EA003902B1 - Индукторы апоптоза, содержащие их противораковые и канцеростатические средства, способ индуцирования апоптоза, полисахариды и способы их получения - Google Patents

Abstract

Индукторы апоптоза, противораковые лекарственные средства и канцеростатические лекарственные средства, содержащие сульфированный(ые) фукозусодержащий(ие) полисахарид(ы) и/или продукты его(их) расщепления, и способ индуцирования апоптоза путем использования сульфированного(ых) фукозусодержащего(их) полисахарида(ов) и/или продукта(ов) его(их) расщепления в качестве активного ингредиента.

Description

Это изобретение относится к индукторам апоптоза, противораковым лекарственным средствам и канцеростатическим лекарственным средствам, которые могут быть использованы как лекарственные препараты. Кроме того, обеспечивается способ индуцирования апоптоза, который используют, например, для выяснений механизма апоптоза и скрининга ингибиторов индукции апоптоза. Также обеспечиваются очищенные сульфированные фукозусодержащие полисахариды и продукты их расщепления и фермент, расщепляющий сульфированный фукозусодержащий полисахарид, который используют для получения продуктов расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида, и изучения их структур.

Предшествующий уровень техники

В последние годы апоптоз (самодеструктивная гибель клетки или суицидальная гибель клетки) привлекает внимание, в связи с рассмотрением гибели клеточной ткани.

Считается, что апоптоз представляет гибель, врожденно программируемую в генах, отличную от некроза, означающего патологическую смерть клетки. А именно, некоторые внешние или внутренние факторы приводят в действие активацию генов, программирующих апоптоз. На основе этих генов, впоследствии генный белок программированной гибели биосинтезируется и разлагается клетками рег 8е, тем самым вызывая гибель.

Целенаправленный апоптоз в требуемой ткани или клетках имеет большое значение, поскольку тем самым могут быть спонтанно удалены ненужные или патогенные клетки из живого тела.

Проблемы, подлежащие решению с помощью изобретения

Данное изобретение ставит своей целью разработку высокобезопасных соединений, обладающих действием индуцировать апоптоз и тем самым предоставлять индукторы апоптоза, противораковые лекарственные средства и канцеростатические лекарственные средства, содержащие эти соединения, и способ индуцирования апоптоза путем использования этих соединений в качестве активного ингредиента. Кроме того, данное изобретение имеет своей целью разработку фермента, способного расщеплять соединения данного изобретения, который полезен при получении продуктов расщепления этих соединений.

Способ решения этих проблем

В общем, первый аспект данного изобретения относится к индукторам апоптоза, которые содержат сульфированный фукозусодержащий полисахарид(ы) и/или продукт(ы) его(их) расщепления.

Второй аспект данного изобретения относится к способу индуцирования апоптоза, который включает использование в качестве актив ного ингредиента сульфированного фукозусодержащего полисахарида(ов) и/или продукта(ов) его(их) расщепления.

Третий аспект данного изобретения относится к противораковым лекарственным средствам, содержащим индуктор апоптоза первого аспекта данного изобретения.

Четвертый аспект данного изобретения относится к канцеростатическим лекарственным препаратам, содержащим индуктор апоптоза первого аспекта данного изобретения.

Пятый аспект данного изобретения относится к сульфированным фукозусодержащим полисахаридам, имеющим следующие физикохимические свойства:

(a) составляющий их сахарид содержит уроновую кислоту, и (b) будучи расщепленным фукоиданазой, продуцируемой Р1ауоЬас!епит ер. 8 А-0082 (РЕКМ ВР-5402), образует, по крайней мере, одно из соединений, выбранных из соединений, представленных нижеследующими формулами (I), (II) и (III):

ОН

Шестой аспект данного изобретения относится к сульфированным фукозусодержащим полисахаридам, имеющим следующие физикохимические свойства:

(а) составляющий их сахарид, в основном, свободен от уроновой кислоты; и (б) они, в основном, не способны расщепляться фукоиданазой, продуцируемой Р1ауоЬас1егшт зр. §А-0082 (РЕЕМ ВР-5402);

(в) способен расщепляться ферментом, продуцируемым ЛИеготоиаз зр. §N-1009 (РЕЕМ ВР-5747), осуществляющим эндорасщепление сульфированного фукозусодержащего полисахарида;

(г) образует осадок с избытком хлорида цетилпиридиния при концентрации соли около

1,5 М.

Седьмой аспект данного изобретения относится к способу получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов пятого аспекта данного изобретения, который включает стадию обработки смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящих из морских водорослей или голотурии, химическим соединением, способным агрегировать кислые полисахариды в присутствии солей, и удаление осадка.

Восьмой аспект данного изобретения относится к способу получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов пятого аспекта данного изобретения, который включает стадию обработки сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящих из морских водорослей или голотурии, анионообменной смолой в присутствии двухвалентного катиона, получая тем самым целевые полисахариды.

Девятый аспект данного изобретения относится к способу получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов пятого аспекта данного изобретения, который включает стадию удаления из них сопутствующих красящих веществ, используя полисахарид или вещество, имеющее анионообменную группу.

Десятый аспект данного изобретения относится к способу получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов шестого аспекта данного изобретения, который включает стадию обработки сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящих из морских водорослей или голотурии, расщепляющим ферментом, способным расщеплять сульфированные фукозусодержащие полисахариды, содержащие уроновую кислоту, или микроорганизмом, содержащим этот фермент, и тем самым получая сульфированные фукозусодержащие целевые полисахариды.

Одиннадцатый аспект данного изобретения относится к способу получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов шестого аспекта данного изобретения, который включает стадию обработки сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящих из морских водорослей или голотурии, химическим соединением, способным вызвать агрегирование кислых полисахаридов в присутствии солей, тем самым осаждая целевые полисахариды.

Двенадцатый аспект данного изобретения относится к способу получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов шестого аспекта данного изобретения, который включает стадию обработки сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящих из морских водорослей или голотурии, анионообменной смолой в присутствии двухвалентного катиона, получая тем самым целевые полисахариды.

Тринадцатый аспект данного изобретения относится к способу получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов шестого аспекта данного изобретения, который включает стадию удаления сопутствующих красящих веществ, используя полисахарид или вещество, имеющее анионообменную группу.

Четырнадцатый аспект данного изобретения относится к способу получения смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, который включает экстракцию смесей сульфированных фукозусодержащих полисахаридов из морских водорослей при совместном присутствии ацетатного и кальциевого ионов.

Изобретателями успешно получены различные очищенные сульфированные фукозусодержащие полисахариды и продукты их расщепления и затем исследованы биологические активности этих веществ. В результате этого было обнаружено, что эти вещества индуцируют апоптоз злокачественных клеток и оказывают сильное противораковое действие. Кроме того, было установлено, что сульфированные фукозусодержащие полисахариды и/или продукты их расщепления имеют сильное канцеростатическое действие. Кроме того, с их помощью удается выделить фермент, способный расщеплять сульфированные фукозусодержащие полисахариды, и этот фермент является полезным при получении продуктов расщепления по данному изобретению.

Краткое описание рисунков

На фиг. 1 представлены степени осаждения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов;

на фиг. 2 представлено молекулярномассовое распределение сульфированного фукозусодержащего полисахарида-ϋ, определенное способом гель-фильтрации с использованием §ерйасгу1 §-500;

на фиг. 3 представлен ИК-спектр сульфированного фукозусодержащего полисахарида-ϋ;

на фиг. 4 представлен ¹Н ЯМР спектр сульфированного фукозусодержащего полисахарида-И;

на фиг. 5 представлена картина элюирования сахаридного соединения (а), являющегося пиридил-(2)-аминированным (РА-а), которое элюировано из Ь-колонки;

на фиг. 6 представлена картина элюирования сахаридного соединения (Ь), являющегося пиридил-(2)-аминированным (РА-Ь), которое элюировано из Ь-колонки;

на фиг. 7 представлена картина элюирования сахаридного соединения (с), являющегося пиридил-(2)-аминированным (РА-с), которое элюировано из Ь-колонки;

на фиг. 8 представлен масс-спектр (отрицательное измерение) сахаридного соединения (a);

на фиг. 9 представлен масс-спектр (отрицательное измерение) сахаридного соединения (b);

на фиг. 10 представлен масс-спектр (отрицательное измерение) сахаридного соединения (c);

на фиг. 11 представлен масс-спектр (отрицательное измерение) сахаридного соединения (a);

на фиг. 12 представлен масс-спектр (отрицательное измерение) сахаридного соединения (b);

на фиг. 13 представлен масс-спектр (отрицательное измерение) сахаридного соединения ^{(c) ;} на фиг. 14 представлен ¹Н ЯМР-спектр сахаридного соединения (а);

на фиг. 15 представлен ¹Н ЯМР-спектр сахаридного соединения (Ь);

на фиг. 16 представлен 'Н ЯМР-спектр сахаридного соединения (с);

на фиг. 17 представлено молекулярномассовое распределение сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, определенное способом гель-фильтрации с использованием 8ерйасту1 8-500;

на фиг. 18 представлен ИК-спектр сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р.

на фиг. 19 представлен ¹Н ЯМР спектр сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р;

на фиг. 20 представлен график, который показывает зависимость относительной активности фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученного с помощью данного изобретения, от значения рН;

на фиг. 21 представлен график, который показывает зависимость относительной активности фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученного с помощью данного изобретения, от температуры;

на фиг. 22 представлено молекулярномассовые распределения сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, определенные способом гель-фильтрации с использованием Се11и1о1ше ССЬ-300, до и после деградации ферментом, расщепляющим эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученным с помощью данного изобретения;

на фиг. 23 представлен график, который показывает зависимость относительной актив ности фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученного с помощью данного изобретения, от концентрации иона кальция в реакционной смеси;

на фиг. 24 представлены молекулярномассовые распределения сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, который деградирован ферментом, расщепляющим эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный с помощью данного изобретения методом гель-фильтрации, определенного способом гель-фильтрации с использованием Се11и1о1ше ССЬ-300, в примере 19-(6);

на фиг. 25 представлен ИК-спектр сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, который деградирован ферментом, расщепляющим эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученным с помощью данного изобретения;

на фиг. 26 представлен ¹Н ЯМР-спектр сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, который деградирован ферментом, расщепляющим эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученным с помощью данного изобретения;

на фиг. 27 представлены зависимости между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде НЬ-60 клеток, к которой были добавлены сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1, 15 и 18 в таком количестве, чтобы получить концентрацию 1 мг/мл;

на фиг. 28 представлены зависимости между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде МОЬТ-3 клеток, к которой были добавлены сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примере 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, полученный в примере 12 и сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 15 и 17, и сульфат декстрана;

на фиг. 29 представлены зависимости между временем инкубации и количеством жизнеспособных в культуральной среде НСТ 116 клеток, к которой были добавлены препарат, содержащий сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 1, смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученная в примере 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-И и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, Р-Рб-1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, полученные в примере 12, сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примере 15, и гепарин декстран сульфат;

на фиг. 30 представлены зависимости между временем инкубации и количеством жизнеспособных в культуральной среде НСТ 116 клеток, к которой добавлен препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полу ченный в примере 1 при различных концентрациях;

на фиг. 31 представлены зависимости между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде ЛС8 клеток, к которой добавлен препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1 при различных концентрациях;

на фиг. 32 представлены зависимости между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде 8А 480 клеток, к которой добавлен препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1 при различных концентрациях;

на фиг. 33 представлены зависимости между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде ΑίΌτ клеток, к которой добавлены препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е, Е-Еб-3 и Е-Еб4, полученные в примере 12 и сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примере 15;

на фиг. 34 представлены зависимости между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде ΑίΌτ клеток, к которой добавлен препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1 при различных концентрациях.

Способ осуществления изобретения

Далее, данное изобретение будет описано более подробно.

Сульфированные фукозусодержащие полисахариды, подлежащие использованию в данном изобретении, особенно не ограничиваются. Например, могут быть использованы полисахариды, имеющие происхождение из Еисик ус51си1о5и5. К]е11тап1е11а стакыСоНа, Ьатшапа )ароп!са. ипбапа ршпаЬПба и других бурых водорослей (Р11аеор11у1а). Известно, что голотурис (морской огурец) содержит сульфированные фукозусодержащие полисахариды в своей соматической стенке. Возможно также в данном изобретении использовать сульфированные фукозусодержащие полисахариды, происходящие из морского огурца. Кроме того, в данном изобретении могут быть использованы продукты расщепления сульфированных фукозусодержащих полисахаридов. Сульфированные фукозусодержащие полисахариды можно расщеплять например, при помощи химических способов расщепления, таких как обработка кислотой, физических способов расщепления, таких как ультразвуковая обработка, или при помощи способов ферментативного расщепления.

Настоящими изобретателями было установлено, что когда сульфированные фукозусодержащие полисахариды и/или продукты их расщепления, описанные выше, добавляют к культуральной среде злокачественных клеток, злокачественные клетки претерпевают апоптоз в пределах от одного до нескольких дней после добавления. Они также подтвердили, что сульфированные фукозусодержащие полисахариды и/или продукты их расщепления не демонстрируют токсичность по отношению к нормальным клеткам.

Используемый здесь термин «сульфированный фукозусодержащий полисахарид» означает полисахарид, имеющий сульфированную фукозу в своей молекуле, без особого ограничения. Примеры его включают полисахариды, содержащиеся в бурых водорослях и морском огурце [«Та!отш Кадаки», кирегущеб Ьу Токиго 8оба, ебйеб Ьу Еиро Едать Куотйки 8Ьиррап К.К., ОекетЬет 15, 1955, р.319, р.321]. Сульфированные фукозусодержащие полисахариды, происходящие из бурых водорослей, обычно называют фукоиданом, фукоидином и фуканом. Хотя известно, что существует несколько молекулярных видов их, эти сульфированные фукозусодержащие полисахариды часто называют фукоиданом в целом. Например, сообщается, что фукоидан, производимый 81дта СЬетюа1 Со., подразделяется на 13 молекулярных видов [СатЬоЬубта!е ВекеатсЬ, 255, 213-224 (1994)], включая группу, содержащую фукозу как основной компонент, и другую группу, содержащую несколько % уроновой кислоты и имеющую высокое содержание фукозы и маннозы в качестве составляющих сахаридов. Сообщается, что эти сульфированные фукозусодержащие полисахариды имеют различные биологические активности, например, потенцирующую макрофаговую активность, ингибирующую канцерогенный метастаз и ингибирующую коагуляцию крови. Однако сульфированные фукозусодержащие полисахариды включают различные молекулярные виды и, поэтому, необходимо разделить и очистить сульфированные фукозусодержащие полисахариды для того, чтобы выяснить, какая молекулярная разновидность действительно имеет определенную активность. Сульфированные фукозусодержащие полисахариды включают полисахариды, которые, в основном, свободны от уроновой кислоты и содержат фукозу в качестве основного компонента составляющих сахаридов, и полисахариды, которые содержат несколько % уроновой кислоты и имеют высокое содержание фукозы и маннозы в качестве составляющих сахаридов. В дальнейшем, сульфированные фукозусодержащие полисахариды, в основном, свободные от уроновой кислоты, будут называть сульфированным фукозусодержащим полисахаридом-Е, полисахариды, содержащие уроновую кислоту, будут называться сульфированным фукозусодержащим полисахаридом-и и смесь этих сульфированных фукозусодержащих полисахаридов называют смесью сульфированных фукозусодержащих полисахаридов.

Хотя способы для разделения сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р и сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и известны, такие как фракционирование и разделение по молекулярной массе с использованием анионообменной смолы известны, при их использовании может быть достигнуто только недостаточное разделение, что затрудняет получение сульфированных фукозусодержащих полисахаридов в большом масштабе в качестве лекарственных средств или функциональной пищи (питания).

Известно также, что окрашивающие вещества трудно полностью удалить из сульфированных фукозусодержащих полисахаридов. Коммерчески доступные продукты фукоидана, и т.п. также загрязнены окрашивающими веществами. Обычно, эти окрашивающие вещества, которые состоят из полифенольных полимеров, являются высоко реакционноспособными и ингибируют различные ферментативные реакции или рост клеток. Кроме того, эти окрашивающие вещества иногда необратимо адсорбируются на полимерах (смолах) или контейнерах, сделанных из полимеров, будучи в контакте с ними. Таким образом, требуется устранить эти высоко реакционноспособные окрашивающие вещества из сульфированных фукозусодержащих полисахаридов для того, чтобы тщательно изучить биологические активности сульфированных фукозусодержащих полисахаридов и предотвратить контейнеры или полимеры от загрязнения.

Известно, что когда смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов экстрагируют из, например, бурых водорослей или их остатка промывки спиртом, загрязнение экстракта альгиновой кислотой можно ингибировать добавлением растворимого ацетата бария, хлорида бария, хлорида кальция или т. п., что облегчает последующую очистку. Однако добавление растворимой соли бария делает обработку отработанного раствора затруднительной. С другой стороны, хлорид кальция вызывает изменение значения рН при смешении с морскими водорослями, что делает необходимым регулирование рН для того, чтобы получить недеградируемые сульфированные фукозусодержащие полисахариды. На стадии регулирования значения рН, иногда наблюдают, что морские водоросли становятся вязкими и агрегируют. В таком случае, эффективность последующей экстракции понижается или разделение твердое вещество/жидкость, в частности, фильтрация, затрудняется.

Хотя полезность сульфированных фукозусодержащих полисахаридов в данной области была ожидаемой, не имеется как товарного продукта сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р или сульфированного фукозу содержащего полисахарида-И с достаточным фракционированием по молекулярному виду, так и сообщения по способу эффективного получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов. Кроме того, товарные сульфированные фукозусодержащие полисахариды содержат высоко реакционноспособные окрашивающие вещества, описанные выше.

Хотя сульфированные фукозусодержащие полисахариды имеют различные активности, до сих пор не получено ни существенно очищенного сульфированного фукозусодержащего полисахарид-Р, ни сульфированного фукозусодержащего полисахарида-И из-за трудности в их фракционном получении, как описано выше.

Однако данное изобретение обеспечивает, в основном, очищенный сульфированный фукозусодержащий полисахарид-И, подходящий способ экстракции его же и способ получения сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и. Данное изобретение, кроме того, обеспечивает сульфированный фукозусодержащий полисахарид-И, из которого удалены высоко реакционноспособные окрашивающие вещества, трудно удаляемые из сульфированных фукозусодержащих полисахаридов в обычных, инигибирующих ферментативных реакциях, и загрязняющие полимеры, и т. д.

Данное изобретение, кроме того, обеспечивает, в основном, очищенный сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, подходящий метод экстракции его и способ получения сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, из которого удалены высоко реакционноспособные окрашивающие вещества, трудно удаляемые из сульфированных фукозусодержащих полисахаридов в обычных, ингибирующих ферментативных реакциях, и загрязняющие полимеры, и т.д.

В качестве сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, подлежащих использованию в данном изобретении, могут быть использованы вещества, содержащие сульфированный фукозусодержащий полисахарид, такие как бурые водоросли и морской огурец, которые, например, сушат, как таковые, и измельчают. Альтернативно, может быть использован экстракт, содержащий сульфированный фукозусодержащий полисахарид, получаемый из вещества, содержащего сульфированный фукозусодержащий полисахарид, либо как такового, либо в очищенном состоянии. Экстракт, содержащий сульфированный фукозусодержащий полисахарид, можно получить и очистить любым широко известным методом без ограничения.

Продукты расщепления сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, подлежащие использованию в данном изобретении, представляют продукты, полученные путем расщепления сульфированных фукозусодержащих полисахаридов при помощи ферментативных, химических или физических способов, и могут быть использованы широко известные ферментативные, химические или физические способы.

Сульфированные фукозусодержащие полисахариды и продукты расщепления сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, подлежащие использованию в данном изобретении, включают фармацевтически приемлемые их соли.

Примеры бурых водорослей, содержащих сульфированные фукозусодержащие полисахариды, из которых можно получить сульфированный фукозусодержащий полисахарид, включают бурые водоросли, описанные в «Со1огей 111и81гайои8 оГ Мапие А1дае оГ Праи» [Гоге^огй: 8асЫо Уашайа. \спиеп Ьу 8окюЫ 8еда\уа. Но1кикйа РиЫкЫид Со., Ь1й., 22-52 (1977)], такие как Рисик уеккШокик, К)е11таше11а сгаккгГойа, Ьатшапа )арошса и Иийапа р1ииайййа.

В качестве морского огурца, содержащего сульфированные фукозусодержащие полисахариды, из которого можно получить сульфированные фукозусодержащие полисахариды, можно использовать, например, те, которые описаны в выложенной Японской патентной заявке № 91027/1992, такие как Зйсйорик )арошси8 и Но1о1йипа Ьеисо8рйо1а.

Сульфированный фукозусодержащий полисахарид несет в своей молекуле сульфатные группы, которые взаимодействуют с различными основаниями, образуя при этом соли. Эти сульфированные фукозусодержащие полисахариды и продукты их расщепления становятся стабильными при превращении их в соли. Их обычно выделяют в форме натриевых и/или калиевых солей или т.п. Соли этих веществ могут быть превращены в свободные сульфированные фукозусодержащие полисахариды и свободные продукты их расщепления путем обработки катионо-обменной смолой, такой как Эо\\'ех 50\ν. Кроме того, эти соли могут быть подвергнуты реакциям солевого обмена обычным способом, превращая их при этом в различные требуемые соли, при необходимости. В качестве солей сульфированных фукозусодержащих полисахаридов и продуктов их расщепления, можно использовать фармацевтически приемлемые соли, например, соли щелочных металлов, таких как калий и натрий, соли щелочно-земельных металлов, таких как кальций, магний и барий, соли органических оснований, такие как соли пиридиния, и аммония.

Порошок, содержащий сульфированные фукозусодержащие полисахариды, можно получить путем сушки бурых водорослей, морского огурца и т.п., содержащих сульфированные фукозусодержащие полисахариды, и последующего измельчения.

Экстракт, содержащий сульфированные фукозусодержащие полисахариды, можно получить путем экстракции порошка, содержащего сульфированные фукозусодержащие полисахариды, горячей водой или разбавленной кислотой.

Чтобы экстрагировать вещества, содержащие сульфированные фукозусодержащие полисахариды, температуру и время экстракции целесообразно выбирать в зависимости от цели (назначения), соответственно в диапазонах от 0 до 200°С и от 1 до 360 мин. Температуру и время экстракции обычно выбирают в диапазоне от 10 до 150°С, предпочтительно от 50 до 130°С, и в диапазоне от 5 до 240 мин, предпочтительно от 10 до 180 мин, соответственно.

В качестве способа очистки экстракта с тем, чтобы повысить содержание сульфированного фукозусодержащего полисахарида, можно использовать, например, фракционирование сульфированных фукозусодержащих полисахаридов с использованием хлорида кальция, ацетата бария, и т.д.; фракционирование сульфированных фукозусодержащих полисахаридов с использованием кислого полисахаридного агглютинирующего (склеивающего) средства, такого как цетилпиридиний хлорид; фракционирование сульфированных фукозусодержащих полисахаридов с использованием кислого полисахаридного агглютинирующего (склеивающего) средства в присутствии солей; гельфильтрацию; и ионообменную хроматографию. При необходимости, очистку можно выполнить, комбинируя эти техники.

Сульфированные фукозусодержащие полисахариды можно подвергнуть расщеплению способами, широко известными для расщепления сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, например, используя фермент, расщепляющий сульфированный фукозусодержащий полисахарид, расщепление кислотой, и обработку ультразвуком. Продукты расщепления можно очистить в соответствии со способами, описанными выше.

Бурые водоросли обычно содержат ряд сульфированных фукозусодержащих полисахаридов. Бурые водоросли, подлежащие использованию в данном изобретении, особенно не ограничиваются. Например, можно использовать бурые водоросли, такие как Рисик уекюШокик, К)е11тап1е11а сгаккгГойа, Ьатшапа )арошса и иийапа ршиайййа и другие бурые водоросли.

Чтобы получить сульфированные фукозусодержащие полисахариды, бурые водоросли сначала экстрагируют водным растворителем.

Морские водоросли, подлежащие экстрагированию, могут быть свежими водорослями. Однако, целесообразно, чтобы до получения экстракта, бурые водоросли были высушены, превращены в порошок, промыты 60-100% спиртом или ацетоном или вымочены в водном растворе, содержащем формальдегид, ацеталь13 дегид, глутаральдегид, аммиак или т.п., поскольку тем самым можно значительно снизить загрязнение сульфированных фукозусодержащих полисахаридов окрашивающими веществами.

Когда сульфированные фукозусодержащие полисахариды экстрагируют из, например, бурых водорослей или их остатка промывки спиртом, загрязнение экстракта альгиновой кислотой можно ингибировать добавлением растворимого ацетата бария, хлорида бария, хлорида кальция или т.п., что облегчает последующую очистку. По причине, описанной выше, предпочтительно экстрагировать сульфированные фукозсодержащие полисахариды 1мМ-1М раствором ацетата кальция при температуре от 50 до 130°С.

Когда водоросли толстые и порошок состоит из больших частиц, иногда наблюдают, что изначально используя раствор ацетата натрия при концентрации 0,2М и выше, можно достичь лишь низкой эффективности экстракции. В таком случае, рекомендуется, чтобы сульфированные фукозусодержащие полисахариды сначала экстрагировали водой и затем к экстрагированному добавляют ацетат кальция с последующим удалением осажденной таким образом альгиновой кислоты.

Когда сульфированные фукозусодержащие полисахариды должны экстрагироваться вместе с альгиновой кислотой или когда следует получить частично деградированные продукты на стадии экстракции, то растворитель и условия для экстракции особенно не ограничиваются. В таком случае, можно использовать воду, водные растворы нейтральных солей, таких как хлорид натрия и хлорид магния, при различных концентрациях, кислые водные растворы, например, лимонной кислоты, фосфорной или хлористоводородной кислоты, при различных концентрациях, и щелочные водные растворы, например, гидроксида натрия и гидроксида калия, при различных концентрациях. Кроме того, туда могут быть добавлены буферы и консерванты. Также, значение рН экстракта, температура экстракции и время экстракции особенно не ограничены. Однако сульфированные фукозусодержащие полисахариды обычно малоустойчивы к кислотам и щелочам. Таким образом, имеется тенденция к легко протекаемому расщеплению, когда используют кислый или щелочной раствор. Произвольные продукты расщепления можно получить, контролируя температуру нагревания, время нагревания, значение рН, и т.д. Например, среднюю молекулярную массу, молекулярномассовое распределение и т.п. продуктов расщепления можно контролировать, осуществляя гель-фильтрацию, обработку мембраной для фракционирования по молекулярным массам, и т.д.

Другими словами, молекулярные массы и сахаридные композиции сульфированного фукозусодержащего полисахарида-И и сульфиро ванного фукозусодержащего полисахарида-Р данного изобретения варьируются в зависимости от времени сбора сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, используемого способа сушки, используемого способа хранения веществ и условий экстракции сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, таких как условия нагревания и значение рН. Например, сульфированные фукозусодержащие полисахариды гидролизуются кислотами. В щелочных условиях, с другой стороны, расщепление сульфированных фукозусодержащих полисахаридов протекает в результате β-элиминирования уроновой кислоты. Таким образом, молекулярные массы и молекулярно-массовые распределения сульфированного фукозусодержащего полисахарида-И и сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, описанных здесь, являются, каждый, одним лишь примером их. Молекулярная масса и молекулярномассовое распределение можно легко варьировать, контролируя условия обработки сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, Например, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р с приблизительно от 1000 до 10000 молекулярно-массовым распределением можно получить путем нагревания исходного вещества при 100°С в течение 1 ч в слабо щелочных условиях и используя на стадии обессоливания молекулярно-ситовую мембрану с размером пор 300. Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения с произвольной молекулярной массой и молекулярно-массовым распределением можно получить, подбирая надлежащим образом условия обработки.

Альгиновая кислота и нейтральные сахариды могут быть удалены из вышеупомянутого экстракта бурых водорослей, например, путем добавления кислого полисахаридного агглютинирующего (склеивающего) средства, такого как цетилпиридиний хлорид, в присутствии солей, таких как хлорид натрия, при концентрации от 0,2 до 0,6М до тех пор, пока больше не образуется осадок, и затем собирая осадок.

Если требуется, осадок промывают раствором солей, таким как 0,2-0,6М хлорид натрия, и цетилпиридиний хлорид, содержавшийся в осадке, отмывают насыщенным спиртовым раствором хлорида натрия, получая тем самым смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов. Чтобы устранить окрашивающие вещества из полученной таким образом смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, осадок можно растворить и затем обработать анионообменной смолой или полисахаридной смолой или подвергнуть ультрафильтрации. В том случае, когда осадок обессоливают и сушат вымораживанием, можно получить сухой препарат.

Настоящими изобретателями было установлено, что сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и данного изобретения демонстрируют совершенно различное поведение по отношению к кислому полисахаридному агглютинирующему средству в присутствии одной или нескольких солей при концентрации 0,6-3М.

Например, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и данного изобретения может быть выделен из водного раствора смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, используя способ данного изобретения.

Сначала, одну или несколько солей добавляют к водному раствору смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов таким образом, чтобы получить общую концентрацию соли 0,6-2М. В качестве солей, подлежащих добавлению, можно использовать, например, хлорид натрия и хлорид кальция, без ограничения.

Обычно, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения может быть отделен от сульфированного фукозусодержащего полисахарида-ϋ данного изобретения при концентрации соли приблизительно 1,5М (см. фиг. 1, которая будет представлена здесь ниже). Например, концентрацию вышеупомянутой соли(ей) доводят до 1,5М и затем добавляют кислое полисахаридное агглютинирующее средство, такое как цетилпиридиний хлорид, до тех пор, пока больше не образуется осадок. Таким образом, осаждают сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р. Путем удаления осадка, можно получить раствор сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и данного изобретения. Этот раствор концентрируют, при необходимости, и затем сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и, содержавшийся в нем, осаждают, добавляя, например, туда в 4 раза больше этанола. Затем, цетилпиридиний хлорид в осадке отмывают насыщенным спиртовым раствором хлорида натрия, получая тем самым сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и данного изобретения. Полученный таким образом сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и может быть растворен и затем подвергнут ультрафильтрации, чтобы тем самым удалить из него окрашивающие вещества. Путем обессоливания и сушки вымораживанием сульфированного фукозусодержащего полисахарида-ϋ, можно получить сухой препарат. Можно также добавлять консерванты и т.п. во время этого способа.

Когда требуется эффективно получить только сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения, концентрация соли на стадии агглютинации, например, цетилпиридиний хлоридом, регулируют не до 0,2-0,6М, а до, например, 2М. Таким образом, полученный осадок содержит исключительно сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения.

Изобретателями было установлено, что когда сульфированные фукозусодержащие полисахариды очищают, используя анионообменную смолу в присутствии двухвалентного катиона, количество сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, адсорбированных на единицу поверхности смолы, можно увеличить и тем самым можно более эффективно разделить сульфированные фукозусодержащие полисахариды. Чтобы получить сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и данного изобретения, используя способ данного изобретения, к смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов добавляют химическое вещество, служащее в качестве источника двухвалентного катиона, при концентрации 1 мМ или более. Затем, анионообменную смолу уравновешивают раствором, содержащим двухвалентный катион предпочтительно при концентрации 1 мМ или более и при этом вышеупомянутая смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов адсорбируется. После тщательного промывания анионообменной смолы раствором, используемым для уравновешивания сульфированные фукозусодержащие полисахариды проявляют при помощи элюирования с линейным градиентом, например хлоридом натрия. В практике этого способа, можно добавлять двухвалентный катион так, чтобы получить концентрацию 1 мМ или более. В том случае когда сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и данного изобретения должен адсорбироваться колонкой, концентрацию предпочтительно устанавливают менее чем 0,5М. В качестве химического вещества, служащего как источник двухвалентного катиона, подлежащего использованию в этом способе, соли кальция и соли бария проявляют особенно превосходное действие. Однако данное изобретение не ограничивается ими, и могут использоваться сульфат магния, хлорид марганца, и т.д.

Когда получают смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов из бурых водорослей обычным способом, полученная смесь загрязнена высоко реакционноспособными окрашивающими веществами, которые загрязняют смолы и полимерные контейнеры, которые находятся в контакте с ними, или ингибируют ферментативные реакции или рост клеток, как описано выше. Обнаружено, что эти окрашивающие вещества можно легко удалить посредством связывания или адсорбции полисахаридным веществом или веществом, несущим анионообменную группу. Другими словами, эти высоко реакционноспособные окрашивающие вещества можно легко устранить путем добавления к раствору, содержащему сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полисахаридных полимеров, таких как ССЬ-2000 (производимого 8е1кадаки Кодуо), 8ерйасту1 8-500,

8ерйабех 6-200 и 8ерйато5е СБ-2В (каждый производимый Рйаттааа) или веществ, несущих анионообменную группу, такие как ΌΕΆΕСе11и1ойпе А-800 (производимого 8е1кадаки Кодуо), ОЕАЕ-8ер11аго5е РР, ОЕАЕ-8ерйабех А-50, 0АЕ-8ерНабех А-50, ЭЕАЕ-8ер11асе1 (каждый произв. Рйаттааа), Т8К-6е1 ЭЕАЕ-ТоуореаН 650, Т8К-6е1 ЭЕАЕ-ТоуореаН 550 (каждый произв. Тохой Сотротайои), АтЬетШе анионообменная смола (произв. Отдало) и сййореаб анионообменная смола (произв. Рнр 8ршшид Со., Ыб.), перемешивания и затем удаления, или пропускания раствора, содержащего сульфированные фукозусодержащие полисахариды, через колонку, наполненную этими веществами. Однако анионообменная смола также связывается с сульфированными фукозусодержащими полисахаридами. Таким образом, предпочтительно контролировать концентрацию соли до приблизительно 2М на стадии адсорбции окрашивающих веществ.

Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и данного изобретения может быть получен, например, способом, описанным в примере 6. Ниже будут проиллюстрированы физико-химические свойства этого сульфированного фукозусодержащего полисахарида-ϋ, хотя для этой цели сульфированным фукозусодержащим полисахаридом-и данного изобретения не ограничиваются.

На фиг. 1 представлена степень осаждения сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и данного изобретения и сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р данного изобретения, полученных в примере 8, при различных концентрациях хлорида натрия в присутствии избытка цетилпиридиний хлорида.

На фиг. 1 ордината относится к степени осаждения (%), а абсцисса относится к концентрации (М) хлорида натрия. Сплошная линия и незаполненный круг обозначают степень осаждения сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и данного изобретения при различных концентрациях хлорида натрия, в то время как пунктирная линия и незаполненный треугольник обозначают степень осаждения сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р данного изобретения при различных концентрациях хлорида натрия (М).

Степени осаждения определяют при температуре раствора 37°С следующим образом.

Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения, каждый, растворяют в воде и 4М хлорида натрия при концентрации 2%. Затем эти растворы смешивают при различных соотношениях, тем самым, получая 125-мкл порции сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и и сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р растворов, имеющие различные концентрации хлорида натрия. Затем цетилпириди ний хлорид растворяют в воде и 4М хлорида натрия при концентрации 2,5% и полученные растворы смешивают при различных соотношениях, получая 1,25% растворы цетилпиридиний хлорида с различными концентрациями хлорида натрия.

Требуется в 3,2 раза больше, по объему, 1,25% раствора цетилпиридиний хлорида для полного осаждения сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и и сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, каждого, растворенного в воде при концентрации 2%. К 125-мкл порциям 2% растворов сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и и сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р с различными концентрациями хлорида натрия добавляют 400-мкл порции растворов цетилпиридиний хлорида с различными концентрациями хлорида натрия. После тщательного перемешивания и выдерживания при стоянии в течение 30 мин каждую смесь центрифугируют и определяют содержание сахарида в супернатанте по фенолсернокислотному методу [Апа1у11са1 СйетШту, 28, 350 (1956)], а затем рассчитывают степень осаждения каждого сульфированного фукозусодержащего полисахарида при каждой концентрации хлорида натрия.

Молекулярную массу полученного таким образом сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и данного изобретения измеряют методом гель-фильтрации с использованием 8ерйасгу1 8-500. В результате, получают молекулярно-массовое распределение с максимумом приблизительно 190 000 (фиг. 2). На фиг. 2 ордината относится к содержанию сахарида в образце, определенному фенолсернокислотным методом, выраженному как поглощение при 480 нм, а абсцисса относится к номеру фракции.

Гель-фильтрацию осуществляют в следующих условиях:

размер колонки: 3,08 х 162,5 см;

растворитель: 10 мМ натрий фосфатный буфер (рН 6,0), содержащий 0,2М хлорида натрия и 10% этанола;

скорость потока: 1,5 мл/мин; концентрация образца: 0,25%;

объем образца: 20 мл; и молекулярно-массовый стандарт: 8йобех 8ТАНВАКЭ Р-82 (производ. 8йо\\'а Эепсо. К.К.)

Затем анализируют компоненты сульфированного фукозосодержащего полисахарида-и данного изобретения, полученного таким образом.

Сначала, определяют содержание фукозы в соответствии со способом, описанным в 1оитпа1 о! Вю1одка1 С’йетМгу. 175, 595 (1948). Затем, полученный сухой препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и растворяют в ΙΝ хлористо-водородной кислоте, получая концентрацию 0,5%, и обрабатывают при 110°С в течение 2 ч, гидролизуя тем самым до составляющих моносахаридов. В дальнейшем, реду цированные (сокращенные, уменьшенные) концы моносахаридов, полученные гидролизом, пиридил-(2)-аминируют (ПА), используя С1усоТАО и О1усоТАО РеадеШ Κίΐ (каждый произв. Такага δΐιιιζο Со., Ыб.) и соотношение составляющих моносахаридов в композиции анализируют ВЭЖХ (НРЬС). ВЭЖХ осуществляют в следующих условиях:

Установка:	Модель Ь-6200 (произв. НйасЫ, Ыб.);
Колонка:	РАЬРАК Тип А (4,6 мм х 150 мм, произв. Такага БЬ^о Со., Ыб.);
Элюент:	700 мМ смеси боратный буфер (рН 9,0):ацетонитрил = 9 : 1;
Детектирование:	Флуорометрический детектор Е-1150 (произв. НйасЫ, Ыб.), длина волны возбуждения: 310 нм, длина волны флуоресценции: 380 нм;
Скорость потока:	0,3 мл/мин;
Температура колонки:	65°С

Затем определяют содержание уроновой кислоты согласно методу, описанному в Апа1убса1 Вюсйет151гу, 4, 330 (1962).

Далее, содержание серной кислоты определяют согласно методу, описанному в Βίοсйетюа1 1ошпа1, 84, 106 (1962).

В результате, установлено, что составляющими сахаридами полученного выше сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и являются фукоза, манноза, галактоза, глюкоза, рамноза, ксилоза и уроновая кислота, и никаких других нейтральных сахаридов, в основном, там не содержится. Соотношение основных компонентов в композиции, выраженное в молях, является следующим: фукоза : манноза : галактоза : уроновая кислота : сульфогруппа = приблизительно 10 : 7 : 4 : 5 : 20.

Затем, ИК-спектр кальциевой соли сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и получают на инфракрасном спектрометре с преобразованием Фурье типа ΙΙΚ-ΌΙΑΜΟΝΏ 20 (произв. 1ЕОЬ Ыб.). Таким образом получен спектр, показанный на фиг. 3. На фиг. 3 ордината относится к пропусканию (%), а абсцисса относится к волновому числу (см^-1) .

'Н ЯМР спектр кальциевой соли сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и данного изобретения получают на спектрометре ядерного магнитного резонанса Модель 1ΝΜα500 (500 мГц; произв. 1ЕОЬ Ыб.). Таким образом получен спектр, показанный на фиг. 4.

На фиг. 4, по ординате отложена интенсивность сигнала, а по абсциссе отложен химический сдвиг (м.д.) (ррм) Химические сдвиги в ¹Н ЯМР выражают, принимая химический сдвиг ΗΟΌ как 4,65 (м.д.).

'Н ЯМР (Ό₂Ο): δ 5,27 (Н в 1-положении маннозы), 5,07 (Н в 1-положении фукозы), 4,49 (Н в 3-положении фукозы), 4,37 (Н в 1положении глюкуроновой кислоты), 4,04 (Н в 4положении фукозы), 3,82 (Н в 2-положении фукозы), 3,54 (Н в 3-положении глюкуроновой кислоты), 3,28 (Н в 2-положении глюкуроновой кислоты), 1,09 (Н в СН3 в 5-положении фукозы).

При измерении на высокоскоростном, высокочувствительном поляриметре БЕРА-300 (произв. НопЬа Бе15аки5Йо), высушенный вымораживанием продукт сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и данного изобретения имеет удельное вращение -53,6°.

Настоящими изобретателями идентифицирована структура полученного таким способом сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и данного изобретения следующим способом.

Деградация (расщепление) сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и деградирующим ферментом, способным деградировать сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и, и очистка продукта деградации.

Очищенный сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и обрабатывают эндофукоиданазой, как будет описано в дальнейшем, и продукты деградации очищают. А именно, 16 мл 1% раствора сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и, 12 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 8,0), 4 мл 4М раствора хлорида натрия и 8 мл 32 мЕ/мл раствора эндофукоиданазы смешивают вместе и реакцию проводят при 25°С в течение 48 ч. Установлено, что поглощение реакционной смеси при 230 нм увеличивается по мере протекания реакции, тем самым подтверждая развитие деградации сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и этим ферментом. После обессоливания с помощью Мкго Асбу^ег С3 (произв. АкаЫ С’11етка1 1пби51гу Со., Ыб.), реакционную смесь разделяют на три фракции (а), (Ь), и (с), и очищают ЭЕАЕ-Берйагою ЕЕ.

Вышеупомянутую эндофукоиданазу получают следующим способом.

Штамм, подлежащий использованию при получении этого фермента, может быть произвольным штаммом, поскольку он способен продуцировать эндофукоиданазу. В качестве конкретного примера, можно указать Е1ауоЬас1егшт 8р. БА-0082 (ЕЕКМ ВР-5402).

Этот штамм, который выделен данными изобретателями из морской воды в Аошогг имеет следующие микологические свойства.

1. Штамм Е1ауоЬас1егшт 8р. БА-0082

a. Морфологические свойства (1) Короткий стержень; ширина: 0,8 -1,0 мкм длина: 1,0 -1,2 мкм (2) Спора: нет (3) Грам-прокрашивание: -

b. Физиологические свойства (1) Область температур роста: способен расти при 37°С или ниже, соответствующий диапазон температур роста составляет от 15 до 28°С (2) Отношение к кислороду: аэробный (3) Каталаза: + (4) Оксидаза: + (5) Уреаза: слабо + (6) Образование кислоты

Ό-глюкоза: + лактоза: + мальтоза: + Ό-маннит: + сахароза: трегалоза: - (7) Гидролиз крахмал: желатин: + казеин: эскулин: + (8) Восстановление нитрата: - (9) Образование индола: - (10) Образование сульфида водорода: - (11) Загустение молока: - (12) Потребность в натрии: + (13) Потребность в солевой среде Рост в свободной от №1С1 среде: Рост в 1% №1С1 среде: -

Рост в среде морской воды: + (14) Хинон: менахинон 6 (15) ОС содержание во внутриклеточной ДНК: 32% (16) ОГ-тест: 0 (17) Цвет колонии: желтый (18) Подвижность: нет (19) Скольжение: нет

Полагают, что этот штамм является бактерией, аналогичной Г1ауоЬас!егшт ас.|иаЫс и Г1ауоЬас!епит тешидокерйсит, описанным Вегдау'5 Мапиа1 о£ 8у51етаОс Вас!егю1оду, 1, (1984) Вегдау'5 Мапиа1 о£ Пе!егттаТ1уе Вас1епо1оду, _)), (1994). Однако этот штамм отличается от первого по неспособности образовывать какую-либо кислоту путем метаболизма сахарозы, неспособен разлагать казеин, способен разлагать эскулин, способен переводить в жидкое состояние желатин и позитивен к уреазе, и от последнего по неспособности разлагать казеин и медленно расти при 37°С. Таким образом, этот штамм был идентифицирован как бактерия, принадлежащая к роду Г1ауоЬас!егшт и ее назвали Г1ауоЬас!егшт 5р. 8А-0082.

Вышеуказанный штамм называют Г1ауоЬас!егшт 5р. 8А-0082 и он депонирован в ΝιТюпа1 1п5!йи!е о£ Вю5с1епсе апб Нитап Тес1то1оду, Адепсу о£ 1пби51па1 8с1епсе апб Тесйпо1оду (1-3, Н1да5Ы 1-с1оте, Т5икиЬа-5Ы, 1Ьагак1-кеп 305, .ΤΑΡΑΝ) под номером в каталоге ГЕВМ Р14872 с 29 марта 1995 года и депонирован в ΝιТюпа1 Тп5111и(е о£ Вю5с1епсе апб НитапТес1по1оду, как описано выше, под номером в каталоге ГЕВМ ВР-5402 (причем перенос в международное депонирование запрошен 15 февраля 1996 г.).

Питательные вещества, подлежащие добавлению в среду для инкубации этого штамма, могут быть произвольными питательными веществами, поскольку применяемый штамм может их утилизировать, продуцируя эндофукоиданазу. Соответствующие примеры источника углерода включают фукоидан, порошок морских водорослей, альгиновую кислоту, фукозу, глюкозу, маннит, глицерин, сахарозу, мальтозу, лактозу и крахмал, в то время как примеры источника азота включают дрожжевой экстракт, пептон, касамино (са5атшо) кислоты, экстракт замоченной кукурузы (сот 51еер йциог), мясной экстракт, обезжиренная соя, сульфат аммония и хлорид аммония. Кроме того, среда может содержать неорганические вещества и соли металлов, такие как соли натрия, фосфаты, соли калия, соли магния и соли цинка.

Выход эндофукоиданазы, полученной инкубацией штамма, варьируется в зависимости от условий инкубации. В целом, предпочтительно, чтобы температура инкубации находилась в диапазоне от 15 до 30°С и значение рН среды находилось в диапазоне от 5 до 9. Выход эндофукоиданазы достигает максимума при инкубации штамма при аэрации и перемешивании в течение 5-72 ч. Как нечто само собой разумеющееся, условия инкубации соответственно выбирают в зависимости от применяемого штамма, состава среды и т. д. так, чтобы достичь максимальный выход.

Эндофукоиданаза содержится как в клетках, так и в культуральном супернатанте.

Вышеупомянутую Г1ауоЬас!егшт 5р. 8А0082 инкубируют в соответствующей среде и клетки собирают и разрушают способом, обычно применяемым для разрушения клеток, таким как ультразвуковая обработка. Таким образом можно получить экстракт, свободный от клеток.

В дальнейшем, экстракт очищают с помощью процедуры очистки, обычно применяемой в данной области, тем самым получая препараточищенный фермент. Например, очистку можно осуществить путем обессоливания, ионнообменной хроматографии, колоночной хроматографией с носителем с гидрофобной связью, гель-фильтрацией или т. п., тем самым получая очищенную эндофукоиданазу, свободную от любой другой фукоиданазы.

Культуральный супернатант, полученный удалением клеток из вышеупомянутой культуральной среды, также содержит большое количество этого фермента (внеклеточный фермент), который можно очистить такими же способами, как способы, применяемые для очистки внутриклеточного фермента.

Далее будет дан пример очистки эндофукоиданазы.

Г1ауоЬас!егшт 5р. 8А-0082 (ГЕВМ ВР5402) инокулируют в 600 мл среды, включающей искусственную морскую воду (рН 7,5, произв. .Татагш ЬаЬогаТогу), содержащую 0,25% глюкозы, 1,0% пептона и 0,05% дрожжевого экстракта, которую пипетируют в 2-х литровую колбу Эрленмейера и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин. Затем штамм инкубируют в нем при 24°С в течение 24 ч, тем самым получая семенную культуру. В 30-ти литровый сосуд ферментер загружают 20 л среды, включающей искусственную морскую воду (рН 7,5, произв. Т-цпапп ЬаЬога1огу), содержащую 0,25% глюкозы, 1,0% пептона, 0,05% дрожжевого экстракта и 0,01% противовспенивающего средства (КМ70 произв. §Ып-Е1зи Сйет1са1 Со., Ь1б.) и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин. После охлаждения, среду инокулируют 600 мл вышеупомянутой семенной культуры, которую затем инкубируют в ней при 24°С в течение 24 ч в условиях аэрации при скорости 10 л/мин и перемешивании при 125 об/мин. После завершения инкубации культуральную среду центрифугируют, тем самым собирая клетки.

Эти клетки суспендируют в 20 мМ ацетатфосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 200 мМ хлорида натрия, разрушают ультразвуковой обработкой и центрифугируют, получая тем самым экстракт клеток.

Эндофукоиданаза в этом клеточном экстракте показывает активность 5 мЕ/мл среды.

К этому экстракту добавляют сульфат аммония, так чтобы в конце концов установить 90% насыщение. После растворения путем перемешивания, смесь центрифугируют и осадок суспендируют в таком же буфере, как вышеупомянутый буфер, в котором суспендировали клетки. Затем суспензию тщательно диализуют против 20 мМ ацетат-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 50 мМ хлорида натрия. После удаления образованного при диализе осадка центрифугированием, его адсорбируют ЭЕЛЕ§ерйагозе РР колонкой, которую уравновешивают 20 мМ ацетат-фосфатным буфером (рН 7,5), содержащим 50 мМ хлорида натрия. Затем адсорбированное вещество хорошо промывают тем же самым буфером и проявляют с помощью элюирования линейным градиентом хлорида натрия от 50 до 600 мМ. Активные фракции объединяют и туда добавляют хлорид натрия, получая финальную концентрацию 4М. Затем его адсорбируют Рйепу1 §ерйагозе СЬ-4В колонкой, которую уравновешивают 20 мМ ацетатфосфатным буфером (рН 8,0), содержащим 4М хлорида натрия. Затем адсорбированное вещество хорошо промывают тем же самым буфером и выделяют с помощью элюирования линейным градиентом хлорида натрия от 4 до 1М. Активные фракции объединяют и концентрируют при помощи ультрафильтра. Далее, подвергают гель фильтрации с использованием 8ерйасгу1 §-300, уравновешивая 10 мМ фосфатным буфером, содержащим 50 мМ хлорида натрия. Активные фракции объединяют. Молекулярная масса фермента, определенная из времени удерживания в §ерйасгу1 §-300 составляет около 460 000. Далее, активную фракцию диализуют против 10 мМ фосфатного буфера (рН 7), содержащего 250 мМ хлорида натрия. Раствор фермента адсорбируют Мопо О НЕ5/5 колонкой, которую уравновешивают 10 мМ фосфатным буфером (рН 7), содержащим 250 мМ хлорида натрия.

Адсорбированное вещество хорошо промывают тем же самым буфером и выделяют с помощью элюирования линейным градиентом хлорида натрия от 250 до 450 мМ. Активные фракции объединяют, получая тем самым очищенный фермент. В табл. 1 суммированы результаты вышеупомянутых стадий очистки.

Таблица I

Стадия	Общий белок (мг)	Общ. активность (МЕ)	Удель. активность (мЕ/мг)	Выход (%)
Клеточный экстракт	61,900	101,000	1,63	100
Аммоний сульфат обессоливание	33,800	88,600	2,62	87,7
ЭЕАЕ-8ерйагозе СЬ-4В	2,190	40,400	18,4	40,0
Рйепу1 8ерйагозе СЬ-4В	48,2	29,000	601	28,7
8ерйасгу1 8-300	7,24	19,600	2,710	19,4
Мопо 0	0,824	15,000	18,200	14,9

Активность этого фермента определяют следующим образом. 50 мкл 2,5% раствора фукоидана, происходящего от К)е11таше11а сгаззЕ ГоНа. 10 мкл этого фермента и 60 мкл 83 мМ фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 667 мМ хлорида натрия, смешивают вместе и реакцию проводят при 37°С в течение 3 ч. Затем 105 мкл реакционной смеси смешивают с 2 мл воды при перемешивании и измеряют поглощение (АТ) при 230 нм. В качестве контролей применяют реакционную смесь, полученную тем же самым способом, но замещая фермент только вышеупомянутым буфером, применяемым для растворения фермента, и другую реакционную смесь, полученную тем же самым способом, но замещая раствор фукоидана только водой, и измеряют также их поглощения (АВ1 и АВ2).

Количество фермента, с помощью которого 1 мкмоль гликозидных связей между маннозой и уроновой кислотой может быть эксклюзивно расщеплено в одну минуту, принимают за одну Е. Расщепленные таким образом связи определяют, считая миллимолярный молекулярный коэффициент экстинкции ненасыщенной уроновой кислоты, получаемой в реакции элиминирования, как 5,5. Активность фермента определяют в соответствии со следующим уравнением:

Активность (Е/мл) = (АТ - АВ1 - АВ2) х 2,105 х 120/ (5,5 х 105 х 0,01 х 180);

2,105: объем (мл) образца, поглощение которого подлежит измерению;

120: объем (мкл) реакционной смеси с ферментом;

5,5: миллимолярный молекулярный коэффициент экстинкции (/мМ) ненасыщенной уроновой кислоты при 230 нм;

105: объем (мкл) реакционной смеси, применяемой для разбавления;

0,01: объем (мл) фермента и

180: время реакции (мин).

Белок определяют, измеряя поглощение раствора фермента при 280 нм, и рассчитывают, принимая поглощение 1 мг/мл раствора белка, равным 1,0.

Фукоидан, происходящий от 1<)е11таше11а сгаззИойа, применяемый в качестве субстрата, получают следующим способом.

Сухую К)е11таше11а сгаззИойа размалывают при помощи свободной мельницы (1гее тШ) (произв. Ыага К1ка1 8е1бакибйо) и обрабатывают 10 объемами 85% метанола при 70°С в течение 2 ч. Затем фильтруют и остаток затем обрабатывают 10 объемами метанола при 70°С в течение 2 ч. После фильтрации, к остатку добавляют 20 объемов воды. Затем смесь обрабатывают при 100°С в течение 3 ч и фильтруют, получая экстракт. Концентрацию соли экстракта доводят до такого же уровня, как концентрация 400 мМ раствора хлорида натрия. Затем туда добавляют цетилпиридиний хлорид до тех пор, пока не перестанет образовываться осадок. После центрифугирования, осадок тщательно промывают этанолом, тем самым полностью удаляя цетилпиридиний хлорид. Далее, его подвергают обессоливанию и удалению низкомолекулярных веществ, используя ультрафильтр (исключение молекулярной массы ультрафильтрационной мембраной: 100 000, произв. Аткоп). Полученный таким образом осадок удаляют с помощью центрифугирования. Супернатант сушат вымораживанием, получая очищенный К]е11таше11а сга881£о11а фукоидан. Анализ структуры продукта реакции-фермента.

Вышеупомянутая эндофукоиданаза представляет фермент, который эксклюзивно деградирует α 1^4 связь между Ό-маннозой и Όглюкуроновой кислотой в сульфированном фукозусодержащем полисахариде-И. Когда полученный выше сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и обрабатывают этим ферментом, образуются олигосахариды, имеющие структуры, представленные следующими формулами (I), (II) и (III):

Ниже будет дано детальное описание.

Порция каждой из трех вышеупомянутых трех фракций (а), (Ь) и (с), отделенной и очищенной с помощью ОЕЛЕ-8ер11аго5е РР, является пиридил-(2)-аминированной (РА) по редуцированному концу при использовании С1усоТАС и С1усоТАС Кеадеп! КД с получением РА сахаридов (РА-а), (РА-Ь) и (РА-с), которые затем анализируют с помощью ВЭЖХ.

ВЭЖХ осуществляют в следующих условиях:

(ί) ВЭЖХ анализ с использованием колонки для молекулярно-массового фракционирования:

установка: модель Ь-6200 (произв. НДасЫ, Ыб.);

колонки : 8ΗΟΌΕΧ 8В-803 (4,6 мм х 250 мм, про-изв. 81ю\\'а Эепсо, К.К.);

элюент: 0,2М смеси хлорид натрия : диметилсульфоксид = 9:1;

детектирование: флуорометрический детектор Р-1150 (произв. НДасЫ, Ь1б.), длина волны возбуждения 320 нм, длина волны флуоресценции 400 нм;

скорость потока: 1 мл/мин; и температура колонки: 50°С.

(ίί) ВЭЖХ анализ с использованием колонки с обращенной фазой:

установка: модель Ь-6200 (произв. НДасЫ, Ыб.);

колонка: Ь-колонка (4,6 мм х 250 мм, произв. Кадаки УакиЫп Кепза Куока1);

элюент: 50 мМ уксусная кислота : триэтиламин (рН 5,5);

детектирование: флуорометрический детектор Р-1150 (произв. Нбас1н. Ь1б.), длина волны возбуждения 320 нм, длина волны флуоресценции 400 нм;

скорость потока: 1 мл/мин; и температура колонки: 40°С.

На фиг. 5, 6 и 7, соответственно, показаны ВЭЖХ картины элюирования пиридил-(2)аминированных сахаридных соединений (РА-а), (РА-Ь) и (РА-с). На каждой фигуре ордината относится к относительной интенсивности флуоресценции, а абсцисса относится к времени удерживания (мин).

Ниже иллюстрируются физические свойства соединений (а), (Ь) и (с), то есть, соединений, представленных формулами (I), (II) и (III).

На фиг. (8), (9) и (10), соответственно, показаны масс-спектры соединений (а), (Ь) и (с), а на фиг. 11, 12 и 13, соответственно, показаны масс-спектры соединений (а), (Ь) и (с). На каждой фигуре ордината относится к относительной интенсивности (%), а абсцисса относится к значению м/ζ.

Кроме того, на фиг. 14, 15 и 16, соответственно, показаны 'Н ЯМР-спектры соединений (а), (Ь) и (с). На каждой фигуре ордината относится к интенсивности сигнала, абсцисса относится к химическому сдвигу (м.д.)

Химические сдвиги в ¹Н ЯМР выражают, принимая химический сдвиг Η0Ό равным 4, 65 (м.д.)

Физические свойства соединения (а):

Молекулярная масса: 564;

МС м/ζ: 563 [М-Н⁺]^-;

МС/МС м/ζ: 97 [Η80₄]^-, 157 [ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота-Н2О-Н⁺], 175 [ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота-Н⁺]^-, 225 [Ь-фукоза сульфат-Н2О-Н⁺]^-, 243 [Ь-фукоза сульфат-Н⁺]^-, 319 [ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота, связанная с О-маннозой-Н₂О-Н⁺]^- , 405 [М-ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислотаН⁺]^-, 483 [М-8О³-Н⁺]^-.

^!ЯМР (Ό₂0):

В описании приняты следующие сокращения для ЯМР данных:

б - дуплет;

б-б - двойной дуплет;

к - синглет;

Ьг-к - широкий синглет;

т - массив;

I - триплет;

Ьг-ΐ - широкий триплет;

с.| - квартет;

δ 5.78 (1Н, б, 1=3.7 Ηζ, 4-Н), 5.26 (1Н, б, 1=1.2 Ηζ, 1-Н), 5.12 (1Н, б, 1=4.0 Ηζ, 1'-Н), 5.03 (1Н, б, 1=6.1 Ηζ, 1-Н), 4.47 (1Н, б-б, 1=3.4, 10.4 Ηζ, 3''-Η), 4.21(1Н, Ьг-к, 2-Н), 4.12 (1Н, т, 5'-Η),

4.10 (1Н, б-б, 1=3.7, 5.8 Ηζ, 3-Н), 4.03 (1Н, б, 1=3.4 Ηζ, 4'-Η), 3.86 (1Η, т, 3-Н), 3.83 (1Н, б-б, 1=4.0, 10.4 Ηζ, 2-Н), 3.72 (1Н, т, 4-Н), 3.72 (1Н, т, 5-Н), 3.70 (Н₂ о£ 2Η, т, 5-СН₂), 3.65 (1Н, б-б, 1=5.8, 6.1Ηζ, 2-Η), 1.08 (Н₃ о£ 3Η, б, 1=6.7 Ηζ, 5'-СН₃) .

Состав сахарида:

Ь-фукоза: ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота : Ό-манноза = 1:1:1 (каждой одна молекула).

Сульфат:

одна молекула (в 3-положении Ь-фукозы).

Пики ¹Η-ЯΜΡ приписаны соответственно положениям, обозначенным цифрами в следующей формуле (IV):

СН, он

он

Физические свойства соединения (Ь):

Молекулярная масса: 724

МС м/Ζ: 723 [М-Н⁺]^-, 361 [М-2Н⁺]^2-.

МС/МС м/ζ: 97 [Η80₄]^-, 175 [ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота-Н⁺], 243 [Ь-фукоза сульфат-Ч]^-, 321 [Μ-803-2Η⁺]^2-, 405 [Мненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота-2803Η⁺]^-, 417 [Μ-Ь-фуко'з1-280_;-11'| ^!Н ЯМР (О₂О): δ 5.66 (1Η, б, 1=3.4 Ηζ, 4Η), 5.27 (1Η, б, 1=7.3 Ηζ, 1-Η), 5.22 (1Η, б, 1=1.8 Ηζ, '-Η), 5.21 (1Η, б, 1=3.7 Ηζ, 1'-Н), 4.50 (1Η, б, 1=3.1 Ηζ, 4-Η), 4.32 (1Η, φ 1=6.7 Ηζ, 5'-Η), 4.27 (1Η, б-б, 1=3.7, 10.4Η_ζ, 2'-Η), 4.21 (1Η, б-б, 1=3.4, 6.7 Ηζ, 3-Η), 4.18 (Η ο£ 1Η, б-б, 1=1.8, 11.0 Ηζ, 5-ϋΗ), 4.15 (1Η, Ьг-к, 2-Η), 4.10 (Η ο£ 1Η, б-б, 1=5.8, 11.0 Ηζ, 5-ΟΗ), 3.99 (1Η, б-б, 1=3.1, 10.4 Ηζ, 3'-Η), 3.90 (1Η, т, 5-Η), 3.82(1Η, т, 3-Η),

3.82 (1Η, т, 4-Η), 3.54 (1Η, Ьг-Ι, 1=7.3 Ηζ, 2-Η),

1,1 (Н₃ ο£ 3Η, б, 1=6.7 Ηζ, 5'-СН₃).

Состав сахарида:

Ь-фукоза : ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота: Ό-манноза = 1:1:1 (каждой одна моле кула).

Сульфат:

три молекулы (в 2- и 4-положениях Ьфукозы и 6-положении Ό-маннозы).

Пики ¹Н-ЯМР приписаны, соответственно, положениям, обозначенным цифрами в следующей формуле (V):

Физические свойства соединения (с):

Молекулярная масса: 1128;

МС м/ζ: 1127 [М-Н⁺]^-;

МС/МС м/ζ: 97 [Н80₄]^-, 175 [ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота-Н⁺]^-, 225 [Ь-фукоза сульфат-Η20-Η⁺]^-, 243 [Ь-фукоза сульфат-Н⁺]^-, 371 [М-ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислотаЬ-фукоза-803-Н⁺]^2-, 405 [сульфированная Ьфукоза, связанная с Ό-маннозой-Н' р. 721 [М-Όманноза-Ь-фукоза-80₃-Н₂О-Н⁺]^-.

¹Η ЯМР (Ό₂0): δ 5.69 (1Н, б, 1=3.7 Ηζ, (4)Η), 5.34 (1Η, к, (1)-Η), 5.16 (1Н, к, 1-Η), 5.10 (1Η, б, 1=4.0 Ηζ, (1)'-Η), 5.50 (1Η, б, 1=3.7 Ηζ, 1'-Η), 4.93 (1Η, б, 1=6.4 Ηζ, (1)-Η), 4.50 (1Η, б-б,

1=3.4, 10.7 Ηζ, 3'-Η), 4.47 (1Η, б-б, 1=3.4, 10.4 Ηζ, (3)'-Η), 4.39 (1Η, б, 1=7.9 Ηζ, 1-Η), 4.33 (1Η, Ьг-8, (2)-Η), 4.14 (1Η, т, 2-Η), 4.12 (1Η, т, (3)Η), 4.12 (1Η, т, 5'-Η), 4.12 (1Η, т, (5)'-Η), 4.04 (1Η, т, 4'-Η), 4.03 (1Η, т, (4)'-Η), 3.85 (1Η, т, 2'Η), 3.85 (1Η, т, (2)'-Η), 3.82 (1Η, т, 3-Η), 3.82 (1Η, т, (3)-Η), 3.73(1Η, т, 4-Η), 3.73(1Η, т, 5Η), 3.73 (1Η, т, (4)-Η), 3.70 (Η₂ о£ 2Η, т, 5-СИ₂), 3.70 (Η₂ ο£ 2Η, т, (5)-СИ₂), 3.67 (1Η, т, 5-Η), 3,62 (1Η, т, 4-Η), 3.62 (1Η, т, (2)-Η), 3.62 (1Η, т, (5)-Η), 3.51 (1Η, ΐ, 1=8.9 Ηζ, 3-Η), 3.28 (1Η, ΐ, 1=7.9Ηζ, 2''-Η), 1.09 (Н₃ ο£ 3Η, б, Ι=6.7Ηζ, (5)'СН₃), 1.07 (Н₃ ο£ 1Η, б, Ι=6.7Ηζ, 5'-СН₃).

Состав сахарида:

Ь-фукоза: ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота: Ό-глюкуроновая кислота: Ό-манноза = 2:1:1:2 (две молекулы Ь-фукозы, две молекулы Ό-маннозы, одна молекула ненасыщенной Όглюкуроновой кислоты и одна молекула Όглюкуроновой кислоты). Сульфат: две молекулы (в 3-положении каждой Ь-фукозы).

Пики ¹Η-ЯМР приписаны, соответственно, положениям, обозначенным цифрами в следующей формуле (VI):

Когда полученный таким образом сульфированный фукозусодержащий полисахарид-ϋ обрабатывают вышеупомянутой эндофукоиданазой, по мере протекания реакции происходит элиминирование и таким образом поглощение при 230 нм увеличивается. Все основные продукты реакции несут ненасыщенные гексуронатные группы, что подтверждает, что полученный сульфированный фукозусодержащий полисахарид-ϋ имеем сахарную цепь, состоящую из гексуроновой кислоты и маннозы, альтернативно связанных одна с другой. Поскольку фукоза содержится в качестве основного составляющего сахарида, полученный сульфированный фукозусодержащий полисахарид-ϋ склонен к деградации кислотами, по сравнению с обычными полисахаридами. С другой стороны, известно, что связи гексуроновых кислот и маннозы относительно высоко устойчивы к кислотам. Изобретатели попытались идентифицировать гексуроновую кислоту в сахарной цепи, которая состоит из гексуроновой кислоты и маннозы, альтернативно связанных одна с другой, и содержится в смеси сульфированных фу козусодержащих полисахаридов, происходящей из К]е11таше11а сгакШоНа, нижеследующим способом со ссылкой на способ, описанный в СагЬобубга1е Кекеагсб, 125, 283-290 (1984). Сначала, сульфированную фукозусодержащую полисахаридную смесь растворяют в 0,3 М щавелевой кислоте и обрабатывают при 100°С в течение 3 ч. Затем ее подвергают фракционированию по молекулярным массам и фракции с молекулярной массой 3 000 или более объединяют. Затем ее в дальнейшем обрабатывают анионообменной смолой и адсорбированные вещества собирают. Полученное таким образом вещество сушат вымораживанием и гидролизуют 4Ν хлористо-водородной кислотой. После доведения значения рН до 8, его пиридил-(2)-аминируют и уроновую кислоту анализируют методом ВЭЖХ. ВЭЖХ осуществляют в следующих условиях:

установка: модель Ь-6200 (произв. Η ПасНЬ Ь1б.);

колонка: РАЬРАК Тип N (4,6 мм х 250 мм, произв. Такага 31шхо Со., Ь1б.);

элюент: 200 мМ уксусная кислотатриэтиламиновый буфер (рН 7,3): ацетонитрил = 25:75;

детектирование: флуорометрический детектор Р-1150 (произв. ΗίΙ;κ1ιί. Ыб.), длина волны возбуждения: 320 нм, длина волны флуоресценции: 400 нм;

скорость потока: 0,8 мл/мин и температура колонки: 40°С.

В качестве стандартов для РА гексуроновых кислот используют стандарты, полученные пиридил-(2)-аминированием глюкуроновой кислоты, производимой 81дта Сбет1са1 Со., галактуроновой кислоты, производимой \Уако Риге СЬетка1 ШбикМек, Ь1б., индуроновой кислоты, полученной гидролизом 4-метилумбеллиферил-а-Ь-идуронида, производимого 81дта С11ет1са1 Со., и маннуроновой кислоты и гулуроновой кислоты, полученной гидролизом альгиновой кислоты (произв. \Уако Риге СЬетка1 Шбийлек, Ыб.), с последующим разделением при помощи анионообменной смолы со ссылкой на способ, описанный в Ас1а Сбетка 8сапбтаука, 15, 1397-1398 (1961).

В результате, установлено, что глюкуроновая кислота только одна содержится в виде гексуроновой кислоты в сахарной цепи в вышеупомянутой смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов.

Далее, глюкуроновую кислоту в гидролизате вышеупомянутой сахарной цепи отселяют от Ό-маннозы, используя анионообменную смолу, и сушат вымораживанием. Затем измеряют ее удельное вращение. Таким образом установлено, что глюкуроновая кислота представляет декстровращающую глюкуроновую кислоту, то есть, Ό-глюкуроновую кислоту.

Далее, сульфированную фукозусодержащую полисахаридную смесь, происходящую от

К|с11тап1с11а сгаккбойа. обрабатывают вышеупомянутой эндофукоиданазой и затем гидролизуют, используя щавелевую кислоту, аналогично вышеупомянутому случаю. Однако никакого полимера, имеющего Ό-глюкуроновую кислоту и Ό-маннозу, альтернативно связанных одна с другой, не обнаружено.

На основе этих результатов устанавливают, что вышеупомянутая эндофукоиданаза расщепляет путем реакции элиминирования сульфированные фукозусодержащие полисахариды, имеющие структуру скелета, состоящую из Όглюкуроновой кислоты и Ό-маннозы, альтернативно связанных одна с другой.

Далее, полимер, полученный деградацией с помощью щавелевой кислоты, подвергают ЯМР анализу, тем самым изучая аномерную конфигурацию мест связывания Ό-глюкуроновой кислоты и Ό-маннозы и гликозидную связь.

Данные ЯМР-анализа полимера являются следующими. Химические сдвиги в 'Н ЯМР выражают, принимая химический сдвиг метильной группы в триэтиламине равным 1,13 (м.д.) а химические сдвиги в ¹³С ЯМР выражают, принимая химический сдвиг метильной группы в триэтиламине равным 9,32 м.д.

'Н ЯМР (Ό₂Θ): δ 5.25 (1Н, Ьг-к, 1-Н), 4.32 (1Н, б, 1=7.6Ηζ, 1'-Н), 4.00 (1Н, Ьг-8, 2-Н), 3.71 (1Н, т, 5'-Н), 3.69 (Н οί 1Н, т, 5-СН), 3.68 (1Н, т, 3-Н), 3.63 (Н οί 1Н, т, 5-СН), 3.63 (1Н, т, 4'Н), 3.57 (1Н, т, 4-Н), 3.54 (1Н, т, 3'-Н), 3.53 (1Н, т, 5-Н), 3.25 (1Н, ΐ, 1=8.5Ш, 2'-Н).

¹³С ЯМР (Ό₂Θ): δ 175.3 (С οί 5'-СООН),

102.5 (1'-С), 99.6 (1-С), 78.5 (2-С), 77.9 (4'-С), 77.0 (3'-С), 76.7 (5'-С), 73.9 (5-С), 73.7 (2'-С), 70.6 (3-С), 67.4 (4-С), 61.0 (С οί 5-СН₂ОН).

Эти пики приписывают, соответственно, положениям, обозначенным цифрами в следующей формуле (VII):

Что касается конфигурации в 1-положении Ό-глюкуроновой кислоты, то ее идентифицируют как β-Ό-глюкуроновую кислоту, ее вицинальной константы (постоянной) связывания 7,6 Гц.

Что касается конфигурации в 1-положении Ό-маннозы, то ее идентифицируют как β-Όманнозу, вследствие ее химического сдвига 5,25 м.д.

Способы связывания составляющих сахаридов анализируют методом НМВС, то есть, методом определения ¹Н-гетероядерной связи. ΌΟί-ί'ΌδΥ и НОНАНА методы применяют при отнесении в ¹Н ЯМР, в то время как Н§рС метод применяют при отнесении в ¹³С ЯМР.

В НМВС спектре взаимодействующие пики наблюдают между 1-Н и 4'-С с между 4'-Н и

1-С, и между 1'-Н и 2-С с между 2-Н и 1'-С. Эти факты указывают, что Ό-глюкоза связана в 2положении Ό-маннозы через β-связь, в то время как Ό-манноза связана в 4-положении Ό-глюкуроновой кислоты через α-связь.

Принимая во внимание вышеупомянутые результаты, обнаружено, что соединение (а) имеет структуру, где ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота и Ь-фукоза, имеющая связанную с ней сульфогруппу, связаны с Όманнозой, которая имеет редуцированный конец; соединение (Ь) имеет структуру, где ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота и Ь-фукоза, имеющая две связанные с ней сульфогруппы, связаны с Ό-маннозой, которая имеет редуцированный конец и имеет сульфогруппу, связанную с ней; и соединение (с) имеет структуру, где Όглюкуроновая кислота и Ь-фукоза, имеющая связанную с ней сульфогруппу, связаны с Όманнозой, которая имеет редуцированный конец, и с этой Ό-глюкуроновой кислотой связана Ό-манноза и, в свою очередь, с этой ненасыщенной Ό-маннозой дополнительно связаны ненасыщенная Ό-глюкуроновая кислота и Ьфукоза, имеющая сульфогруппу, связанную с ней.

Как обсуждено выше, полученный сульфированный фукозусодержащий полисахарид-ϋ имеет структуру, где Ό-глюкуроновая кислота и Ό-манноза альтернативно связаны одна с другой, и Ь-фукоза связана, по крайней мере, с одной Ό-маннозой.

Кроме того, он имеет частичную (фрагмент) структуру, представленную следующей общей формулой (VIII), где, по крайней мере, одна из спиртовых гидроксильных групп сульфирована и п равно целому числу 1 или более:

Данное изобретение обеспечивает сульфированный фукозусодержащий полисахарид-ϋ, который был отделен от сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р данного изобретения, и очищен. Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-ϋ данного изобретения содержит уроновую кислоту в виде его составляющего сахарида и деградируется фукоиданазой, полученной с помощью Р1ауоЬас!етшт кр. БА-0082 (РЕЕМ ВР-5402), с получением, по крайней мере, одного соединения, выбранного из соединений, представленных вышеупомянутыми формулами (I), (II) и (III). Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-ϋ данного изобретения не ограничен молекулярной массой, молекулярно-массовым распределением или сахаридной композицией. А именно, можно получить сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и, имеющий произвольную молекулярную массу и молекулярно-весовое распределение, и можно получить сульфированные фукозусодержащие полисахариды, имеющие определенным образом прогнозируемые физико-химические свойства.

Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и данного изобретения не имеет такого сильного антикоагулянтного действия, как действие, показанное сульфированным фукозусодержащим полисахаридом-Р. Таким образом, могут быть разработаны сульфированные фукозусодержащие полисахариды, в основном, не проявляющие антикоагулянтную активность. Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и данного изобретения может использоваться в виде очищенных сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, в противораковых средствах, антиметастатических средствах, канцеростатических агентах и т.п. Кроме того, он полезен в качестве антигена против антисульфированного фукозусодержащего полисахаридного антитела. Кроме того, можно получить олигосахариды, такие как олигосахариды, имеющие структуры вышеуказанных формул (I), (II) и (III), из сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и. А именно, его используют для получения этих новых соединений. Ниже описывается сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения и способ его получения.

Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения можно получить, используя способ данного изобретения следующим образом. Смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов обрабатывают расщепляющим ферментом, способным деградировать сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и. После завершения ферментативной реакции, деградированный таким образом сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и удаляют ультрафильтрацией, и т.д. В качестве вышеупомянутого расщепляющего фермента можно использовать любой фермент, который может селективно деградировать сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и. В качестве его конкретного примера можно указать вышеупомянутую эндофукоиданазу, продуцируемую Р1ауоЬас1егшш кр. 8А0082 (РЕЕМ ВР-5402).

При обработке этим ферментом, концентрация субстрата, температура, значение рН и т.д. могут быть подобраны соответственно так, чтобы обеспечить преимущественно протекание ферментативной реакции. Обычно желательно, чтобы концентрация субстрата варьировалась в диапазоне от приблизительно 0,1 до 10%, температура варьировалась от приблизительно 20 до 40°С и значение рН варьировалось от приблизительно 6 до 9.

Можно также микроорганизм, способный продуцировать расщепляющий фермент, имеющий способность деградировать сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и, подвергнуть инкубации в среде, в которую добавлена смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, и затем сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р подвергнуть очистке из этой среды. Микроорганизм, подлежащий использованию, может быть произвольным микроорганизмом, который способен продуцировать расщепляющий фермент, имеющий способность деградировать сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и. В качестве конкретного его примера, можно указать микроорганизм Р1ауоЬае1егшш кр. 8А-0082 (РЕЕМ ВР5402), описанный выше, и Рисо1бапоЬас1ег шаппик М-0098 (РЕЕМ-5403).

Питательные вещества, подлежащие добавлению в среду, могут быть произвольными, поскольку используемый штамм может утилизовать их для того, чтобы продуцировать расщепляющий фермент. Соответствующие примеры источника углерода включают фукоидан, порошок морских водорослей, альгиновую кислоту, фукозу, глюкозу, маннит, глицерин, сахарозу, мальтозу, лактозу и крахмал, в то время как примеры источника азота включают дрожжевой экстракт, пептон, сакашшо кислоты, экстракт замоченной кукурузы, мясной экстракт, обезжиренную сою, сульфат аммония и хлорид аммония. Среда может дополнительно содержать неорганические вещества и соли металла, такие как соли натрия, фосфаты, соли калия, соли магния и соли цинка.

Не говоря уже о том, что условия инкубации следует подбирать в зависимости от используемого штамма, состава среды, и т. д. так, чтобы достичь максимального уровня активности расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и. Вообще говоря, инкубацию можно осуществлять при температуре от 15 до 30°С и при рН среды от 5 до 9 в условиях аэрации/перемешивании в течение от 5 до 72 ч. После завершения инкубации, компоненты в среде, другие чем сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, а именно, таким образом деградированный сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и и т.д., могут быть удалены, например, ультрафильтрацией.

Этот штамм Рисо1бапоЬас1ег шагтик М0098, который был выделен настоящими изобретателями из морской воды Аошоп. имеет следующие микологические свойства.

1. Рисо1бапоЬас1ег таппик 8Ζ-0098 штамм.

a. Морфологические свойства (1) Диплококк (короткий стержень); ширина: 0,5 - 0,7 мкм длина : 0,5 - 0,7 мкм (2) Спора: нет (3) Грам-окрашивание: -

b. Физиологические свойства (1) Область температур роста : способен расти при 37°С, соответствующий диапазон температур роста в пределах от 15 до 28°С;

(2) Отношение к кислороду: аэробный (3) Каталаза : + (4) Оксидаза : - (5) Уреаза : - (6) Гидролиз крахмал: + желатин: + казеин: + эскулин: + (7) Восстановление нитрата: - (8) Образование индола: - (9) Образование сульфида водорода: + (10) Загустение молока: - (11) Потребность в натрии: + (12) Потребность в солевой среде

Рост в свободной от №1С1 среде : Рост в 1% №1С1 среде: Рост в среде морской воды: + (13) Хинон: менахинон 7 (14) ОС содержание во внутриклеточной ДНК: 61% (15) Диаминопимелиновая кислота в клеточной стенке: - (16) Гликолил тест: - (17) Присутствие гидроксижирной кислоты: + (18) ОР-тест: 0 (19) Цвет колонии: нет образования характерного пигмента колонии (20) Подвижность: да (21) Скольжение: нет (22) Жгутик: полярный монотрихат

Согласно классификации, описанной в Вегдеу'8 Мапиа1 оГ Ое1егттабуе Вас1епо1оду, _)? (1994), этот штамм попадает в группу 4 (Грамотрицательные аэробные бациллы и кокки). Однако этот штамм значительно отличается от бактерий, относящихся к группе 4, по имеющемуся менахинону 7 в электронной транспортной цепи и содержанию 61% ОС.

В основном грамотрицатальные бактерии имеют убихинон в электронной транспортной цепи, в то время как грамположительные бактерии имеют менахинон.

Хотя грамотрицательные бактерии, относящиеся к родам Р1ауоЬас1егтт и СуЮрНада, имеют исключительно менахинон в электронной транспортной цепи, они сильно отличаются по ОС содержанию от вышеупомянутого штамма, такого как СуЮрНада агуепЦсо1а, который является почвенной бактерией и содержит от 43 до 46% ОС, и СуЮрНада ббВиепк, С. Гегтеп1ап5, С. таппа и С. цЕдтока, которые являются морскими бактериями, каждая из которых содержит 42% ОС. Когда этот штамм сравнивают по гомологии в 168рДНК (168γΌΝΑ) последовательности со штаммами, которые были идентифицированы, то даже наиболее гомологичный штамм (УеггисоткгоЬшт кртокит) показывает гомологию 76,6%. Широко известно, что две бактерии с гомологией 90% или менее, одна от другой отличаются по роду. Таким образом, изобретатели пришли к выводу, что этот штамм представляет новую бактерию, не принадлежащую ни к одному из существующих родов, и его назвали Рисо1бапоЬас1ег таппт 81-0098.

Вышеуказанный штамм называют Рисо1бапоЬас!ег таппик 81-0098 и он депонирован в №Шопа1 1п8111и1е оГ Вюкаепсе апб Нитап ТесНпо1оду, Адепсу оГ 1пби51па1 8аепсе апб ТесЕпо1оду (1-3, ШдакЫ Ι-сНоте, ТкикиЬа-кЫ, 1Ьагак1-кеп 305, 1ΑΡΑΝ) под номером в каталоге РЕКМ Ρ-14873 с 29 марта 1995 года и депонирован в №1бопа1 Iпк111и1е оГ Вюкаепсе апб Нитап ТесЕпо1оду, как описано выше, под номером в каталоге РЕКМ ВР-5403 (причем перенос в международное депонирование запрошен 15 февраля 1996 г.).

Как описано выше, изобретателями было установлено, что сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и данного изобретения демонстрируют совершенно различные друг от друга поведения по отношению к полисахаридному агглютинирующему средству в присутствии одной или более солей при концентрации от 0,6 до 3 М.

Например, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения может быть выделен из водного раствора смесей сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, используя способ данного изобретения.

Сначала, одну или более солей добавляют к водному раствору смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов таким образом, чтобы получить суммарную концентрацию соли от 0,6 до 3М. В качестве солей, подлежащих добавлению, можно использовать, например, хлорид натрия и хлорид кальция без ограничения. После доведения концентрации соли, кислый полисахаридный коагулирующий агент, такой как цетилпиридиний хлорид, добавляют до тех пор, пока осадок больше не будет образовываться. Затем осадки собирают, получая тем самым сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения.

Однако следует обратить внимание на точку, где сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р может с трудом образовывать какой-либо осадок в случае цетилпиридиний хлорида, когда концентрация вышеупомянутой соли превышает 2М. Обычно, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения можно отделить от сульфированного фукозусодержащего полисахарида-ϋ при концентрации соли приблизительно 1,5М (смотри, иллюстрацию фиг .1).

После промывания осадка, при необходимости, цетилпиридиний хлорид в осадке вымывают с помощью смеси натрий хлорид насыщенный спирт, получая тем самым сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения. Осадок можно растворить и подвергнуть ультрафильтрации, чтобы удалить окрашивающие вещества из полученного таким образом сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р данного изобретения. Возможно также обессоливание и сушка вымораживанием осадка с получением сухого препарата. Кроме того, в процессе можно добавить консервант или т.п.

Настоящими изобретателями также обнаружено, что когда сульфированные фукозусодержащие полисахариды очищают, используя анионообменную смолу, как описано выше, сосуществование двухвалентного катиона вызывает количественное увеличение сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, адсорбированных на единицу поверхности смолы, и таким образом сульфированные фукозусодержащие полисахариды можно выделить более эффективно. Чтобы получить сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения, используя способ данного изобретения, к смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов добавляют химическое вещество, служащее в качестве источника двухвалентного катиона, предпочтительно при концентрации 1 мМ или более. Затем, анионообменную смолу уравновешивают раствором, содержащим двухвалентный катион предпочтительно при концентрации 1 мМ или более, и при этом вышеупомянутая смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов адсорбируется. После тщательного промывания анионообменной смолы используемым раствором при уравновешивании сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р выделяют при помощи элюирования линейным градиентом, например, хлорида натрия. В практике данного способа, двухвалентный катион может быть добавлен так, чтобы получить концентрацию 1 мМ или больше. В качестве химического вещества, выполняющего роль источника двухвалентного катиона, подлежащего использованию в данном способе, соли кальция и соли бария демонстрируют особенно превосходные действия. Однако данное изобретение не ограничивается этими веществами и могут быть также использованы сульфат магния, хлорид марганца, и т.д.

Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения можно получить, например, способом, описанным в примере 8. Ниже будут иллюстрированы физикохимические свойства этого сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, хотя сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения не ограничивается им.

Молекулярная масса полученного таким образом сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р определяют с помощью метода гель-фильтрации с использованием 8ер1агу1 8500. В результате этого, он показывает молекулярно-массовое распределение вблизи приблизительно 190 000 (фиг. 17). На фиг. 17 ордината относится к содержанию сахарида в образце, определенному по фенол-сернокислотному способу, и выраженному как поглощение при 480 нм, в то время как абсцисса соответствует номеру фракции. Гель-фильтрацию осуществляют в следующих условиях:

размер колонки: 3,08 х 162,5 см;

растворитель: 10 мМ натрий фосфатный буфер (рН 6,0), содержащий 0,2М хлорида натрия и 10% этанола;

скорость потока: 1,5 мл/мин; концентрация образца: 0,25%; объем образца: 20 мл;

стандарт молекулярной массы: 8йобех

8ΤΆΝΏΆΚΌ Р-82 (производимый 81ю\\'а Эепко. К.К.).

Затем анализируют компоненты полученного таким образом сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р данного изобретения.

Сначала, содержание фукозы определяют в соответствии со способом, описанным в 1оигпа1 о£ Вю1одюа1 Сйеш181ту, 175, 595 (1948).

Затем, сухой препарат полученного таким образом сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р растворяют в ΙΝ хлористоводородной кислоте, получая концентрацию 0,5%, и обрабатывают при 110°С в течение 2 ч, гидролизуя тем самым его на составляющие моносахариды. В дальнейшем, редуцированные концы моносахаридов, полученных гидролизом, пиридил-(2)-аминируют (ПА) путем использования О1усоТАО и О1усоТАО КеадеШ Кй и соотношение составляющих моносахаридов в композиции анализируют при помощи ВЭЖХ. ВЭЖХ осуществляют в следующих условиях:

установка: модель Ь-6200 (произв. НйасЫ, Ш.);

колонка: РАЬРАК Тип А (4,6 мм х 150 мм);

элюент: 700 мМ боратный буфер (рН 9,0): ацетонитрил = 9:1;

детектирование: флуореметрический детектор Р-1150 (произв. НйасЫ, Ыб.), длина волны возбуждения: 310 нм, длина волны флуоресценции: 380 нм;

скорость протока: 0,3 мл/мин; и температура колонки: 65°С.

Затем содержание уроновой кислоты определяют согласно методу, описанному в Апа1у 11са1 Вюсйеш181ту, 4, 330 (1962).

В дальнейшем, содержание серной кислоты определяют в соответствии с методом, описанным в Вюсйетюа1 1оитпа1, 84, 106 (1962).

В результате, установлено, что составляющими сахаридами полученного выше сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р являются фукоза и галактоза при молярном отношении приблизительно 10:1. Ни уроновая кислота, ни какие-либо другие нейтральные сахариды, в основном, в нем не содержатся. Молярное отношение фукозы к сульфату составляет приблизительно 1:2.

Затем, 16 мл 1% раствора фукоидана-Е, 12 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 8,0), 4 мл 4М хлорида натрия и 8 мл 32 мЕ/мл раствора вышеупомянутой эндофукоиданазы, происходящей от Е1ауоЬас!егшт кр. 8А-0082 (ЕЕВМ ВР-5402), смешивают вместе и подвергают взаимодействию при 25°С в течение 48 ч. В результате, продукт расщепления не образуется и субстрат не деградирует.

ИК-спектр кальциевой соли сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е получают на инфракрасном спектрометре с Фурье преобразованием типа ЛВ-ΌΙΑΜΟΝΏ 20 (произв. 1ЕОЬ Ь!б.). Так получен спектр, показанный на фиг. 18. На фиг. 18 ордината соответствует пропусканию (%), а абсцисса соответствует волновому числу (см^-1).

¹Н ЯМР спектр натриевой соли сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е данного изобретения получают на спектрометре ядерного магнитного резонанса Модель 1ΝΜα500 (500 мГц; произв. ХЕОЬ Ь!б.). Так получен спектр, показанный на фиг. 19.

На фиг. 19 по ординате отложена интенсивность сигнала, а по абсциссе отложен химический сдвиг (м.д.). Химические сдвиги в ¹Н ЯМР выражают, используя в качестве эталона химический сдвиг НОИ, равный 4,65 м.д.

¹Н ЯМР (Ό₂Ο): δ 5,30 (Н в 1-положении фукозы), 1,19 (Н в СН3 при 5-положении фукозы).

При измерении на высокоскоростном, высокочувствительном поляриметре §ЕИА^Л-300 (произв. НопЬа 8е1какикйо), высушенный вымораживанием продукт сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е имеет удельное вращение -135°.

Данное изобретение обеспечивает сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е, который был отделен от сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и данного изобретения и очищен. Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е данного изобретения, в основном, не содержит уроновой кислоты в качестве составляющего сахарида и он не деградируется фукоиданазой, продуцируемой Е1ауоЬас!егшт кр. 8А-0082 (ЕЕВМ-5402). Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е данного изобретения не ограничивается по молекулярной массе, молекулярно-массовому распределению или составу сахарида. А именно, можно получить сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е, имеющий произвольную молекулярную массу и молекулярномассовое распределение, и могут предусматриваться сульфированные фукозусодержащие по лисахариды, имеющие определенным образом прогнозируемые физико-химические свойства, такие как состав сахаридов и редуцированный конец и чрезвычайно высокая степень сульфирования.

Будучи отделенным от сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и, который, в основном, не имеет антикоагулянтной активности, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е данного изобретения имеет сильную антикоагулянтную активность. Таким образом, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е и/или продукты его расщепления могут использоваться в антикоагулянтных агентах в виде очищенных сульфированных фукозусодержащих полисахаридов и, кроме того, они полезны в качестве антигена против антитела антисульфированного фукозусодержащего полисахарида.

Когда сульфированные фукозусодержащие полисахариды или продукты их расщепления согласно данному изобретению добавляют при концентрации 1 мкг/мл или более к культуральной среде злокачественных клеток, злокачественные клетки претерпевают апоптоз на протяжении от одного до нескольких дней после добавления. Другими словами, сульфированные фукозусодержащие полисахариды и продукты их расщепления имеют сильное действие, вызывая апоптоз. На нормальные клетки эти вещества не оказывают ни какого-либо вызывающего апоптоз действия, ни токсичности. В частности, сульфированные фукозусодержащие полисахариды, происходящие из пригодных в пищу бурых водорослей и морского огурца, и продукты их расщепления высоко безопасны.

Чтобы получить индуктор апоптоза данного изобретения, сульфированные фукозусодержащие полисахариды и продукты их расщепления используют в качестве активного ингредиента и комбинируют с широкоизвестными фармацевтическими носителями. В общем, сульфированные фукозусодержащие полисахариды и/или продукты их расщепления смешивают с фармацевтически приемлемыми жидкими или твердыми носителями. После необязательного добавления растворителей, диспергирующих средств, эмульгаторов, буферов, стабилизаторов, наполнителей, связующих, дезинтеграторов, смазывающих средств и т.п., смесь перерабатывают в твердые препараты, такие как таблетки, гранулы, порошки, дусты, капсулы или т. п., или жидкие препараты, такие как растворы, суспензии, эмульсия и т. п. Альтернативно, ее можно переработать в сухой препарат, который может быть переведен в жидкое состояние добавлением соответствующего носителя в него до использования.

Индуктор апоптоза данного изобретения можно применять либо перорально, либо парентерально, например с помощью инъекции или внутривенного капельного вливания.

Фармацевтические носители могут быть надлежащим образом подобраны в зависимости от пути введения и лекарственной формы, описанной выше. В случае оральных лекарственных средств, можно использовать, например, крахмал, лактозу, сахарозу, маннит, карбоксиметилцеллюлозу, кукурузный крахмал и неорганические соли. При получении оральных лекарственных средств, можно добавить связующие, дезинтеграторы, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества, улучшающие текучесть, корригенты, окрашивающие вещества, отдушки и т.п. Конкретными примерами этих добавок являются следующие.

Связующее: крахмал, декстрин, порошкообразная аравийская камедь, желатин, гидроксипропилкрахмал, метилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, кристаллическая целлюлоза, этилцеллюлоза, поли(винилпирролидон) и макрогол.

Дезинтегратор: крахмал, гидроксипропилкрахмал, натрий карбоксиметилцеллюлоза, кальций карбоксиметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза.

Поверхностно-активное вещество: натрийлаурилсульфат, соевый лецитин, сахарозные сложные эфиры жирных кислот и полисорбат 80.

Смазывающее вещество: тальк, воски, гидрированные масла растительного происхождения, сахарозные сложные эфиры жирных кислот, стеарат магния, стеарат кальция, стеарат алюминия и полиэтиленгликоль.

Вещества, повышающие текучесть: легкая безводная кремневая кислота, сухой гель гидроксида алюминия, синтетический алюмосиликат и силикат магния.

Примеры жидких препаратов для орального применения включают суспензии, эмульсии, сиропы и эликсиры, причем каждый необязательно содержит корригенты и красители.

С другой стороны, парентеральные препараты могут быть получены путем растворения или суспендирования сульфированных фукозусодержащих полисахаридов и/или продуктов их расщепления, которые являются активным ингредиентом данного изобретения, в разбавителях, таких как дистиллированная вода для инъекции, физиологический соляной раствор, водный раствор глюкозы, растительные масла для инъекции, кунжутное масло, арахисовое масло, соевое масло, кукурузное масло, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль или т.п., обычным способом и добавлением, при необходимости, бактерицидов, стабилизаторов, тонизирующих средств, смягчающих средств и т.д.

Индуктор апоптоза данного изобретения применяют путем введения способом, подходящим для лекарственной формы. Способ введения особенно не ограничен. А именно, может быть выбрано внутреннее применение, наруж ное применение или инъекция. Инъекции могут вводиться, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно или интрадермально. Препараты для наружного применения включают суппозитории.

Доза индуктора апоптоза данного изобретения особенно не конкретизируется, но она может определяться в зависимости от лекарственной формы, способа введения, цели использования, и возраста, веса тела, состояний и т.д. пациента. В общем, доза может быть определена так, чтобы взрослый пациент получал от 1 до 1 000 мг/день, предпочтительно от 10 до 200 мг/день, активного ингредиента. Само собой разумеется, доза варьируется в зависимости от различных факторов. Так, в некоторых случаях достаточно использовать дозу меньше, чем вышеупомянутый уровень, а в других случаях требуется доза, превышающая вышеупомянутый уровень.

Противораковое лекарственное средство можно получить, используя предлагаемые сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и, и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р и/или продукты их расщепления, которые имеют противораковое действие, в качестве активного ингредиента, комбинируя их с широкоизвестными фармацевтическими носителями и затем подвергая эту смесь переработке в лекарственный препарат. Противораковое лекарственное средство можно получить способом, описанным выше. В общем, сульфированные фукозусодержащие полисахариды и/или продукты их расщепления данного изобретения смешивают с фармацевтически приемлемыми жидкими или твердыми носителями. После необязательного добавления растворителей, диспергирующих средств, эмульгаторов, буферов, стабилизаторов, наполнителей, связующих, дезинтеграторов, смазывающих средств и т.п., смесь подвергают переработке в твердые препараты, такие как таблетки, гранулы, порошки, дусты, капсулы или т. п., или в жидкие препараты, такие как растворы, суспензии, эмульсия или т.п. Альтернативно, смесь можно подвергнуть переработке в сухой препарат, который может быть переведен в жидкое состояние добавлением в него соответствующего носителя до использования.

Противораковое лекарственное средство данного изобретения можно применять либо перорально, либо парентерально, например с помощью инъекции или внутривенного капельного вливания.

Фармацевтические носители могут быть надлежащим образом подобраны в зависимости от пути введения и лекарственной формы в соответствии со случаем вышеупомянутого индуктора апоптоза.

Противораковое лекарственное средство данного изобретения применяют при помощи соответствующего пути введения, подходящего для данной лекарственной формы. Способ введения особенно не ограничен. А именно, может быть выбрано внутреннее применение, наружное применение или инъекция. Инъекции могут вводиться, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно или интрадермально. Препараты для наружного применения включают суппозитории.

Доза противоракового лекарственного средства данного изобретения особенно не конкретизируется, но она может определяться в зависимости от лекарственной формы, способа введения, цели использования, и возраста, веса тела, состояний и т.д. пациента. В общем, доза может быть определена так, чтобы взрослый пациент получал от 1 до 1000 мг/день, предпочтительно от 10 до 200 мг/день, активного ингредиента. Само собой разумеется, доза варьируется в зависимости от различных факторов. Так, в некоторых случаях достаточно использовать дозу меньше, чем вышеупомянутый уровень, а в других случаях требуется доза, превышающая вышеупомянутый уровень.

Лекарственное средство данного изобретения можно применять орально, как таковое. Альтернативно, его можно добавлять в произвольную пищу или питье для каждодневного потребления.

Канцеростатическое лекарственное средство можно получить, используя сульфированные фукозусодержащие полисахариды и/или продукты их расщепления, которые имеют канцеростатическое действие, в качестве активного ингредиента, комбинируя их с широкоизвестными фармацевтическими носителями и затем подвергая эту смесь переработке в лекарственный препарат. Канцеростатическое лекарственное средство можно получить способом, описанным выше. В общем, сульфированные фукозусодержащие полисахариды и/или продукты их расщепления данного изобретения смешивают с фармацевтически приемлемыми жидкими или твердыми носителями. После необязательного добавления растворителей, диспергирующих средств, эмульгаторов, буферов, стабилизаторов, наполнителей, связующих, дезинтеграторов, смазывающих средств и т. п., смесь подвергают переработке в твердые препараты, такие как таблетки, гранулы, порошки, дусты, капсулы или т. п., или в жидкие препараты, такие как растворы, суспензии, эмульсия или т. п. Альтернативно, смесь можно подвергнуть переработке в сухой препарат, который может быть разжижен добавлением в него соответствующего носителя до использования.

Канцеростатическое лекарственное средство данного изобретения можно применять либо перорально, либо парентерально, например с помощью инъекции или внутривенного капельного вливания.

Фармацевтические носители могут быть надлежащим образом подобраны в зависимости от пути введения и лекарственной формы в соответствии со случаем вышеупомянутого индуктора апоптоза.

Канцеростатическое лекарственное средство данного изобретения применяют при помощи соответствующего пути введения, подходящего для лекарственной формы. Способ введения особенно не ограничен. А именно, может быть выбрано внутреннее применение, наружное применение или инъекция. Инъекции могут вводиться, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно или интрадермально. Препараты для наружного применения включают суппозитории.

Доза канцеростатического лекарственного средства данного изобретения особенно не конкретизируется, но она может определяться в зависимости от лекарственной формы, способа введения, цели использования, и возраста, веса тела, состояний и т.д. пациента. В общем, доза может быть определена так, чтобы взрослый пациент получал от 1 до 1000 мг/день, предпочтительно от 10 до 200 мг/день, активного ингредиента. Само собой разумеется, доза варьируется в зависимости от различных факторов. Так, в некоторых случаях достаточно использовать дозу меньше, чем вышеупомянутый уровень, а в других случаях требуется доза, превышающая вышеупомянутый уровень. Лекарственное средство данного изобретения можно применять орально, как таковое. Альтернативно, его можно добавлять в произвольную пищу или питье для каждодневного потребления.

Сульфированные фукозусодержащие полисахариды и продукты их расщепления согласно данному изобретению являются веществами природного происхождения и они не проявляют токсичности при оральном введении мышам.

Лекарственные средства данного изобретения, как ожидают, могут быть использованы в качестве лечебных средств при инфекционных заболеваниях, иммунной депрессии, гипериммунности, рака, вирусных заболеваний и т.п. Также, их можно использовать для предупреждения образования злокачественной опухоли, поддерживая состояние здоровья. Способ индуцирования апоптоза данного изобретения используют, например, для изучения механизмов биологической защиты, иммунных функций и отношений к злокачественному новообразованию и вирусным заболеваниям, или разработки индукторов апоптоза. В частности, сульфированные фукозусодержащие полисахариды и продукты их расщепления согласно данному изобретению, полученные из съедобных бурых водорослей или морского огурца, которые принимали в виде пищи на протяжении длительного времени, являются высоко безопасными при оральном применении.

Вследствие высоких молекулярных масс сульфированных полисахаридов, сульфирован ные фукозусодержащие полисахариды не могут быть использованы, как таковые, в качестве лекарственных средств, но их можно подвергнуть расщепления до некоторой степени, увеличив тем самым их антигенность, гомогенность, антикоагулянтную активность и т.д. Данное изобретение обеспечивает фермент, способный селективно деградировать только сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, и продукты расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, полученные обработкой сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р этим ферментом.

Штамм, подлежащий использованию в данном изобретении, может представлять любой А11еготоиак, поскольку он может продуцировать фермент, расщепляющий эндсульфированный фукозусодержащий полисахарид. В качестве конкретного примера штамма, способного продуцировать фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, можно указать АИеготоиак кр. §А-1009. Продукты расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р данного изобретения можно получить обработкой сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р ферментом, расщепляющим эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, происходящим от этого штамма.

Этот штамм, который впервые был выделен настоящими изобретателями из морской воды в Аотоп, имеет следующие микологические свойства.

а. Морфологические свойства (1) Стержень;

ширина: приблизительно 1 мкм длина: приблизительно 2 мкм (2) Спора: нет (4) Грам-прокрашивание: - (5) Ь. Физиологические свойства (1) Область температур роста: соответствующий диапазон температур роста составляет от 15 до 30°С, не способен расти при 4°С или 40°С.

(2) Отношение к кислороду: аэробный (3) Каталаза: + (4) Оксидаза: + (5) Липаза: + (6) Метаболизм глюкоза: + манноза: сахароза: + лактоза: целлобиоза: + мелибиоза: маннит: + глицерин: + метанол: ОЬ-яблочная кислота: янтарная кислота: фумаровая кислота: лимонная кислота: салицин: - (7) Гидролиз крахмал: желатин: - (8) Восстановление нитрата: - (9) Денитрификация: - (10) Разложение альгиновой кислоты: + (11) Утилизация β-гидроксимасляной кислоты: - (12) Аккумуляция полигидроксимасляной кислоты: - (13) Потребность в натрии: + (14) Потребность в солевой среде

Рост в свободной от №1С1 среде: Рост в 1% №1С1 среде: Рост в среде морской воды: + (15) Хинон : убихинон 8 (16) ОС содержание во внутриклеточной ДНК: 36% (17) ОР-тест: О (18) Цвет колонии: нет образования характерного пигмента (19) Яркость: - (20 Подвижность: + (21) Жгутик: полярный монотрихат

Согласно классификации, описанной в Вегдау'к Маииа1 о Г §ук!етайс Вас1епо1оду, 1, 343-352 (1984) и Вегдау'к Маииа1 оГ Ое1егттайуе Вас1епо1о§у, 9 75, 132-133 (1994), этот штамм идентифицирован как бактерия, принадлежащая роду АЙеготоиак. Однако физиологические свойства этого штамма не соответствуют ни одной из бактерий, описанных там. Также он показывает низкое ОС содержание. Таким образом, его называют АЙеготоиак кр. §N-1009.

Вышеуказанный штамм идентифицируют как АЙеготоиак кр. §N-1009 и он депонирован в №йоиа1 1икй1и1е оГ Вюкаеисе аий НитаиТесйио1оду (1-3, Нщак1н 1-сНоте, ТкикиЬа-кЫ, 1Ьагак1-кеи 305, 1ΛΡΛΝ) под регистрационным номером РЕКМ Р-15436 с 13 февраля 1996 г. и депонирован в №йоиа1 1икй1и1е о£ Вюкаеисе аий Нитаи-Тесйио1о§у, как описано выше, под регистрационным номером РЕКМ ВР-5747 (причем перенос в международное депонирование запрошен 15 ноября 1996 г.).

Питательные вещества, подлежащие добавлению к среде для инкубирования этого штамма, могут быть произвольными питательными веществами, поскольку штамм может их утилизировать, продуцируя фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения. Соответствующие примеры источника углерода включают сульфированные фукозусодержащие полисахариды, порошок морских водорослей, альгиновую кислоту, фукозу, галактозу, глюкозу, маннит, глицерин, сахарозу и мальтозу, в то время как примеры источника азота включают дрожжевой экстракт, пептон, касамино (сакаинпо) кислоты, экстракт замоченной кукурузы, мясной экстракт, обезжиренная соя, сульфат аммония и хлорид аммония. Кроме того, среда может содержать неорганические вещества и соли металлов, такие как соли натрия, фосфаты, соли калия, соли магния и соли цинка.

Кроме того, этот штамм растет очень хорошо в морской воде или искусственной морской воде, содержащей вышеуказанные питательные вещества.

При инкубации штамма, продуцирующего фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения, выход варьируется в зависимости от условий инкубации. Вообще говоря, максимальный выход фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, может быть достигнут инкубацией штамма при температуре от 15 до 30°С и при значении рН среды от 6 до 9 в условиях аэрации/перемешивании в течение от 5 до 72 ч.

Не говоря уже о том, что условия инкубации должны подбираться в зависимости от используемого штамма, состава среды, и т.д. для того, чтобы выход фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения мог достичь максимального уровня.

Фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения содержится как в клетках, так и в культуральном супернатанте.

Вышеупомянутый АДеготопак 8р. 8Ν-1009 инкубируют в соответствующей среде и клетки собирают и разрушают способом, обычно используемым для разрушения клеток, таким как обработка ультразвуком. Таким образом получают свободный от клеток экстракт.

В дальнейшем, экстракт очищают при помощи техники очистки, обычно используемой в данной области, получая тем самым препарат очищенного фермента. Например, очистку можно осуществлять путем обессоливания, ионообменной хроматографии, колоночной хроматографии с гидрофобными носителем, гельфильтрации или т.п., получая при этом очищенный фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения, свободный от какой-либо другой фукоиданазы.

Культуральный супернатант, полученный путем удаления клеток из вышеупомянутой культуральной среды, кроме того, содержит большое количество этого фермента, который можно очистить теми же самыми способами, как способы, применяемые для очистки внутриклеточного фермента.

Химические и физико-химические свойства фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения являются следующими:

(ί) функция: действие на сульфированные фукозусодержащие полисахариды, имеющие следующие физико-химические свойства, т.е., на сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р и деградация этого сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р:

(a) составляющий сахарид: в основном, свободный от уроновой кислоты; и (b) в основном, неспособные расщепляться фукоиданазой, продуцируемой Р1ауоЬас1егшт 8р. 8А-0082 (РЕКМ ВР-5402);

но отсутствие действия на сульфированные фукозусодержащие полисахариды, имеющие следующие физико-химические свойства, т.е., на сульфированный фукозусодержащий полисахарид-И:

(c) составляющий сахарид: содержащий уроновую кислоту; и (б) будучи деградированными фукоиданазой, продуцируемой Р1а-уоЬас1егшт 8р. 8А-0082 (РЕКМ ВР-5402), образуют, по крайней мере, одно из соединений, выбранных из соединений, представленных нижеследующими формулами (I), (II) и (III):

(и) оптимальное значение рН: находится в диапазоне от приблизительно рН 7 до 8 (фиг. 20).

Фиг. 20 представляет график, который показывает взаимосвязь между относительной активностью этого фермента и рН значением, где ордината соответствует относительной активности (%), в то время как абсцисса соответствует рН значению. Сплошную линию получают, используя сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р с РА- редуцированным концом (РА-РР) в качестве субстрата, в то время как пунктирную линию получают, используя сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, как будет описано в (У)-(2) в дальнейшем, в качестве субстрата.

(ΐϊϊ) оптимальная температура: находится в диапазоне от приблизительно 30 до 35°С (фиг. 21).

Фиг. 21 представляет график, который показывает взаимосвязь между относительной активностью этого фермента и температурой, где ордината соответствует относительной активности (%), в то время как абсцисса соответствует температуре (°С). Сплошную линию получают, используя сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р с РА-редуцированным концом (РА-РР) в качестве субстрата, в то время как пунктирную линию получают, используя сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, как будет описано в (У)-(2), как будет описано в дальнейшем, в качестве субстрата.

(ίν) молекулярная масса: молекулярная масса этого фермента, определенная гельфильтрацией с использованием 8ерйасгу1 8-200 (произв. РНагтааа). составляет приблизительно 100 000.

(ν) способ измерения ферментативной активности.

Активность фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения измеряют следующим способом.

Сначала, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р и РА-РР, служащие в качестве субстрата фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения, получают в нижеследующих стадиях (1)-(3).

(1) Получение смеси К]е11таше11а сгаххбо11а сульфированных фукозусодержащих полисахаридов:

кг сухих К]е11таше11а сгакхлГоНа измельчают с помощью мельницы Мобе1 М-2 -(произв. №па К1ка1 8е1хаких1ю) и обрабатывают 4,5 объемами 80% этанола при 80°С в течение 2 ч. Затем фильтруют и остаток подвергают вышеуказанным процедурам, т.е. экстракции 80% этанолом и фильтрации трижды, получая тем самым 1,870 г остатка после промывания спиртом. К этому остатку добавляют 36 л воды и смесь подвергают обработке при 100°С в течение 2 ч и затем фильтруют, получая тем самым экстракт. Концентрацию соли в экстракте доводят до того же уровня, что и концентрация 400 мМ раствора хлорида натрия. Затем 5% цетилпиридиний хлорида добавляют туда до тех пор, пока осадок больше не образуется. После центрифугирования, осадок повторно промывают 80% этанолом для того, чтобы полностью удалить цетилпиридиний хлорид. Затем, его растворяют в 3 л 2М раствора хлорида натрия. После удаления не растворимых веществ центрифугированием, 100 мл ОЕАЕ-С’е11и1оПпе А-800, уравновешенной 2М хлоридом натрия, суспендируют в нем. Суспензию перемешивают и затем фильтруют, чтобы удалить смолу. Фильтрат подают в 100 мл ПЕАЕ-Себшойпе А-800 колонку, уравновешенную 2М хлоридом натрия, и фракцию, проходящую через нее, обессоливают и вещества с низкой молекулярной массой удаляют оттуда, используя ультрафильтрационную мембрану (исключение мембраной молекулярной массы: 100000). Полученный таким образом осадок удаляют центрифугированием. Супернатант сушат вымораживанием, получая 82,2 г очищенной смеси К]е11таше11а сгакхаГойа сульфированных фукозусодержащих полисахаридов.

(2) Получение сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р:

г вышеупомянутой смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящей от К)е11ташеба сгакыГойа, растворяют в 600 мл 20 мМ ацетата натрия (рН 6,0), содержащего 0,2М хлорида кальция. Затем раствор подают в 3600 мл 0ЕАЕ-8ерНагохе РР колонку, предварительно уравновешенную 20 мМ ацетата натрия (рН 6,0), содержащего 0,2М хлорида натрия. Затем колонку тщательно промывают 20 мМ ацетата натрия (рН 6,0), содержащего 0,2М хлорида кальция, и выделяют элюированием с линейным градиентом хлорида натрия от 0 до 2М.

Фракции сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, элюированные при концентрации хлорида натрия 0,75М и выше, собирают и обессоливают, используя ультрафильтр, снабженный ультрафильтрационной мембраной с исключением по молекулярной массе 100 000.

После сушки вымораживанием получают 3,3 г высушенного вымораживанием препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р.

(3) Получение РА-РР:

мг вышеупомянутого высушенного вымораживанием препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р растворяют в 480 мкл воды и 12-мкл порции полученного раствора пипетируют в 36 трубок. После высушивания вымораживанием редуцированный конец пиридил-(2)-аминируют (РА), используя 61усоТА6 и 61усоТА6 Кеадеп! Кб, получая тем самым РА-РР. Полученный таким образом РАРР растворяют в 10 мМ растворе ацетата аммония, содержащем 15 мл 10% метанола и подвергают гель фильтрации, используя Се11и1ойпе ССЬ-300 колонку (40 х 900 мм). Высокомолекулярные фракции собирают и обессоливают, тщательно диализуя с использованием мембраны для диализа с размером пор 3500. Затем, это концентрируют до 5 мл с помощью испарителя, получая тем самым РА-РР, подлежащий использованию в качестве субстрата фермента, расще пляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е данного изобретения.

Количество РА-ЕЕ, полученного таким образом, определяют как приблизительно 40 нмоль путем сравнения с интенсивностью флуоресценции меченой пиридил-(2)-аминированной фукозы (произв. Такага Б1игео Со., Ыб.; длина волны возбуждения: 320 нм, длина волны флуоресценции: 400 нм).

Используя сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е, полученный с помощью вышеупомянутых стадий (1) и (2), активность фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е, данного изобретения определяют следующим образом.

А именно, 12 мкл 2,5% раствора сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е, 6 мкл 1М раствора хлорида натрия, 12 мкл 1М раствора хлорида натрия, 72 мкл буфера (рН 7,5), содержащего 50 мМ уксусной кислоты, имидазол и Трис гидрохлорид, и 18 мкл фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е данного изобретения смешивают вместе и подвергают взаимодействию при 30°С в течение 3 ч. Затем реакционную смесь обрабатывают при 100°С в течение 10 мин и центрифугируют. Затем степень расщепления измеряют, анализируя 100мкл порцию реакционной смеси методом ВЭЖХ.

В качестве контролей можно использовать реакционную смесь, полученную тем же самым способом, но заменяя фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения буфером, используемым для растворения фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения в нем, и другую реакционную смесь, полученную тем же самым способом, но заменяя раствор сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е только водой. Эти контроли также анализируют с помощью ВЭЖХ.

Количество фермента, с помощью которого фукозильные связи в 1 мкмоль сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е можно расщепить за 1 мин, принимают за одну Е. Расщепленные таким образом фукозильные связи рассчитывают согласно следующему уравнению:

Активность (Е/мл) == {(12 х 2,5)/(100 х МЕ)}х{(МЕ/М)-1}х{0,12/(180 х0,01)} (12х2,5/100): сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е (мг), добавленный к реакционной системе;

МЕ: средняя молекулярная масса субстрата (сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е);

М: средняя молекулярная масса реакционного продукта;

(МЕ/М) -1: число расщеплений ферментом в одной молекуле сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е;

180: время реакции (мин);

0,01: объем (мл) раствора фермента; и

0,12: объем (мл) всей реакционной смеси. ВЭЖХ осуществляют в следующих условиях:

установка: модель Ь-6200 (произв. НйасЫ, Ыб.);

колонка: ОНраск ΚΒ-8 04 (8 мм х 300 мм, произв. Б1ю\\'о Эепко Κ.Κ.);

элюент: 25 мМ имидазольный буфер (рН 8), содержащий 5 мМ азида натрия, 25 мМ хлорида кальция и 50 мМ хлорида натрия;

детектирование: дифференциальный рефрактометрический детектор (БЬобех ΚΙ-71, произв. Б1ю\\'а Эепко Κ.Κ.);

скорость потока: 1 мл/мин;

температура колонки: 25°С

Чтобы измерить среднюю молекулярную массу продукта реакции, пуллулан (ри11и1ап) с известной молекулярной массой (Стандарт Р-82, произв. Б1ю\\'а Эепко Κ.Κ.) анализируют методом ВЭЖХ в тех же самых условиях, как условия, описанные выше. Затем, получают кривую, показывающую взаимосвязь между молекулярной массой пуллулана и временем удерживания на ОНраск КВ-804 и ее применяют в качестве стандартной кривой для определения молекулярной массы вышеупомянутого продукта ферментативной реакции.

Используя РА-ЕЕ, полученный в вышеописанных стадиях (1)-(3), определяют активность фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения следующим способом.

А именно, 2 мкл 8 пмоль/мкл раствора РаЕЕ, 5 мкл 1М раствора хлорида кальция, 10 мкл раствора 1М хлорида натрия, 23 мкл воды, 50 мкл буфера (рН 8,2), содержащего 50 мМ уксусной кислоты, имидазол и Трис гидрохлорид, и 10 мкл фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения смешивают вместе и подвергают взаимодействию при 30°С в течение 3 ч. Затем реакционную смесь обрабатывают при 100°С в течение 10 мин и центрифугируют. Затем степень расщепления измеряют методом ВЭЖХ, используя 80 мкл полученного таким образом образца.

В качестве контролей можно использовать реакционную смесь, полученную тем же самым способом, но заменяя фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид данного изобретения, буфером, используемым для растворения фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид данного изобретения в нем, и другую реакционную смесь, полученную тем же самым способом, но заменяя РА-ЕЕ раствор только водой. Эти контроли также анализируют с помощью ВЭЖХ.

Количество фермента, с помощью которого фукозильные связи в 1 мкмоль сульфированного фукозусодержащего полисахарида можно расщепить за 1 мин, принимают за одну Е. Расщепленные таким образом фукозильные связи рассчитывают согласно следующему уравнению:

Активность (Е/мл) = х 10^-6х{(МР/М)-1}х{1/(180х0,01)} х 10^-6: количество (мкмоль) РА-РР, добавленного к реакционной системе;

МР: средняя молекулярная масса субстрата (сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р);

М: средняя молекулярная масса реакционного продукта;

(МР/М) -1: число расщеплений ферментом в одной молекуле сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р;

180: время реакции (мин); и

0,01: объем (мл) раствора фермента.

ВЭЖХ осуществляют в следующих условиях:

установка: модель Ь-6200 (произв. НйасЫ, Ыб.);

колонка: ОНраск 8В-803 (8 мм х 300 мм, произв. 81ιο\\ό Бепко К. К.);

элюент: 200 мМ раствор хлорида натрия, содержащий 5 мМ азида натрия и 10% диметилсульфоксида;

детектирование: флуорометрический детектор Р-1150 (произв. НйасЫ, Ь!б.), длина волны возбуждения: 320 нм, длина волны флуоресценции: 400 нм;

скорость протока: 1 мл/мин; и температура колонки: 50°С.

Чтобы измерить среднюю молекулярную массу продукта реакции, редуцированный конец меченого пуллулана с известной молекулярной массой (Стандарт Р-82, произв. 81ю\\'а Бепко К.К.) пиридил-(2)-аминируют (РА), используя С1усоТАС и С1усоТАС КеадегИ Κίΐ, получая тем самым РА-пуллуланы различных молекулярных масс. Эти РА-пуллуланы различных молекулярных масс анализируют методом ВЭЖХ в тех же самых условиях, как условия, описанные выше. Затем, получают кривую, показывающую взаимосвязь между молекулярной массой пуллулана и временем удерживания на ОНраск 8В-803 и применяют в качестве стандартной кривой для определения молекулярной массы вышеупомянутого продукта ферментативной реакции.

Белок определяют путем измерения поглощения раствора фермента при 280 нм. Расчет проводят, принимая поглощение 1 мг/мл раствора белка за 1,0.

Изобретателями был выяснен механизм действия фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения следующим способом.

(1) Деградация сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р ферментом, расщепляющим эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, и получение продукта расщепления: Очищенный сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, происходящий от К)е11таше11а сга^мГойа. обрабатывают ферментом, расщепляющим эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения, тем самым получая продукты его расщепления.

Сначала получают фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид. А именно, А1!еготопа§ §р. 8Ν1009 (РЕКМ ВР-5747) инокулируют в 600 мл среды, содержащей искусственную морскую воду (рН 8,2, произв. 1атапп ЬаЬога!огу), содержащую 0,25% глюкозы, 1,0% пептона и 0,05% экстракта дрожжей, которую пипетируют в 2-х литровую колбу Эрленмейера и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин. Затем штамм инкубируют в ней при 25°С в течение 26 ч, получая посевную культуру. В 30-ти литровый ферментер подают 20 л среды, включающей искусственную морскую воду (рН 8,0), содержащую 1,0% пептона, 0,02% экстракта дрожжей, 0,2% вышеупомянутого сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, происходящего от К)е11таше11а сгакДГойа, и 0,01% противовспенивающего средства (КМ70, произв. 81ιίπ-Εΐ5ΐι С11етюа1 Со., Иб.), и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин. После охлаждения, среду инокулируют с 600 мл вышеупомянутой посевной культурой, которую затем инкубируют при 24°С в течение 24 ч в условиях аэрации при скорости 10 л/мин и перемешивании при 250 об/мин. После завершения инкубации, культуральную среду центрифугируют, получая клетки и культуральный супернатант. Полученный таким образом культуральный супернатант концентрируют с помощью ультрафильтра, исключающего фракцию с молекулярной массой 10000 и высаливают, используя 85% сульфат аммония. Полученный таким образом осадок собирают центрифугированием и тщательно диализуют против 20 мМ Трис гидрохлорид буфера (рН 8,2), содержащего искусственную морскую воду, разбавленную в 10 раз. Таким образом получают 600 мл неочищенного фермента.

мл полученного таким образом неочищенного фермента, 44 мл искусственной морской воды, 510 мг вышеупомянутого сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р и 36 мл воды смешивают вместе и рН смеси доводят до 8. После взаимодействия при 25°С в течение 48 ч, реакционную смесь подвергают гель-фильтрации, используя Се11и1оГте ССЬ300 и таким образом разделяют на четыре фракции, которые называют, в порядке молекулярной массы, как Р-Рб-1 (молекулярная масса: более чем 25000), Р-Рб-2 (молекулярная масса: 12000-25000), Р-Рб-3 (молекулярная масса: 6500-12000) и Р-Рб-4 (молекулярная масса: 6500 или менее). Эти фракции обессоливают и сушат вымораживанием, получая 170, 270, 300 и 340 мг сухих препаратов, соответственно.

Фиг. 22 показывает результаты гельфильтрации с помощью Се11и1ойпе ССЬ-300 продуктов ферментативного переваривания сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, т.е., продуктов расщепления. На фиг. 22 ордината соответствует поглощению при 480 нм (развитие окраски определялось фенолсернокислотным методом), в то время как абсцисса соответствует номеру фракции. Каждая фракция имеет 10 мл элюата. Колонка имеет объем 1 075 мл и в качестве элюента используют 0,2М раствор ацетата аммония, содержащего 10% этанола.

На фиг. 22 незаполненный кружок показывает результат гель-фильтрации сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, который был подвергнут расщеплению ферментом, в то время как сплошной треугольник относится к результатам гель-фильтрации сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р до ферментативного расщепления.

Вышеупомянутые результаты Се11и1ойпе ССй-300 гель-фильтрации указывают, что продукт реакции фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения демонстрирует молекулярно-массовое распределение в пределах от 1 000 до 30 000.

(2) Анализ на сахарид с редуцированным концом и состав нейтральных сахаридов в продукте ферментативной реакции:

Порцию каждой из вышеупомянутых Р-Рб1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4 отбирают на пробу и редуцированный конец их пиридил-(2)аминируют (РА), используя набор реагентов С1усоТА6 и 61усоТА6 йеадеп! Кй. Полученные таким образом (РА-Р-Рб-1), (РА-Р-Рб-2), (РА-РРб-3) и (РА-Р-Рб-4) гидролизуют, обрабатывая 4Ν хлористо-водородной кислотой при 100°С в течение 3 ч и сахариды с редуцированным концом исследуют ВЭЖХ.

ВЭЖХ осуществляют в следующих условиях:

установка: модель Ь-6200 (произв. НйасЫ, Ыб.);

колонка: РАЬРАК Туре А (4,6 мм х 150 мм, произв. Такага Мшхо Со., Иб.);

элюент: 700 мМ боратный буфер (рН 9,0) : ацетонитрил =9 :1;

детектирование: флуорометрический детектор Р-1150 (произв. НйасЫ, Ыб.), длина волны возбуждения: 310 нм, длина волны флуоресценции: 380 нм;

скорость потока: 0,3 мл/мин; температура колонки : 65°С.

В результате обнаружено, что (РА-Р-Рб-1), (РА-Р-Рб-2), (РА-Р-Рб-3) и (РА-Р-Рб-4) -все несут фукозу в виде сахарида с редуцированным концом.

Кроме того, составы нейтральных сахаридов Р-Рб-1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4 определяют следующим способом. Используемый в качестве субстрата сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р гидролизуют серной кислотой и редуцированные концы составляющих сахаридов его пиридил-(2)-аминируют (РА), используя набор реагентов 61усоТА6 и 61усоТА6 йеадеп! Кй, и затем анализируют при помощи ВЭЖХ в тех же самых условиях, что используют при анализе вышеуказанных продуктов. В результате обнаружены только фукоза и галактоза, имеющие Ь- и Ό-конфигурации, соответственно. Таким образом, в отношении продуктов (ферментативной реакции) рассматриваются только Ь-фукоза и Ό-галактоза.

А именно, содержание Ό-галактозы, которая является одним из составляющих сахаридов, определяют следующим способом. Используя РКй Лактоза/Галактоза (произв. Воейппдег Маппйеш-УатапоисЫ), в соответствии с описанием производителя конструируют реакционную систему, с помощью которой можно определить только Ό-галактозу. Раздельно Р-Рб-1, РРб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4 гидролизуют 4Ν хлористоводородной кислотой при 100°С в течение 2 ч и, после нейтрализации, подвергают определению в этой реакционной системе.

С другой стороны, содержание Ь-фукозы, которая является другим составляющим сахаридом, определяют следующим способом. В соответствии со способом, описанным в Сйшса1 СйетЫгу, 36, 474-476 (1990), Р-Рб-1, Р-Рб-2, РРб-3 и Р-Рб-4 гидролизуют 4Ν хлористоводородной кислотой при 100°С в течение 2 ч и после нейтрализации подвергают определению в этой реакционной системе.

В результате обнаружено, что Р-Рб-1, Р-Рб2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4 показывают отношение Ьфукозы к Ό-галактозе 100:44, 100:27, 100:5 и 100:1, соответственно.

Эти результаты можно суммировать следующим образом. Фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения действует на сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р и гидролизует фукозильные связи, тем самым образуя продукты расщепления с молекулярной массой приблизительно от 1000 до 30000. Среди этих продуктов расщепления продукт, имеющий более высокую молекулярную массу, показывает большее содержание галактозы. Все эти продукты расщепления имеют Ьфукозу в качестве редуцированного конца.

Затем, исследуют специфичность субстрата этого фермента путем обработки сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и ферментом, расщепляющим эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения.

А именно, 12 мкл 2,5% раствора сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и, мкл 1М раствора хлорида кальция, 12 мкл 1М раствора хлорида натрия, 72 мкл 50 мМ имидазольного буфера (рН 7,5) и 18 мкл фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения (1,6 мЕ/мл) смешивают вместе и подвергают взаимодействию при 30 °С в течение 3 ч. Затем реакционную смесь обрабатывают при 100°С в течение 10 мин и центрифугируют. Затем измеряют степень расщепления, анализируя 100-мкл порцию реакционной смеси методом ВЭЖХ.

В качестве контроля можно использовать реакционную смесь, полученную тем же самым способом, но заменяя в ней фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения буфером, используемым для растворения фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения. Этот контроль также анализируют с помощью ВЭЖХ.

ВЭЖХ осуществляют в следующих условиях:

установка: модель Ь-6200 (произв. НйасЫ, Ыб.);

колонка: ОНраск КВ-8 04 (8 мм х 300 мм, произв. 81ю\уо Эепко К. К.);

элюент: 25 мМ имидазольный буфер (рН 8), содержащий 5 мМ азида натрия, 25 мМ хлорида кальция и 50 мМ хлорида натрия; детектирование: дифференциальный рефрактометрический детектор (8йобех К1-71, произв. 81ю\\'а Эепко К. К.);

скорость протока: 1 мл/мин; температура колонки: 25°С.

В результате, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и совсем не деградируется ферментом, расщепляющим эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения.

Как описано выше, данное изобретение относится к ферментативной композиции, содержащей вышеуказанный фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, и источник кальция.

Примеры источника кальция, который может быть использован в твердой композиции, включают соли кальция, такие как хлорид кальция, карбонат кальция, ацетат кальция, оксид кальция, гидроксид кальция и их гидраты. В жидкой композиции, где источник кальция растворен, суспендирован или эмульгирован в растворителе, таком как вода или спирт, с другой стороны, источник кальция может быть либо таким соединением, как цитированные выше, либо соединением, способным ионизоваться, например, при растворении.

Эти источники кальция являются эффективными в активации или стабилизации фермента.

Соответственно, вышеупомянутая ферментативная композиция может дополнительно содержать добавки, обычно используемые в данной области в зависимости от цели, пока при этом не ухудшаются вышеупомянутые действия источника кальция.

Продукты расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е можно получить путем обработки вещества, содержащего сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е, ферментом, расщепляющим эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения, в качестве вещества, содержащего сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е, можно использовать, например, очищенный продукт сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е, вышеуказанную смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов или экстракт бурых водорослей с водным растворителем. Вещество, содержащее сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е, можно растворить стандартным способом. Хотя сульфированные фукозусодержащие полисахариды могут быть растворены в растворе при наивысшей концентрации, концентрацию обычно подбирают, учитывая способность к обработке и титр фермента.

Растворитель для раствора сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е может быть соответственно выбран из воды, буферов и т. п., в зависимости от цели. рН раствора обычно находится внутри области нейтрального рН и ферментативную реакцию обычно осуществляют при приблизительно 30°С. Молекулярную массу продуктов расщепления можно регулировать, контролируя количество фермента, время реакции и т.д.

Затем, продукты расщепления подвергают фракционированию по молекулярным весам, получая тем самым продукты расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е с более равномерным распределением молекулярной массы. Фракционирование по молекулярной массе можно осуществлять, применяя обычно используемые техники, такие как гель-фильтрация или использование мембраны для фракционирования по молекулярной массе. При необходимости, продукты расщепления могут быть дополнительно подвергнуты очистке, например, с помощью ионообменной смолы или активированного угля. Если требуется, продукты расщепления могут быть также обессолены, стерилизованы и высушены вымораживанием с получением сухого препарата продуктов расщепления данного изобретения.

Примеры

Далее, для иллюстрации данного изобретения более подробно, а не с целью ограничения, приводятся нижеследующие примеры, в которых процентные отношения даны по весу.

Пример 1.

кг тщательно высушенной К)е11таше11а сга551&11а размалывают при помощи мельницы (произв. №па К1ка1 8е15аки5ко). Полученный таким образом сухой порошок суспендируют в 9 л 80% этанола и обрабатывают при 80°С в течение 2 ч. Затем смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, получая тем самым осадок. Этот осадок повторно промывают этанолом и фильтруют трижды таким же способом, как описано выше, получая остаток после промывания этанолом. Этот остаток суспендируют в 40 л воды, обрабатывают при 95°С в течение 2 ч и фильтруют. Остаток промывают горячей водой, получая тем самым 36 л экстракта, содержащего сульфированные фукозу содержащие полисахариды К)е11таше11а сга55Йо11а. 1,8 л полученного таким образом экстракта сушат вымораживанием, получая тем самым 15,4 г препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида. К оставшемуся экстракту добавляют хлорид натрия, до получения концентрации 0,4М. Далее, туда добавляют 5% цетилпиридиний хлорид до тех пор, пока не прекратиться образование осадка. Затем осадки собирают центрифугированием и суспендируют в 3 л 0,4М водного раствора хлорида натрия с последующим центрифугированием и промывкой. После трехкратного повторения этой процедуры промывки, к осадку добавляют 1 л 4М водного раствора хлорида натрия. После хорошего перемешивания, туда добавляют этанол, получая концентрацию 80%. Затем смесь перемешивают и центрифугируют, получая тем самым осадок. Осадок суспендируют в 80% этаноле и центрифугируют. Эти процедуры повторяют до тех пор, пока поглощение супернатанта при 260 нм не достигнет 0. Осадок растворяют в 3 л 2М водного раствора хлорида натрия. После удаления нерастворимых веществ центрифугированием, туда добавляют 100 мл 0ЕАЕ-Се11и1оПпе А-800 (произв. 8е1кадаки Кодуо), уравновешенной 2 М водным раствором хлорида натрия. Далее, добавленную выше смолу удаляют фильтрацией. Фильтрат подают в ОЕАЕ-Се11и1оПпе А-800 колонку, уравновешенную 2 М водным раствором хлорида натрия, и неадсорбированную фракцию подвергают ультрафильтрации, используя ультрафильтр, снабженный полыми волокнами с исключением молекулярной массы 100 000, тем самым полностью удаляя окрашивающие вещества и хлорид натрия. Далее, нерастворимые вещества удаляют центрифугированием с последующей фильтрацией и сушкой вымораживанием. Высушенная вымораживанием смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов весит 76 г.

Пример 2.

кг тщательно высушенной Ьат1папа _)арошса размалывают при помощи мельницы (произв. №га К1ка1 8е15аки5Йо). Полученный таким образом сухой порошок суспендируют в 9 л 80% этанола и обрабатывают при 80°С в тече ние 2 ч. Затем смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, получая тем самым осадок. Этот осадок повторно промывают этанолом и фильтруют трижды таким же способом, как описано выше, получая тем самым остаток после промывания этанолом. Этот остаток суспендируют в 40 л воды, обрабатывают при 95°С в течение 2 ч и фильтруют. Остаток промывают горячей водой, получая тем самым 36 л экстракта, содержащего сульфированные фукозусодержащие полисахариды Ьаттапа )арошса. К экстракту добавляют хлорид натрия, получая концентрацию 0,4М. Далее туда добавляют 5% цетилпиридиний хлорид до тех пор, пока не прекратиться образование осадка. Затем осадки собирают центрифугированием и суспендируют в 3 л 0,3М водного раствора хлорида натрия с последующим центрифугированием и промывкой. После трехкратного повторения этой процедуры промывки, к осадку добавляют 1 л 4М водного раствора хлорида натрия. После хорошего перемешивания, туда добавляют этанол, получая концентрацию 80%. Затем смесь перемешивают и центрифугируют, получая тем самым осадок. Осадок суспендируют в 80% этаноле и центрифугируют. Эти процедуры повторяют до тех пор, пока поглощение супернатанта при 260 нм не достигает 0. Осадок растворяют в 3 л 2 М водного раствора хлорида натрия. После удаления нерастворимых веществ центрифугированием, туда добавляют 100 мл ЬЕАЕСе11и1оДпе А-800 (произв. 8е1кадаки Кодуо), уравновешенного 2М водным раствором хлорида натрия и перемешивают. Далее, добавленную выше смолу удаляют фильтрацией. Фильтрат подают в ОЕАЕ-Се11и1оПпе А-800 колонку, уравновешенную 2М водным раствором хлорида натрия, и неадсорбированную фракцию подвергают ультрафильтрации, используя ультрафильтр, снабженный полыми волокнами с исключением молекулярной массы 100 000 или меньше, тем самым полностью удаляя окрашивающие вещества и хлорид натрия. Далее, нерастворимые вещества удаляют центрифугированием и фильтрацией с последующей сушкой вымораживанием. Высушенная вымораживанием смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов весит 52 г.

Пример 3. Экстракция смеси Ьаттапа )арошса сульфированных фукозусодержащих полисахаридов.

кг тщательно высушенной Ьаттапа _)арошса размалывают при помощи мельницы (произв. №иа К1ка1 8е15аки51ю). Полученный таким образом сухой порошок суспендируют в 9 л 80% этанола и обрабатывают при 80°С в течение 2 ч. Затем смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, получая тем самым осадок. Этот осадок повторно промывают этанолом и фильтруют трижды таким же способом, как описано выше, получая тем самым остаток после промывания этанолом. Этот остаток суспен дируют в 36 л 0,2М раствора ацетата кальция, обрабатывают при 95°С в течение 2 ч и фильтруют. Остаток промывают 4 л 0,2М раствора ацетата кальция, получая тем самым 36 л экстракта, содержащего сульфированные фукозусодержащие полисахариды Ьатшапа )арошса.

Пример 4. Приготовление смеси Ьатшапа )арошса сульфированных фукозусодержащих полисахаридов.

К фильтрату, полученному в примере 3, добавляют добавляют 5% цетилпиридиний хлорид до тех пор, пока не прекратиться образование осадка. Затем осадки собирают центрифугированием и суспендируют в 3 л 0,3М водного раствора хлорида натрия с последующим центрифугированием и промывкой. После трехкратного повторения этой процедуры промывки, к осадку добавляют 1 л 4М водного раствора хлорида натрия. После хорошего перемешивания, туда добавляют этанол, получая концентрацию 80%. Затем смесь перемешивают и центрифугируют, получая тем самым осадок. Осадок суспендируют в 80% этаноле и центрифугируют. Эти процедуры повторяют до тех пор, пока поглощение супернатанта при 260 нм не достигнет 0. Осадок растворяют в 3 л 2 М водного раствора хлорида натрия. После удаления нерастворимых веществ центрифугированием, туда добавляют 100 мл ОЕАЕ-Се11и1ойпе А-800 (произв. 8е1кадаки Кодуо), уравновешенной 2 М водным раствором хлорида натрия и перемешивают. Далее, добавленную выше смолу удаляют фильтрацией. Фильтрат подают в ЭЕЛЕСе11и1ойпе А-800 колонку, уравновешенную 2 М водным раствором хлорида натрия, и неадсорбированную фракцию подвергают ультрафильтрации, используя ультрафильтр, снабженный полыми волокнами с исключением молекулярной массы 100 000 или меньше, тем самым полностью удаляя окрашивающие вещества и хлорид натрия. Далее нерастворимые вещества удаляют центрифугированием с последующей фильтрацией и сушкой вымораживанием. Высушенная вымораживанием смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов весит 52 г. Эта смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов не содержит окрашивающегося вещества, адсорбированного смолами.

Пример 5.

Четыре порции по 1 г высушенной вымораживанием смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, описанной в примере 4, взвешивают и растворяют, соответственно, в воде, 0,2М хлориде натрия, 0,2М хлориде кальция и 0,2М хлориде магния. Затем, приготавливают четыре ПЕАЕ-§ерйагозе РР колонки объемом 500 мл. Две из этих колонок, уравновешивают 0,2М хлоридом натрия, в то время как другие две, соответственно, уравновешивают 0,2М хлоридом кальция и 0,2М хлоридом магния. Одну из колонок, уравновешенных 0,2М хлоридом натрия, промывают водой в количестве, в раз превышающем объем колонки. Затем, пробы смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, растворенной в воде, растворах хлорида натрия, хлорида кальция и хлорида магния, подают в ПЕАЕ-§ерйагозе РР колонки, которые уравновешивают, соответственно, водой, растворами хлорида натрия, хлорида кальция и хлорида магния. Затем, каждую колонку тщательно промывают раствором, применяемым для уравновешивания, и проявляют элюированием с линейным градиентом хлорида натрия от 0 до 4М. В результате, все смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов адсорбируются исключительно в системах с использованием хлорида кальция и хлорида магния. С другой стороны, сульфированные фукозусодержащие полисахариды адсорбируются только в небольшом количестве, соответствующем 0,4 г, колонками, уравновешенными водой и хлорида натрия.

В каждой колонке, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения, в основном, отделяется от сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и.

Пример 6.

кг тщательно высушенной К)е11таше11а сгаззбоНа размалывают при помощи мельницы (произв. №иа К1ка1 8е1закиз1ю). Полученный таким образом сухой порошок суспендируют в 9 л 80% этанола и обрабатывают при 80°С в течение 2 ч. Затем смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, получая тем самым осадок. Этот осадок повторно промывают этанолом и фильтруют трижды таким же способом, как описано выше, получая тем самым остаток после промывания этанолом. Этот остаток суспендируют в 36 л 0,2М раствора ацетата кальция, обрабатывают при 95°С в течение 2 ч и фильтруют. Остаток промывают 4 л 0,2М раствора ацетата кальция, получая тем самым 36 л экстракта, содержащего сульфированные фукозусодержащие полисахариды К)е11таше11а сгаззЕ £ойа.

Этот фильтрат концентрируют до 2 л с использованием ультрафильтра, снабженного ультрафильтрационной мембраной с исключением молекулярной массы 100 000. Затем, туда добавляют хлорид натрия, получая конечную концентрацию 1,5 М. Далее туда добавляют 5% цетилпиридиний хлорид до тех пор, пока не прекратиться образование осадка. Затем осадки собирают центрифугированием и полученный таким образом супернатант концентрируют до 1 л с помощью ультрафильтрации. После добавления 4 л этанола, полученные при этом осадки собирают центрифугированием. К этому осадку добавляют 100 мл 4М водного раствора хлорида натрия, а затем хорошо перемешивают. Затем туда добавляют этанол, получая концентрацию 80%, смесь перемешивают и центрифугируют. Полученный осадок суспендируют в 80% этаноле и центрифугируют. Эти процедуры повторя ют до тех пор, пока поглощение супернатанта при 260 нм не достигнет 0. Осадок растворяют в 2 л 2М водного раствора хлорида натрия. После удаления нерастворимых веществ центрифугированием, туда добавляют 50 мл ЭЕЛЕСе11и1о£те А-800 (произв. 8е1кадаки Кодуо), уравновешенной 2 М водным раствором хлорида натрия, и перемешивают. Далее, добавленную выше смолу удаляют фильтрацией. Фильтрат подают в ОЕАЕ-Се11и1оПпе А-800 колонку, уравновешенную 2 М водным раствором хлорида натрия, и неадсорбированную фракцию подвергают ультрафильтрации, используя ультрафильтр, снабженный полыми волокнами с исключением молекулярной массы 100 000 или меньше, тем самым полностью удаляя окрашивающие вещества и хлорид натрия. Далее, нерастворимые вещества удаляют центрифугированием и фильтрацией с последующей сушкой вымораживанием. Высушенный вымораживанием сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и весит 15 г. Этот сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и не содержит окрашивающего вещества, адсорбированного полисахаридными смолами.

После обработки вышеупомянутой эндофукоиданазой, этот сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и деградирует, давая тем самым олигосахариды, представленные вышеупомянутыми формулами (Ι), (ΙΙ) и (ΙΙΙ).

Пример 7.

кг тщательно высушенной К)е11таше11а сга88Йо11а размалывают при помощи мельницы (произв. №1га К1ка1 8ещаки5Йо). Полученный таким образом сухой порошок суспендируют в 9 л 80% этанола и обрабатывают при 80°С в течение 2 ч. Затем смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, получая тем самым осадок. Этот осадок повторно промывают этанолом и фильтруют трижды таким же способом, как описано выше, получая тем самым остаток после промывания этанолом. Этот остаток суспендируют в 36 л 0,2М раствора ацетата кальция, обрабатывают при 95°С в течение 2 ч и фильтруют. Остаток промывают 4 л 0,2М раствора ацетата кальция, получая тем самым 36 л экстракта, содержащего сульфированные фукозусодержащие полисахариды К)е11таше11а сгазы£о11а. К полученному таким образом фильтрату добавляют 5% цетилпиридиний хлорид до тех пор, пока не прекратиться образование осадка. Затем осадки собирают центрифугированием и суспендируют в 3 л 0,4М водного раствора хлорида натрия с последующим центрифугированием и промывкой. После трехкратного повторения этой процедуры промывки, к осадку добавляют 1 л 4М водного раствора хлорида натрия и смесь хорошо перемешивают. Затем туда добавляют этанол, получая концентрацию 80%, и смесь перемешивают и центрифугируют, получая тем самым осадок. Полученный осадок суспендируют в 80% этаноле и центрифугиру ют. Эти процедуры повторяют до тех пор, пока поглощение супернатанта при 260 нм не достигнет 0. Осадок растворяют в 3 л 2М водного раствора хлорида натрия. После удаления нерастворимых веществ центрифугированием, туда добавляют 100 мл ПЕАЕ-Се11и1о£ше А-800 (произв. 8е1кадаки Кодуо), уравновешенной 2 М водным раствором хлорида натрия, и перемешивают. Далее, добавленную выше смолу удаляют фильтрацией. Фильтрат подают в ЭЕАЕСе11и1о£ше А-800 колонку, уравновешенную 2 М водным раствором хлорида натрия, и неадсорбированную фракцию подвергают ультрафильтрации, используя ультрафильтр, снабженный полыми волокнами с исключением молекулярной массы 100 000 или меньше, тем самым полностью удаляя окрашивающие вещества и хлорид натрия. Далее, нерастворимые вещества уделяют центрифугированием и фильтрацией с последующей сушкой вымораживанием. Высушенная вымораживанием смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов весит 90 г. Эта смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов не содержит окрашивающего вещества, адсорбированного полисахаридными смолами. Взвешивают 7 г этой смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов и растворяют в 0,2М хлориде кальция. Затем, 4 000 мл ПЕАЕ-8ерйаго5е РР колонку уравновешивают 0,2М хлоридом кальция. Сульфированную фукозусодержащую полисахаридную смесь, растворенную в 0,2М хлориде кальция, подают в ПЕАЕ-8ерЬаго5е РР колонку и тщательно промывают 0,2 М хлоридом кальция. Затем проявляют элюированием с линейным градиентом хлорида натрия от 0 до 4 М. Среди элюированных таким образом фракций, фракции, имеющие концентрацию от 0,05 до 0,8 М, объединяют, обессоливают диализом и затем сушат вымораживанием. Таким образом, получают 2,1 г сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и, в основном, отделенный от сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р.

Среди фракций, элюированных выше, фракции, имеющие концентрацию от 0,9 до 1,5М, объединяют, обессоливают диализом и затем сушат вымораживанием. Таким образом, получают 4,7 г сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, в основном, отделенного от сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и.

Пример 8. Получение сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р.

Взвешивают 1,2 г смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученной в примере 7, и растворяют в 1,5М растворе хлорида натрия так, чтобы получить конечную концентрацию 0,2%. Затем, туда добавляют 1,25% цетилпиридиний хлорида в 1,5М растворе хлорида натрия до тех пор, пока не прекратится образование осадка. Затем осадки собирают центрифугированием и суспендируют в 500 мл 1,5М водного раствора хлорида натрия с последующим центрифугированием и промывкой. После трехкратного повторения этой процедуры промывки, к осадку добавляют 1 л 4М водного раствора хлорида натрия и смесь хорошо перемешивают. Затем, туда добавляют этанол, получая концентрацию 80%, и смесь перемешивают и центрифугируют, получая тем самым осадок. Полученный осадок суспендируют в 80% этаноле и центрифугируют. Эти процедуры повторяют до тех пор, пока поглощение супернатанта при 260 нм не достигнет 0. Осадок растворяют в 500 мл 2М водного раствора хлорида натрия. После удаления нерастворимых веществ центрифугированием, туда добавляют 1 мл ΌΕΑΕСе11и1ойпе А-800 (произв. 8е1кадаки Кодуо), уравновешенной 2М водным раствором хлорида натрия, и перемешивают. Далее добавленную выше смолу удаляют фильтрацией. Фильтрат подают в ОЕАЕ-С’е11и1оПпе А-800 колонку, уравновешенную 2 М водным раствором хлорида натрия, и неадсорбированную фракцию подвергают ультрафильтрации, используя ультрафильтр, снабженный полыми волокнами с исключением молекулярной массы 100 000 или меньше, тем самым полностью удаляя окрашивающие вещества и хлорид натрия. Далее нерастворимые вещества удаляют центрифугированием с последующей фильтрацией и сушкой вымораживанием. Высушенный вымораживанием сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р весит 710 г. Этот сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р не содержит окрашивающего вещества, адсорбированного полисахаридными смолами. Этот сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р представляет сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения, который не содержит уроновую кислоту, и который содержит фукозу в качестве основного компонента составляющих сахаридов.

Пример 9. Способ ферментной очистки сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р.

Взвешивают 10 г смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученной в примере 7, и растворяют в 500 мл искусственной воды. Затем, туда добавляют 5 Е вышеупомянутой эндофукоиданазы, происходящей от Р1ауоЬас1егшт кр. БА-0082 (РЕЕМ ВР-5402) и подвергают взаимодействию при 25°С в течение 50 ч. Реакционную смесь ультрафильтруют через ультрафильтр, снабженный полыми волокнами с исключением молекулярной массы 100000 или меньше. После полного удаления веществ с низкой молекулярной массой, нерастворимые вещества удаляют центрифугированием и фильтрацией с последующей сушкой вымораживанием. Высушенный вымораживанием сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р весит 6 г. Этот сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р не содержит окрашивающего вещества, адсорбированного полисахаридными смолами. Найдено, что этот сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р представляет сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения, который не содержит уроновую кислоту,и который содержит фукозу в качестве основного компонента составляющих сахаридов.

Пример 10. Способ очистки сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р с помощью инкубации.

Взвешивают 60 г смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученной в примере 7, и растворяют в 20 л искусственной морской воды. Затем, туда добавляют 200 г пептона и 4 г дрожжевого экстракта. После введения в 30-ти литровый сосуд-ферментатор и стерилизации, содержимое инокулируют вышеупомянутым Р1ауоЬас1егшт кр. БА-0082 (РЕЕМ ВР-5402), и затем инкубируют при 25°С в течение 24 ч. После центрифугирования, чтобы удалить клетки, культуральную среду ультрафильтруют через ультрафильтр, снабженный полыми волокнами с исключением молекулярной массы 100 000 или меньше. После полного удаления веществ с низкой молекулярной массой, нерастворимые вещества удаляют центрифугированием и фильтрацией с последующей сушкой вымораживанием. Высушенный вымораживанием сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р весит 36 г. Этот сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р не содержит окрашивающего вещества, адсорбированного полисахаридными смолами. Найдено, что этот сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р представляет сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения, который не содержит уроновую кислоту, и который содержит фукозу в качестве основного компонента составляющих сахаридов.

Пример 11.

Четыре порции по 1 г высушенной вымораживанием смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, описанной в примере 7, взвешивают и растворяют, соответственно, в воде, растворах 0,2М хлорида натрия, 0,2М хлорида кальция и 0,2М хлорида магния. Затем, приготавливают четыре ЭЕАЕ-Берйагоке РР колонки объемом 500 мл. Две из этих колонок уравновешивают 0,2М хлоридом натрия, в то время как другие две, соответственно, уравновешивают 0,2М хлоридом кальция и 0,2М хлоридом магния. Одну из колонок, уравновешенных 0,2М хлоридом натрия, промывают количеством воды в 10 раз превышающем объем колонки. Затем, пробы смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, растворенной в воде, растворах хлорида натрия, хлорида кальция и хлорида магния, подают в ЭЕАЕ

8ер11аго8е РР колонки, которые уравновешивают, соответственно, водой, хлоридом натрия, хлоридом кальция и хлоридом магния. Затем, каждую колонку тщательно промывают раствором, применяемым для уравновешивания, и проявляют элюированием с линейным градиентом хлорида натрия от 0 до 4М. В результате, все смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов адсорбируются исключительно в системах с применением хлорида кальция и хлорида магния. С другой стороны, сульфированные фукозусодержащие полисахариды адсорбируются только в небольшом количестве, соответствующем 0,4 г, колонками, уравновешенными водой и хлоридом натрия.

В каждой колонке, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р данного изобретения, в основном, отделяется от сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и.

Пример 12. Взвешивают 7 г смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, описанной в примере 1, и растворяют в 800 мл 0,2М хлорида кальция. Далее 4 л ЭЕЛЕ8ер11аго8е РР колонку уравновешивают 0,2 М раствором хлорида кальция и весь раствор описанного выше сульфированного фукозусодержащего полисахарида вводят в колонку. После промывания 8 л 0,2М раствора хлорида кальция, проявляют элюированием с линейным градиентом хлорида натрия от 0 до 4М. Среди элюированных таким образом фракций, фракции, в которых определяют уроновую кислоту (концентрация хлорида натрия: приблизительно 0,9М или менее, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и), и фракции, в которых не определяется уроновая кислота (концентрация хлорида натрия: при приблизительно 1,2М, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р), каждую, обессоливают и сушат вымораживанием. Таким образом, получают 1,4 г и 4,8 г сухих препататов, соответственно.

Пример 13.

Сульфированную фукозусодержащую полисахаридную смесь, полученную в примере 1, обрабатывают эндофукоиданазой, продуцированной Р1ауоЬас1егшт 8р. 8А-0082 (РЕКМ ВР5402). Таким образом, получают олигосахариды, имеющие следующие структуры:

Согласно настоящему изобретению осуществляют ферментативную реакцию как описано ниже и тем самым получают вышеупомянутые олигосахариды.

А именно, 80 мл 2,5% раствора смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов примера 1, 60 мл 50 мМ раствора фосфатного буфера (рН 7,5), 20 мл 4М хлорида натрия и 40 мл 32 мЕ/мл раствора эндофукоиданазы смешивают вместе и подвергают взаимодействию при 25°С в течение 48 ч.

Затем реакционную смесь фракционируют по молекулярным массам, используя Се11и1оДпе ССЬ-300 колонку (произв. 8е1кадаки Кодуо), и объединяют фракции с молекулярной массой 2000 или менее. После обессоливания с помощью Мюго Асбухег С3, объединенную фракцию разделяют на три фракции, используя ЬЕАЕ8ер11аго8е РР, затем снова обессоливают и сушат вымораживанием. Таким образом, получают 250 мг, 310 мг и 52 мг олигосахаридов вышеупомянутых формул (I), (II) и (III), соответственно.

Пример 14.

г смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, описанной в примере 1, растворяют в 500 мл 0,2 М лимонной кислоты и рН полученного раствора доводят до 2,9. Затем смесь обрабатывают при 100°С в течение 3 ч. К полученному таким образом гидролизату добавляют 150 мл 1М раствора ацетата кальция. После удаления полученного таким образом осадка центрифугированием, (раствор) подвергают фракционированию по молекулярной массе с помощью гель-фильтрации, используя Се11и1ойпе ССЬ-25 (молекулярная масса: более 5000, 5 000-3 000, 3 000-2 000, 2 000-1 000, 1000-500,). Полученные фракции обозначают как СРб-0111, СРб-011-2, СРб-011-3, СРб-011-4, СРб-011-5 и СРб-011-6 в порядке уменьшения молекулярной массы (высокая низкая). Эти шесть фракций, каждую, обессоливают и сушат вымораживанием. Таким образом, получают 2,3 г, 1,7 мг, 0,88 г, 1,8 г, 1,4 г и 0,72 г сухих препаратов, соответственно

Пример 15.

Взвешивают 60 г смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученной в примере 1, и растворяют в 20 л искусственной морской воды. Затем, туда добавляют 200 г пептона и 4 г дрожжевого экстракта. После введения в 30-ти литровый сосуд-ферментатор и стерилизации, содержимое инокулируют вышеупомянутым Е1ауоЬас1егшт 8р. БА-0082 (ЕЕЯМ ВР-5402), и затем инкубируют при 25°С в течение 24 ч. После центрифугирования, чтобы удалить клетки, культуральную среду ультрафильтруют через ультрафильтр, снабженный полыми волокнами, с исключением молекулярной массы 100 000 или меньше. После полного удаления веществ с низкой молекулярной массой, нерастворимые вещества удаляют центрифугированием и фильтрацией с последующей сушкой вымораживанием. Высушенный вымораживанием сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Е весит 36 г.

Пример 16.

Разрезают 5 кг Бйсйорш )арошси8. Затем внутренние органы удаляют и соматические стенки собирают. К 200 г соматических стенок добавляют 500 мл ацетона. После обработки в гомогенизаторе, смесь фильтруют и остаток промывают ацетоном до тех пор, пока окрашивающие вещества полностью не удалятся. Затем остаток фильтруют при отсасывании, получая 140 г сухого продукта. К этому сухому продукту добавляют 2,8 л 0,4М водного раствора хлорида натрия. После обработки при 100°С в течение 1 ч, смесь фильтруют и остаток тщательно промывают 0,4 М водным раствором хлорида натрия. Таким образом получают 3,7 л экстракта. К этому экстракту добавляют 5% цетилпиридиний хлорид до тех пор, пока не прекратится образование осадка. Полученные таким образом осадки собирают центрифугированием и затем снова суспендируют в 0,4М водном растворе хлорида натрия, а затем центрифугируют. К полученному таким образом осадку добавляют 1 л 4 М водного раствора хлорида натрия и полученную смесь обрабатывают в гомогенизаторе. Затем туда добавляют 4 л этанола при перемешивании. После перемешивания в течение 1 ч смесь фильтруют, получая тем самым осадок. Полученный осадок суспендируют в 80% этаноле и центрифугируют. Эти процедуры повторяют до тех пор, пока поглощение супернатанта при 260 нм не достигнет 0. Осадок суспендируют в 2 л 2М водного раствора хлорида натрия и нерастворимые вещества удаляют центрифугированием. Супернатант полностью обессоливают ультрафильтрацией с помощью ультрафильтра, снабженного мембраной с исключением молекулярной массы 30 000. После высушивания вымораживанием, получают 3,7 г сульфированного фукозусодержащего полисахарида.

Пример 17.

кг тщательно высушенной Еиси8 уе81си1о8и8 размалывают при помощи мельницы (про изв. №га Κί1<ηί Бе18аки8Йо). Полученный таким образом сухой порошок суспендируют в 9 л 80% этанола и обрабатывают при 80°С в течение 2 ч. Затем смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, получая тем самым осадок. Этот осадок повторно промывают этанолом и фильтруют трижды таким же способом, как описано выше, получая тем самым остаток после промывания этанолом. Этот остаток суспендируют в 40 л воды, обрабатывают при 100°С в течение 2 ч и фильтруют. К фильтрату добавляют хлорид натрия до получения концентрации 0,5М. Далее, туда добавляют 5% цетилпиридиний хлорид до тех пор, пока не прекратится образование осадка. Затем осадки собирают центрифугированием и суспендируют в 3 л 0,4М водного раствора хлорида натрия с последующим центрифугированием и промывкой. После трехкратного повторения этой процедуры промывки, к осадку добавляют 250 г хлорида натрия и суспендируют в 3 л этанола. Затем суспензию центрифугируют, получая тем самым осадок. Осадок суспендируют в 80% этаноле и центрифугируют. Эти процедуры повторяют до тех пор, пока поглощение супернатанта при 260 нм не достигнет 0. Осадок растворяют в 3 л 2 М водного раствора хлорида натрия. После удаления нерастворимых веществ центрифугированием, туда добавляют 100 мл ПЕАЕ-Се11и1ойпе А800 (произв. БеПкщаки Иодуо), уравновешенной 2 М водным раствором хлорида натрия, и перемешивают. Далее, добавленную выше смолу удаляют фильтрацией. Фильтрат подают в ПЕАЕ-Се11и1ойпе А-800 колонку, уравновешенную 2М водным раствором хлорида натрия, и неадсорбированную фракцию подвергают ультрафильтрации, используя ультрафильтр, снабженный полыми волокнами, с исключением молекулярной массы 100 000 или менее, тем самым полностью удаляя окрашивающие вещества и хлорид натрия. Далее, нерастворимые вещества удаляют центрифугированием и фильтрацией с последующей сушкой вымораживанием. Высушенная вымораживанием сульфированная фукозусодержащая полисахаридная смесь весит 92 г.

Пример 18.

кг тщательно высушенной Ипбапа ршпаййба размалывают при помощи мельницы (произв. №га Κί1<ηί Бе18аки8Йо). Полученный таким образом сухой порошок суспендируют в 9 л этанола и обрабатывают при 75°С в течение 1 ч. Затем смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, получая тем самым осадок. К этому осадку добавляют 9 л 80% этанола и смесь перемешивают, обрабатывают при 80°С в течение 1 ч и фильтруют через фильтровальную бумагу, получая тем самым осадок. Этот осадок повторно промывают 80% этанолом и фильтруют трижды таким же способом, как описано выше, получая тем самым 1908 г остатка после промывания этанолом. 684 г этого остатка суспенди руют в 9л 0,2М ацетате кальция и обрабатывают при 95°С в течение 1 ч. После того, как суспензия отстоится в течение 24 ч, получают супернатант. К осадку, полученному после удаления супернатанта, добавляют 9 л 0,2М ацетата кальция и смесь перемешивают и дают отстояться в течение 1 ч, получая тем самым супернатант. Полученный таким образом супернатант объединяют с супернатантом, полученным выше. Затем супернатант ультрафильтруют с помощью ультрафильтра, снабженного полыми волокнами, с исключением молекулярной массы 10 000, и концентрируют до 350 мл. Концентрат центрифугируют. После удаления осадка, его подвергают ультрафильтрации, добавляя 2 мМ хлорид натрия. После полного удаления ацетата кальция, остаток лиофильно сушат, получая тем самым 3,2 г лиофильно высушенного продукта. Этот лиофильно высушенный продукт содержит 3,1 г сульфированного фукозусодержащего полисахарида.

Пример 19.

(1) Приготовление смеси К)е11таше11а сгаккйоНа сульфированных фукозусодержащих полисахаридов 2 кг высушенной К)е11таше11а сгаккйоНа размалывают при помощи мельницы Модель М-2 (произв. Ыага К1ка1 8е1какикко). Полученный таким образом сухой порошок обрабатывают 4,5 объемами 60% этанола и при 80°С в течение 2 ч и затем фильтруют. Полученный осадок повторно промывают 60% этанолом и фильтруют трижды таким же способом, как описано выше, получая тем самым 1870 г остатка после промывания этанолом. К этому остатку добавляют 36 л воды и смесь обрабатывают при 100°С в течение 2 ч, получая тем самым экстракт. Концентрацию соли экстракта доводят до того же уровня, как уровень 400 мМ раствора хлорида натрия. Затем, туда добавляют 5% цетилпиридиний хлорид до тех пор, пока не прекратится образование осадка. После центрифугирования, осадок повторно промывают 80% этанолом, тем самым полностью удаляя из него цетилпиридиний хлорид. Далее его растворяют в 3 л 2М хлорида натрия. После удаления нерастворимых веществ центрифугированием, 100 мл ОЕАЕ-Се11и1оПпе А-800 (произв. 8е1кадаки Кодуо), уравновешенной 2М хлоридом натрия, суспендируют в нем. Суспензию перемешивают и затем фильтруют, удаляя тем самым смолу. Фильтрат подают в 100 мл ОЕАЕ-СеПЫоПпе А800 колонку, уравновешенную 2М хлоридом натрия, и фракцию, проходящую через нее, обессоливают и низкомолекулярные вещества удаляют из нее, используя ультрафильтр (мембрана с исключением молекулярной массы 100000). Полученный таким образом осадок удаляют центрифугированием. Супернатант сушат вымораживанием, получая тем самым 82 г смеси К)е11таше11а сгаккбока сульфированных фукозусодержащих полисахаридов.

(2) Приготовление сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р.

г вышеупомянутой смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящей от К)е11тап1е11а сгаккбока, растворяют в 600 мл 20 мМ раствора ацетата натрия (рН 6,0), содержащего 0,2М хлорида кальция. Затем раствор подают в 3600 мл ЭЕАЕ-8ерНагоке РР колонку, предварительно уравновешенную 20 мМ ацетатом натрия (рН 6,0), содержащем 0,2 М хлорида кальция. Затем колонку тщательно промывают 20 мМ ацетатом натрия (рН 6,0), содержащем 0,2М хлорида кальция и проявляют элюированием с линейным градиентом хлорида натрия от 0 до 2М. Затем фракции сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р элюируют при концентрациях хлорида натрия от 0,75М или более, и вышеуказанные фракции собирают и обессоливают, используя ультрафильтр, снабженный ультрафильтрационной мембраной с исключением молекулярной массы 100 000. После лиофильной сушки, получают 3,3 г лиофильно высушенного препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р.

(3) Приготовление фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид

АНеготопак кр. 8 А-1009 (РЕКМ ВР-5747) инокулируют в 600 мл среды, включающей искусственную морскую воду (рН 8,2, произв. 1атапп ЬаЬогаШгу), содержащей 0,25% глюкозы, 1,0% пептона и 0,05% дрожжевого экстракта, которую стерилизуют (120°С, 20 мин) и пипетируют в 2-х литровую колбу Эрленмейера. Затем штамм инкубируют при 25°С в течение 25 ч, тем самым получая семенную культуру. В 30-ти литровый сосуд-ферментер загружают 18 л среды, содержащей искусственную морскую воду (рН 8,0), содержащей 200 г пептона, 4 г дрожжевого экстракта и 4 мл противовспенивающего средства (КМ70 произв. 81ип-Е1ки СЬетка1 Со., Шб.) и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин. После охлаждения, среду инокулируют 20 г К)е11таше11а сгаккйоНа сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, полученного по способу примера 8, который растворяют отдельно в 2 л искусственной морской воды, стерилизованной при 120°С в течение 15 мин, и 600 мл вышеупомянутой семенной культуры, а затем инкубируют при 24°С в течение 20 ч при аэрации при скорости 10 л/мин и перемешивании при 250 об/мин. После завершения инкубации, культуральную среду центрифугируют, тем самым получая клетки и культуральный супернатант. При измерении с использованием сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р в качестве субстрата, культуральный супернатант показал активность фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения 5 мЕ/мл среды.

Культуральный супернатант концентрируют с помощью ультрафильтра с исключением фракционной молекулярной массы 10 000, и осадок, полученный таким образом, удаляют центрифугированием. Затем его высаливают, используя 85% сульфат аммония. Полученный таким образом осадок отделяют центрифугированием и тщательно диализуют против 20 мМ Трис гидрохлорид буфера (рН 8,2), содержащим искусственную морскую воду (1атапп 8), разбавленную в 10 раз. Таким образом получают 400 мл неочищенного фермента.

Полученный таким образом раствор неочищенного фермента адсорбируют ΌΕΑΕСе11и1ойпе А-800 (произв. 8е1кадаки Кодуо) колонкой, уравновешенной 20 мМ Трис гидрохлорид буфером (рН 8,2), содержащим 5 мМ азида натрия и искусственную морскую воду (1атапп 8), разбавленную в 10 раз. Затем адсорбированные вещества тщательно промывают тем же самым буфером и элюируют в тот же самый буфер, используя растворы, содержащие 100 мМ, 200 мМ, 300 мМ, 400 мМ и 600 мМ хлорида натрия. Активные фракции объединяют.

При измерении с использованием сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р в качестве субстрата, этот частично очищенный фермент показал активность 10 200 мЕ (10,2 Е). Он не засорен другим ферментом, расщепляющим эндосульфированные фукозусодержащие полисахариды.

Часть полученного таким образом частично очищенного фермента подвергают гельфильтрации через 8ерЕсгу1 8-200, который уравновешивают 10 мМ Трис гидрохлорид буфером (рН 8,0), содержащим 5 мМ азида натрия и искусственную морскую воду (1атапп 8), разбавленную в 10 раз. Определенная таким образом молекулярная масса составляет приблизительно 100000.

(4) Используя полученный выше частично очищенный фермент и РА-РР, соответственно, в качестве источника фермента и субстрата, проводят исследование влияния концентрации кальция на активность этого фермента.

В ферментативной реакции используют буфер (рН 7), содержащий 50 мМ уксусной кислоты, имидазол и Трис гидрохлорид. В реакционной смеси растворяют хлорид натрия таким образом, чтобы получить финальную концентрацию 400 мМ.

Активность фермента измеряют, варьируя концентрацию хлорида кальция в реакционной смеси от 0 до 100 мМ. На фиг. 23 показаны результаты, где ордината относится к относительной активности (%), а абсцисса относится к концентрации кальция (мМ) в реакционной смеси.

Таким образом, найдено, что активность этого фермента значительно выше в присутствии соли кальция.

(5) Фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения выдерживают при 5°С в течение 20 ч в условиях диализа против шести буферов, указанных ниже, и затем измеряют остаточную активность.

1. 20 мМ Трис гидрохлоридный буфер (рН 8,2).

2. 20 мМ Трис гидрохлоридный буфер (рН

8,2), содержащий 5 мМ азида натрия.

3. 20 мМ Трис гидрохлоридный буфер (рН

8,2), содержащий 5 мМ азида натрия и 50 мМ хлорида натрия.

4. 20 мМ Трис гидрохлоридный буфер (рН

8,2), содержащий 5 мМ азида натрия и 500 мМ хлорида натрия.

5. 20 мМ Трис гидрохлоридный буфер (рН

8,2), содержащий 5 мМ азида натрия, 50 мМ хлорида натрия и 10 мМ хлорида кальция.

6. 20 мМ Трис гидрохлоридный буфер (рН

8,2), содержащий 5 мМ азида натрия и искусственную морскую воду (1атагш 8), разбавленную в 10 раз.

В результате, установлено, что фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения инактивируется при диализе против буферов 1, 2 и 3. С другой стороны, активность этого фермента сохраняется (подтверждается) при диализе против буферов 4, 5 и 6.

На основе этих результатов установлено, что этот фермент стабилизируется в присутствии 500 мМ хлорида натрия или иона кальция.

(6) Взвешивают 5 г сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, полученного выше, и смешивают с 471 мл 50 мМ имидазольного буфера (рН 8), 12,5 мл 4 М хлорида натрия, 6,25 мл 4 М хлорида кальция и 10 мл (соответствующие 6 мЕ) частично очищенного фермента, расщепляющего эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения, полученного в примере 19-(3). После взаимодействия при 25°С в течение 120 ч, получают продукт деградации сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р.

На фиг. 25 и 26 представлены, соответственно, ИК и ЯМР аналитические данные полученного выше продукта деградации. На фиг. 24 представлены результаты гель-фильтрации с использованием Се11ийпе ОСЬ-300. А именно, это вещество показывает молекулярно-массовое распределение, находящееся в диапазоне от 1000 до 30000.

Это вещество содержит 46% сульфата в терминах 8О (молекулярная масса: 96) и показывает нейтральный сахаридный состав фукозы и галактозы (100: 4).

На каждой из фиг. 24-26 ордината и абсцисса имеют те же самые значения, соответственно, что и значения на фиг. 2-4.

Пример 20.

Клетки НЬ-60 (АТСС СКЬ-1964) премиелоцитарного лейкоза человека инкубируют в КРМ1 1640 среде (произв. О1Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ДКН Вюкаеисе), обрабатывают при 56°С в течение 30 мин и затем суспендируют в А§Р104 среде (произв. А_циото1о Со., Ый.) таким образом, чтобы получить концентрацию 5х10⁵ клеток/9 мл. К четырем 9-мл порциям этой суспензии добавляют 1мл порции 5 мг/мл растворов сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученных в примерах 1, 12 и 15, в физиологическом растворе, которые были обработаны фильтрованием через ацетатцеллюлозный фильтр (размер пор: 0,20 мкм, произв. Согшид; такой же используют в последующей обработке фильтром). После инкубации при 37°С в течение 40 ч в присутствии 5% диоксида углерода, клетки отделяют от супернатанта центрифугированием. Полученные таким образом клетки суспендируют в 20 мкл 50 мМ Трис гидрохлорид буфере (рН 7,8), содержащем 10 мМ этилендиаминтетраацетата и 0,5% натрий лауроил саркозината. Затем туда добавляют 1 мкл 10 мг/мл Рибонуклеазы А (произв. §1дта) и смесь обрабатывают при 50°С в течение 30 мин. После добавления 1 мкл 10 мг/мл Протеиназы К, смесь обрабатывают при 50°С в течение 1 ч. Обработанные таким образом клетки используют в качестве пробы и подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле при постоянном напряжении 100 в. Этот гель погружают в раствор этидиум бромида в течение 30 мин и затем состояния ДНК в геле исследуют, используя осветитель для исследования в проходящем свете. В результате, наблюдают ступеньки ДНК, характерные для апоптоза. Для дополнительного подтверждения, вышеуказанную процедуру повторяют, используя, 10 мкг/мл раствор актиномицина Ό, известного как реагент, вызывающий апоптоз, в качестве заменителя вышеупомянутых сульфированных фукозусодержащих полисахаридов. В результате, наблюдают ступеньки ДНК после инкубации в течение 20 ч аналогично случаю с сульфированными фукозусодержащими полисахаридами.

Исходя из этих результатов, становится ясным, что апоптоз НЬ-60 клеток может вызываться сульфированными фукозусодержащими полисахаридами, полученными в примерах 1, 12 и 15.

Сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1, 12 и 15, каждый, растворяют в 30 мМ Нерек буфере (рН

7,2), содержащем 120 мМ хлорида натрия так, чтобы получить концентрацию 5 мг/мл и обрабатывают в автоклаве при 121°С в течение 20 мин. Затем исследуют влияние этих сульфированных фукозусодержащих полисахаридов индуцировать апоптоз на НЬ-60 клетках (АТСС ССЬ-240) таким же способом, как описано вы ше. Таким образом получают одинаковые результаты.

Пример 21.

Клетки НЬ-60 (АТСС СКЬ-240) премиелоцитарного лейкоза человека инкубируют в КРМ1 1640 среде (произв. О1Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ДКН Вюкаеисе), обрабатывают при 56°С в течение 30 мин и затем суспендируют в А§Р104 среде (произв. АДиотоШ Со., Ый.) таким образом, чтобы получить концентрацию 5х10⁵ клеток/9 мл. К 9 мл этой суспензии добавляют 1 мл 5 мг/мл раствора сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученного в примере 15, в физиологическом растворе, который был обработан фильтром. После инкубации при 37°С в течение 20 ч в присутствии 5% диоксида углерода, клетки отделяют от супернатанта центрифугированием. Полученные таким образом клетки подвергают С1етка окрашиванию в соответствии с методом, описанным в «Аро1окЫки Лккеи РигоЮкоги», §йищи-кка, киреМкей Ьу УакшсЫ Таиита, 93-95 (1995). А именно, полученные выше клетки фиксируют на предметном стекле, используя Сагиоу'к фиксатор (уксусная кислота:метанол =1:3), прокрашивают С1етка красителем (произв. Мегск & Со., 1ис.) и наблюдают в оптическом микроскопе. Таким образом, наблюдают ядерные фрагменты, характерные для апоптоза. Этот факт указывает на то, что сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 15, индуцирует апоптоз НЬ-60 клеток.

Сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 15, растворяют в 30 мМ Норек буфере (рН 7,2), содержащем 120 мМ хлорида натрия так, чтобы получить концентрацию 5 мг/мл и обрабатывают в автоклаве при 121°С в течение 20 мин. Затем исследуют влияние сульфированного фукозусодержащего полисахарида на индуцирование апоптоза тем же способом, как описано выше. Таким образом получают те же результаты.

Пример 22.

Клетки НЬ-60 (АТСС ССЬ-240) премиелоцитарного лейкоза человека инкубируют в КРМ1 1640 среде (произв. О1Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ДКН Вюкаеисе), обрабатывают при 56°С в течение 30 мин и затем суспендируют в А§Р104 среде (произв. АДиотоШ Со., Ый.) таким образом, чтобы получить концентрацию 5 х 10⁵ клеток/4,5 мл. К четырем порциям по 4,5 мл этой суспензии добавляют 0,5 мл-овые порции. 10 мг/мл растворов сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученных в примерах 1, 15 и 18, в 30 мМ Нерек буфере (рН 1,2), содержащем 120 мМ хлорида натрия, которые были обработаны в автоклаве при 121°С в течение 20 мин. После инкубации при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода, клетки подсчитывают методом прокрашивания Трипан Голу77 бым (Тгурап В1ие) спустя 24 и 40 ч после иницирования инкубации.

Результаты представлены на фиг. 27, которая представляет график, показывающий взаимосвязь между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде НЬ-60 клеток, к которой сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1, 15 и 18, были добавлены в таком количестве, чтобы получить концентрацию 1 мг/мл. На этой фигуре абсцисса соответствует времени инкубации (час), в то время как ордината соответствует количеству жизнеспособных клеток (х 10⁵ клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 27 незаполненный квадрат соответствует контролю (нет добавления), + соответствует сульфированному фукозусодержащему полисахариду, полученному в примере 1, заполненный кружок соответствует сульфированному фукозусодержащему полисахариду, полученному в примере 15, и х соответствует сульфированному фукозусодержащему полисахариду, полученному в примере 18.

В этом случае, мертвые клетки демонстрируют морфологические характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация (деление на фрагменты) клеток. А именно, эти результаты указывают на то, что сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1, 15 и 18, индуцируют апоптоз НЬ60 клеток и значительно ингибируют рост этих клеток.

Сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1, 15 и 18, растворяют в 30 мМ Нерек буфере (рН 7,2), содержащем 120 мМ хлорида натрия, так, чтобы получить концентрацию 10 мг/мл, и обрабатывают фильтром. Затем исследуют влияние этих сульфированных фукозусодержащих полисахаридов на индуцирование апоптоза тем же способом, как описано выше. Таким образом те же результаты получают.

Пример 23.

Клетки МОЬТ-3 (АТСС СВЬ-1552) острого лимфатического лейкоза человека суспендируют в ВРМ1 1640 среде (произв. 61Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ЖН Вюкстепсе), обрабатывают при 56°С в течение 30 мин таким образом, чтобы получить концентрацию 5х10⁵ клеток/9 мл. К пяти порциям по 9 мл этой суспензии добавляют 1-мл порции 5 мг/мл растворов сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученных в примерах 1, 2, 12 и 16, в физиологическом растворе, которые были обработаны фильтром. После инкубации при 37°С в течение 60 ч в присутствии 5% диоксида углерода, клетки отделяют от супернатанта центрифугированием. Затем полученные таким образом клетки суспендируют в 20 мкл 50 мМ Трис гидрохлорид буфере (рН 7,8), содержащем 10 мМ этилендиаминтетраацетата и 0,5% натрий лауроил саркозината. Затем туда добавляют 1 мкл 10 мг/мл Рибонуклеазы А (произв. 81д1аа) и смесь обрабатывают при 50°С в течение 30 мин. После добавления 1 мкл 10 мг/мл Протеиназы К, смесь обрабатывают при 50°С в течение 1 ч. Обработанные таким образом клетки используют в качестве пробы и подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле при постоянном напряжении 100 В. Этот гель погружают в раствор этидиум бромида в течение 30 мин и затем состояния ДНК в геле исследуют, используя осветитель для исследования в проходящем свете. В результате, наблюдают ступеньки ДНК, характерные для апоптоза. Для дополнительного подтверждения, вышеуказанную процедуру повторяют, используя 10 мкг/мл раствор актиномицина Ό, известного как реагент, вызывающий апоптоз, в качестве заменителя вышеупомянутых сульфированных фукозусодержащих полисахаридов. В результате, наблюдают ступеньки ДНК после инкубирования в течение 20 ч аналогично случаю с сульфированными фукозусодержащими полисахаридами.

Исходя из этих результатов, становится ясным, что апоптоз МОЬТ-3 клеток может вызываться сульфированными фукозусодержащими полисахаридами, полученными в примерах 1, 2, 12 и 16.

Сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1, 2, 12 и 16, каждый, растворяют в РВ8, полученным растворением 8 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия, 2,9 г динатрий кислый фосфат додекагидрата и 0,2 г калий дикислый фосфата в 1 л воды, так, чтобы получить концентрацию 5 мг/мл и обрабатывают в автоклаве при 121°С в течение 20 мин. Затем исследуют влияние этих сульфированных фукозусодержащих полисахаридов на индуцирование апоптоза таким же способом, как способ, описанный выше. Таким образом получают те же результаты.

Пример 24.

Клетки МОЬТ-3 (АТСС СВЬ-1552) острого лимфатического лейкоза человека инкубируют при 37° в ВРМ1 1640 среде (произв. 61Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ЖН Вюкаепсе), обрабатывают при 56°С в течение 30 мин и затем суспендируют в ВРМ1 1640 среде (произв. АцпотоЮ Со., Ь!б.) таким образом, чтобы получить концентрацию 5х10³ клеток/мл. Затем суспензию пипетируют в 24-луночный планшет (произв. ЕАЬСО^ при соотношении 1,8 мл/лунка. К суспензии добавляют 0,2-мл порции 0,5 мг/мл растворов сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученного в примере 1, сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Е, полученного в примере 12, сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученных в примерах 15 и 17 и сульфата декстрана (молекулярная масса: 500 000; произв. Аако Риге Скет1са1 Жбикйгек, Ыб.) каждый, растворенный в РВ8, и стерилизуют с последующей инкубацией при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода. В качестве контроля, только РВ8 добавляют в таком же количестве и осуществляют инкубацию таким же образом. Спустя 2, 4, 6 и 8 дней после начала инкубации, клетки подсчитывают методом окрашивания Трипан Голубым.

Результаты представлены на фиг. 28, которая представляет график, показывающий взаимосвязь между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде МОЬТ-3 клеток, к которой сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, полученный в примере 12 и сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 15 и 17 и сульфат декстрана были добавлены в таком количестве, чтобы получить концентрацию 0,5 мг/мл. На этой фигуре, абсцисса соответствует времени инкубации (день), в то время как ордината соответствует количеству жизнеспособных клеток (х 10⁴ клеток/2 мл) в культуральной среде. На фиг. 28 незаполненный кружок соответствует контролю (нет добавления), заполненный кружок соответствует сульфированному фукозусодержащему полисахариду-Р, полученному в примере 12, незаполненный квадрат соответствует сульфированному фукозусодержащему полисахариду, полученному в примере 1, незаполненный треугольник соответствует сульфированному фукозусодержащему полисахариду, полученному в примере 17, и заполненный квадрат соответствует сульфированному фукозусодержащему полисахариду, полученному в примере 15. Сульфат декстрана показывает, в основном, такую же кривую, как кривая, полученная при использовании сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 15.

В этом случае, мертвые клетки демонстрируют морфологические характеристики апоптоза, такие как сокращение (сморщивание) и фрагментация клеток. А именно, эти результаты указывают на то, что сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, полученный в примере 12, сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 15 и 17 и сульфат декстрана, индуцируют апоптоз МОЬТ-3 клеток и значительно ингибируют рост этих клеток.

Сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примерах 15 и 17 и сульфат декстрана (молекулярная масса: 500 000: произв. \Уако Риге Сбетка1 Ыбийпек, Ыб.), каждый, растворяют в РВ8 так, чтобы получить концентрацию 0,5 мг/мл, и обрабатывают в автоклаве при 121°С в течение 20 мин. Затем исследуют их влияние на индуцирование апоптоза тем же способом, как описано выше. Таким образом те же результаты получают.

Пример 25.

Клетки ИЬ-60 (АТСС ССЬ-240) премиелоцитарного лейкоза человека инкубируют при 37°С в ΚРМI 1640 среде (произв. С1Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ΙΚΗ Вюкшепсе), обработанной при 56°С в течение 30 мин, и затем суспендируют в А8Р104 среде (произв. АцпотоЮ Со., Ыб.) таким образом, чтобы получить концентрацию 5х10⁴ клеток/900 мкл. К девяти порциям по 900 мкл этой суспензии, соответственно, добавляют 100-мкл порции физиологического раствора и 10 мг/мл растворы препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученного в примере 1, Р-Рб-1 до Р-Рб-4 и трех сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученных в примере 13, в физиологическом растворе, которые были обработаны фильтром. После инкубации при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода в течение 40 ч, клетки наблюдают под микроскопом, чтобы исследовать степень роста и морфологию клеток.

В результате, ИЬ-60 клетки, к которым добавляют препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, Р-Рб-1 до Р-Рб-4 и три сульфированных фукозусодержащих полисахарида, все, демонстрируют типичные характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация клеток. ИЬ-60 клетки, к которым добавляли физиологический раствор, демонстрировали повышение в подсчете клеток приблизительно в 4 раза, в то время как ИЬ-60 клетки, к которым добавляли препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, Р-Рб-1 до Р-Рб-4 и три сульфированных фукозусодержащих полисахарида не демонстрируют увеличения или уменьшения до уровня менее чем 1/10. Эти результаты указывают на то, что рост ИЬ60 клеток был ингибирован благодаря апоптозиндуцирующим действиям препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида, РРб-1 до Р-Рб-4 и трех сульфированных фукозусодержащих полисахаридов.

Для дополнительного подтверждения, вышеуказанную процедуру повторяют, используя 10 мкг/мл раствор актиномицина Ό, известного как реагент, вызывающий апоптоз, в качестве заменителя вышеупомянутых сульфированных фукозусодержащих полисахаридов. В результате, наблюдают сморщивание и фрагментацию клеток после инкубирования в течение 20 ч аналогично случаю с сульфированными фукозусодержащими полисахаридами. Исходя из этих результатов, становится ясным, что апоптоз Η660 клеток может быть индуцирован препаратом сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученного в примере 1, Р-Рб-1 до РРб-4 и тремя сульфированными фукозусодержащими полисахаридами, полученными в примере 13.

Препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, Р-Рй-1 до Р-Рй-4 и три сульфированных фукозусодержащих полисахарида, полученные в примере 13, каждый, растворяют в 30 мМ Нерез буфере (рН 7), содержащем 120 мМ хлорида натрия, так, чтобы получить концентрацию 10 мг/мл и обрабатывают в автоклаве при 121°С в течение 20 мин. Затем исследуют их влияние на индуцирование апоптоза тем же самым способом, как описано выше. Таким образом те же результаты получают.

Пример 26.

Легочные злокачественные клетки А-549 (АТСС ССЬ-185), 8У40-трансформированные легочные клетки ХУ1-38УА13 (АТСС ССЬ-75.1) и печеночные злокачественные клетки Нер С2 (АТСС НВ-8065), каждый тип клеток, суспендируют в ΚΡΜΙ 1640 среде (произв. 61Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ЖН Вюзшепсе), обработанной при 56°С в течение 30 мин, так, чтобы получить концентрацию 10⁴ клеток/1,8 мл. К 1,8-мл порциям суспензии каждой клеточной линии добавляют 200-мкл-овые порции физиологического раствора и 1 мг/мл растворы сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученных в примерах 1 и 15, и шести сульфированных фукозусодержащих олигосахаридов, полученных в примере 14, в физиологическом растворе, которые были обработаны фильтром. После инкубации при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода в течение 6 дней, клетки наблюдают под микроскопом, чтобы исследовать степень роста и морфологию клеток.

В результате, легочные злокачественные клетки А-549, 8У40-трансформированные легочные клетки ^У1-38УА13 и печеночные злокачественные клетки Нер С2. к которым сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1 и 15, и три фракции с молекулярным весом 2 000 или более из шести сульфированных фукозусодержащих олигосахаридов, полученных в примере 14, все, демонстрируют типичные характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация клеток. Злокачественные клеточные линии, к которым добавляют физиологический раствор, демонстрировали заметное увеличение в количестве клеток, в то время как злокачественные клеточные линии, к которым добавляли сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1 и 15, и три фракции с молекулярным весом 2 000 или более из шести сульфированных фукозусодержащих олигосахаридов, полученных в примере 14, демонстрировали, каждый тип клеток, уменьшение в количестве клеток. Эти результаты указывают на то, что рост каждой из злокачественных клеточных линий был ингибирован благодаря апоптозиндуцирующим действиям этих сульфирован ных фукозусодержащих полисахаридов и олигосахаридов.

Сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1 и 15, и шесть сульфированных фукозусодержащих олигосахаридов, полученных в примере 14, каждый, растворяют в РВ8 так, чтобы получить концентрацию 1 мг/мл, и обрабатывают в автоклаве при 121°С в течение 20 мин. Затем исследуют их влияние на индуцирование апоптоза тем же самым способом, как описано выше. Таким образом получают те же результаты.

Пример 27.

Относящиеся к ободочной или толстой кишке злокачественные клетки НСТ 116 (АТСС ССЬ-247) и желудочные злокачественные клетки А68 (АТСС ССЬ-1739), каждый, суспендируют в МсСоу'з 5а среде (произв. 61Ьсо) и Нат'з Р12 среде (произв. 61Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ДКН Вюзс1епсе), обработанной при 56°С в течение 30 мин, так, чтобы получить концентрацию 10⁴ клеток/1,8 мл. К 1,8-мл порциям суспензии каждой клеточной линии добавляют 200-мкл порции физиологического раствора и 10 мг/мл растворы сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученных в примерах 1, 12 и 15, и четырех сульфированных фукозусодержащих олигосахаридов Р-Рй-1 до Р-Рй-4, в физиологическом растворе, которые были обработаны фильтром. После инкубации при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода в течение 48 ч, клетки наблюдают под микроскопом, чтобы исследовать степень роста и морфологию клеток.

В результате, относящиеся к ободочной или толстой кишке злокачественные клетки НСТ 116 и желудочные злокачественные клетки АС8, к которым добавляют сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1, 12 и 15, и четыре сульфированные фукозусодержащие олигосахарида Р-Рй-1 до РРй-4, все, демонстрируют типичные характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация клеток. Злокачественные клеточные линии, к которым добавляют физиологический раствор, демонстрировали заметное увеличение в количестве клеток, в то время как злокачественные клеточные линии, к которым добавляли сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1, 12 и 15, и четыре сульфированных фукозусодержащих олигосахарида Р-Рй-1 до Р-Рй-4, демонстрировали, каждый тип, уменьшение в количестве клеток. Эти результаты указывают на то, что рост каждой из злокачественных клеточных линий был ингибирован благодаря апоптоз-индуцирующим действиям этих сульфированных фукозусодержащих полисахаридов и олигосахаридов.

Сульфированные фукозусодержащие полисахариды, полученные в примерах 1, 12 и 15, и четыре сульфированных фукозусодержащих олигосахарида Р-Рб-1 до Р-Рб-4, каждый, растворяют в РВ8 так, чтобы получить концентрацию 10 мг/мл, и обрабатывают в автоклаве при 121°С в течение 20 мин. Затем исследуют их влияние на индуцирование апоптоза тем же самым способом, как описано выше. Таким образом те же результаты получают.

Пример 28.

Злокачественные клетки НСТ 116, относящиеся к ободочной или толстой кишке, инкубируют при 37°С в МсСоу'8 5а среде (произв. С1Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ЖН Вюкаепсе), обработанной при 56°С в течение 30 мин, и затем суспендируют в среде МсСоу'8 5а так, чтобы получить концентрацию - 5 х 10³ клеток/мл. Затем суспензию пипетируют в 24-луночный планшет (произв. РАЬС0^ при соотношении 1,8 мл/лунка. К суспензии добавляют 0,2-мл порции 10 мг/мл растворов препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида, и смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученной в примере 1, сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р и сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и, полученных в примере 12, Р-Рб-1, РРб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, и сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученного в примере 15, растворенные в РВ8, и 5 мг/мл растворы гепарина (произв. \Уако Риге Сйетка1 [пбикШек, Иб.) и сульфата декстрана (молекулярная масса: 500 000, произв. \Уако Риге Скетка1 ШбикМек, Иб.), которые были обработаны в автоклаве при 121°С в течение 20 мин, с последующей инкубацией при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода. В качестве контроля добавляют только РВ8 в том же количестве и инкубацию осуществляют таким же образом. Спустя 1, 2, 3 и 4 дня после инициирования инкубации, жизнеспособные клетки подсчитывают в соответствии со способом, описанным в «8о8Ык| Ва1уо по буйки» (кесопб еб.), Акакига 81иррап, еб. Ьу №рроп 8о81гк1 Ва1уо Саккак 2628 (1990), а именно методом прокрашивания Трипан Голубым в счетной камере.

Результаты представлены на фиг. 29, которая показывает взаимосвязь между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде клеток НСТ116, к которой были добавлены препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученная в примере 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид- и и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, полученные в примере 12, Р-Рб-1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 15, каждый в концентрации 1 мг/мл, и гепарин и сульфат декстрана, каждый в концентрации 0,5 мг/мл. На этой фигуре абсцисса соответствует времени инкубации (день), в то время как ордината соответствует количеству жизнеспособных клеток (х 10⁴ клеток/2 мл) в культуральной среде. На фиг. 29 незаполненный кружок соответствует контролю (нет добавления), заполненный кружок соответствует препарату сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученному в примере 1, и заполненный квадрат соответствует смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученной в примере 1. Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-И и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, полученные в примере 12, Р-Рб-1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, и сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 15, демонстрируют, каждый, в основном, ту же кривую, как в случае смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов примера 1. С другой стороны, гепарин и сульфат декстрана демонстрируют, каждый, в основном, ту же кривую, как в случае препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1.

В результате, клетки НСТ116, к которым добавляли РВ8, демонстрировали значительное увеличение в количестве клеток, в то время как НСТ клетки, к которым добавляли препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1, смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов примера 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и примера 12, Р-Рб-1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и РРб-4, гепарин и сульфат декстрана, демонстрируют в каждом случае небольшое увеличение или уменьшение в количестве клеток.

Клетки НСТ116, к которым добавляли препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1, смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов примера 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-И примера 12, Р-Рб-1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, сульфированный фукозусодержащий полисахарид примера 15, гепарин и сульфат декстрана, все, демонстрируют типичные характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация клеток.

А именно, было обнаружено, что рост клеток НСТ116 ингибируется вследствие апоптозиндуцирующих действий этих сульфированных фукозусодержащих полисахаридов и олигосахаридов, гепарина и сульфата декстрана.

Препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида и смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученная в примере 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р и сульфированный фукозусодержащий полисахарид-И, полученные в примере 12, Р-Рб-1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, и сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 15, каждый, растворяют в РВ8 так, чтобы получить концентрацию мг/мл. Гепарин и сульфат декстрана, каждый, растворяют в РВ8 так, чтобы получить концентрацию 5 мг/мл. Эти растворы, все, обрабатывают фильтром и затем исследуют их влияние на индуцирование апоптоза тем же самым способом, как описано выше. Таким образом получают те же результаты.

Пример 29.

Злокачественные клетки НСТ 116, относящиеся к ободочной или толстой кишке, инкубируют при 37°С в МсСоу'к 5а среде (произв. С1Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ЖН Вюкаепсе), обработанной при 56°С в течение 30 мин, и затем суспендируют в МсСоу'к 5а среде так, чтобы получить концентрацию 5 х 10³ клеток/мл. Затем суспензию пипетируют в 24-луночный планшет (произв. РАЬСОК) при соотношении 1,8 мл/лунка. К суспензии добавляют 0,2-мл-овые порции 20 мг/мл, 30 мг/мл и 50 мг/мл растворов препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученного в примере 1 в РВ8, которые были обработаны в автоклаве при 121°С в течение 20 мин, с последующей инкубацией при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода. В качестве контроля, только РВ8 добавляют в том же количестве и инкубацию осуществляют таким же образом. После инициирования инкубации, жизнеспособные клетки подсчитывают с течением времени в соответствии со способом, описанным в «8окй1к1 Ва1уо по СуЫки» (кесопб еб.), Акакига 8йиррап, еб. Ьу №рроп 8окйк1 Ва1уо Саккад 26-28 (1990), а именно методом прокрашивания Трипан Голубым на счетной камере.

Результаты представлены на фиг. 30, которая показывает взаимосвязь между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде клеток НСТ116, к которой были добавлены препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, при различных концентрациях. На этой фигуре абсцисса соответствует времени инкубации (час), в то время как ордината соответствует количеству жизнеспособных клеток (х 10⁴ клеток/2 мл) в культуральной среде. На фиг. 30 незаполненный кружок соответствует контролю (нет добавления), заполненный кружок соответствует добавлению 2 мг/мл препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида, заполненный квадрат соответствует добавлению 3 мг/мл его и заполненный треугольник соответствует добавлению 5 мг/мл его.

В результате клетки НСТ116, к которым добавляли РВ8, демонстрируют значительное увеличение в количестве клеток, в то время как клетки, к которым добавляли препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1, демонстрируют, в каждом случае, уменьшение в количестве клеток.

Клетки НСТ 116, к которым добавляли препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1, демонстрируют типичные характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация клеток.

А именно, было обнаружено, что препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, оказывает индуцирующее действие на апоптоз на клетках НСТ 116, по крайней мере, при концентрации 2 мг/мл и таким образом ингибирует рост клеток.

Препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, растворяют в РВ8 так, чтобы получить концентрацию 20 мг/мл, 30 мг/мл и 50 мг/мл и обрабатывают фильтром. Затем исследуют их влияние на индуцирование апоптоза тем же самым способом, как описано выше. Таким образом те же результаты получают.

Пример 30.

Человеческие желудочные злокачественные клетки АС8 инкубируют при 37°С в Нат'к Р12 среде (произв. С1Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ЖН В1окс1епсе), обработанной при 56°С в течение 30 мин, и затем суспендируют в Нат'к Р12 среде так, чтобы получить концентрацию 5х10³ клеток/мл. Затем суспензию пипетируют в 24луночный планшет (произв. ΕΛΕΟΌΝ) при соотношении 1,8 мл/лунка. К суспензии добавляют 0,2-мл-овые порции 20, 30 и 50 мг/мл растворов препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученного в примере 1, в РВ8, которые были обработаны в автоклаве при 121°С в течение 20 мин, с последующей инкубацией при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода. В качестве контроля, только РВ8 добавляют в том же количестве и инкубацию осуществляют таким же образом. После инициирования инкубации, жизнеспособные клетки подсчитывают с течением времени в соответствии со способом, описанным в «8окй1к1 Ва1уо по Суи!ки» (кесопб еб.), Акакига 8йиррап, еб. Ьу №рроп 8окй1к1 Ва1уо Саккад 26-28 (1990), а именно методом прокрашивания Трипан Голубым на счетной камере.

Результаты представлены на фиг. 31, которая показывает взаимосвязь между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде АС8 клеток, к которой был добавлен препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, при различных концентрациях. На этой фигуре, абсцисса соответствует времени инкубации (час), в то время как ордината соответствует количеству жизнеспособных клеток (х 10⁴ клеток/2 мл) в культуральной среде. На фиг. 31 незаполненный кружок соответствует контролю (нет добавления), заполненный кружок соответствует добавлению 2 мг/мл препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида, заполненный квадрат соответствует до бавлению 3 мг/мл его и заполненный треугольник соответствует добавлению 5 мг/мл его.

В результате, АС8 клетки, к которым добавляли РВ8, демонстрируют значительное увеличение в количестве клеток, в то время как АС8 клетки, к которым добавляли препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1 при конечной концентрации 3 мг/мл или более, демонстрируют, заметное уменьшение в количестве клеток, и рост клеток, к которым был добавлен 2 мг/мл препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1, в значительной степени, ингибирован.

АС8 клетки, к которым добавляли препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1, демонстрируют типичные характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация клеток. А именно, было обнаружено, что препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, оказывает апаптоз-индуцирующее действие на АС8 клетки, по крайней мере, при концентрации 2 мг/мл и таким образом ингибирует рост клеток.

Препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, растворяют в РВ8 так, чтобы получить концентрацию 20, 30 и 50 мг/мл и обрабатывают фильтром. Затем исследуют их влияние на индуцирование апоптоза тем же самым способом, как описано выше. Таким образом те же результаты получают.

Пример 31.

Относящиеся к ободочной или толстой кишке злокачественные клетки 8\У480 (АТСС ССЬ-228) инкубируют при 37°С в Ь-15 среде (произв. 61Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ДКН Вюкаепсе), обработанной при 56°С в течение 30 мин, и затем суспендируют в Ь-15 среде так, чтобы получить концентрацию 5х10³ клеток/мл. Затем суспензию пипетируют в 24-луночный планшет (произв. РЛЬСОЦ) при отношении 1,8 мл/лунка. К суспензии добавляют 0,2-мл-овые порции 10, 30 и 50 мг/мл растворов препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученного в примере 1, в РВ8, которые были обработаны в автоклаве при 121°С в течение 20 мин, с последующей инкубацией при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода. В качестве контроля, только РВ8 добавляют в том же количестве и инкубацию осуществляют таким же образом. После инициирования инкубации, жизнеспособные клетки подсчитывают с течением времени в соответствии со способом, описанным в «8ох1ик| Ва1уо по СщПхи» (хесопб еб.), Акакига 81иррап, еб. Ьу №рроп 8охНк| Ва1уо 6акка1, 26-28 (1990), а именно методом прокрашивания Трипан Голубым на счетной камере.

Результаты представлены на фиг. 32, которая показывает взаимосвязь между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде 8\У480 клеток, к которым был добавлен препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, при различных концентрациях. На этой фигуре абсцисса соответствует времени инкубации (час), в то время как ордината соответствует количеству жизнеспособных клеток (х 10⁴ клеток/2 мл) в культуральной среде. На фиг. 32 незаполненный кружок соответствует контролю (нет добавления), заполненный кружок соответствует добавлению 1 мг/мл препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида, заполненный квадрат соответствует добавлению 3 мг/мл его и заполненный треугольник соответствует добавлению 5 мг/мл его.

В результате, 8\У480 клетки, к которым добавляли РВ8, демонстрируют значительное увеличение в количестве клеток, в то время как 8\У480 клетки, к которым добавляли препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1 при конечной концентрации 3 мг/мл или более, демонстрируют заметное уменьшение в количестве 1 клеток и рост клеток, к которым был добавлен 1 мг/мл препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1, в значительной степени, ингибирован.

8\У480 клетки, к которым добавляли препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1, демонстрируют типичные характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация клеток. А именно, было обнаружено, что препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, оказывает апоптозиндуцирующее действие на 8\У480 клетки, по крайней мере, при концентрации 1 мг/мл и таким образом ингибирует рост клеток.

Препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, растворяют в РВ8 так, чтобы получить концентрацию 10, 30 и 50 мг/мл и обрабатывают фильтром. Затем исследуют их влияние на индуцирование апоптоза тем же самым способом, как описано выше. Таким образом те же результаты получают.

Пример 32.

Человеческие, относящиеся к ободочной или толстой кишке, злокачественные клетки \УЮг (АТСС ССЬ-218) инкубируют при 37°С в ΌΜΕΜ среде (произв. Оаппрроп Рйагтасеийса1 Со., Ыб.), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ДКН Вюкаепсе) и 1% (произв. Оанирроп Рйагтасеийса1 Со., Иб.), обработанной при 56°С в течение 30 мин, и затем суспендируют в вышеупомянутой среде таким способом, чтобы получить концентрацию 5х10³ клеток/мл. Затем суспензию пипетируют в 24луночный планшет (произв. РАЬСО^ при со отношении 1,8 мл/лунка. К суспензии добавляют 0,2-мл порции 10 мг/мл растворов смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученной в примере 1, сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, полученного в примере 12, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, и сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученного в примере 15, растворенных в РВБ, и обрабатывают в автоклаве при 121°С в течение 20 мин, с последующей инкубацией при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода. В качестве контроля, только РВБ добавляют в том же количестве и инкубацию осуществляют таким же образом. После инициирования инкубации, жизнеспособные клетки подсчитывают с течением времени в соответствии со способом, описанным в «БокЫШ Ва1уо по буйки» (кесопб еб.), Акакига Бкиррап, еб. Ьу №рроп Боккк! Ва1уо Сакка1, 26-28 (1990), а именно методом прокрашивания Трипан Голубым на счетной камере.

Результаты представлены на фиг. 33, которая показывает взаимосвязь между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде νίΌτ клеток, к которым были добавлены смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученная в примере 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, полученный в примере 12, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, и сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 15, таким образом, чтобы получить каждую концентрацию 1 мг/мл. На этой фигуре абсцисса соответствует времени инкубации (час), в то время как ордината соответствует количеству жизнеспособных клеток (х 10⁴ клеток/2 мл) в культуральной среде. На фиг. 33 незаполненный кружок соответствует контролю (нет добавления), заполненный квадрат соответствует сульфированному фукозусодержащему полисахариду-Р, полученному в примере 12 и заполненный кружок соответствует сульфированному фукозусодержащему полисахариду, полученному в примере 15. Р-Рб-3 и Р-Рб-4 демонстрируют, каждый, в основном, ту же самую кривую, как в случае сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученного в примере 15.

В результате, νίΌτ клетки, к которым добавляли РВБ, демонстрируют значительное увеличение в количестве клеток, в то время как \νίΌΓ клетки, к которым добавляли смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов примера 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р примера 12, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, и сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 15, демонстрируют, каждый, уменьшение в количестве клеток.

νίΌτ клетки, к которым добавляли смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов примера 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р примера 12, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, и сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 15, демонстрируют типичные характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация клеток.

А именно, было обнаружено, что смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов примера 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р примера 12, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, и сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 15, оказывают апоптоз-индуцирующее действие на νίΌτ клетки и таким образом ингибируют рост клеток.

Смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученная в примере 1, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, полученный в примере 12, Р-Рб-3 и Р-Рб4, и сульфированный фукозусодержащий полисахарид, полученный в примере 15, каждый, растворяют в РВБ так, чтобы получить концентрацию 10 мг/мл и обрабатывают фильтром. Затем исследуют их влияние на индуцирование апоптоза тем же самым способом, как описано выше. Таким образом, получают те же результаты.

Пример 33.

Человеческие, относящиеся к ободочной или толстой кишке, злокачественные клетки νίΌτ (АТСС ССЬ-218) инкубируют при 37°С в ΌΜΕΜ среде (произв. Оабирроп РйагтасеиДса1 Со., Ыб.), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. 1ЕН Вюкаепсе) и 1% ИЕАА (произв. Оаиирроп РйагтасеиДса1 Со., Ыб.), обработанной при 56°С в течение 30 мин, и затем суспендируют в вышеупомянутой среде таким способом, чтобы получить концентрацию 5х10⁶ клеток/мл. Затем суспензию пипетируют в 24луночный планшет (произв. РАЬСОЫ) при соотношении 1,8 мл/лунка. К суспензии добавляют 0,2-мл-овые порции 10, 30 и 50 мг/мл растворов препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученного в примере 1, в РВБ, которые были обработаны в автоклаве при 121°С в течение 20 мин, с последующей инкубацией при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода. В качестве контроля, только РВБ добавляют в том же количестве и инкубацию осуществляют таким же образом. После инициирования инкубации, жизнеспособные клетки подсчитывают с течением времени в соответствии со способом, описанным в «БокЫк1 Ва1уо по буйки» (кесопб еб.), Акакига Бкиррап, еб. Ьу Мрроп БокШ Вауо бакка1, 26-28 (1990), а именно методом прокрашивания Трипан Голубым на счетной камере.

Результаты представлены на фиг. 34, которая показывает взаимосвязь между временем инкубации и количеством жизнеспособных клеток в культуральной среде νίΌτ клеток, к которой был добавлен препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, при различных концентрациях. На этой фигуре абсцисса соответствует времени инкубации (час), в то время как ордината соответствует количеству жизнеспособных клеток (х 10⁴ клеток/2 мл) в культуральной среде. На фиг. 34 незаполненный кружок соответствует контролю (нет добавления), заполненный квадрат соответствует добавлению 1 мг/мл препарата сульфированного фукозусодержащего полисахарида, заполненный квадрат соответствует добавлению 3 мг/мл его и заполненный треугольник соответствует добавлению 5 мг/мл его.

В результате, ΑιΌγ клетки, к которым добавляли РВ8, демонстрируют значительное увеличение в количестве клеток, в то время как А1Бг клетки, к которым добавляли препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1 при конечной концентрации 3 мг/мл или более, демонстрируют заметное уменьшение количества клеток и рост клеток, к которым добавлен 1 мг/мл препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1, в значительной степени, ингибирован.

А1Бг клетки, к которым добавляли препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида примера 1, демонстрируют типичные характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация клеток. А именно, было обнаружено, что препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, оказывает апоптоз-индуцирующее действие на А1Бг клетки и таким образом ингибируют рост клеток.

Препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида, полученный в примере 1, растворяют в РВ8 так, чтобы получить концентрацию 10, 30 и 50 мг/мл и обрабатывают фильтром. Затем исследуют их влияние на индуцирование апоптоза тем же самым способом, как описано выше. Таким образом, получают те же результаты.

Пример 34.

Клетки НЬ-60 (АТСС ССЬ-240) премиелоцитарного лейкоза человека инкубируют при 37°С 1640 среде (произв. 61Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ЖН Вюкаепсе), обработанной при 56°С в течение 30 мин, и затем суспендируют в А8Р104 среде (произв. АцпотоЮ Со., Ыб.) таким образом, чтобы получить концентрацию 5 х 10⁴ клеток/900 мкл. Затем суспензию пипетируют в 6луночный планшет (произв. РАЬСОК) при соотношении 4,5 мл/лунка.

К суспензии добавляют 0,5-мл порции 10 мг/мл раствора высушенного вымораживанием продукта расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, описанного в примере 19(6), растворенного в 30 мМ Нерек буфере (рН 7), содержащем 120 мМ хлорида натрия, и обрабатывают фильтром с последующей инкубацией при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода. В качестве контроля добавляют только вышеупомянутый буфер в том же количестве и инкубацию осуществляют тем же способом. Спустя 22 и 46 ч после инициирования инкубации, жизнеспособные клетки подсчитывают в соответствии со способом, описанным в «8окЫк1 Вауо по СщПки» (кесопб еб.), Акакига 8киррап, еб. Ьу Νίρροη 8οκ1ιί1<ί Ва1уо Саккак 26-28 (1990), а именно методом прокрашивания Трипан Голубым на счетной камере.

В результате, было обнаружено, что вышеупомянутый высушенный вымораживанием продукт расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р индуцирует апоптоз НЬ-60 клеток и таким образом снижает скорость роста клеток.

Пример 35.

Клетки НЬ-60 премиелоцитарного лейкоза человека суспендируют в КРМ1 1640 среде (произв. 61Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ЖН Вюкаепсе), обработанной при 56°С в течение 30 мин, так, чтобы получить концентрацию 5х10⁴ клеток/900 мкл. К шести порциям этой суспензии добавляют 100-мкл порции 10 мг/мл растворов сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, описанного в примере 19(2), Р-Рб-1, Р-Рб-2, РРб-3 и Р-Рб-4, растворенных в 30 мМ Нерек буфере (рН 7), содержащем 120 мМ хлорида натрия, и обрабатывают фильтром с последующей инкубацией при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода в течение 46 ч.

Спустя 22 и 48 ч после начала инкубации, жизнеспособные клетки в культуральной среде подсчитывают.

Отдельно, клетки НЬ-60 премиелоцитарного лейкоза человека суспендируют в А8Р 104 среде (произв. А_)шото!о Со., Ыб.) таким образом, чтобы получить концентрацию 5х10⁴ клеток/900 мкл. К шести порциям этой суспензии добавляют 100-мкл порции 10 мг/мл растворов сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Р, Р-Рб-1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, растворенные в 30 мМ Нерек буфере (рН 7), содержащем 120 мМ хлорида натрия, и обрабатывают фильтром с последующей инкубацией при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода в течение 40 ч.

Спустя 16 и 40 ч после начала инкубации, жизнеспособные клетки в культуральных средах подсчитывают.

Два типа клеток, инкубированных таким образом, наблюдают под микроскопом, чтобы исследовать степень роста и морфологию клеток.

В результате, все клетки, инкубированные в А8Р 104 среде, к которой были добавлены сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, Р-Рб-1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, демонстрируют типичные характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация клеток. В этих случаях, наблюдали небольшое увеличение в количестве жизнеспособных клеток или клетки были почти полностью уничтожены. В противоположность, клетки, инкубированные в среде, к которой был добавлен только буфер, возросли почти втрое. С другой стороны в случаях клеток, инкубированных в среде 1640 ЕРМ1 все клетки в среде, к которой добавляли Р-Рб-1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4, демонстрируют характеристики апоптоза, такие как сморщивание и фрагментация клеток. В этих случаях, клетки почти полностью уничтожены. В противоположность, клетки, инкубированные в среде, к которой добавляли только буфер, увеличиваются в количестве втрое, в то время как клетки, инкубированные в среде, к которой добавляли сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, увеличивались в количестве приблизительно в 2,5 раза.

Исходя из этих результатов, установлено, что сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р оказывает сильное апоптоз-индуцирующее действие на раковые клетки в свободной от сыворотки среде, в то время как Р-Рб-1, Р-Рб-2, Р-Рб-3 и Р-Рб-4 оказывают сильное апоптоз-индуцирующее действие на раковые клетки как в свободной от сыворотки среде, так и среде, содержащей сыворотку.

Для дополнительного подтверждения, клетки НЬ-60 премиелоцитарного лейкоза человека суспендируют в ЕРМ1 1640 среде (произв. С1Ьсо), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. ЖН Вюзаепсе). обработанной при 56°С в течение 30 мин, так, чтобы получить концентрацию 5х10⁴ клеток/900 мкл. К двум порциям по 9 мл этой суспензии добавляют 1-мл порции 30 мМ Нерез буфера (рН 7), содержащем 120 мМ хлорида натрия и 10 мг/мл раствор Р-Рб-4, растворенного в этом буфере, и обрабатывают фильтрованием. После инкубации при 37°С в течение 16 ч в присутствии 5% диоксида углерода, клетки отделяют от супернатанта центрифугированием.

Клетки, полученные таким образом, суспендируют в 20 мкл 50 мМ Трис гидрохлорид буфере (рН 7,8), содержащем 10 мМ этилендиамин-тетраацетата и 0,5% натрий лауроил саркозината. Затем туда добавляют 1 мкл 10 мг/мл Рибонуклеазы А (произв. §|дта) и смесь обрабатывают при 50°С в течение 30 мин. После добавления 1 мкл 10 мг/мл Протеиназы К, смесь обрабатывают при 50°С в течение 30 мин. Обработанные таким образом клетки используют в качестве пробы и подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле при постоянном напряжении 100 В. Этот гель погружают в раствор этидиум бромида в течение 30 мин и затем состояния ДНК в геле исследуют, используя осветитель для исследования в проходящем свете. В результате, наблюдают ступеньки ДНК, характерные для апоптоза. Для дополнительного подтверждения, вышеуказанную процедуру повторяют, используя актиномицин Ό, известный как реагент, вызывающий апоптоз, в качестве заме нителя вышеупомянутого Р-Рб-4. В результате, наблюдают ступеньки ДНК аналогично случаю с использованием Р-Рб-4.

Исходя из этих результатов, становится ясным, что когда сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р подвергают расщеплению ферментом, расщепляющим эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, данного изобретения, его апоптоз-индуцирующее действие на раковые клетки увеличивается.

Пример 36.

Отбирают пробы венозной крови у здоровой женской особи возраста 21 и здоровой мужской особи возраста 32 и разбавляют в 2 раза раствором, содержащим, на литр раствора, 100 мг глюкозы, 0,74 мг СаС1₂-Н₂О, 19,92 мг МдС1₂, 40,26 мг КС1, 7371 мг №1С1 и 1756,5 мг трис гидрохлорида. Затем осторожно сверху покрывают слоем раствора в два раза большем количестве для отделения лимфоцитов (поставляемого Оайирроп Р11агтасеиОса1 Со., ЬЙ.), который предварительно был помещен в пробирку для центрифугирования, и затем центрифугируют при 18-20°С и 400 х д в течение 30 мин. После завершения центрифугирования, отбирают фракцию лимфоцитов из верхнего слоя раствора для разделения лимфоцитов.

Нормальные лимфоциты, полученные таким образом, добавляют в 24-луночный планшет при соотношении 1,9 х 10⁵/лунка с последующим добавлением туда 1,8-мл порций среды ЕРМ1-1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (обработанной при 56°С в течение 30 мин) и 0,2 мл 5 мг/мл каждого из сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученных в вышеуказанных примерах, и продуктов их расщепления. Затем лимфоциты инкубируют при 37°С. В качестве контроля, только физиологический раствор добавляют в качестве заменителя раствора сульфированного фукозусодержащего полисахарида. После инициирования инкубации, в каждой лунке под микроскопом контролируют морфологические изменения и количество жизнеспособных клеток. В результате не наблюдали никакого различия в морфологии клеток среди лунок, содержащих различные сульфированные фукозусодержащие полисахариды, лунок, содержащих продукты их расщепления и контрольной лунки. Кроме того, наблюдали небольшое различие в количестве жизнеспособных клеток. На день 13 в каждой лунке почти все клетки были уничтожены. Исходя из этих результатов, установлено, что сульфированные фукозусодержащие полисахариды и продукты их расщепления не оказывают токсического действия на нормальные клетки даже при такой концентрации, которая сильно индуцирует апоптоз раковых клеток.

Пример 37. Противораковое действие сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и на твердую злокачественную опухоль.

Клетки мышиной твердой злокачественной опухоли Ме£ЪА (4 х 10⁶ клеток/мышь) подкожно инъецируют в брюшную полость самца ВАЬВ/с мыши в возрасте 8 недель и весом приблизительно 20 г. В дальнейшем, сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и, описанный в примере 6, подкожно инъецируют в то же самое место в дозе 100 мг/кг/день в течение 10 дней. В контрольной группе, инъецируют физиологический раствор таким же образом. Спустя 2 недели, образовавшуюся раковую ткань в брюшной области мыши извлекают и взвешивают. В табл. 2 представлены результаты. А именно, средняя масса опухоли у контрольной группы составляла 1,25 г, в то время как средняя масса опухоли у группы, которой вводили сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и, составляла 0,28 г, что указывает на значительное (р < 0,01 к контролю) противораковое действие. Степень ингибирования составляет 77,6%.

Таблица 2

Мышь (п)	Масса опухоли (г) (значение ± СО)	Степень ингибирования (%)
Контроль ( 8 )	1,25 ± 0,10	-
Изобретение (8)	0,28 ± 0,07	77,6

Пример 38. Канцеростатическое действие сульфированного фукозусодержащего полисахарида.

В дорсальную (заднюю) область девятнадцати самцов 8ргадиге-Эа^1еу крыс в возрасте 6 недель подкожно инъецируют 7,4 мг/кг азоксиметана (произв. №1са1а1 Текдие). В дальнейшем, химическое вещество подкожно вводят в дорсальную область животного раз в неделю до 10ой недели. При введении азоксиметан растворяют в 0,1М фосфатном буфере (рН 6,5), содержащем 0,9% хлорида натрия, и концентрацию раствора контролируют, чтобы каждый раз получить дозу 100 мкл.

Одновременно с первым введением азоксиметана, 70 мл горячего водного экстракта К)е11таше11а сгаккйойа, полученного в соответствии со способом, описанным в примере 1, дают пяти крысам из вышеописанных девятнадцати ежедневно как питьевую воду до 30-ой недели. Этот горячий водный экстракт содержит 2 мг/мл смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов. Таким образом, смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов орально вводят ежедневно в дозе 140 мг/кг/день.

Четырнадцати крысам из вышеописанных девятнадцати дают не сульфированный фукозусодержащий полисахарид, а водопроводную воду в качестве питьевой воды, и этих животных называют контрольной группой.

До 30-ой недели, у всех четырнадцати крыс из пятнадцати крыс контрольной группы наблюдали образование местной злокачественной опухоли в наружном ухе. В группе, которой вводили смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, в противоположность этому, у одной крысы из пяти обнаружена опухоль, что указывает на значительное канцеростатическое действие.

До 30-ой недели в контрольной группе умерли три крысы, в то время как в группе с введением смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов выжили все животные. На 30-ую неделю средняя масса тела контрольной группы и группы с введением смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов составляла 716 г и 817 г, соответственно. С другой стороны, средняя масса тела группы (пять крыс), которой не вводили азоксиметан, составляла 788 г. Другими словами, прирост массы тела у группы с введением смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, оказался сравнимым с приростом массы тела у группы, которой не вводили азоксиметан.

Затем, из контрольной группы отбирают четыре крысы и им орально вводят ежедневно 40 мл вышеупомянутого горячего водного экстракта К)е11таше11а сга88йо11а (содержащего 80 мг смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов) в качестве питьевой воды, начиная от 30-ой недели. На 36-ой неделе у двух крыс из четырех обнаруживается заметное сморщивание местной злокачественной опухоли на внешнем ухе, тем самым указывая на противораковое действие сульфированных фукозусодержащих полисахаридов.

Как описано выше, было обнаружено, что оральное применение сульфированных фукозусодержащих полисахаридов является эффективным в предотвращении канцерогенеза, вызванного канцерогенным химическим веществом, предотвращении ингибировании прироста массы тела благодаря канцерогенному химическому веществу и сокращению раковых тканей.

Пример 39. Инъекция.

Смесь сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, полученную в примере 1, растворяют в воде для инъекции, получая 5% раствор. Этот раствор упаковывают в ампулы для сушки вымораживанием в количестве 50 мг/ампула сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, а затем подвергают сушке вымораживанием. Отдельно, 2 мл физиологического раствора добавляют в качестве растворителя.

Пример 40. Инъекция.

Получают препарат для инъекции следующего состава:

Сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и (пример 12) 40 мг

Физиологический раствор д.8 мл/ампула

Аналогично, получают другой препарат для инъекции с использованием сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Г примера 12.

Пример 41. Таблетка.

Получают таблетку следующего состава: Препарат сульфированного фукозусодержащего полисахарида (пример 1) 10 мг

Кукурузный крахмал 65 мг

Карбоксиметилцеллюлоза 20 мг

Поливинилпирролидон 3 мг

Стеарат магния 2мг

100 мг/таблетка

Пример 42. Инъекция.

Г-Гб-1 растворяют в воде для инъекции, получая 5% раствор. Этот раствор упаковывают в ампулы для сушки вымораживанием в количестве 50 мг/ампула сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, а затем подвергают сушке вымораживанием. Отдельно, 2 мл физиологического раствора добавляют в качестве растворителя.

Пример 43. Инъекция.

Получают препарат для инъекции следующего состава:

Высушенный вымораживанием продукт расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Г (полученный в примере 19(6)) 40 мг

Физиологический раствор д.5.

мг/ампула Пример 44. Таблетка.

Получают таблетку следующего состава: Высушенный вымораживанием продукт расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Г (полученный в примере 19(6)) 10 мг

Кукурузный крахмал 65 мг

Карбоксиметилцеллюлоза 20 мг

Поливинилпирролидон 3 мг

Стеарат магния 2 мг

100 мг/таблетка

Действия изобретения

Данное изобретение обеспечивает лекарственные средства, которые имеют индуцирующее апоптоз действие на ненужные или патогенные клетки, которые индуцируют апоптоз патологически поврежденных клеток при болезнях, ассоциируемых с аномальной пролиферацией клеток, таких как злокачественная опухоль (рак) и вирусные заболевания, и таким образом являются полезными для предотвращения и лечения различных заболеваний. При раке пищеварительного тракта, такого как рак, относящийся к оболочной или толстой кишке, или рак желудка, в частности, апоптоз раковых клеток может индуцироваться оральным введением лекарственных средств данного изобретения. Таким образом, лекарственные средства данного изобретения, которые содержат в качестве активного ингредиента сульфированные фукозусодержащие полисахариды и/или продукты их расщепления, находящиеся в натуральной пище, являются противораковыми лекарственными средствами, чрезвычайно подходящими для рака в областях пищеварительного тракта. Лекарственные средства данного изобретения, кроме того, оказывают канцеростатическое действие и таким образом могут предотвращать канцерогенез, вызванный канцерогенными химическими веществами. Благодаря происхождению из годных в пищу веществ, таких как съедобные коричневые водоросли и морской огурец, лекарственные средства данного изобретения могут поставляться по низкой цене в большом количестве и они непревзойденны по своей высокой безопасности. Кроме того, ежедневное потребление пищи или напитков, содержащих сульфированные фукозусодержащие полисахариды и/или продукты их расщепления, способствует поддержанию и улучшению здоровья человека. Данное изобретение, кроме того, обеспечивает способ индуцирования апоптоза, который применим к исследованиям для раскрытия механизма апоптоза, разработки ингибиторов индукции апоптоза и т.п.

Данное изобретение, кроме того, обеспечивает сульфированный фукозусодержащий полисахарид-и и продукты его расщепления, которые, в основном, свободны от сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Г и из которых были удалены высоко реакционноспособные окрашивающие вещества, полезные в областях инженерии сахарной цепи, медицины и т.п. Также, разработан способ их эффективного получения.

Данное изобретение, кроме того, обеспечивает сульфированный фукозусодержащий полисахарид-Г и продукты его расщепления, которые, в основном, свободны от сульфированного фукозусодержащего полисахарида-и и из которых удалены высоко реакционноспособные окрашивающие вещества, полезные в областях сахарной цепной инженерии, медицины и т.п. Кроме того, разработан способ их эффективного получения.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, который может быть использован для анализа структуры сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Г, расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Г и получения продуктов расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Г, полезных для детектирования биологических активностей сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Г; способ получения этого фермента; и продукты расщепления сульфированного фукозусодержащего полисахарида-Г, имеющие сильное индуцирующее апоптоз действие на

100 раковые клетки, которые получают, используя этот фермент.

Благодаря данному изобретению, фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид-Р, который нельзя получить в стабильном состоянии обычными способами, можно получить в высоко стабильном состоянии в присутствии ионов кальция. Кроме того, согласно данному изобретению, фермент, расщепляющий эндосульфированный фукозусодержащий полисахарид, может очень эффективно действовать в присутствии ионов кальция.

Claims (30)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Индуктор апоптоза, включающий сульфированный(ые) фукозусодержащий(ие) полисахарид(ы) и/или продукт(ы) его(их) расщепления, причем указанный(ые) сульфированный (ые) фукозусодежащий(ие) полисахарид(ы) имеет(ют) следующие физико-химические свойства:

   (а) составляющий его(их) сахарид содержит уроновую кислоту и (б) будучи расщепленным(и) фукоиданазой, продуцируемой Р1ауоЬас1епит 8р. 8А-0082 (РЕКМ ВР-5402), образует, по крайней мере, одно из соединений, выбранных из соединений, представленных следующими формулами (Ι), (II) и (III):

   I он он
2. 2. Индуктор апоптоза, содержащий сульфированный(ые) фукозусодержащий(ие) полисахарид(ы) и/или продукты его(их) расщепления, причем указанный(ые) сульфированный(ые) фукозусодержащий(ие) полисахарид(ы), имеет(ют) следующие физико-химические свойства:

   (а) составляющий его(их) сахарид, в основном, свободен от уроновой кислоты;

   (б) в основном, не способен расщепляться фукоиданазой, продуцируемой Р1ауоЬас1епит 8р. 8А-0082 (РЕКМ ВР-5402);

   (в) способен расщепляться ферментом, продуцируемым А Него топах 8р. 8Ν-1009 (РЕКМ ВР-5747), осуществляющим эндорасщепление сульфированного фукозусодержащего полисахарида;

   (г) образует осадок с избытком хлорида цетилпиридиния при концентрации соли около

   1,5 М.
3. 3. Индуктор апоптоза по п.1, в котором указанный продукт расщепления является соединением, выбранным из соединений, представленных следующими формулами (I), (II) и (III):
4. 4. Индуктор апоптоза по п.2, который является продуктом расщепления, полученным обработкой сульфированного(ых) фукозусодержащего(их) полисахарида(ов) ферментом, осуществляющим эндорасщепление сульфированного фукозусодержащего полисахарида, продуцируемым А1 (его топах 8р. 8Ν-1009 (РЕКМ ВР5747) и действующим на сульфированные фуко

   101

   102 зусодержащие полисахариды и расщепляющим указанные сульфированные фукозусодержащие полисахариды, имеющие следующие физикохимические свойства:

   (а) составляющий их сахарид, в основном, свободен от уроновой кислоты; и (б) в основном, не способен расщепляться фукоиданазой, продуцируемой Е1ауоЬас1егшт 8р. БА-0082 (ЕЕКМ ВР-5402), причем указанный фермент имеет оптимальное значение рН, составляющее приблизительно от 7 до 8, и оптимальную температуру действия в диапазоне приблизительно от 30 до 35°С.
5. 5. Индуктор апоптоза по п.2, содержащий продукт расщепления, получаемый обработкой сульфированного фукозусодержащего полисахарида фукоиданазой, продуцируемой Е1ауоЬас1епит 8р. БА-0082 (ЕЕКМ ВР-5402), и не удаляемый ультрафильтрационной мембраной с размером пор 100000.
6. 6. Индуктор апоптоза по п.2, содержащий продукт расщепления, который получают инкубацией Е1ауоЬас1егшт 8р. БА-0082 (ЕЕКМ ВР5402) в присутствии сульфированного фукозусодержащего полисахарида и фракционированием из полученной таким образом культуральной среды и который не удаляется ультрафильтрационной мембраной с размером пор 100000.
7. 7. Индуктор апоптоза по п.2, содержащий продукт расщепления, полученный расщеплением сульфированного фукозусодержащего полисахарида кислотой.
8. 8. Индуктор апоптоза по п.7, в котором указанный продукт расщепления представляет собой продукт расщепления, подвергнутый фракционированию по молекулярным массам.
9. 9. Индуктор апоптоза по любому из пп.1, 2, 5, 6, 7, в котором указанный сульфированный фукозусодержащий полисахарид и/или продукт(ы) его расщепления происходит(ят) из Ю)е11тап1е11а сга881£ойа, Ьатшапа )арошса, Еиси8 У181си1о8и8, ипбапа ртпабПба или Бйсйори8 |арошси8.
10. 10. Способ индуцирования апоптоза, который включает использование в качестве активного ингредиента сульфированного(ых) фукозусодержащего(их) полисахарида(ов) и/или продукта(ов) его(их) расщепления, причем указанный(ые) сульфированный(ые) фукозусодержащий(ие) полисахарид(ы) имеет(ют) следующие физико-химические свойства:

    (а) составляющий его(их) сахарид содержит уроновую кислоту и (б) при расщеплении фукоиданазой, продуцируемой Е1ауоЬас1егшт 8р. БА-0082 (ЕЕКМ ВР-5402), образует, по крайней мере, одно из соединений, выбранных их соединений, представленных следующими формулами (Ι), (ΙΙ) и (III):
11. 11. Способ индуцирования апоптоза, включающий использование в качестве активного ингредиента сульфированного(ых) фукозусодержащего(их) полисахарида(ов) и/или продукта(ов) его(их) расщепления, причем указанный(ые) сульфированный(ые) фукозусодержащий(ие) полисахарид(ы) имеет(ют) следующие физико-химические свойства:

    (а) составляющий его(их) сахарид, в основном, свободен от уроновой кислоты;

    (б) в основном, не способен расщепляться фукоиданазой, продуцируемой Е1ауоЬас1егшт 8р. БА-0082 (ЕЕКМ ВР-5402);

    (в) способен расщепляться ферментом, продуцируемым А11еготопа8 8р. Б№1009 (ЕЕКМ ВР-5747), осуществляющим эндорасщепление сульфированного фукозусодержащего полисахарида;

    (г) образует осадок с избытком хлорида цетилпиридиния при концентрации соли около

    1,5 М.
12. 12. Способ индуцирования апоптоза по п.10, в котором указанный продукт расщепления представляет собой соединение, выбранное из соединений, представленных следующими формулами (I), (II) и (III):

    103

    104
13. 13. Способ индуцирования апоптоза по п.11, в котором указанный(ые) продукт(ы) расщепления, полученный(ые) обработкой сульфированного(ых) фукозусодержащего(их) полисахарида(ов) ферментом, продуцируемым Абеготопак 8р. 8Ν-1009 (РЕКМ ВР-5747), осуществляющим эндорасщепление сульфированного фукозусодержащего полисахарида и действующим на сульфированные фукозусодержащие полисахариды и расщепляющим указанные сульфированные фукозусодержащие полисахариды, имеют следующие физико-химические свойства:

    (а) составляющий их сахарид, в основном, свободен от уроновой кислоты и (б) в основном, не способен расщепляться фукоиданазой, продуцируемой Р1ауоЬас!егшт 8р. 8А-0082 (РЕКМ ВР-5402);

    причем указанный фермент имеет оптимальное значение рН, составляющее приблизительно от 7 до 8, и оптимальную температуру действия в диапазоне от приблизительно 30 до 35°С.
14. 14. Способ индуцирования апоптоза по п.11, который включает использование в качестве активного ингредиента продукта расщепления, полученного обработкой сульфированного фукозусодержащего полисахарида фукоиданазой, продуцируемой Р1ауоЬас!егшт 8р. 8А0082 (РЕКМ ВР-5402) и не удаляемого ультрафильтрационной мембраной с размером пор 100000.
15. 15. Способ индуцирования апоптоза по п.11, включающий использование в качестве активного ингредиента продукта расщепления, который получают инкубацией Р1ауоЬас!егшт 8р. 8А-0082 (РЕКМ ВР-5402) в присутствии сульфированного фукозусодержащего полисахарида и фракционированием из полученной таким образом культуральной среды и который не удаляется ультрафильтрационной мембраной с размером пор 100000.
16. 16. Способ индуцирования апоптоза по п.11, включающий использование в качестве активного ингредиента продукта расщепления, полученного расщеплением сульфированного фукозусодержащего полисахарида кислотой.
17. 17. Способ индуцирования апоптоза по п.16, в котором указанный продукт расщепления представляет продукт расщепления, подвергнутый фракционированию по молекулярным массам.
18. 18. Способ индуцирования апоптоза по любому из пп. 10, 11, 14, 15, 16, в котором указанный сульфированный фукозусодержащий полисахарид и/или продукт(ы) его расщепления происходят из К)е11таше11а сга881£оба, Ьаттапа )арошса, Рисик У181си1о8и8, Ипбапа рбтабПба или 8бсбори8 )арошси8.
19. 19. Противораковое лекарственное средство, содержащее индуктор апоптоза по любому из пп.1-9.
20. 20. Канцеростатическое лекарственное средство, содержащее индуктор апоптоза по любому из пп.1-9.
21. 21. Сульфированные фукозусодержащие полисахариды, имеющие следующие физикохимические свойства:

    (1) составляющий их сахарид содержит уроновую кислоту и (2) будучи расщепленным фукоиданазой, продуцируемой Р1ауоЬас!егшт 8р. 8А-0082 (РЕКМ ВР-5402), образует, по крайней мере, одно из соединений, выбранных из соединений, представленных следующими формулами (I),

    105

    106
22. 22. Способ получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов по п.21, который включает стадию обработки смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящих из морских водорослей или голотурии, химическим соединением, способным агрегировать кислые полисахариды в присутствии солей, и удаление осадка.
23. 23. Способ получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов по п.21, который включает стадию обработки смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящих из морских водорослей или голотурии, анионообменной смолой в присутствии двухвалентного катиона для поглощения целевых полисахаридов.
24. 24. Способ получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов по п.21, включающий стадию удаления из них сопутствующих красящих веществ с помощью полисахаридного вещества или вещества, имеющего анионообменную группу.
25. 25. Сульфированные фукозусодержащие полисахариды, имеющие следующие физикохимические свойства:

    (а) составляющий их сахарид, в основном, свободен от уроновой кислоты;

    (б) в основном, не способен расщепляться фукоиданазой, продуцируемой Е1ауоЬас!егшт кр. 8А-0082 (ЕЕВМ ВР-5402);

    (в) способен расщепляться ферментом, продуцируемым А1 (его то пак кр. 8Ν-1009 (ЕЕВМ ВР-5747), осуществляющим эндорасще пление сульфированных фукозусодержащих полисахаридов;

    (г) образует осадок с избытком хлорида цетилпиридиния при концентрации раствора соли около 1,5 М.
26. 26. Способ получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов по п.25, включающий стадию обработки смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящих из морских водорослей или голотурии, расщепляющим ферментом, способным расщеплять сульфированные фукозусодержащие полисахариды, содержащие уроновую кислоту, или микроорганизмом, продуцирующим указанный фермент для поглощения целевых сульфированных фукозусодержащих полисахаридов.
27. 27. Способ получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов по п.25, включающий стадию обработки смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящих из морских водорослей или голотурии, химическим соединением, способным агрегировать кислые полисахариды в присутствии солей, осаждая тем самым целевые полисахариды.
28. 28. Способ получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов по п.25, включающий стадию обработки смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, происходящих из морских водорослей или голотурии, анионообменной смолой в присутствии двухвалентного катиона для поглощения целевых полисахаридов.
29. 29. Способ получения сульфированных фукозусодержащих полисахаридов по п.25, включающий стадию удаления из них сопутствующих красящих веществ с помощью полисахаридного вещества или вещества, имеющего анионообменную группу.
30. 30. Способ получения смеси сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, включающий экстракцию смесей сульфированных фукозусодержащих полисахаридов, содержащих сульфированную фукозу, из морских водорослей, при совместном присутствии ионов ацетата и кальция.