий указанными выше свойствами , выделен из больных клубней картофел . Дл  этой цели часть пораженной ткани на границе с внешне здоровой тканью вырезают стерильным скальпелем, промывают в течение 15-20 мин несколькими порци ми стерильной воды. Затем растительную ткань растирают в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды и образующуюс  гомогенную кашицу высевают петлей на поверхность агара на чашках Петри. Чашки помещают в термостат (температура 25 ± 3)°С. Питательными средами дл  выделени  бактерий обычно служат: картофельный агар; картофельный агар + 1 % дрожжевого автолизата: агар картофельный + 1% глюкозы; м со- пептонный агар.

Культуру хран т; а/в пробирках на кос ках с картофельным агаром при комнатной температуре, б/в пробирках на кос ках с картофельным агаром, поверхность которого заливают растительным маслом.

Состав среды картофельный агар: на 1 л дистиллированной воды 200 г картофел , 0,5% хлористого натри . 1,5-2,0% агара, рН 7,0-7.2.

Штамм С. sepedonicum ИМ8 7694 депонирован в коллекции культур Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков Минмедпрома и имеет регистрационный номер 1857.

Штамм С. sepedonicum ВНИИА 1857 имеет следующие морфологические и биохимические признаки.

Культурально-морфологические свойства - хорошо растет на обычных питательных средах.

На картофельном агаре - колонии Kpyi лые, гладкие, приподн тые, блест щие, ела бо слизистые, желто-оранжевые.

На м со-пептонном агаре - колонии

круглые, гладкие, более прозрачные, чем при росте на картофельном агаре, слабо слизистые, желтого цвета, со временем маслообразной консистенции.

При росте в м со-пептонном бульоне культура растет умеренно, образует нежную пленку и небольшой осадок.

Культура растет в аэробных услови х, оптимальн  температура роста (25 ± 3)°С, минимальна  3-4°С, максимальна  3031°С . рН: оптимальное 7,0 ± 0,2; растут в интервале рН от 6,7 до 7,4.

Физиолого-биохимические признаки. Культура не образует кислоту из глюкозы, мальтозы, мелецитозы, инулина, лактозы,

сахарозы, маннита, салицина, дульцитэ, сорбита. Не образует сероводород, индол, нитраты не редуцирует, молоко слабо пеп- тонизирует, не разжижает желатины.

Использует ацетат, сукцинат, не использует лактат и пропионат.

Факторы роста - биотин, никотинова  кислота, гистидин, пурин, пиримидин, мети- онин, аспарагин. Цистеин и другие аминокислоты могут ингибировать рост бактерий.

Штамм С. sepedonicum ИМВ 7694 при культивировании на жидкой синтетической среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, а азота - хлористый аммоний, синтезирует полисахарид, обладающий способностью иидуцировэт0 образование интерферона в клетках человека и животных.

Безвредность. Штамм С. sepedonicum ИМВ 7694 не вирулентен, не токсичен дл 

теплокровных животных. Введение 24-часовой культуры С. sepedonicum ИМВ 7694 внутрибрюшинно, подкожно и перорально в дозах 5 и 10 млрд микробных клеток на 1 мышь, а также фильтратов среды роста

(после культивировани  культуры на жидкой синтетической среде) не вызывало у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов

животных.

Штамм 7694 С. sepedonicum не патогенен дл  теплокровных животных.

Выращиавние бактериальной массы С. sepedonicum ИМВ 7694 и получение полисахарида осуществл ли следующим образом . Дл  получени  инокул та используют 24-часовую культуру, выращенную на картофельном при(25 ±3)°С. Выращивание продуцента осуществл ют в колбах обьеMOM 500 мл, содержащих 200 мл жидкой синтетической среды следующего состава, г/л: MgS04 0.2; ЫаэНРО 6,0; KH2PO i 3,0; NH-iCI 1,0; глюкоза 5,0.

Выращивание культуры продуцента осуществл ют при (25 ± 3)°С п течение 35-41 ч, целевой продукт выдел ют м гким щелочным гидролизом целых клеток.

Премер 1. Культуру С. sepedonlcum ИМВ 7694, хран щуюс  на кос ках с картофельным агаром, засевают на кос к с той же средой и выращивают в термостате при (25 ± 3)°С в течение 24 ч. Затем культуру смывают с кос ков жидкой питательной средой описанного выше состава и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержащие200 мл аналогичной питательной среды; выращивают на качалках (240 об/мин) в течение 31 ч. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20-25 мин, промывают физиологическим раствором и подвергают гидролизу в 5%-ном растворе КОН (100 мл на 10 г влажных клеток) в течение 1,5-2,0 ч. Гицролизат диализуют против водопроводной , а затем дистиллированной воды до нейтрального значени  рН, центриф угиру- ют дл  осаждени  неразрушенных клеток, а также загр зн ющих компонентов клеточной стенки при 5000 об/мин в течение 20-25 мин, Полисахарид осаждают из надосадоч- ной жидкости добавлением 5-ти объемов спирта. Осадок полисахарида освобождают от липидов последовательной обработкой ацетоном, эфиром, а затем смесью хлороформа с метанолом (2:1) и подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-ТСК геле. Полисахарид, целевой продукт, элюи- руют 0,50 М раствором , рН 6,0, Фракции полисахарида собирают, диализу- ют против водопроводной, а затем дистиллированной воды, лиофильно высушивают.

Гомогенность полисахарида показана гель-фильтрацией на сефарозе 6В (фиг.1), В целевом продукте содержитс  80 ±5% уг- леводоров.

Моносахаридный состав целевого продукта изучали методом газожидкостной хроматографии (фиг.2), а также 13С-ЯМР спектроскопии. Установлено, что полисахарид состоит из тетрасахаридных повтор ющих звеньев, представленных остатками рамнозы (двум ) и остатками галактозы (двум ), к С4 и С6 которой присоедин етс  пи- ровиноградна  кислота.

Молекул рна  масса полисахарида, установленна  методами гельхроматографии на сефарозе 6В, а также седиментации и диффузии, составл ет 60 000.

Выход очищенного полисахарида составл ет 4-5% сухой массы клегок.

Полученный полисахарид провер ют на интерферониндуцирующую активность.

Индукцию интерферона в опытах In

vitro проводили внесением в суспензию лейкоцитов периферической крови человека (5 106 клеток/мл)полисахарида в конечной концентрации 200 мкг) в пробе. Смесь

инкубируют при 37°С в течение 24 ч, затем центрифугируют, В опытах In vivo животным (мыши линии СВА с массой 18-20 г) внутри- брюшинно ввод т полисахарид в дозе 10 и 100 мкг/мышь в 0,5 мл. Через 4 и 24 ч после

введени  полисахарида мышь декапитиру- ют и собирают пул сывороток, получают спленоциты общеприн тым методом путем разволокнени  ткани селезенки. Ложный сывороточный интерферон получают, ввод  животным вместо полисахарида алланто- исную жидкость. В полученном материале (сыворотки, суспензии спленоцитов, культу- ральна  среда) определ ют активность интерферона по способности подавл ть

цитотоксическое действие вируса-индикатора (вирус везикул рного стоматита - ВВС), 100 тканевых цитопатогенных доз (ТЦД)мл. Учет результатов проводили через 48 ч. Зэ единицу активности принимают величины , обратные максимальному разведению интерферона, предотвращающему на 50% цитопатическое действие 100ТЦЦ ВВС в культуре перевиваемых человеческих лейкоцитов линии или культурами мышиных

фибробластов линии 1-929 соответственно

Тип интерферона определ ют по инги- бированию активности интерферона специфическими моноклинальными антителами к препаратам у-и а-типам человеческого

интерферона.

В опытах in vitro интерферониндуциру- юща  активность полисахарида составила 1920 ± 580ИЕ50/МЛ.

При изучении интерфероногенной актив;:ости в опытах in vivo было установлено, что внутрибрюшинное введение его в дозе 0,5-5,0 мг/мг спуст  4 ч вызывает образование интерферона в селезенках и сыворотках крови мышей, При этом оказалось, что введение полисахарида в дозе 0,5 мг/кг вызывало продукцию интерферона гораздо более эффективнее по сравнению с другими исследованными дозами.

При сравнительном изучении интерфероногенной активности известных препаратов продигиозана установлено, что предлагаемый полисахарид более эффективен (табл.).

Предлагаемый полисахарид не  вл етс  токсичным даже в дозе 40 мг/кг (ЛДбо продигиозана равна 2-3,5 мг/кг). не обладает побочными эффектами, Продигиозан вызывает повышение температуры тела примерно у 30% больных через 2-4 ч после инъекции до субфебриальных цифр.

Таким образом, предлагаемый нами штамм 7694 С. sepedonlcum  вл етс  новым штаммом, продуцирующим полисахарид ,  вл ющийс  активным индуктором у-интерферона.

Выращивание культуры продуцента более , чем в 10 раз дешевле выращивани  В. prodiglosum.

Полисахарид в отличие от продипшзака  вл етс  токсичным и не обладает побочными действи ми.

Изобретение может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности, при этом не требуетс  дополнительных ассигнований дл  осуще- ствлени  технологических процессов выращивани  продуцента и выделени  из него полисахарида.

Интерфероногенна  активность полисахарида Corynebacterium sepedonlcum ЛМВ 7694 и продигиозана Bacterium prodlgoosum приведена в таблице.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм бактерий Coryaebacterium sepedonicum ВНИИА 1857 - продуцент полисахарида , индуцирующего образование

   интерферона.

   Аьдо

   iy

   1,110ф

   0,8

   Ofi

   0,1

   I li I

   / г j Ј s § 7