CN100406023C - 细胞凋亡诱导物 - Google Patents

细胞凋亡诱导物 Download PDF

Info

Publication number
CN100406023C
CN100406023C CNB2004100396908A CN200410039690A CN100406023C CN 100406023 C CN100406023 C CN 100406023C CN B2004100396908 A CNB2004100396908 A CN B2004100396908A CN 200410039690 A CN200410039690 A CN 200410039690A CN 100406023 C CN100406023 C CN 100406023C
Authority
CN
China
Prior art keywords
sulfur acid
fucose polysaccharide
acid fucose
polysaccharide
mixture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB2004100396908A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1528340A (zh
Inventor
酒井武
北野秀夫
于福功
中山信司
儿岛薰
木村瞳
中西芳邦
片山薰
富永隆生
屿中一夫
猪饲胜重
加藤郁之进
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sugar Lock Engineering Institute Co., Ltd.
Takara Bio Inc
Original Assignee
Sugar Lock Engineering Institute Co Ltd
Takara Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sugar Lock Engineering Institute Co Ltd, Takara Bio Inc filed Critical Sugar Lock Engineering Institute Co Ltd
Publication of CN1528340A publication Critical patent/CN1528340A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100406023C publication Critical patent/CN100406023C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01078—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/2488—Mannanases
    • C12N9/2494—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01044—Fucoidanase (3.2.1.44)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及包含含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物的细胞凋亡诱导物、抗癌药物和防癌药物；以及使用含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物作为活性成分来诱导细胞凋亡的方法。本发明还涉及一种降解酶，这种酶在产生含硫酸岩藻糖多糖的降解产物时是有用的。

Description

细胞凋亡诱导物
本申请是同名中国专利申请97191855.4号的分案申请，原案国际申请日1997年1月21日，国际申请号PCT/JP97/00116。
本发明涉及可用于医药品的细胞凋亡诱导物、抗癌药物和制癌药物。本发明还提供了一种诱导细胞凋亡的方法，这种方法在例如，解释细胞凋亡机理和筛选细胞凋亡诱导抑制剂上是有用的。本发明还提供了纯化的含硫酸岩藻糖多糖及其降解产物以及可用于产生含硫酸岩藻糖多糖的降解产物并研究其结构的含硫酸岩藻糖多糖的降解酶。
近几年，在关于细胞组织的死亡方面，细胞凋亡(apoptosis，自我破碎细胞死亡或者自杀性细胞死亡)的方式已经引起了人们的关注。
人们认为，细胞凋亡与坏死意义上的病理细胞死亡不同，是在基因中固定编程的死亡。也就是一些外部或者内部因子触发细胞凋亡的编程基因的活化。在基因基础上，随后生物合成了编程的死亡基因蛋白质并且分解细胞本身，因此引起死亡。
如果可能，在所需的组织或者细胞中表达细胞凋亡是很有意义的，因为可以从活体中自发地除去不必要的或者病原细胞。
本发明目的在于开发具有诱导细胞凋亡的高度安全的化合物，并且因此提供含有这些化合物的细胞凋亡诱导物、抗癌药物和制癌药物和通过使用这些化合物作为活性成分来诱导细胞凋亡的方法。本发明的目的还在于提供能够降解本发明的化合物的酶，所说的酶在产生这些化合物的降解产物方面是有用的。
总之，本发明的第一项发明涉及细胞凋亡的诱导物，其特征在于包含含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物。
本发明的第二项发明涉及诱导细胞凋亡的方法，其特征在于使用含有硫酸岩藻糖的岩藻糖多糖和/或其降解产物作为活性成分。
本发明的第三项发明涉及抗癌药物，其特征在于含有本发明的第五项或者第六项发明的含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物。
本发明的第四项发明涉及包含含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物的制癌药物。
本发明的第五项发明涉及具有下列理化性质的含硫酸岩藻糖多糖：
(1)组成糖类：含有糖醛酸；和
(2)由黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的岩藻依聚糖分解酶降解，结果形成了至少一种由下列化学式(I)、(II)和(III)代表的化合物：
Figure C20041003969000091
Figure C20041003969000101
本发明的第六项发明涉及具有下列理化性质的含硫酸岩藻糖多糖：
(1)组成糖类：实质上不含有糖醛酸；和
(2)实质上不能被黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的岩藻依聚糖分解酶降解。
本发明的第七项发明涉及本发明的第五项发明的含硫酸岩藻糖多糖的制造方法，其特征在于含有使用能够聚合酸性多糖的药物，在盐存在下处理含硫酸岩藻糖多糖的混合物，并且除去沉淀的步骤。
本发明的第八项发明涉及本发明的第五项发明的含硫酸岩藻糖多糖的制造方法，其特征在于含有使用阴离子交换树脂，在二价阳离子存在下处理含硫酸岩藻糖多糖的混合物，并提取目的多糖的步骤。
本发明的第九项发明涉及产生本发明的第五项发明的含硫酸岩藻糖多糖的制造方法，其特征在于含有在产生本发明的第五项发明的含硫酸岩藻糖多糖的过程中，通过使用多糖物质或者具有阴离子交换基团的物质除去共存的着色物质的步骤。
本发明的第十项发明涉及本发明的第六项发明的含硫酸岩藻糖多糖的制造方法，包括使用能够降解含有糖醛酸的含硫酸岩藻糖多糖的降解酶或者含有此酶的微生物处理含硫酸岩藻糖多糖的混合物，并收集目的多糖的步骤。
本发明的第十一项发明涉及本发明的第六项发明的含硫酸岩藻糖多糖的制造方法，包括使用能够聚合酸性多糖的药物，在盐的存在下处理含硫酸岩藻糖多糖的混合物和沉淀出目的多糖的步骤。
本发明的第十二项发明涉及本发明的第六项发明的含硫酸岩藻糖多糖的制造方法，包括在二价阳离子存在下，使用阴离子交换树脂处理含硫酸岩藻糖多糖的混合物以吸收所说的多糖的步骤。
本发明的第十三项发明涉及本发明的第六项发明的含硫酸岩藻糖多糖的制造方法，包括在本发明的第六项发明的含硫酸岩藻糖多糖的过程中，通过使用多糖物质或者具有阴离子交换基团的物质除去共存的着色物质的步骤。
本发明的第十四项发明涉及含硫酸岩藻糖多糖混合物的制造方法，其特征在于在乙酸根离子和钙离子存在下，从海藻类中提取在本发明的第七项、第八项、第十项、第十一项或者第十二项发明中使用的含硫酸岩藻糖多糖混合物。
本发明的第十五项发明涉及具有下列理化性质的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶：
(i)功能：作用于具有下列理化性质的含硫酸岩藻糖多糖并降解该含硫酸岩藻糖多糖：
(a)组成糖类：实质上不含有糖醛酸；和
(b)实质上不能被黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的岩藻依聚糖分解酶降解。
不作用于具有下列理化性质的含硫酸岩藻糖多糖：
(c)组成糖类：含有糖醛酸；和
(d)能被黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的岩藻依聚糖分解酶降解以形成至少一种由下列化学式(I)、(II)和(III)代表的化合物：
Figure C20041003969000131
Figure C20041003969000141
(ii)最适pH值：大约pH 7-8；和
(iii)最适温度：大约30-35℃。
本发明的第十六项发明涉及一种酶组合物，这种组合物包含本发明的第十五项发明的钙源和含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶。
本发明的第十七项发明涉及本发明的第十五项发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的制造方法，包括培养能够产生本发明的第十五项发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的交替单胞菌属和从培养基中回收所说的酶。
本发明的第十八项发明涉及一种含硫酸岩藻糖多糖的降解产物，这种降解产物是通过使用本发明的第十五项发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶处理本发明的第六项发明的含硫酸岩藻糖多糖所获得的。
本发明人成功地获得了各种纯化的含硫酸岩藻糖多糖或其降解产物，并且考查了这些物质的生物活性。结果，他们发现这些物质诱导癌细胞的细胞凋亡，并且具有强烈的抗癌作用。他们还发现含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物具有强烈的制癌作用。他们还成功地分离了能够降解含硫酸岩藻糖多糖并且在制备本发明的降解产物时有用的酶，从而完成了本发明。
附图的简要说明
图1.显示含硫酸岩藻糖多糖的沉淀比。
图2.显示通过凝胶过滤方法用Sephacryl S-500测定的含硫酸岩藻糖多糖-U的分子量分布。
图3.是含硫酸岩藻糖多糖-U的IR光谱。
图4.是含硫酸岩藻糖多糖-U的1H-NMR谱。
图5.显示从L-柱中洗脱的糖类化合物(a)的吡啶基-(2)-氨基化物(PA-a)的洗脱模式。
图6.显示从L-柱中洗脱的糖类化合物(b)的吡啶基-(2)-氨基化物(PA-b)的洗脱模式。
图7.显示从L-柱中洗脱的糖类化合物(c)的吡啶基-(2)-氨基化物(PA-c)的洗脱模式。
图8.是糖类化合物(a)的质谱图(负测量)。
图9.是糖类化合物(b)的质谱图(负测量)。
图10.是糖类化合物(c)的质谱图(负测量)。
图11.是糖类化合物(a)的质-质谱图(负测量)。
图12.是糖类化合物(b)的质-质光谱图(负测量)。
图13.是糖类化合物(c)的质-质光谱图(负测量)。
图14.是糖类化合物(a)的1H-NMR谱。
图15.是糖类化合物(b)的1H-NMR谱。
图16.是糖类化合物(c)的1H-NMR谱。
图17显示通过凝胶过滤方法用聚丙烯酰胺葡聚糖S-500测定的含硫酸岩藻糖多糖-F的分子量分布。
图18.是含硫酸岩藻糖多糖-F的IR光谱。
图19.是含硫酸岩藻糖多糖-F的1H-NMR谱。
图20.显示了本发明得到的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的相对活性和pH值之间的关系。
图21.显示了本发明得到的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的相对活性和温度之间的关系。
图22.显示通过凝胶过滤方法，使用Cellulofine GCL-300用本发明获得的含内-硫酸岩藻糖多糖降解酶降解含硫酸岩藻糖多糖-F前后的分子量分布。
图23.显示了本发明得到的含内-硫酸岩藻糖多糖降解酶的相对活性与反应混合物中的钙离子浓度之间的关系。
图24.显示了在实施例19-(6)中，用本发明得到的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶降解后，通过凝胶过滤方法使用Cellulofine GCL-300测定的含硫酸岩藻糖多糖-F的分子量分布。
图25.是用本发明得到的含内-硫酸岩藻糖多糖降解酶降解的含硫酸岩藻糖多糖-F的IR光谱。
图26.是用本发明得到的含内-硫酸岩藻糖多糖降解酶降解的含硫酸岩藻糖多糖-F的1H-NMR谱。
图27.显示了培养时间与HL-60细胞培养液中活细胞数之间的关系，所说的培养液中已经按浓度为1mg/ml加入了实施例1、15和18中获得的含硫酸岩藻糖多糖。
图28显示培养时间与MOLT-3细胞培养液中的活细胞数之间的关系，其中向MOLT-3细胞培养液中加入了实施例1得到的含硫酸岩藻糖多糖、实施例12得到的含硫酸岩藻糖多糖-F、实施例15和17中得到的含硫酸岩藻糖多糖和葡聚糖硫酸酯。
图29.显示培养时间和HCT 116细胞培养液中的活细胞数之间的关系，其中向HCT 116细胞培养液中加入了在实施例1中所获得的包含含硫酸岩藻糖多糖的标品；在实施例1中所获得的含硫酸岩藻糖多糖的混合物；在实施例12中所获得的含硫酸岩藻糖多糖-U和含硫酸岩藻糖多糖-F、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4；在实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖和肝素和葡聚糖硫酸酯。
图30.显示培养时间和HCT 116细胞培养液中的活细胞数之间的关系，其中以不同的浓度向HCT 116细胞培养液中加入了在实施例1中所获得的含硫酸岩藻糖多糖的标品。
图31.显示培养时间和AGS细胞培养液中的活细胞数之间的关系，其中以不同的浓度向AGS细胞培养液中加入实施例1中所获得的含硫酸岩藻糖多糖标品。
图32.显示培养时间和SW 480细胞培养液中的活细胞数之间的关系，其中以不同的浓度向SW 480细胞培养液中加入实施例1中所获得的含硫酸岩藻糖多糖标品。
图33.显示培养时间和WiDR细胞培养液中的活细胞数之间的关系，其中向WiDR细胞培养液中加入实施例1中所获得的含硫酸岩藻糖多糖标品；在实施例12中所获得的含硫酸岩藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4和在实施例15中所获得的含硫酸岩藻糖多糖。
图34.显示培养时间和WiDR细胞培养液中的活细胞数之间的关系，其中以不同的浓度向WiDR细胞培养液中加入实施例1中所获得的含硫酸岩藻糖多糖标品。
现在，以更详细的方式描述本发明。
用于本发明的含硫酸岩藻糖多糖没有特别的限制。例如，可以使用那些来源于墨角藻(Fucus vesicilosus)、Kjellmaniella crassifolia、昆布Laminaria japonica、裙带菜Undaria pinnatifida和任何其它的褐藻(褐藻门)的含硫酸岩藻糖多糖。已知在海参的体壁中有含硫酸岩藻糖多糖。在本发明中也可以使用源于海参的含硫酸岩藻糖多糖。此外，在本发明中使用了含硫酸岩藻糖多糖的降解产物。例如，可以通过化学降解方法(如用酸处理)和物理降解方法(如超声处理)或者酶促降解方法降解含硫酸岩藻糖多糖。
本发明人已发现当将如上所述的各种含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物加入到癌细胞的培养基中，在加入后的一至几天内癌细胞出现细胞凋亡。同时也确认对正常细胞没有任何毒性。
本文所使用的术语″含硫酸岩藻糖多糖″是指没有任何特殊限定的硫酸化的在分子中具有岩藻糖的多糖。这种多糖的例子包括褐藻和海参中的多糖[《多糖类化学》，左右田德郎监修，江上不二夫编辑、共立出版株式会社，1955年12月15日出版p.319，p.321]。一般把来源于褐藻的含硫酸岩藻糖多糖称为岩藻依聚糖、岩藻多糖和脱氧半乳聚糖。虽然已知这种多糖具有几种分子类型，但是一般把这些含硫酸岩藻糖多糖称为岩藻聚糖。例如，据报导由Sigma化学公司生产的岩藻依聚糖可以分成13种分子类型[Carbonhydrate Research，255，213-224(1994)]，其中包括一种以岩藻糖作为主要组分的组和另一种含有百分之几的糖醛酸且组成糖类富含岩藻糖和甘露糖的组。已经有人报道过，这些含硫酸岩藻糖多糖具有各种生物活性，例如加强巨噬细胞活性、抑制癌转移和抑制血液凝聚活性。然而，含硫酸岩藻糖多糖涉及各种分子形式，因此需要分离和纯化含硫酸岩藻糖多糖，以确认哪一种分子形式实际上具有某种特定的活性。含硫酸岩藻糖多糖涉及那些实质上不含糖醛酸并以岩藻糖作为主要组成成分的多糖；和那些含有百分之几的糖醛酸并富含岩藻糖和甘露糖(作为组成糖类)的多糖。在下文，将实质上不含有糖醛酸的含硫酸岩藻糖多糖称为含硫酸岩藻糖多糖-F，将那些含有糖醛酸的含硫酸岩藻糖多糖称为含硫酸岩藻糖多糖-U，以上两种的混合物的含硫酸岩藻糖多糖的混合物称为含硫酸岩藻糖多糖混合物。
虽然已经知道分离含硫酸岩藻糖多糖-F和含硫酸岩藻糖多糖-U的方法，例如分子量分级分离和使用阴离子交换树脂分离，但是这些分离方法是不够的，这使得大规模制备用作药物或者功能性食品的含硫酸岩藻糖多糖变得困难。
另外，已知着色物质很难从含硫酸岩藻糖多糖完全除去。市售的岩藻聚糖产物等也都含有着色物质物质。通常，这些由多酚聚合物组成的着色物质具有高度的反应活性，并且阻碍各种酶促反应，抑制细胞的生长。此外，这些着色物质有时不可逆地吸附到与之接触的树脂或者由树脂制成的容器上。因此，必需从含硫酸岩藻糖多糖中除去这些具有高度反应活性的着色物质，以便精确地检测所说的含硫酸岩藻糖多糖的生物活性，并且防止污染容器或者树脂。
已知当从例如，褐藻或者其的乙醇洗涤的残留物中提取含硫酸岩藻糖多糖混合物时，通过加入可溶性的乙酸钡、氯化钡、氯化钙等可以抑制抽提物中的含有藻酸的杂质，这有利于随后的纯化。然而，加入可溶性的钡盐给废液体处理带来困难。另一方面，氯化钙与海藻类混合时，引起pH值发生变化，为得到不可降解的含硫酸岩藻糖多糖必须对pH值进行调节。在调节pH值的步骤中，由于海藻类胶粘和聚合在一起，在随后的抽提中的效率会降低，或者固/液分离时过滤变得困难。
虽然正在期待含硫酸岩藻糖多糖的工业实用性，但是目前既没有任何已经对分子种类进行足够分级分离的含硫酸岩藻糖多糖-F或者含硫酸岩藻糖多糖-U的上市产物，也没有有关有效生产含硫酸岩藻糖多糖的方法的报告。此外，如上所述市售的含硫酸岩藻糖多糖含有具有高度反应活性的着色物质。
虽然含硫酸岩藻糖多糖具有各种活性，但是如上所述，由于这种多糖分级制备上的困难，迄今为止实质上既没有获得含硫酸岩藻糖多糖-F，也没有获得含硫酸岩藻糖多糖-U。
然而，本发明实质上提供了纯化的含硫酸岩藻糖多糖-U、一种方便地提取这种多糖的方法和生产含硫酸岩藻糖多糖-U的方法。本发明还提供了含硫酸岩藻糖多糖-U，从这种多糖里已经除去了具有高度反应活性的着色物质，通常这种物质很难从含硫酸岩藻糖多糖中除去，其抑制酶促反应并污染树脂等。
此外，本发明实质上提供了纯化的含硫酸岩藻糖多糖-F、一种方便地提取这种多糖的方法和产生含硫酸岩藻糖多糖-F的方法。
本发明还提供了含硫酸岩藻糖多糖-F，从这种多糖里已经除去了具有高度反应活性的着色物质，通常这种物质很难从含硫酸岩藻糖多糖中除去，其抑制酶促反应并污染树脂等。
本发明中使用的含硫酸岩藻糖多糖，可以使用褐藻和海参等具含有含硫酸岩藻糖多糖的物体，例如将其干燥和粉碎而利用。另外可以使用从具有含硫酸岩藻糖多糖的物质中获得的包含含硫酸岩藻糖多糖的提取液或者这种提取液的纯化形式。可以通过公知的方法制备和纯化包含含硫酸岩藻糖多糖的提取物，没有特别限制。
用于本发明的含硫酸岩藻糖多糖的降解产物是通过使用酶促、化学或者物理方法降解含硫酸岩藻糖多糖获得的，也可以通过公知的酶促、化学或者物理方法来降解。
用于本发明的含硫酸岩藻糖多糖和其降解产物包括其药学上可接受的盐。
作为含硫酸岩藻糖多糖的褐藻(可以从其中制备含硫酸岩藻糖多糖)，例如《原色日本海藻图鉴》[山田幸雄序，濑川宗吉著，保育社，22-52页(1977)]中所描述的那些褐藻，例如墨角藻、Kjellmaniella crassifolia、昆布、和裙带菜Undaria pinnatifida等。
作为包含含硫酸岩藻糖多糖的海参，例如特开平91027/1992中所述，例如可以用刺参Stichopus japonicus和玉足海参Holothuria leucospilota等从中制备含硫酸岩藻糖多糖。
在含硫酸岩藻糖多糖的分子中具有硫酸根基团可与各种碱基反应形成盐。当这些含硫酸岩藻糖多糖及其降解产物转化为盐时，就会变得稳定。通常以钠和/或钾盐等形式分离。通过使用阳离子交换树脂(例如Dowex50W)处理这些物质的盐可以将它们转化成游离的含硫酸岩藻糖多糖或其游离降解产物。此外，如果需要，可以将这些盐通过常规的方式进行盐交换反应以便将它们转化成各种所需的盐。对于含硫酸岩藻糖多糖、其降解产物，可以使用药学上可接受的一种，例如碱金属(如钾和钠)盐、碱土金属(如钙、镁和钡)盐、含有有机碱(如吡啶鎓)的盐、铵盐等。
可以通过将褐藻、海参等并研磨来制备包含含硫酸岩藻糖多糖的粉体。
可以通过热水或者稀酸提取包含含硫酸岩藻糖多糖的粉体来制备包含含硫酸岩藻糖多糖的提取液。
为了提取包含含硫酸岩藻糖多糖的提取物，可以根据提取的目的选择合适的提取温度和时间，温度的变化范围为0-200℃，时间的范围为1-360分钟。通常抽提温度和时间的选择范围分别为10-150℃(优选的是50-130℃)和5至240分钟(优选的为10至180分钟)。
有关纯化所说的提取物以提高含硫酸岩藻糖多糖浓度的方法，例如可以使用通过氯化钙、乙酸钡等对含硫酸岩藻糖多糖进行分级分离；通过使用酸性多糖凝集剂(例如氯化十六烷基吡啶鎓盐)对含硫酸岩藻糖多糖进行分级分离；在盐的存在下通过使用酸性多糖凝集剂对含硫酸岩藻糖多糖进行分级分离；凝胶过滤；离子交换层析。如果需要，可以将这些方法结合起来进行纯化。
可以通过已知的用于降解含硫酸岩藻糖多糖的方法来降解含硫酸岩藻糖多糖，例如，使用含硫酸岩藻糖多糖降解酶、通过酸降解和超声处理进行降解。可以按照上述的方法纯化所说的降解产物。
褐藻通常包含多种的含硫酸岩藻糖多糖。至于本发明所使用者对褐藻种类没有特别的限定。例如，可以使用来源于墨角藻、Kjellmaniellacrassifolia、昆布、裙带菜Undaria pinnatifida的褐藻和任何其它的褐藻。
为了产生含硫酸岩藻糖多糖，首先用含水的溶剂提取褐藻。
将要提取的海藻类可以是新鲜的海藻。然而，在提取物的制备前，将褐藻干燥，研成粉，并用60至100％的醇或者丙酮洗涤或者浸在含有甲醛、乙醛、戊二醛、氨等的水溶液中是有利的，这是因为这样可以大量地除去带有着色物质的含硫酸岩藻糖多糖中的杂质。
当从例如，褐藻或它的乙醇洗涤残留物中提取含硫酸岩藻糖多糖时，可以通过加入可溶性的乙酸钡、氯化钡、氯化钙或其它类似物来抑制提取物中的含有藻酸的杂质，这样有利于随后的纯化。由于上述的原因，优选在50-130℃的温度下使用1mM-1M的乙酸钙溶液提取含硫酸岩藻糖多糖。
当藻类较厚，并且粉末颗粒大时，可以观察到最初使用浓度为0.2M或更高的乙酸钙溶液提取时效率很低。在这种情况下，可以首先用水提取含硫酸岩藻糖多糖，然后向提取物中加入乙酸钙，再除去藻酸并沉淀。
当要同时提取含硫酸岩藻糖多糖和藻酸时，或者要在此提取步骤中获得部分的降解产物时，提取的溶剂和条件不作特别限制。在这种情况下，可以使用水、或氯化钠和氯化镁等各种浓度的中性盐的水溶液、柠檬酸、磷酸和盐酸等各种浓度的酸性水溶液、各种浓度的碱性水溶液(例如氢氧化钠和氢氧化钾)。也可以向其中加入缓冲液和防腐剂。此外，提取物的pH值、提取温度和提取时间不作特别限定。然而，通常含硫酸岩藻糖多糖对酸和碱不稳定。因此，当使用酸性或碱性溶液时，容易发生降解。可以通过控制加热温度、加热时间、pH值等来制备任意的降解产物。例如，可以通过使用凝胶过滤、用分子量分级分离膜处理等等来控制降解产物的平均值分子量、分子量分布等。
这就是说，本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U和含硫酸岩藻糖多糖-F的分子量和糖类组分的变化取决于含硫酸岩藻糖多糖物质的收获期、干燥此原料所使用的方法、存储此原料所用的方法、含硫酸岩藻糖多糖的提取条件(如加热条件和pH值)而各异。例如，可以用酸水解含硫酸岩藻糖多糖。另一方面，在碱性条件下，含硫酸岩藻糖多糖的糖醛酸发生β消除而降解。因此，本文描述的含硫酸岩藻糖多糖-U和含硫酸岩藻糖多糖-F的分子量和分子量分布只是一个例子。通过控制含硫酸岩藻糖多糖的处理条件可以很容易改变所说的分子量和分子量分布。例如，可以通过将起始材料在100℃和弱碱性条件下加热1小时并在脱盐步骤中使用孔大小为300的分子筛膜来制备分子量分布为大约1,000至10,000的含硫酸岩藻糖多糖-U和含硫酸岩藻糖多糖-F。可以通过选择适当的处理条件来制备任意分子量和分子量分布的本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U和含硫酸岩藻糖多糖-F。
为从上述的褐藻提取物中除去藻酸和中性糖，可以通过在例如0.2至0.6M的浓度的食盐等盐类的存在下加入酸性多糖凝集剂(例如氯化十六烷基吡啶鎓盐)，直到没有沉淀产生为止，然后收集所说的沉淀。
如果需要，用盐溶液(例如0.2至0.6M的氯化钠)洗涤所得的沉淀，并用饱和的氯化钠乙醇溶液将沉淀中含有的氯化十六烷基吡啶鎓盐洗掉，这样就得到了含硫酸岩藻糖多糖的混合物。为了从所得的含硫酸岩藻糖多糖混合物中除去着色物质，可以将所说的沉淀溶解，然后用阴离子交换树脂或者多糖树脂进行处理，或者进行超滤。或将所得的沉淀脱盐并且冷冻干燥，可以获得干燥的制品。
本发明人发现，本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F和含硫酸岩藻糖多糖-U在浓度为0.6至3M的一种或多种盐存在下对酸性多糖凝集剂有完全不同的反应。
例如，通过使用本发明的方法可以从含硫酸岩藻糖多糖混合物的水溶液中分离本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U。
首先，向含硫酸岩藻糖多糖混合物的水溶液加入一种或多种盐，使总盐浓度为0.6至2M。添加的盐没有特别的限制，例如可以使用氯化钠、氯化钙等。
通常，在盐浓度大约为1.5M时，可以分离本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U以及本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F(参见下文给出的图1的具体描述)。例如，将上述提及的盐的浓度调整到1.5M，然后加入酸性多糖凝集剂(例如氯化十六烷基吡啶鎓盐)，直到不再有沉淀产生，沉淀出了含硫酸岩藻糖多糖-F。除去这些沉淀，可以得到本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U的溶液。根据需要将此溶液浓缩，然后通过向其中加入，例如4倍的乙醇来沉淀溶液中的含硫酸岩藻糖多糖-U。接下来，用饱和的氯化钠乙醇溶液洗涤除去沉淀中的氯化十六烷基吡啶鎓盐，这样就得到了本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U。可以将所得的含硫酸岩藻糖多糖-U溶解，然后进行超滤，就可以从中除去着色物质。脱盐后冷冻干燥可以获得干燥的标品。在此过程中可以加入防腐剂等。
当需要有效地只产生本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F时，在用例如氯化十六烷基吡啶鎓盐凝集作用步骤中的盐浓度调节为2M，而不是0.2至0.6M。这样，所获得的沉淀中只含有本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F。
本发明人已发现，在二价阳离子存在下使用阴离子交换树脂纯化含硫酸岩藻糖多糖时，可以增加每单位树脂上所吸附的含硫酸岩藻糖多糖的量，这样可以更有效地分离含硫酸岩藻糖多糖。即，采用本发明的方法生产本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U时，首先优选以1mM或更高的浓度向含硫酸岩藻糖多糖混合物中加入充当二价阳离子源的化学药品。接下来用含有所说优选的浓度为1mM或更高的二价阳离子的溶液平衡阴离子交换树脂，吸附上述的含硫酸岩藻糖多糖的混合物。使用平衡化后的溶液充分洗涤所说的阴离子交换树脂后，例如使用氯化钠通过梯度洗脱来溶出含硫酸岩藻糖多糖。在实施此方法时，加入的二价阳离子的最终浓度为1mM或更高，当要通过此柱来吸附本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U时，优选地将浓度调节为低于0.5M。有关此方法中所使用的充当二价阳离子源的化学制剂，钙盐和钡盐显示出特别优良的效果，然而，对此没有任何限制，也可以使用硫酸镁、氯化锰等。
当通过常规的方法从褐藻中生产含硫酸岩藻糖多糖的混合物时，所获得的混合物污染有高反应活性的着色物质，上述物质污染与之接触的树脂或树脂性容器，或者抑制酶活性或细胞的生育。已发现通过使用多糖性物质或带有阴离子交换基团的物质经结合或者吸附可以容易地除去这些着色物质。这就是说，可以通过向包含含硫酸岩藻糖多糖的溶液中加入多糖树脂(如Cellulofine、GCL-2000(由生化学工业社制造)、聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl S-500、交联葡聚糖凝胶Sephadex G-200和琼脂糖凝胶Sepharose CL-2B(均由Pharmacia制造))或带有阴离子交换基团的物质(如DEAE-Cellulofine A-800(由生化学工业社制造)、DEAE-SepharoseFF、DEAE-Sephadex A-50、QAE-Sephadex A-50、DEAE-Sephacel(均由Pharmacia公司生产)、TSK-Gel DEAE-Toyopearl 650、TSK-凝胶DEAE Toyopearl 550(均由Tosoh公司制造)、Amberlite阴离子交换树脂(由Organo出售)和chitopearl阴离子交换树脂(由富士纺绩有限公司制造))，然后搅拌后除去，或使包含含硫酸岩藻糖多糖的溶液流过由这些物质装载的柱，从而将该反应性强的着色物质容易地去除。不过，因为阴离子交换树脂也和含硫酸岩藻糖多糖结合。因此，优选在着色物质的吸附步骤中把盐的浓度控制在大约2M。
可以按照例如在实施例6中描述的方法制备本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U。接下来，将说明所说的含硫酸岩藻糖多糖-U的理化性质，但并非限定本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U。
图1显示了在过剩量的氯化十六烷基吡啶鎓盐存在下，在各种氯化钠浓度下，本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U与实施例8中获得的本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F的沉淀形成性。
在图1中，纵坐标为沉淀比(％)，横坐标为氯化钠浓度(M)。实线和圆圈代表在各种氯化钠浓度下的本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U的沉淀比；虚线和三角形代表在各种氯化钠浓度(M)下，本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F的沉淀比。
此沉淀比是在溶液温度为37℃时通过下列方法测定的。
将本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U和含硫酸岩藻糖多糖-F分别溶解在水和4M的氯化钠中，浓度为2％。然后，以各种比例混合这些溶液，以便得到具有各种氯化钠浓度的含硫酸岩藻糖多糖-U以及含硫酸岩藻糖多糖-F的各125μl的溶液。接下来，将氯化十六烷基吡啶鎓盐溶解在水中和4M的氯化钠中，浓度为2.5％，将所获得的溶液以各种比例混合，得到具有各种氯化钠浓度的1.25％的氯化十六烷基吡啶鎓盐溶液。
分别完全沉淀出以2％的浓度溶解在水中的本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U和含硫酸岩藻糖多糖-F需要3.2倍(体积比)的1.25％氯化十六烷基吡啶鎓盐溶液。将400μl的具有各种氯化钠浓度的氯化十六烷基吡啶鎓盐溶液加入到125μl的具有各种氯化钠浓度的含硫酸岩藻糖多糖-U和含硫酸岩藻糖多糖-F的2％溶液中。充分搅拌后，静止30分钟，将每一种混合物离心，并通过酚-硫酸方法[Analytical Chemistry 28，350(1956)]测定上清液中的糖含量，然后计算在每种氯化钠浓度时每个含硫酸岩藻糖多糖的沉淀比。
通过凝胶过滤方法经Sephacryl S-500测定上述获得的本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U的分子量。结果，分子量分布为大约190,000(图2)。在图2中，纵坐标代表通过酚-硫酸方法测定的样品中的糖含量(以480nm下的吸收率表示)，而横坐标代表组分号。
在下列条件下进行凝胶过滤：
柱大小：3.08×162.5cm；
溶剂：含有0.2M氯化钠和10％乙醇的10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)
流速：1.5毫升/分钟；
样品浓度：0.25％；
样品体积：20ml；和
分子量标准物：Shodex STANDARD P-82(由昭和电工株式会社制造)
接下来，分析了上述获得的本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U的组分。
首先，按照Journal of Biological Chemistry 175，595(1948)中描述的方法测定岩藻糖含量。
接下来，将上述获得的含硫酸岩藻糖多糖-U的干燥标品溶解在1N的盐酸溶液中，得到0.5％浓度的溶液，并在110℃下处理2小时以便水解成组成单糖。其后，使用GlycoTAG和GlycoTAG试剂盒(均为宝酒造有限公司制造)将由水解获得的单糖的还原末端吡啶基-(2)-氨基化(PA)，通过HPLC分析组成单糖的组分比。在下列条件下进行HPLC：
仪器：L-6200型(由日立制作所制造)；
柱：PALPAK Type A(4.6mmx150mm，由宝酒造社制造)；
洗脱液：700mM硼酸缓冲液(pH 9.0)∶乙腈＝9∶1；
检测仪：荧光检测器F-1150(日立制作所制造)，激发波长：310nm，荧光波长：380nm；
流速：0.3毫升/分钟；和
柱温：65℃。
接下来，按照Analytical Chemistry 4，330(1962)中描述的方法测定糖醛酸的含量。
其后，按照Biochemical Jorunal 84，106(1962)中描述的方法测定硫酸的含量。
结果，表明上述获得的含硫酸岩藻糖多糖-U的组成糖化物是岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、糖醛酸，并且实质上不含其它的中性糖。主要成分的组成比(mol比)如下：岩藻糖∶甘露糖∶半乳糖∶糖醛酸∶硫酸根基团＝大约10∶7∶4∶5∶20。
然后，用傅里叶变换红外分光光度计JIR-DIAMOND 20(由JEOL有限公司制造)测定含硫酸岩藻糖多糖-U钙盐的IR光谱。这样，得到了在图3中所示的光谱。在图3中，纵坐标代表透光度(％)，横坐标代表到波数(cm-1)。
接下来，使用核磁共振波谱仪JNM-a500型(500MHz；JEOL有限公司制造)测量了本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U钙盐的NMR光谱。这样，得到了在图4中所示的波谱。
在图4中，纵坐标代表信号强度，横坐标代表化学位移(ppm)。通过将HOD的化学位移作为4.65ppm来表达在1H-NMR中的化学位移。
1H-NMR(D2O)：
δ5.27(甘露糖的1-位H)、5.07(岩藻糖的1-位H)、4.49(岩藻糖的3-位H)、4.37(葡糖醛酸的1-位H)、4.04(岩藻糖的4-位H)、3.82(岩藻糖的2-位H)、3.54(葡糖醛酸的3-位H)、3.28(葡糖醛酸的2-位H)、1.09(岩藻糖的5-位CH3中的H)。
使用高速、高灵敏度的旋光计SEPA-300(堀场制作所制造)测量本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U的冷冻干燥产物，具有-53.6°的比旋。
本发明人以下列的方式已鉴定了所获得的本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U的结构。
使用能够降解含硫酸岩藻糖多糖-U的降解酶降解含硫酸岩藻糖多糖-U，并纯化所得的降解产物：
使用下文描述的内-岩藻依聚糖分解酶处理纯化的含硫酸岩藻糖多糖-U，并纯化所得的降解产物。
也就是说，将16ml的1％含硫酸岩藻糖多糖-U的溶液、12ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)、4ml 4M氯化钠溶液和8ml 32mU/ml的内-岩藻依聚糖分解酶溶液混合，并在25℃下反应48小时。已经证明在反应过程中反应混合物在230hm的吸光度有所提高，这表明此酶对含硫酸岩藻糖多糖-U的降解正在进行中。用Micro Acilyzer G3(旭化成公司制造)脱盐后，将反应混合物分成三部分(a)、(b)、(c)，并用DEAE-Sepharose FF纯化。
以下列方式制备上述内-岩藻依聚糖分解酶。
用于产生这种酶的菌株可以是任何能够产生内岩藻依聚糖分解酶的菌株。作为一个特殊例子，可以使用黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)。
由本发明人从青森的海水中分离的这种菌株具有下列的菌学特性。
1.Flavobacterium sp.SA-0082菌株
a.形态学的特征
(1)短杆菌；
宽度：0.8-1.0μm
长度：1.0-1.2μm
(2)孢子：无
(3)革兰氏染色：阴性
b.生理学特性
(1)生长温度范围：能够在37℃或更低的温度生长，适宜的生长温度范围为15-28℃。
(2)对氧的反应：需氧
(3)过氧化氢酶：+
(4)氧化酶：+
(5)脲酶：弱+
(6)酸形成D-葡萄糖：+
乳糖：+
麦芽糖：+
D-甘露糖醇：+
蔗糖：-
海藻糖：-
(7)水解淀粉：-
明胶：+
酪蛋白：-
七叶苷：+
(8)硝酸盐的还原性：-
(9)吲哚形成：-
(10)硫化氢形成：-
(11)牛奶的凝固：-
(12)对钠的需求：+
(13)对盐的需求
在无NaCl的培养基中的生长：-
在1％的NaCl培养基中的生长：-
在海水培养基中的生长：+
(14)醌：甲基萘醌类6
(15)菌体内DNA的GC含量：32％
(16)OF-检验：O
(17)菌落颜色：黄色
(18)运动性：无
(19)滑行：无
可以推测，这种菌株是Bergey系统细菌学手册，1(1984)和Bergey鉴定细菌学手册，9(1994)中描述的水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)和脑膜脓毒性金黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)的细菌类似物。然而，此菌株与水生黄杆菌的不同点在于：不可以通过蔗糖代谢形成任何的酸、不能分解酪蛋白、能够分解七叶苷、能够使明胶液化并且为脲酶阳性，这种菌株与脑膜脓毒性金黄杆菌的不同在于不能分解酪蛋白、在37℃下生长缓慢。因此，此菌株被鉴定为属于黄杆菌属的细菌，并且命名为黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082。
上述菌株命名为Flavobacterium sp.SA-0082，并且自1995年3月25日以登记号FERM P-14872保藏在通商产业省工业技术院生命工业技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号，305)，并且以登记号FERMBP-5402保藏在如上所述的通商产业省工业技术院生命工业技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号，305)(根据1996年2月15日的请求转为国际保藏)。
加入到培养此菌株的培养基中的营养物质可以是任何此菌株能够利用产生内-岩藻依聚糖分解酶的物质。合适的碳源的例子包括岩藻依聚糖、海藻类粉末、藻酸、岩藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖、麦芽糖、乳糖和淀粉等；氮源合适的例子包括酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米浆、肉膏、脱脂大豆、硫酸铵和氯化铵。培养基中还可以含有无机物质和金属盐，例如钠盐、磷酸盐、钾盐、镁盐和锌盐。
通过培养此菌株产生的内-岩藻依聚糖分解酶的产量变化取决于培养条件。一般来说，优选的培养温度为15℃至30℃，优选的培养基pH值范围为5至9。在通气和搅拌条件下培养5至72小时可以得到最大产量的内-岩藻依聚糖分解酶。当然，合适的培养温育的选择取决于所使用的菌株、培养基组分等等，以便获得最大产量。
在菌体和培养物上清液中都可以获得上述的内-岩藻依聚糖分解酶。
在合适的培养基培养上述的Flavobacterium sp.SA-0082，收获菌体，经通常使用的破碎细胞的方法(如超声处理)破碎菌体。这样，可以获得无细胞的提取物。
其后，通过本领域一般所使用的纯化方法纯化这些提取物，这样就得到了纯化的酶制品。例如，纯化可以通过盐析、离子交换层析、疏水结合柱层析、凝胶过滤或其它纯化方法进行纯化，以便得到纯化的不含任何其它岩藻依聚糖分解酶的内-岩藻依聚糖分解酶。
通过从上述的培养基中除去菌而获得的培养物上清液也含有大量的所说的酶(菌体外酶)，可以通过与纯化菌体内酶所使用的相同方法纯化此酶。
下面给出纯化内岩藻依聚糖分解酶的例子。
将黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)接种在人工海水(pH7.5，Jamarin实验室制造)培养基600ml中，其中人工海水含有0.25％的葡萄糖、1.0％的蛋白胨和0.05％酵母提取物，并将培养基转移到2升锥形瓶(在120℃灭菌20分钟)中，然后，在24℃将菌株培养24小时以得到种培养液。在一个30升发酵罐中加入20L含有0.25％的葡萄糖、1.0％的蛋白胨、0.05％酵母提取物和0.01％脱泡剂(信越化学工业公司制造的KM70)的人工海水(pH7.5，Jamarin实验室制造)培养基，并在120℃灭菌20分钟。在冷却后，将培养基用上述的600ml种培养液接种，然后以10升/分钟的速率充气和125rpm搅拌，在24℃下将其培养24小时。在培养完成后，将培养基离心以收集菌体。
将这些细胞悬浮在含有200mM氯化钠的20mM醋酸盐-磷酸盐缓冲液(pH7.5)中，用超声处理打碎细胞，并通过离心以得到菌体提取物。在此菌体提取物中的内-岩藻依聚糖分解酶表现出5mU/ml培养基的活性。
把硫酸铵加入所说的提取物，得到硫酸铵的90％饱和溶液。通过搅拌溶解后，将混合物离心，并将沉淀悬浮在与上述提及的悬浮细胞的同一缓冲液中，。然后，将悬液用含有50mM氯化钠的20mM醋酸盐-磷酸盐缓冲液(pH7.5)完全透析。在透析形成的沉淀和通过心除去后，先用含有50mM氯化钠的20mM醋酸盐-磷酸盐缓冲液(pH7.5)平衡的DEAE-Sepharose FF柱吸附，然后，用同一缓冲液充分洗涤吸附的物质，并且用50mM-600mM的氯化钠的线型梯度洗脱以展开吸附的物质。收集活性组分，并加入氯化钠，使氯化钠的终浓度为4M。接下来，用含有4M氯化钠的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)平衡的苯基Sepharose凝胶CL-4B柱吸附。然后，用同一缓冲液充分洗涤所说的吸附物质，并且用4M-1M的氯化钠的线型梯度洗脱以展开吸附的物质。收集活性组分，并用超滤器浓缩。接下来，用含有50mM氯化钠的10mM磷酸盐缓冲液平衡的SephacrylS-300进行凝胶过滤。收集活性组分。通过在聚丙烯酰胺葡聚糖S-300中的保留时间测定的酶的分子量大约为460,000。接下来用含有250mM氯化钠的10mM磷酸盐缓冲液(pH7)将活性组分透析。通过用含有250mM氯化钠的10mM磷酸盐缓冲液(pH7)平衡的Mono Q HR5/5柱吸附酶溶液。用同一缓冲液充分洗涤吸附的物质，并且用250mM-450mM的氯化钠的线型梯度洗脱以展开吸附的物质。收集活性组分，得到纯化的酶。表1总结了上述的纯化步骤。
表1
  步骤   总蛋白质(mg)   总活性(mU)   比活(mU/mg)   产量(％)
  菌体提取物   61,900   101,000   1.63   100
  硫酸铵盐析   33,800   88,600   2.62   87.7
  DEAE-SepharoseFF   2,190   40,400   18.4   40.0
  苯基SepharoseCL-4B   48.2   29,000   601   28.7
  SephacrylS-300   7.24   19,600   2,710   19.4
  Mono Q   0.824   15,000   18,200   14.9
通过下列方式测定所说的酶的活性。
将来源于Kjellmaniella crassifolia岩藻依聚糖的50μl 2.5％溶液、与10μl的所说的酶和60μl含有667mM氯化钠的83mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)混合并在37℃反应3小时。然后，将2ml的水和105μl的反应混合物搅拌混合，并在230nm测量吸光度(AT)。把使用相同的方法(但是只用上述的缓冲液(用来溶解酶)代替酶)制备的反应混合物、使用相同的方法(但是只用水代替岩藻依聚糖溶液)制备的另一个反应混合物作为对照，也测定吸光度(AB1和AB2)。
将上述反应体系中可在1分钟切割1μmol的在甘露糖和糖醛酸之间的糖苷键的酶量作为1U。通过将在消除反应中形成的不饱和糖醛酸的毫摩尔分子吸光系数定为5.5对上述方法切断的键定量。按照下列计算式测定酶的活性：
活性(U/ml)＝(AT-AB1-AB2)×2.105×120/(5.5×105×0.01×180)；
2.105：待测的吸收样品的体积(ml)；
120：酶反应混合物的体积(μl)；
5.5：在230nm不饱和糖醛酸的毫摩尔分子消光系数(/mM)；
105：用于稀释的反应混合物的体积(μl)；
0.01：酶的体积(ml)；和
180：反应时间(分钟)。
通过在280nm测量酶溶液的吸光度测定蛋白质，并将1mg/ml蛋白质溶液的吸光度作为1.0计算蛋白质的量。
以下列方式制备了来源于Kjellmaniella crassifolia的用作底物的岩藻聚糖。
用自由粉碎机M-2型(由奈良机械制作所制)将干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末，并在70℃下用10倍的85％甲醇处理2小时。然后过滤，将残留物在70℃下用10倍的甲醇再处理2小时。过滤后，向残留物中加入20倍的水。然后，将所得的混合物在100℃下处理3小时，过滤混合物得到提取物。将提取物的盐浓度调整到与400mM氯化钠溶液中盐浓度的水平相同。然后，向其中加入氯化十六烷基吡啶鎓盐，直到沉淀不再产生，离心后，将沉淀用乙醇充分洗涤以完全除去氯化十六烷基吡啶鎓盐。接下来通过使用超滤器(超滤膜的排阻分子量：100,000，由Amicon制造)进行脱盐并除去低分子量物质。通过离心除去所得的沉淀。将上清液冷冻干燥，得到纯化的Kjellmaniella crassifolia岩藻依聚糖。酶反应产物的结构解析：
上述的内-岩藻依聚糖分解酶是专一降解含硫酸岩藻糖多糖-U的D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸之间的α1→4键的酶。用此酶处理上面获得的含硫酸岩藻糖多糖-U，形成了其结构由下列化学式(I)、(II)和(III)代表的低聚糖：
Figure C20041003969000331
Figure C20041003969000341
现在进行详细描述。
通过使用GlycoTAG和GlycoTAG试剂盒将上述分离并经DEAE-Sepharose FF纯化的三个组分(a)、(b)和(c)的还原性末端分别进行吡啶基-(2)-氨基化(PA)，得到PA化糖(PA-a)、(PA-b)和(PA-c)，然后通过HPLC进行分析。
在下列条件下进行HPLC：
(i)通过使用分子量分级分离柱进行HPLC分析：
仪器：L-6200型(日立制作所制造)；
柱：SHODEX SE-803(4.6X250mm，由昭和电工社制造)；
洗脱液：0.2M氯化钠∶二甲基亚砜＝9∶1；
检测仪：荧光检测器F-1150(由日立制作所制造)，
激发波长：320nm，
荧光波长：400nm；
流速：1毫升/分钟；和
柱温：50℃。
(ii)使用反相柱进行HPLC分析
仪器：L-6200型(由日立制作所制造)；
柱：L-柱(4.6X250mm，由化学药品检查协会制造)；
洗脱液：50mM醋酸-三乙胺(pH5.5)；
检测仪：荧光检测器F-1150(由日立制作所制造)，
激发波长：320nm，
荧光波长：400nm；
流速：1毫升/分钟；和
柱温：40℃。
图5、6和7分别表明了吡啶基-(2)-氨基化糖类化合物(PA-a)、(PA-b)和(PA-c)的HPLC洗脱模式。在每一个图中，纵坐标代表相对荧光强度，横坐标代表保留时间(分钟)。
接下来，将说明化合物(a)、(b)和(c)(即由化学式(I)、(II)和(II)代表的化合物)理化性质。
图(8)、(9)和(10)分别表明化合物(a)、(b)和(c)的质谱，而图11、12和13分别表明化合物(a)、(b)和(c)的质-质谱。在每一个图中，纵坐标代表相对强度(％)，横坐标代表m/z值。
此外，图14、15和16分别表明化合物(a)、(b)和(c)的1H-NMR谱。在每一个图中，纵坐标代表信号强度，横坐标代表化学位移(ppm)。
把HOD的化学位移作为4.65ppm为基准来表示1H-NMR的化学位移。
化合物(a)的理化性质：
分子量：564
MS m/z：563[M-H+]-
MS/MS m/z：97[HSO4]-，157[不饱和D-葡萄糖醛酸-H2O-H+]-，175[不饱和D-葡萄糖醛酸-H+]-，225[L-岩藻糖硫酸酯-H2O-H+]-，243[L-硫酸岩藻糖-H+]-，319[不饱和D-葡糖醛酸与D-甘露糖的结合物-H2O-H+]-，405[M-不饱和D-葡萄糖醛酸-H+]-，483[M-SO3-H+]-。
1H-NMR(D2O)
δ5.78(1H，d，J＝3.7Hz，4″-H)，5.26(1H，d，J＝1.2Hz，1-H)，5.12(1H，d，J＝4.0Hz，1′-H)，5.03(1H，d，J＝6.1Hz，1″-H)，4.47(1H，d-d，J＝3.4，10.4Hz，3′-H)，4.21(1H，br-s，2-H)，4.12(1H，m，5′-H)，4.10(1H，d-d，J＝3.7，5.8Hz，3″-H)，4.03(1H，d，J＝3.4Hz，4′-H)，3.86(1H，m，3-H)，3.83(1H，d-d，J＝4.0，10.4Hz，2′-H)，3.72(1H，m，4-H)，3.72(1H，m，5-H)，3.70(2H，m，5-CH2的H2)，3.65(1H，d-d，J＝5.8，6.1Hz，2″-H)，1.08(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)
糖的组成：
L-岩藻糖∶不饱和D-葡萄糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1(各1分子)
硫酸盐：1分子(在L-岩藻糖的3-位上)
在1H-NMR中的峰归属如下式(IV)中数字显示：
Figure C20041003969000381
化合物(b)的理化性质：
分子量：724
MS m/z：723[M-H+]-，361[M-2H+]2-
MS/MS m/z：97[HSO4]-，175[不饱和D-葡萄糖醛酸-H+]-，243[L-硫酸岩藻糖-H+]-，321[M-SO3-2H+]2-，405[M-不饱和D-葡萄糖醛酸-2SO3-H+]-，417[M-L-岩藻糖-2SO3-H+]-。
1H-NMR(D2O)
δ5.66(1H，d，J＝3.4Hz，4″-H)，5.27(1H，d，J＝7.3Hz，1″-H)，5.22(1H，d，J＝1.8Hz，′-H)，5.21(1H，d，J＝3.7Hz，1′-H)，4.50(1H，d，J＝3.1Hz，4′-H)，4.32(1H，q，J＝6.7Hz，5′-H)，4.27(1H，d-d，J＝3.7，10.4Hz，2′-H)，4.21(1H，d-d，丁＝3.4，6.7Hz，3″-H)，4.18(1H，d-d，J＝1.8，11.0Hz，5-CH的H)，4.15(1H，br-s，2-H)，4.10(1H，d-d，J＝5.8，11.0Hz，5-CH的H)，3.99(1H，d-d，J＝3.1，10.4Hz，3′-H)，3.90(1H，m，5-H)，3.82(1H，m，3-H)，3.82(1H，m，4-H)，3.54(1H，br-t，J＝7.3Hz，2″-H)，1.11(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3).
糖的组成：
L-岩藻糖∶不饱和D-葡萄糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1(各1分子)。
硫酸盐：3分子(在L-岩藻糖的2-和4-位上及D-甘露糖的6-位上)
在1H-NMR中的峰归属如下式(V)中数字显示：
Figure C20041003969000391
化合物(c)的理化性质:
分子量：1128
MS m/z：1127[M-H+]-
MS/MS m/z：97[HSO4]-，175[不饱和D-葡萄糖醛酸酯-H+]-，225[L-岩藻糖硫酸酯-H2O-H+]-，243[L-硫酸岩藻糖-H+]-，371[M-不饱和D-葡萄糖醛酸-L-岩藻糖-SO3-2H+]2-，405[硫酸化的L-岩藻糖与D-甘露糖结合物-H+]-，721[M-D-甘露糖-L-岩藻糖-SO3-H2O-H+]-
1H-NMR(D2O)
δ5.69(1H，d，J＝3.7Hz，(4)″-H)，5.34(1H，s，(1)-H)，5.16(1H，s，1-H)，5.10(1H，d，J＝4.0Hz，(1)′-H)，5.50(1H，d，J＝3.7Hz，1’-H)，4.93(1H，d，J＝6.4Hz，(1)”-H)，4.50(1H，d-d，J＝3.4，10.7Hz，3′-H)，4.47(1H，d-d，J＝3.4，10.4Hz，(3)’-H)，4.39(1H，d，J＝7.9Hz，1″-H)，4.33(1H，br-s，(2)-H)，4.14(1H，m，2-H)，4.12(1H，m，(3)″-H)，4.12(1H，m，5′-H)，4.12(1H，m，(5)’-H)，4.04(1H，m，4′-H)，4.03(1H，m，(4)’-H)，3.85(1H，m，(2)′-H)，3.85(1H，m，2’-H)，3.82(1H，m，3-H)，3.82(1H，m，(3)-H)，3.73(1H，m，4-H)，3.73(1H，m，5-H)，3.73(1H，m，(4)-H)，3.70(2H，m，5-CH2的H2)，3.70(2H，m，(5)-CH2的H2)，3.67(1H，m，5″-H)，3.62(1H，m，4″-H)，3.62(1H，m，(2)″-H)，3.62(1H，m，(5)-H)，3.51(1H，t，J＝8.9Hz，3″-H)，3.28(1H，t，J＝7.9Hz，2″-H)，1.09(3H，d，J＝6.7Hz，(5)′-CH3的H3)，1.07(1H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)。
糖的组成：
L-岩藻糖∶不饱和D-葡萄糖醛酸∶D-葡萄糖醛酸∶D-甘露糖＝2∶1∶1∶2(两个L-岩藻糖分子，两个D-甘露糖分子，一个不饱和D-葡糖醛酸分子和一个D-葡萄糖醛酸分子)。
硫酸根：两个分子(在每个L-岩藻糖的3-位上)。
1H-NMR中的峰归属如下式(VI)中数字显示：
Figure C20041003969000411
当使用上述的内-岩藻依聚糖分解酶处理所得的含硫酸岩藻糖多糖-U时，当反应进行过程中发生消除反应，增加了在230nm的吸光度。所有的主要反应产物都带有消除反应产物不饱和己糖醛酸盐基团，这表明所获得的含硫酸岩藻糖多糖-U具有由相互结合的己糖醛酸和甘露糖组成的糖链。由于主要组成糖类包括岩藻糖，所以与一般的多糖相比，所获得的含硫酸岩藻糖多糖-U容易被酸降解，另一方面，已知己糖醛酸和甘露糖之间的键对酸有较高耐受性。本发明人试图以下列方式参考CarbohycrrateResearch，125，283-290(1984)中描述的方法鉴定糖链中的己糖醛酸，所说的糖链由相互结合的己糖醛酸和甘露糖组成，并且包含在Kjellmaniellacrassifolia的含硫酸岩藻糖多糖的混合物中。首先，将含硫酸岩藻糖多糖混合物溶解在0.3M草酸中，并且在100℃处理3小时。然后进行分子量分级分离，收集分子量为3,000或更高的组分。然后，使用阴离子交换树脂处理，收集吸附的物质。将所获得的物质冷冻干燥，并用4N的盐酸进行酸水解。将pH值调整到8后，将其吡啶基-(2)-氨基化，通过HPLC分析糖醛酸。在下列条件下进行HPLC：
仪器：L-6200型(由日立制作所制造)；
柱：PALPAK Type N(4.6mm×250mm，由宝酒造社制造)；
洗脱液：200mM醋酸-三乙胺缓冲液(pH 7.3)∶乙腈＝25∶75；
检测仪：荧光检测器F-1150(由Hitachi有限公司制造)，激发波长：320nm，荧光波长：400nm；
流速：0.8毫升/分钟；和
柱温：40℃。
此外，将Sigma公司产的葡萄糖醛酸，和光纯药社产的半乳糖醛酸，将Sigam公司产的4-甲基伞形烷基-L-艾杆糖苷酸水解得到的艾杆糖醛酸，按Acta Chemica Scandinavica，15，1397-1398(1961)记载的方法，将和光纯药社产的藻酸经水解、然后经阴离子交换树脂分离而得到的甘露糖醛酸和古洛糖醛酸PA化，得到PA化己糖醛酸的标准物质。
结果发现，在上述的含硫酸岩藻糖多糖混合物的糖链只含有葡萄糖醛酸形式的己糖醛酸。
此外，通过使用阴离子交换树脂和冷冻干燥将上述糖链的水解产物中的葡萄糖醛酸与D-甘露糖分离。然后测量它的比旋光度。因此证明葡萄糖醛酸是右旋的，即D-葡糖醛酸。
此外，先用上述的内-岩藻依聚糖分解酶处理来源于Kjellmaniellacrassifolia的含硫酸岩藻糖多糖混合物，然后，和上述相同使用草酸水解。然而，却没有发现任何具有D-葡糖醛酸和D-甘露糖二者相互结合的聚合物。基于这一结果，说明上述的内-岩藻依聚糖分解酶是通过消除反应切断的含硫酸岩藻糖多糖骨架结构具有由D-葡糖醛酸和D-甘露糖二者相互结合组成的结构。
此外，通过对草酸降解而获得的聚合物进行NMR分析，以确定D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸的结合位点以及糖苷键的异构构型。
聚合物的NMR分析的数据如下。通过将在三乙胺中甲基基团的化学位移作为1.13ppm来表示在1H-NMR中的化学位移；而将在三乙胺中甲基基团的化学位移作为9.32ppm来表示在13C-NMR中的化学位移。
1H-NMR(D2O)
δ5.25(1H，br-s，1-H)，4.32(1H，d，J＝7.6Hz，1′-H)，4.00(1H，br-s，2-H)，3.71(1H，m，5′-H)，3.69(1H，m，5-CH的H)，3.68(1H，m，3-H)，3.63(1H，m，5-CH的H)，3.63(1H，m，4′-H)，3.57(1H，m，4-H)，3.54(1H，m，3′-H)，3.53(1H，m，5-H)，3.25(1H，t，J＝8.5Hz，2′-H)
13C-NMR(D2O)
δ175.3(5′-COOH中的C)，102.5(1′-C)，99.6(1-C)，78.5(2-C)，77.9(4′-C)，77.0(3′-C)，76.7(5′-C)，73.9(5-C)，73.7(2′-C)，70.6(3-C)，67.4(4-C)，61.0(5-CH2OH中的C)。
峰分别归属于下列式(VII)中数字所示的位置：
Figure C20041003969000431
关于D-葡萄糖醛酸在1-位的立体构型，由于其7.6Hz的邻位偶合常数，所以将其确定为β-D-葡萄糖醛酸。
关于D-甘露糖在1-位的构型，由于其具有5.25ppm的化学位移，所以将其确定为α-D-甘露糖。
通过HMBC方法(即C-H-异核异核远程相关)分析了组成糖的结合方式。在1H-NMR的归属中使用了DQF-COSY和HOHAHA方法，而在13C-NMR的归属中使用了HSQC方法。
在HMBC光谱中，观察到在1-H和4’-C之间与4’-H和1-C之间、1’-H和2-C之间与2-H和1’-C之间均存在相关的峰。这些事实表明D-葡萄糖通过β-键结合到D-甘露糖的2-位上，而D-甘露糖通过α-键结合到D-葡萄糖醛酸的4-位上。
综合考虑上述的结果表明所说的化合物(a)具有这样的结构，其中不饱和D-葡萄糖醛酸及结合有硫酸基团的L-岩藻糖结合到还原末端D-甘露糖的残基上；所说的化合物(b)具有这样的结构，其中不饱和D-葡萄糖醛酸及结合有两个硫酸基团的L-岩藻糖结合到与一个硫酸根结合的还原末端D-甘露糖残基上；所说的化合物(C)具有这样的结构，其中还原末端的D-甘露糖的残基上结合了D-葡萄糖醛酸和结合有硫酸根的L-岩藻糖，D-葡萄糖醛酸上结合了D-甘露糖，该D-甘露糖上又结合了不饱和D-葡萄糖醛酸和结合有硫酸根的L-岩藻糖。
如上述所讨论的，所获得的含硫酸岩藻糖多糖-U中具有D-葡萄糖醛酸和D-甘露糖相互结合的结构，并且至少有一个D-甘露糖上结合有L-岩藻糖。
而且，所说的含硫酸岩藻糖多糖-U具有下面的通式(VIII)所代表的部分结构，其中至少有一个醇羟基已经硫酸酯化，n代表1或更大的整数：
Figure C20041003969000441
本发明提供了与本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F相分离的含硫酸岩藻糖多糖-U。本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U以糖醛酸作为它的组成糖类，并且由黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的岩藻依聚糖分解酶降解，同时产生至少一种由上述化学式(I)、(II)和(III)代表的化合物。其分子量、分子量分布和糖类组成对本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U没有任何限制。也就是说，可以制备具有任意分子量和分子量分布的含硫酸岩藻糖多糖-U，并且可以提供具有已经限定的理化性质的含硫酸岩藻糖多糖。
本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U没有含硫酸岩藻糖多糖-F的强抗凝血活性。这样可以提供实质上不表现抗凝血活性的含硫酸岩藻糖多糖。本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U作为纯化的含硫酸岩藻糖多糖可能作为抗癌剂、抗转移剂、制癌剂等。另外，其作为针对抗含硫酸岩藻糖多糖抗体的抗原是有用的。从含硫酸岩藻糖多糖-U产生具有上述化学式(I)、(II)和(III)结构的低聚糖也是可能的。也就是说，其在生产这些新奇化合物方面是有用的。
接下来将描述本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F及其产生方法。
通过下列方式使用本发明的方法可以产生本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F。用能够降解含硫酸岩藻糖多糖-U的降解酶处理含硫酸岩藻糖多糖混合物。在酶促反应完成后，通过超滤等除去这样降解的含硫酸岩藻糖多糖-U。关于上述的降解酶，任何只要能够选择地降解含硫酸岩藻糖多糖-U的酶都可以使用。作为它的特殊的例子，可以引用的是上述的由黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的内-岩藻依聚糖分解酶。
在用此酶处理时，可以选择适当的底物浓度、温度、pH值等等以便有利于酶促反应的进行。通常理想的是底物浓度范围从0.1至10％，温度范围从20至大约40℃，pH值范围从6至大约9。
也可以将能够产生降解酶(此酶能够降解含硫酸岩藻糖多糖-U)的微生物接种在其中已经加入了含硫酸岩藻糖多糖混合物的培养基中，然后从此培养基中纯化含硫酸岩藻糖多糖-F。用于此目的微生物可以是任何一种能够产生降解含硫酸岩藻糖多糖-U的降解酶的微生物。作为它的一个特殊的例子，可以引用的是上述的黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERMBP-5402)和Fucoidanobacter marinus SI-0098(FERM BP-5403)。
培养基中将要加入的营养源可以是任何一种所使用的菌株能够利用的物质，以便产生所说的降解酶。合适的碳源的例子包括岩藻依聚糖、海藻类粉末、藻酸、岩藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖、麦芽糖、乳糖和淀粉等；而氮源合适的例子包括酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米浆、肉膏、脱脂大豆、硫酸铵和氯化铵。培养基中还可以含有无机物质和金属盐，例如钠盐、磷酸盐、钾盐、镁盐和锌盐。
更不用说可以依据所使用的菌株、培养基组成等等选择培养条件来降解含硫酸岩藻糖多糖-U的活性以便获得最大水平的降解含硫酸岩藻糖多糖-U的活性。一般来说，优选的培养温度为15℃至30℃，培养基的pH值范围为5至9。在通气搅拌条件下培养5至72小时。在培养完成后，例如可以通过超滤除去培养基中非含硫酸岩藻糖多糖-F的组分，即所降解的含硫酸岩藻糖多糖-U。
本发明人从青森县海水中分离的菌株Fucoidanobacter marinus SI-0098具有下列菌学性质。
1.Fucoidanobacter marinus SI-0098菌株
a.形态学的特征
(1)双球菌(短杆菌)；
宽度：0.5-0.7μm
长度：0.5-0.7μm
(2)孢子：无
(3)革兰氏染色：-
b.生理学特性
(1)生长温度范围：能够在37℃生长，适宜的生长温度范围为15-28℃。
(2)对氧的反应：需氧
(3)过氧化氢酶：+
(4)氧化酶：-
(5)脲酶：-
(6)水解淀粉：+
明胶：-
酪蛋白：-
七叶苷：+
(7)硝酸盐的还原性：-
(8)吲哚形成：-
(9)硫化氢形成：+
(10)牛奶的凝固：-
(11)对钠的需求：+
(12)对盐的需求
在无NaCl的培养基中的生长：-
在1％的NaCl培养基中的生长：-
在海水培养基中的生长：+
(13)醌：甲基萘醌类7
(14)胞内DNA的GC含量：61％
(15)在细胞壁中的二氨基庚二酸：-
(16)羟乙酰基检验：-
(17)羟基脂肪酸存在：+
(18)OF-检验：O
(19)菌落颜色：不形成有特征的菌落颜色
(20)运动性：有
(21)滑行性：无
(22)鞭毛：极性单鞭毛
根据在Bergey的鉴定细菌学手册，9(1994)中描述的基本分类，此菌株属于第4组(革兰氏阴性需氧杆菌和球菌)。然而，此菌株在很大程度上与属于4组的细菌不同，后者在电子传递链上具有甲基萘醌类7和含有61％的GC。原则上，革兰氏阴性细菌在电子传递链中存在泛醌，而革兰氏阳性细菌具有甲基萘醌类。
尽管属于黄杆菌属和噬纤维菌属的革兰氏阴性细菌在电子传递链中例外地含有甲基萘醌类，但是在GC含量方面它们与上述的菌株在很大程度上不同，如为土壤细菌的栖地噬纤维菌(Cytophaga arvensicola)含有43至46％的GC，而为海洋细菌的流散噬纤维菌(Cytophaga diffluens)、发酵噬纤维菌(Cytophaga fermentans)、海洋噬纤维菌(Cytophaga marina)和潮湿噬纤维菌(Cytophaga uliginosa)含有42％的GC。当比较此菌株和已经鉴定的菌株的16S rDNA序列的同源性时，甚至最同源的菌株(多刺疣微菌(Verrucomicrobium spinosum))也只有76.6％的同源性。已知两个同源性为90％或少于90％的细菌属于不同的属。因此，确定此菌株为一种新型细菌，不属于任何已知的属，将其命名为海洋岩藻依聚糖杆菌Fucoidanobactermarinus SI-0098。
上述菌株命名为Fucoidanobacter marinus SI-0098，并且自1995年3月29日以登记号FERM P-14873保藏在通商产业省工业技术院生命工业技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号，305)，并且以登记号FERM BP-5403保藏在如上所述的通商产业省工业技术院生命工业技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号，305)(根据1996年2月15日的要求转为国际保藏)。
如前所述，本发明人已发现本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F和含硫酸岩藻糖多糖-U在0.6至3M浓度的一种或多种盐的存在下，对酸性多糖凝集剂显示出完全不同的表现。
例如，可以通过使用本发明的方法从含硫酸岩藻糖多糖混合物的水溶液中分离本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F。
首先，将一种或多种盐加入到含硫酸岩藻糖多糖混合物的水溶液中，使总盐浓度为0.6至3M。至于要加入的盐，例如可以使用氯化钠和氯化钙等(没有限定)。在调整盐浓度后，加入酸性多糖凝结剂(例如氯化十六烷基吡啶鎓盐)，直到不再形成沉淀为止。然后，收集沉淀得到本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F。
然而，当上述的盐浓度超过2M时，并且使用氯化十六烷基吡啶鎓盐作为酸性多糖凝结剂时，本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F很难形成沉淀，这一点必需注意。通常，可以在大约1.5M盐浓度的溶液中将含硫酸岩藻糖多糖-U与本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F分离(参见图1的描述)。
在洗涤沉淀后，如果需要，用饱和的氯化钠醇溶液洗去沉淀中的氯化十六烷基吡啶鎓盐以得到本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F。
可以将沉淀溶解并进行超滤以便从所得的本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F中除去着色物质。也可以脱盐和冻干所得的沉淀以得到干燥的制。此外，在此过程中可以加入防腐剂等物质。
本发明人也已发现，如前所述，当使用阴离子交换树脂纯化含硫酸岩藻糖多糖时，由于二价阳离子的共存造成吸附在每单位树脂的含硫酸岩藻糖多糖的量增加，因此可以更有效地分离含硫酸岩藻糖多糖。为了通过使用本发明的方法生产本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F，因此，优选地以1mM或更高的浓度将化学上作为二价阳离子源的物质加入到含硫酸岩藻糖多糖混合物中。接下来，用含有二价阳离子的溶液平衡阴离子交换树脂，优选的溶液浓度为1mM或者更高一些，因此吸附了上述的含硫酸岩藻糖多糖混合物。在用平衡溶液彻底洗涤阴离子交换树脂后，通过用例如，氯化钠的线型梯度洗脱以展开含硫酸岩藻糖多糖-F。在此方法的实践中，可以加入二价阳离子以便使得溶液的浓度为1mM或者更高。至于在本方法中作为二价阳离子源的化学试剂，钙盐和钡盐展示出特别好效果。然而，本发明没有限定在上述方法中使用的盐，例如也可以使用硫酸镁、氯化锰等。
例如，通过实施例8中所描述的方法获得本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F。接下来将说明含硫酸岩藻糖多糖-F的理化性质，但并非限定本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F。
通过凝胶过滤方法使用Sephacryl S-500测量上述获得的含硫酸岩藻糖多糖-F的分子量。结果显示其分子量分布大约为190,000(图17)。在图17中，纵坐标代表通过酚-硫酸方法测定的样品中糖类的含量，以480nm的吸光度来表示，横坐标代表组分号。
在下列条件下进行凝胶过滤：
柱大小：3.08×162.5cm；
溶剂：含有0.2M氯化钠和10％乙醇的10mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)；
流速：1.5毫升/分钟；
样品浓度：0.25％；
样品量：20ml；
分子量标准：Shodex STANDARD P-82(由昭和电工社制造)。
接下来，分析了上述获得的本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F的组分。
首先，按照Journal of Biological Chemical 175，595(1948)中所描述的方法测定岩藻糖含量。
接下来，在1N盐酸中溶解上述获得的含硫酸岩藻糖多糖-F的干燥制品以使得浓度为0.5％，并且在110℃下处理2小时以水解成结构单糖。其后，通过使用GlycoTAG和GlycoTAG试剂盒将由水解获得的单糖的还原端吡啶基-(2)-氨基化(PA)，并由HPLC分析组成单糖的组成比。在下列条件下进行HPLC：
仪器：L-6200型(由Hitachi有限公司制造)；
柱：PALPAK Type A(4.6mm×150mm)；
洗脱液：700mM严格缓冲液(pH 9.0)∶乙腈＝9∶1；
检测仪：荧光检测器F-1150(由Hitachi有限公司制造)，激发波长：310nm，荧光波长：380nm；
流速：0.3毫升/分钟；和
柱温：65℃。
接下来，按照Ahalytical Biochemistry 4，330(1962)中描述的方法测定糖醛酸的含量。
其后，按照Biochemical Journal 84，106(1962)中描述的方法测定硫酸的含量。
结果，表明上述获得的含硫酸岩藻糖多糖-F的组成糖是大约10∶1摩尔比的岩藻糖和半乳糖，含硫酸岩藻糖多糖-F实质上不含有糖醛酸或者其它的中性糖类。岩藻糖和硫酸盐摩尔比大约为1∶2。
接下来，将6ml的岩藻依聚糖-F的1％溶液、12ml的50mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)、4ml的4M氯化钠和8ml 32mU/ml的上述内-岩藻依聚糖分解酶(来源于黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402))的溶液混合，并且在25℃反应48小时。结果，没有形成任何降解产物，底物没有被降解。
然后，用傅里叶变换红外分光光度计JIR-DIAMOND 20(由JEOL有限公司制造)测定含硫酸岩藻糖多糖-F钙盐的IR光谱。这样，得到了在图18中所示的光谱。在图18中，纵坐标代表透光度(％)，横坐标代表到波数(cm-1)。
接下来，使用核磁共振波谱仪JNM-a500型(500MHz；JEOL有限公司制造)测量了本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F钠盐的NMR光谱。这样，得到了在图19中所示的波谱。
在图19中，纵坐标代表信号强度，横坐标代表化学位移(ppm)。通过将HOD的化学位移作为4.65ppm来表达在1H-NMR中的化学位移。
1H-NMR(D2O)：
5.30(岩藻糖的1-位H)、1.19(岩藻糖的5-位CH3的H)。
当使用高速、高灵敏度的旋光计SEPA-300(堀场制作所制造)测量时，本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F的冷冻干燥产物具有-135°的比旋。
本发明提供了与本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U相分离并纯化的含硫酸岩藻糖多糖-F。本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F实质上不含糖醛酸作为组成糖类，并且不被黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的岩藻依聚糖分解酶降解。本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F在分子量、分子量分布、和糖类组分方面，没有限制。也就是说，可以制备具有任意分子量和分子量分布的含硫酸岩藻糖多糖-F，也可以制备具有能清楚地说明理化性质(例如糖类组分、还原端和极其高度硫酸化)含硫酸岩藻糖多糖F。
由于是从实质上不含有抗凝血活性的含硫酸岩藻糖多糖-U相分离得到的，所以本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F具有很强的抗凝剂活性。这样，可以将含硫酸岩藻糖多糖-F和/或其降解产物用于抗凝剂中(使用纯化的含硫酸岩藻糖多糖)，也可以用作为抗含硫酸岩藻糖多糖抗体的抗原。
当以1μg/ml或更高浓度将按照本发明的含硫酸岩藻糖多糖或者降解产物加入到癌细胞的培养基中时，在加入后的一至几天内，癌细胞经历细胞凋亡。这就是说，含硫酸岩藻糖多糖和其降解产物具有很强的诱导细胞凋亡的作用。这些物质对正常细胞既没有诱导细胞凋亡也没有毒性。特别是来源于可食用的褐藻和海参的含硫酸岩藻糖多糖和其降解产物是非常安全的。
为了制备本发明的细胞凋亡诱导物制剂，可将含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物用作活性成分，并且与公知的药物载体结合。一般来说，将含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物与药学上可接受的液体或者固体载体混合。在选择性地加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲液、稳定剂、充填剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等试剂后，将混合物制成固体制剂，如片剂、颗粒剂、粉末剂、胶囊剂等或者液体制剂如溶液、混悬剂、乳剂等。另外，也可以制成干燥制剂，这种制剂在使用前可以通过加入适当的载体进行液化。
可以通过口服或者肠胃外(例如，注射或者静脉内滴注)施用本发明的细胞凋亡诱导物。
可以根据施用习惯和前面描述的剂量形式适当地选择药物载体。在口服药物的情况下，可以采用例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉和无机盐作为药物载体。为了制备口服药物也可以加入结合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性改进剂、矫味剂、着色物质剂、香味剂等等。这些添加剂的特殊的例子如下。
粘合剂：淀粉、糊精、粉碎的阿拉伯胶、明胶、羟丙基淀粉、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、结晶纤维素、乙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮和聚乙二醇。
崩解剂：淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素和低取代的羟丙基纤维素。
表面活性剂：月桂基硫酸钠、大豆卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯和聚山梨醇酯八十。
润滑剂：滑石、蜡、氢化植物油、蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝和聚乙二醇。
流动性改进剂：轻无水硅酸、干燥的氢氧化铝凝胶、合成硅酸铝和硅酸镁。
口服的液态制剂的例子包括混悬剂、乳剂、糖浆剂和酏剂，其中每一种物质中可以选择性地包含矫味、矫臭剂和着色物质。
另一方面，可以通过将作为本发明的活性成分的含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物以常规方式溶解或者悬浮在稀释液(如注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油(芝麻油、花生油、大豆油、玉米油)、丙二醇、聚乙二醇等等)中来获得肠胃外制剂，如果需要，可以加入杀菌剂、稳定剂、等张剂、无痛化剂等等。
通过与药剂形式合适的给药途径给予本发明的细胞凋亡诱导物。也没有特别限定它的施用方法。也就是说，可以选择内用、外用或者注射。例如，可以静脉内、肌肉内、皮下或皮内注射施用本发明的细胞凋亡诱导物。用于外用的制剂包括栓剂。
本发明的细胞凋亡诱导物的施用剂量，可以根据药剂形式、患者的施用方法、施用目的、年龄、体重、身体状况适当地施用，设有一定限制。一般对成年人来说，可以施用1至1,000mg/日，优选的10至200mg/日的活性成分。实际上，施用的剂量随着各种因素的变化而异。因此，在一些情况下，施用比上述剂量更低一些的水平就足够了，在其它情况下可以施用超过上述水平的剂量。
通过使用按照本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U、含硫酸岩藻糖多糖-F和/或其降解产物作为活性成分，将其与公知的药物载体结合，然后将此混合物加工成药物制剂，从而可以制成抗癌作用的抗癌药物。可以按照上述描述的方法生产抗癌药物。一般来说，将含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物与药学上可接受的液体或者固体载体混合。在选择性地加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲液、稳定剂、充填剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等试剂后，将混合物制成固体制剂，如片剂、颗粒剂、粉末剂、散剂、胶囊剂等或者液体制剂如溶液剂、混悬剂、乳剂等。另外，也可以制成干燥制剂，这种制剂在使用前可以通过加入适当的载体进行液化。
可以通过口服或者肠胃外(例如，注射或者静脉内滴注)施用本发明的抗癌药物。
可以适当地按照给药方式和按照上述的细胞凋亡诱导物的剂形选择药物载体。
通过与药剂形式合适的给药方式施用本发明的抗癌药物。也没有特别限定它的给药方法。也就是说，可以选择内用、外用或者注射。例如，可以静脉内、肌肉内、皮下或皮内注射施用本发明的抗癌药物。用于外部施用的制剂包括栓剂。
没有特别地限定本发明的抗癌药物的施用剂量，但是可以根据剂形、患者的给药方法、使用目的、年龄、体重、身体状况适当地施用。一般对成年人来说，可以施用1至1,000mg/天(优选的10至200mg/天)的活性成分。实际上，施用的剂量随着各种因素的变化而异。因此，在一些情况下，施用比上述剂量更低一些的水平就足够了，在其它情况下可以施用超过上述水平的剂量。本发明的药物也可以口服施用。另外，也可以将所说的药物加入到任何的每天摄取的食品或者饮料中。
通过使用按照本发明的含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物作为活性成分，将其与公知的药物载体结合，然后将此混合物加工成药物制剂，从而可以产生有抑癌作用的制癌药物。可以按照上述描述的方法产生制癌药物。一般来说，将含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物与药学上可接受的液体或者固体载体混合。在选择性地加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲液、稳定剂、充填剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等试剂后，将混合物制成固体制剂，如片剂、颗粒、散剂、粉末剂、胶囊等或者液体制剂如溶液、悬液、乳剂等。另外，也可以制成干燥制剂，这种制剂在使用前可以通过加入适当的载体进行液化。
可以通过口服或者肠胃外(例如，注射或者静脉内滴注)施用本发明的制癌药物。
可以适当地根据给药方式和按照上述的细胞凋亡诱导物的药剂形式选择药物载体。
通过与药剂形式合适的给药方式施用本发明的制癌药物。也没有特别限定它的施用方法。也就是说，可以选择内用、外用或者注射。例如，可以静脉内、肌肉内、皮下或皮内注射给予本发明的制癌药物。用于外用的制剂包括栓剂。
没有特别地限定本发明的制癌药物的施用剂量，但是可以根据药剂形式、患者的施用方法、施用目的、年龄、体重、身体状况适当地施用。一般对成年人来说，可以施用1至1,000mg/天(优选的10至200mg/天)的活性成分。实际上，施用的剂量随着各种因素的变化而异。因此，在一些情况下，施用比上述剂量更低一些的水平就足够了，在其它情况下可以施用超过上述水平的剂量。本发明的药物也可以口服施用。另外，也可以将所说的药物加入到任何的每天摄取的食品或者饮料中。
按照本发明的含硫酸岩藻糖多糖与它的降解产物是天然来源的物质，并且当给小鼠口服给药时没有显示任何毒性。
本发明的药物目的是用于治疗传染病、免疫机能低下或亢进、癌、病毒性疾病等。也可以将它们用作为防癌剂而保健。本发明的诱导细胞凋亡的方法例如在研究生物防御机制、免疫功能和与癌和病毒相关的疾病或者开发抑制细胞凋亡诱导物中是有用的。尤其是从可食用的褐藻或者海参中制备的本发明的含硫酸岩藻糖多糖和其降解产物都长期被作为食物，在口服施用方面是高度安全的。
由于硫酸化的多糖的分子量是非常大的，含硫酸岩藻糖多糖不适合作为药物，但是为改进它的抗原性、均一性、抗凝血活性等等，有必要在一定程度上降解。本发明提供了能够选择地只降解含硫酸岩藻糖多糖-F和通过使用酶处理含硫酸岩藻糖多糖-F获得的降解产物的酶。
本发明所使用的菌株可以是属于交替单胞菌属的任何菌株，只要这种菌株可以产生含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶。Alteromonas sp.SA-1009可以作为能够产生含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的菌株的一个具体的例子。可以通过用来源于此菌株的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶处理含硫酸岩藻糖多糖-F获得本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F的降解产物。
由本发明人从青森县的海水中最近分离的这种菌株具有下列菌学性质。
a.形态学的特征
(1)杆菌；
宽度：大约1μm
长度：大约2μm
(2)孢子：无
(3)革兰氏染色：-
b.生理学特性
(1)生长温度范围：适宜的生长温度范围为15-30℃，能够在4℃或40℃生长。
(2)对氧的反应：需氧
(3)过氧化氢酶：+
(4)氧化酶：+
(5)脂酶：+
(6)代谢性葡萄糖：+
甘露糖：-
蔗糖：+
乳糖：-
纤维二糖：+
蜜二糖：-
甘露糖醇：+
甘油：+
甲醇：-
DL-苹果酸：-
琥珀酸：-
富马酸：-
柠檬酸：-
水杨甙：-
(7)水解淀粉：-
明胶：-
(8)硝酸盐的还原性：-
(9)脱氮反应：-
(10)藻酸的分解：+
(11)β-羟丁酸的使用：-
(12)聚羟丁酸的积累：-
(13)对钠的需求：+
(14)对盐的需求
在无NaCl的培养基中的生长：-
在1％的NaCl培养基中的生长：-
在海水培养基中的生长：+
(15)醌：泛醌8
(16)胞内DNA的GC含量：36％
(17)OF-检验：O
(18)菌落颜色：不形成有特征的颜色
(19)发光度：-
(20)运动性：+
(21)鞭毛：极性的单鞭毛
按照“Bergey系统细菌学手册，1，343-352(1984)”和“Bergey鉴定细菌学手册，9 75，132-133(1994)”中的描述，将这种菌株鉴定为属于属交替单胞菌属的细菌。然而，此菌株的生理学特性与手册中所描述的任一细菌不同。其显示出低GC含量。因此，将其命名为Alteromonas sp.SN-1009。
上述菌株命名为Alteromonas sp.SN-1009，并且自1996年2月13日以登记号FERM P-15436保藏在通商产业省工业技术院生命工业技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号，305)，并且以登记号FERMBP-5747保藏在如上所述的通商产业省工业技术院生命工业技术研究所(根据1996年11月15日的要求转为国际保藏)。
加入到培养此菌株的培养基中的营养物质可以是任何此菌株能够利用产生本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的物质。合适的碳源的例子包括含内-硫酸岩藻糖多糖、海藻类粉末、藻酸、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖和麦芽糖；合适的氮源的例子包括酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米浆、肉膏、脱脂大豆、硫酸铵和氯化铵。培养基中还可以含有无机物质和金属盐，例如钠盐、磷酸盐、钾盐、镁盐和锌盐。
而且，此菌株在包含上述营养物质的海水或者人工海水中的生长良好。
在培养此菌株产生发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的过程中，所说的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的产量变化取决于培养条件。一般来说，通过在15℃至30℃的培养温度、培养基pH值为6至9、在通气和搅拌条件下培养5至72小时可以得到最大产量的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶。
更不用说，可以按照所使用的菌株、培养基组分等选择培养条件以便获得本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的最大产量。
在这些菌体和培养物上清液中都可以获得本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶。
在合适的培养基培养上述的Alteromonas sp.SN-1009，收获菌体，经通常使用的破碎细胞的方法(如超声处理)破碎这些菌体。这样，可以获得无细胞的提取物。
其后，通过本领域一般所使用的纯化方法纯化这些提取物，这样就得到了纯化的酶制剂。例如，纯化可以通过盐析、离子交换层析、疏水结合柱层析、凝胶过滤或其它纯化方法进行纯化，以便得到纯化的不含任何其它岩藻依聚糖分解酶的本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶。
通过从上述的培养基中除去细胞而获得的培养物上清液也含有大量的所说的酶，可以通过与纯化胞内酶所使用的相同方法纯化此酶。
本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的化学和理化性质如下：
(i)功能：作用于具有下列理化性质的含硫酸岩藻糖多糖(即含硫酸岩藻糖多糖-F)和降解含硫酸岩藻糖多糖-F：
(a)组成糖类：实质上不含有糖醛酸；和
(b)实质上不能被黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的岩藻依聚糖分解酶降解。
不作用于具有下列理化性质的含硫酸岩藻糖多糖(即含硫酸岩藻糖多糖-U)：
(c)组成糖类：含有糖醛酸；和
(d)能被黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的岩藻依聚糖分解酶降解以形成至少一种由下列化学式(I)、(II)和(III)代表的化合物：
Figure C20041003969000581
Figure C20041003969000591
Figure C20041003969000601
(ii)最适pH值：大约pH 7-8(图20)。
图20为显示所说的酶的相对活性和pH值之间的关系的图表，其中纵坐标代表相对活性(％)，而横坐标代表pH值。通过使用具有PA化还原性末端(PA-FF)的含硫酸岩藻糖多糖-F作为底物得到了实线；通过使用含硫酸岩藻糖多糖-F作为在下文(v)-(2)中将要描述的底物得到了虚线。
(iii)最适温度：大约30-35℃(图21)。
图21为显示所说的酶的相对活性和温度之间的关系的图表，其中纵坐标代表相对活性(％)，而横坐标代表温度(℃)。通过使用具有PA化还原性末端(PA-FF)的含硫酸岩藻糖多糖-F作为底物得到了实线；通过使用含硫酸岩藻糖多糖-F作为在下文(v)-(2)中将要描述的底物得到了虚线。
(iv)分子量：通过凝胶过滤使用Sephacryl S-200(由Pharmacia制造)测定的酶的分子量大约为100,000；
(v)用于测量酶促活性的方法：以下列方式测量了本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的活性。
首先，按照下列步骤(1)-(3)制备了作为本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的底物的含硫酸岩藻糖多糖-F和PA-FF。
(1)制备来源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸岩藻糖多糖混合物：
用自由粉碎机M-2型(由奈良机械制作所)将2kg干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末，并在80℃下用4.5倍的80％乙醇处理2小时。然后过滤，将残留物在按照上述过程处理，即用80％乙醇处理并过滤三次并得到用乙醇洗涤后的1,870g残留物。向所说的残留物中加入36升水，将所得的混合物在100℃下处理2小时，然后过滤混合物得到提取物。将提取物的盐浓度调整到与400mM氯化钠溶液的盐浓度相同的水平。然后，向其中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓盐，直到沉淀不再产生。离心后，将沉淀用80％的乙醇重复洗涤以完全除去氯化十六烷基吡啶鎓盐。接下来，将所得的混合物溶解在3升的2M氯化钠溶液中。在通过离心除去不溶物质后，将其悬浮在100ml用2M氯化钠平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800中。将悬液搅拌，然后过滤以除去树脂。将滤液加入到用2M氯化钠平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，通过使用超滤膜(超滤膜的排阻分子量：100,000)将流出的组分脱盐，从组分中除去低分子量物质。通过离心除去所得的沉淀。将上清液冷冻干燥，得到82.2g纯化的Kjellmaniellacrassifolia含硫酸岩藻糖多糖混合物。
(2)含硫酸岩藻糖多糖-F的制备：
将上述的6g来源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸岩藻糖多糖混合物溶解在含有0.2M氯化钙的600ml的20mM的乙酸钠(pH 6.0)中。然后，先将溶液加入到用含有0.2M氯化钙的20mM乙酸钠(pH 6.0)预先平衡的3600ml的DEAE-Sepharose FF柱中。然后，将柱用含有0.2M氯化钙的20mM乙酸钠(pH 6.0)彻底洗涤，并用0至2M的梯度氯化钠洗脱展开。
收集在0.75M的氯化钠浓度洗脱的含硫酸岩藻糖多糖-F组分和上述洗脱的组分，并通过具有100,000排阻分子量的超滤膜的超滤器脱盐。在冷冻干燥后得到了3.3g的含硫酸岩藻糖多糖-F的冻干制剂。
(3)PA-FF的制备：
将上述的12mg含硫酸岩藻糖多糖-F的冻干制剂溶解在480μl的水中，并分别将得到12μl的溶液转移到36个管中。在冷冻干燥后，通过使用GlycoTAG和GlycoTAG试剂盒将还原性末端吡啶基-(2)-氨基化(PA)，因此得到PA-FF。将上述获得的PA-FF溶解在15ml含有10％甲醇的10mM乙酸铵溶液中，并使用Cellulofine GCL-300柱(40×900mm)进行凝胶过滤。收集高分子量的组分，并通过使用孔大小为3500的透析膜透析脱盐。其后，用蒸发器浓缩至5ml，因此得到了将用作本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖-F降解酶底物的PA-FF。
通过与市售的吡啶基-(2)-氨基化的岩藻糖(由宝酒造社有限公司制造；激发波长：320nm，荧光的波长：400nm)的荧光强度比较估计上述获得的PA-FF的数量大约为40nmol。
通过使用上述步骤(1)和(2)获得的含硫酸岩藻糖多糖-F，按照下列方式测定本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的活性。
也就是说，将12μl的2.5％的含硫酸岩藻糖多糖-F溶液；6μl的1M氯化钙溶液；12μl的1M氯化钠溶液；72μl含有50mM乙酸、咪唑和Tris-盐酸的缓冲液(pH7.5)和18μl的本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖-F降解酶混合，并且在30℃下反应3小时。然后100℃将反应混合物处理10分钟并离心。通过HPLC分析100μl的混合物来测定降解程度。
作为对照，使用由此方法制备的反应混合物(只是以溶解本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的缓冲液代替本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶)和以同样方法制备的另一种反应混合物(只是以水替代含硫酸岩藻糖多糖-F的溶液)。也通过HPLC分析这些对照。
在1分钟内切割1μmol含硫酸岩藻糖多糖-F的岩藻糖基键所用的酶量定义为1U。按照下列式子计算所切割的岩藻糖基键：
活性(U/ml)＝{(12×2.5)/(100×MF)}×{(MF/M)-1}×{0.12/(180×0.01)}
(12×2.5)/100：加入到反应系统中的含硫酸岩藻糖多糖-F(mg)；
MF：底物的平均分子量(含有硫酸岩藻糖的多糖-F)；
M：反应产物的平均分子量；
(MF/M)-1：一个分子的含有硫酸岩藻糖的多糖-F中由酶切割的数量；
180：反应时间(分钟)；
0.01：酶溶液的量(ml)；和
0.12：整个反应混合物的量(ml)。
在下列条件下进行HPLC：
仪器：L-6200型(由Hitachi有限公司制造)；
柱：OHpak KB-804(8mmx300mm，由昭和电工株式会社制造)；
洗脱液：25mM含有5mM的叠氮化钠、25mM的氯化钙和50mM氯化钠的咪唑缓冲液(pH 8)。
检测仪：示差折光计检测仪(Shodex RI-71，昭和电工株式会社制造)；
流速：1毫升/分钟；和
柱温：25℃。
为了测量反应产物的平均分子量，在同样的条件下如上所述通过HPLC分析市售的分子量已知的支链淀粉(标准物P-82，由Showa DenkoK.K.制造)。然后，制备表示OHpak KB-804上支链淀粉的分子量和保留时间之间关系的曲线，并用作测定上述的酶促反应产物的分子量的标准曲线。
通过使用经上述步骤(1)-(3)获得的PA-FF按照下列方式测定本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的活性。
也就是说，将2μl的8pmol/μl的PA-FF溶液、5μl的1M氯化钙溶液；10μl的1M氯化钠溶液；23μl的水、50μl含有50mM乙酸、咪唑和Tris盐酸的缓冲液(pH8.2)和10μl的本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶混合，并且在30℃下反应3小时。然后100℃下将反应混合物处理10分钟并离心。通过HPLC分析80μl所制备的样品来测定降解程度。
使用由此方法制备的反应混合物(只是以溶解本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的缓冲液代替本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶)和以同样方法制备的另一种反应混合物(只是以水替代PA-FF溶液)作为对照。也通过HPLC分析这些对照。
在1分钟内切割1μmol含硫酸岩藻糖多糖的岩藻糖基键所用的酶量定义为1U。按照下列式子计算所切割的岩藻糖基键：
活性(U/ml)＝16×10-6×{(MF/M)-1}×{1/(180×0.01)}
16x10-6：加入到反应系统中的PA-FF的量(μmol)；
MF：底物的平均分子量(含有硫酸岩藻糖的多糖-F)；
M：反应产物的平均分子量；
(MF/M)-1：一个分子的含有硫酸岩藻糖的多糖-F中由酶切割的数量；
180：反应时间(分钟)；
0.01：酶溶液的量(ml)；和
在下列条件下进行HPLC：
仪器：L-6200型(由日立制作所制造)；
柱：OHpak KB-803(8mmx300mm，由昭和电工株式会社制造)；
洗脱液：200mM含有5mM的叠氮化钠、10％的二甲基亚砜的氯化钠溶液。
检测仪：荧光检测器F-1150(由Hitachi有限公司制造)，激发波长：320nm，荧光波长：400nm；
流速：1毫升/分钟；和
柱温度：50℃.
为了测量反应产物的平均分子量，通过使用GlycoTAG和GlycoTAG试剂盒将市售的分子量已知的支链淀粉(标准物P-82，由Showa Denko K.K.制造)吡啶基-(2)-氨基化(PA)以得到具有各种分子量的PA-支链淀粉。在同样的条件下如上所述通过HPLC分析这些具有各种分子量的PA-支链淀粉。然后，制备表示OHpak KB-803上支链淀粉的分子量和保留时间之间关系的曲线，将其用作测定上述的酶促反应产物的分子量的标准曲线。
通过在280nm测量酶溶液的吸收率来测定蛋白质。将1mg/ml蛋白质溶液的吸收率作为1.0来进行计算。
本发明人以下列方式解释了本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的作用机理。
(1)通过含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶降解含硫酸岩藻糖多糖-F和制备降解产物：
用含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶处理来源于Kjellmaniella crassifolia的纯化含硫酸岩藻糖多糖-F，因此制备了它的降解产物。
首先，制备了含硫酸岩藻糖多糖降解酶。也就是说，将Alteromonas sp.SN-1009(FERM BP-5747)接种到600ml的含有人工海水(pH8.2，Jamarin实验室制造)的培养基中，其中人工海水含有0.25％的葡萄糖、1.0％的蛋白胨和0.05％酵母提取物(所说的培养基已经转移到2-L锥形瓶并在120℃灭菌20分钟)。然后，在25℃将菌株培养26小时以得到种子培养物。在一个30-L发酵罐中加入20L含有0.25％的葡萄糖、1.0％的蛋白胨、0.02％酵母提取物和0.2％源于上述的Kjellmaniella crassifolia的含硫酸岩藻糖多糖-F和0.01％脱泡剂(信越化学工业公司制造的KM70)的人工海水(pH8.0，Jamarin实验室制造)培养基，并在120℃灭菌20分钟。在冷却后，将培养基用上述的600ml种子培养物接种，然后以10l/分钟的速率充气和250rpm搅拌，并在24℃下将其培养24小时。在培养完成后，将培养基离心以得到菌体和培养物上清液。将所得的培养物上清液用具有10,000分级分子量的超滤器浓缩，并且使用85％硫酸铵盐析。通过离心得到形成的沉淀，并用含有稀释了10倍的人工海水的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.2)彻底透析。这样就得到了600ml酶的粗提物。
将40ml所得的酶的粗提物、44ml的人工海水、510mg的上述含硫酸岩藻糖多糖-F和36ml的水混合，将混合物的pH值调整到8。在25℃反应48小时后，通过使用Cellulofine GCL-300将反应混合物进行凝胶过滤，并且将其分成四个组分，根据分子量的大小分别命名为F-Fd-1、(分子量：超过25,000)、F-Fd-2(分子量：12,000-25,000)、F-Fd-3(分子量：6,500-12,000)和F-Fd-4(分子量：6,500或更小)。将这些组分脱盐并冷冻干燥，因此分别得到了170、270、300和340mg的干燥制品。
图22显示了含硫酸岩藻糖多糖-F的酶促消化产物(即降解产物)的凝胶过滤(使用Cellulofine GCL-300)。在图22中，纵坐标代表在480nm的吸收率(用硫酸苯酯方法测定产生的颜色)，而横坐标代表组分号。每一个组分具有10ml的洗脱物。柱的体积为1,075ml，0.2M含有10％乙醇的乙酸铵溶液作为洗脱液。
在图22中，○代表已经用酶降解的含硫酸岩藻糖多糖-F的凝胶过滤结果，而黑三角形代表酶促降解前的含硫酸岩藻糖多糖-F的凝胶过滤结果。
上述的Cellulofine GCL-300凝胶过滤结果表明本发明的含硫酸岩藻糖多糖降解酶的反应产物具有大约1,000至30,000范围的分子量分布。
(2)在酶促反应产物中的还原端糖类和中性糖类组分的分析：
将上述的F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4分成样品，并通过使用GlycoTAG和GlycoTAG试剂盒对还原性末端进行吡啶基-(2)-氨基化(PA)。通过在100℃下使用4N盐酸处理3小时将上述获得的(PA-F-Fd-1)、(PA-F-Fd-2)、(PA-F-Fd-3)和(PA-F-Fd-4)水解，并通过HPLC测定还原性末端糖。
在下列条件下进行HPLC：
仪器：L-6200型(由日立制作所制造)；
柱：PALPAK Type A(4.6mmx150mm)(宝酒造社制)；
洗脱液：700mM硼酸缓冲液(pH 9.0)∶乙腈＝9∶1；
检测仪：荧光检测器F-1150(由日立制作所制造)，激发波长：310nm，荧光波长：380nm；
流速：0.3毫升/分钟；和
柱温：65℃。
结果表明(PA-F-Fd-1)、(PA-F-Fd-2)、(PA-F-Fd-3)和(PA-F-Fd-4)还原性末端糖类都是岩藻糖。
此外，用下列方式测定了F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4的中性糖类组分。用硫酸水解作为底物的含硫酸岩藻糖多糖-F，并通过使用GlycoTAG和GlycoTAG试剂盒将其组成糖的还原性末端进行吡啶基-(2)-氨基化(PA)，然后在与分析上述酶促反应产物的相同条件下进行HPLC分析。结果，只检测到了分别具有L-和D-构型的岩藻糖和半乳糖。这样，在产物中只发现了L-岩藻糖和D-半乳糖。
也就是说，按照下列方式测定了组成糖化物之一的D-半乳糖的含量。通过使用F-试剂盒乳糖/半乳糖(由Boehringer-Mannheim-山之内制造)，按照生产厂商的说明构建了只测定D-半乳糖的反应系统。在100℃下使用4N盐酸分别将F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4水解2小时；在中和后，在此反应系统中进行测定。
另一方面，按照下列方式测定了作为另一个组成糖类的L-岩藻糖的含量。按照在Clinical Chemistry，36，474-476(1990)中的描述，在100℃下使用4N盐酸将F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4水解2小时；在中和后，在此反应系统中进行测定。
结果表明，F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4的L-岩藻糖与D-半乳糖的比分别为100∶44、100∶27、100∶5和100∶1。
这些结果可以总结如下。本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶作用于含硫酸岩藻糖多糖-F并且水解岩藻糖基键，因此形成了分子量大约为1,000至30,000的降解产物。在这些降解产物中，具有更高的分子量的产物显示出具有更高的半乳糖含量。所有这些降解产物都具有L-岩藻糖作为还原性末端。
接下来，通过使用本发明的含硫酸岩藻糖多糖降解酶处理含硫酸岩藻糖多糖-U检验了此酶的底物特异性。
也就是说，将12μl的2.5％的含硫酸岩藻糖多糖-U溶液；6μl的1M氯化钙溶液；12μl的1M氯化钠溶液；72μl的50mM咪唑缓冲液(pH7.5)和18μl的本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖-F降解酶(1.6mU/ml)混合，并且在30℃下反应3小时。然后100℃将反应混合物处理10分钟并离心。通过HPLC分析100μl的混合物来测定降解程度。
使用由此方法制备的反应混合物(只是以溶解本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的缓冲液代替本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶)作为对照。也通过HPLC分析这些对照。
在下列条件下进行HPLC：
仪器：L-6200型(由日立制作所制造)；
柱：OHpak KB-804(8mmx300mm，由昭和电工株式会社制造)；
洗脱液：25mM含有5mM的叠氮化钠、25mM的氯化钙和50mM氯化钠的咪唑缓冲液(pH 8)。
检测仪：示差折光计检测仪(Shodex RI-71，昭和电工株式会社制造)；
流速：1毫升/分钟；和
柱温：25℃。
结果，含硫酸岩藻糖多糖-U没有完全被本发明的含硫酸岩藻糖多糖降解酶降解。
如上所述，本发明涉及包含本发明上述含硫酸岩藻糖多糖降解酶和钙源的酶的组合物。
能够用于固体组合物中的钙源的例子包括钙盐，例如氯化钙、碳酸钙、乙酸钙，氧化钙、氢氧化钙或其水合物。在液态组合物中，钙源可以溶解在溶剂(如水或者醇)溶解、悬浮或乳化，另一方面，钙源可以是上述引用的或已经电离(例如通过分解)的任何简单化合物。
这些钙源在激活或者稳定酶上是有效的。
因此，只要不破坏上述钙源的作用，根据使用的目的，上述酶组合物还可以含有本领域一般使用的添加剂。
可以通过用本发明的含硫酸岩藻糖多糖降解酶处理包含含硫酸岩藻糖多糖-F的材料来制备含硫酸岩藻糖多糖-F的降解产物。至于包含含硫酸岩藻糖多糖-F的材料，可以使用例如，纯化的含硫酸岩藻糖多糖-F产物、上述的含硫酸岩藻糖多糖混合物或者褐藻含水的溶剂的提取物。可以使用常规方式溶解包含含硫酸岩藻糖多糖-F的材料。虽然含硫酸岩藻糖多糖可以溶解在高浓度的溶液中，但是浓度通常取决于可使用性和酶的滴度。
可以按照目的从水、缓冲液中适当地选择含硫酸岩藻糖多糖-F溶液的溶剂。溶液的pH值通常为中性，酶促反应一般在大约30℃下进行。可以通过控制酶量、反应时间等调节降解产物的分子量。
接下来，对降解产物进行分子量分级分离以得到具有更均一分子量分布的含硫酸岩藻糖多糖-F的降解产物。可以通过通常使用的方法(例如凝胶过滤或者使用分子量分级分离膜)进行分子量分级分离。如果需要，例如可以用离子交换树脂或活性碳进行处理来进一步纯化降解产物。如果需要，也可以对降解产物脱盐、灭菌和冷冻干燥，从而得到本发明的降解产物的干燥制剂。
实施例
为了进一步详细地说明本发明(但是并不对本发明构成任何限制)，给出了下列实施例，其中的百分比是重量比。
实施例1
用自由粉碎机(由奈良机械制作所)将2kg彻底干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末。将获得的干燥粉末悬浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下处理2小时。然后将混合物通过滤纸过滤得到了残留物，将残留物按照与上述过程相同的方法用乙醇重复洗涤和过滤三次，因此得到用乙醇洗涤后残留物。将残留物悬浮在40升水中，并在95℃下处理2小时，然后过滤。用热水洗涤残余物得到36升包含来源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸岩藻糖多糖的提取物。将1.8升上述获得的提取物冷冻干燥得到15.4g含硫酸岩藻糖多糖制剂。将剩余物提取液加入氯化钠以使浓度达到0.4M。此外，向其中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓盐，直到不再产生沉淀为止。然后通过离心收集沉淀，并将其悬浮在3升的0.4M氯化钠的水溶液中，然后离心并洗涤。在重复三次洗涤过程后，向沉淀中加入1升4M氯化钠的水溶液。在充分搅拌后，加入乙醇使之浓度达到80％。然后将混合物搅拌、离心以得到沉淀。将沉淀悬浮在80％乙醇中并离心。重复上述过程，直到上清液在260nm的吸收率为0。将沉淀溶解在3升的2M氯化钠的水溶液中。在通过离心除去不溶解的物质后，将其加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化学工业社制造)中并搅拌，接下来，通过过滤除去加入的树脂。将滤液加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000的排阻分子量的中空纤维的超滤器将未吸收的组分超滤以完全除去着色物质和氯化钠。接下来，通过离心除去不溶物质，然后进行过滤和冷冻干燥。冻干的含硫酸岩藻糖多糖混合物的重量为76g。
实施例2
用自由粉碎机(由奈良机械制作所)将2kg彻底干燥的昆布研成粉末。将获得的干燥粉末悬浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下处理2小时。然后将混合物通过滤纸过滤得到残留物，将残留物按照与上述过程相同的方法用乙醇重复洗涤和过滤三次，因此得到用乙醇洗涤后残留物。将残留物悬浮在40升水中，并在95℃下处理2小时，然后过滤。用热水洗涤残余物得到36升包含来源于昆布的含硫酸岩藻糖多糖的提取物。将提取液加入氯化钠以使浓度达到0.4M。此外，向其中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓盐，直到不再产生沉淀为止。然后通过离心收集沉淀，并将其悬浮在3升的0.3M氯化钠的水溶液中，然后离心并洗涤。在重复三次洗涤过程后，向沉淀中加入1升4M氯化钠的水溶液。在充分搅拌后，加入乙醇使之浓度达到80％。然后将混合物搅拌、离心以得到沉淀。将沉淀悬浮在80％乙醇中并离心。重复上述过程，直到上清液在260nm的吸收率为0。将沉淀溶解在3升的2M氯化钠的水溶液中。在通过离心除去不溶解的物质后，将其加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化学工业社制造)中并搅拌，接下来，通过过滤除去加入的树脂。将滤液加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纤维的超滤器将未吸收的组分超滤以完全除去着色物质和氯化钠。接下来，通过离心和过滤除去不溶物质，然后进行冷冻干燥。冻干的含硫酸岩藻糖多糖混合物的重量为52g。
实施例3
昆布中的含硫酸岩藻糖多糖混合物的提取：
用自由粉碎机(由奈良机械制作所)将2kg彻底干燥的昆布研成粉末。将获得的干燥粉末悬浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下处理2小时。然后将混合物通过滤纸过滤得到残留物，将残留物按照与上述过程相同的方法用乙醇重复洗涤和过滤三次，因此得到用乙醇洗涤后残留物。将残留物悬浮在36升的0.2M乙酸钙溶液中，并在95℃下处理2小时，然后过滤。用4升的0.2M乙酸钙溶液洗涤，得到了36升包含来源于昆布的含硫酸岩藻糖多糖的提取物。
实施例4
昆布中的含硫酸岩藻糖多糖混合物的制备
向实施例3中获得的滤液中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓盐，直到不再产生沉淀为止。然后通过离心收集沉淀，并将其悬浮在3升的0.3M氯化钠的水溶液中，然后离心并洗涤。在重复三次洗涤过程后，向沉淀中加入1升4M氯化钠的水溶液。在充分搅拌后，加入乙醇使之浓度达到80％。然后将混合物搅拌、离心以得到沉淀。将沉淀悬浮在80％乙醇中并离心。重复上述过程，直到上清液在260nm的吸收率为0。将沉淀溶解在3升的2M氯化钠的水溶液中。在通过离心除去不溶解的物质后，将其加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化学工业社制造)中并搅拌，接下来，通过过滤除去加入的树脂。将滤液加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纤维的超滤器将未吸收的组分超滤以完全除去着色物质和氯化钠。接下来，通过离心和过滤除去不溶物质，然后进行冷冻干燥。冻干的含硫酸岩藻糖多糖混合物的重量为52g。此含硫酸岩藻糖多糖混合物中不含任何被多糖树脂吸附的着色物质。
实施例5
从实施例4中所描述的冷冻干燥的含硫酸岩藻糖多糖混合物中称量出4份(每份1g)，将其分别溶于水、0.2M氯化钠、0.2M氯化钙和0.2M氯化镁中。接下来，制备体积为500ml的四个DEAE-Sepharose FF柱。在这些柱中，其中有两个用0.2M氯化钠平衡，而其它的两个分别用0.2M氯化钙和0.2M氯化镁平衡。将用0.2M氯化钠平衡一个柱用10倍于柱体积的水洗涤。接下来，溶解在水、氯化钠、氯化钙和氯化镁中的含硫酸岩藻糖多糖混合物样品分别加入用水、氯化钠、氯化钙和氯化镁平衡的DEAE-Sepharose FF柱中。然后，将每一个柱用平衡时使用的溶液彻底洗涤，并且用0-4M的氯化钠的梯度洗脱来展开。结果，只有使用氯化钙和氯化镁的系统的柱吸附了全部含硫酸岩藻糖多糖混合物。另一方面，用水和氯化钠平衡的柱只吸附了少量的(0.4g)含硫酸岩藻糖多糖。
在每一个柱中，实质上将本发明的含硫酸岩藻糖多糖-F与含硫酸岩藻糖多糖-U进行了分离。
实施例6
用自由粉碎机(由奈良机械制作所)将2kg彻底干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末。将获得的干燥粉末悬浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下处理2小时。然后将混合物通过滤纸过滤得到残留物，将残留物按照与上述过程相同的方法用乙醇重复洗涤和过滤三次，因此得到用乙醇洗涤后残留物。将残留物悬浮在36升的0.2M乙酸钙溶液中，并在95℃下处理2小时，然后过滤。然后用4升的0.2M乙酸钙溶液洗涤，因此得到36升包含来源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸岩藻糖多糖的提取物。
使用具有100,000或更低的排阻分子量膜的超滤器将滤液浓缩至2升。接下来，向其中加入氯化钠以使最终浓度达到1.5M。此外，向其中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓盐，直到不再产生沉淀为止。然后通过离心收集沉淀，并将所获得的上清液通过超滤浓缩至1升。在加入4升的乙醇后，通过离心收集所得的沉淀。向沉淀中加入100ml的4M氯化钠水溶液，然后充分搅拌。向混合物中加入乙醇使之浓度达到80％。然后将混合物搅拌、离心。将获得的沉淀悬浮在80％乙醇中并离心。重复上述过程，直到上清液在260nm的吸收率为0。将沉淀溶解在2升的2M氯化钠的水溶液中。在通过离心除去不溶解的物质后，将其加入到用2M氯化钠水溶液平衡的50ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化学工业社制造)中并搅拌，接下来，通过过滤除去加入的树脂。将滤液加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并将未吸收的组分通过使用具有100,000或更低的中空纤维排阻分子量的超滤器超滤以完全除去着色物质和氯化钠。接下来，通过离心和过滤除去不溶物质，然后进行冷冻干燥。冻干的含硫酸岩藻糖多糖-U的重量为15g。本发明的含硫酸岩藻糖多糖-U不含有任何被多糖树脂吸附的着色物质。
当使用上述的内-岩藻依聚糖分解酶处理时，含硫酸岩藻糖多糖-U降解成为上述化学式(I)、(II)和(III)所代表的低聚糖。
实施例7
用自由粉碎机(由奈良机械制作所)将2kg彻底干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末。将获得的干燥粉末悬浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下处理2小时。然后将混合物通过滤纸过滤得到残留物，将残留物按照与上述过程相同的方法用乙醇重复洗涤和过滤三次，因此得到用乙醇洗涤后残留物。将残留物悬浮在36升的0.2M乙酸钙溶液中，并在95℃下处理2小时，然后过滤。然后用4升的0.2M乙酸钙溶液洗涤，因此得到36升包含来源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸岩藻糖多糖的提取物。向所得的滤液中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓盐，直到不再产生沉淀为止。然后通过离心收集沉淀，并将其悬浮在3升的0.4M氯化钠的水溶液中，然后离心并洗涤。在重复三次洗涤过程后，向沉淀中加入1升4M氯化钠的水溶液，并充分搅拌。向所得的混合物中加入乙醇使之浓度达到80％，并将混合物搅拌、离心以得到沉淀。将所得的沉淀悬浮在80％乙醇中并离心。重复上述过程，直到上清液在260nm的吸收率为0。将沉淀溶解在3升的2M氯化钠的水溶液中。在通过离心除去不溶解的物质后，将其加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化学工业社制造)中并搅拌。接下来，通过过滤除去加入的树脂。将滤液加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纤维的超滤器将未吸收的组分超滤以完全除去着色物质和氯化钠。接下来，通过离心和过滤除去不溶物质，然后进行冷冻干燥。冻干的含硫酸岩藻糖多糖混合物的重量为90g。得到的含硫酸岩藻糖多糖混合物不含有任何被多糖树脂吸附的着色物质。所得的冷冻干燥的含硫酸岩藻糖多糖混合物中称量出7g，然后将其溶于0.2M氯化钙中。然后用0.2M氯化钙平衡4000ml的DEAE-Sepharose FF柱。将溶解在0.2M氯化钙中的含硫酸岩藻糖多糖混合物加入到DEAE-Sepharose FF柱中，并用0.2M氯化钙溶液彻底洗涤。接下来，用0-4M的氯化钠的线型梯度洗脱来展开。在这样洗脱的组分中，将那些具有0.05至0.8M浓度的氯化钠组分组合，并通过透析来脱盐，然后冷冻干燥。这样实质上得到与含硫酸岩藻糖多糖-F分离的2.1g含硫酸岩藻糖多糖-U。
在上述洗脱的组分中，将那些具有0.9至1.5M浓度的氯化钠组分组合，并通过透析来脱盐，然后冷冻干燥。这样实质上得到与含硫酸岩藻糖多糖-U分离的4.7g含硫酸岩藻糖多糖-F。
实施例8
含硫酸岩藻糖多糖-F的制备：
从实施例7中所获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物称量出1.2g，并将其溶解在1.5M氯化钠溶液中，使之终浓度为0.2％。接下来，向其中加入溶解在1.5M氯化钠溶液中的1.25％氯化十六烷基吡啶鎓盐，直到不再产生沉淀为止。然后通过离心收集沉淀，并将其悬浮在500ml的1.5M氯化钠的水溶液中，然后离心并洗涤。在重复三次洗涤过程后，向沉淀中加入1升4M氯化钠的水溶液，并将混合物充分搅拌。向所得的混合物中加入乙醇使之浓度达到80％，并将混合物搅拌、离心以得到沉淀。将所得的沉淀悬浮在80％乙醇中并离心。重复上述过程，直到上清液在260nm的吸收率为0。将沉淀溶解在500ml的2M氯化钠的水溶液中。在通过离心除去不溶解的物质后，将其加入到用2M氯化钠水溶液平衡的1ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化学工业社制造)中并搅拌。接下来，通过过滤除去加入的树脂。将滤液加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纤维的超滤器将未吸收的组分超滤以完全除去着色物质和氯化钠。接下来，通过离心和过滤除去不溶物质，然后进行冷冻干燥。冻干的含硫酸岩藻糖多糖-F的重量为710mg。得到的含硫酸岩藻糖多糖-F不含有任何被多糖树脂吸附的着色物质。这种含硫酸岩藻糖多糖-F就是本发明的不含糖醛酸并含有岩藻糖作为组成糖的主要组分的含硫酸岩藻糖多糖-F。
实施例9
用酶促纯化含硫酸岩藻糖多糖-F的方法
从在实施例7中所获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物称量出10g，并溶解在500ml的人工海水中。接下来，向其中加入5U上述来源于黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)内-岩藻依聚糖分解酶，并在25℃下反应50小时。并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纤维的超滤器将反应混合物进行超滤。在完全除去低分子量物质后，通过离心和过滤除去不溶物质，然后进行冷冻干燥。冻干的含硫酸岩藻糖多糖-F的重量为6g。得到的含硫酸岩藻糖多糖-F不含有任何被多糖树脂吸附的着色物质。发现这种含硫酸岩藻糖多糖-F就是本发明的不含糖醛酸并含有岩藻糖作为组成糖的主要组分的含硫酸岩藻糖多糖-F。
实施例10
用培养性纯化含硫酸岩藻糖多糖-F的方法
从在实施例7中所获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物称量出60g，并溶解在20升的人工海水中。接下来，向其中加入200g蛋白胨和4g酵母提取物。在将其加入到30升的发酵罐并灭菌后，用上述的黄杆菌Flavobacteriumsp.SA-0082(FERM BP-5402)接种，并在25℃下培养24小时。通过离心除去细胞后，使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纤维的超滤器将培养基进行超滤。在完全除去低分子量物质后，通过离心和过滤除去不溶物质，然后进行冷冻干燥。冻干的含硫酸岩藻糖多糖-F的重量为36g。得到的含硫酸岩藻糖多糖-F不含有任何被多糖树脂吸附的着色物质。发现这种含硫酸岩藻糖多糖-F就是本发明的不含糖醛酸并含有岩藻糖作为组成糖的主要组分的含硫酸岩藻糖多糖-F。
实施例11
从实施例7中所描述的冷冻干燥的含硫酸岩藻糖多糖混合物中称量出4份(每份1g)，将其分别溶于水、0.2M氯化钠、0.2M氯化钙和0.2M氯化镁中。接下来，制备体积为500ml的四个DEAE-Sepharose FF柱。在这些柱中，其中有两个用0.2M氯化钠平衡，而其它的两个分别用0.2M氯化钙和0.2M氯化镁平衡。将用0.2M氯化钠平衡一个柱用10倍于柱体积的水洗涤。接下来，将溶解在水、氯化钠、氯化钙和氯化镁中的含硫酸岩藻糖多糖混合物样品分别加入用水、氯化钠、氯化钙和氯化镁平衡的DEAE-Sepharose FF柱中。然后，将每一个柱用平衡时使用的溶液彻底洗涤，并且用0-4M的氯化钠的线型梯度洗脱来展开。结果，只有使用氯化钙和氯化镁的系统的柱吸附了全部硫酸岩藻糖多糖混合物。另一方面，用水和氯化钠平衡的柱只吸附了少量的(0.4g)含硫酸岩藻糖多糖。
在每一个柱中，实质上含硫酸岩藻糖多糖-U与含硫酸岩藻糖多糖-F得到分离。
实施例12
从在实施例7中所获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物称量出7g，并溶解在800ml的0.2M氯化钙中。接下来，用0.2M氯化钙平衡4升的DEAE-Sepharose FF柱，将上述的含硫酸岩藻糖多糖的全部溶液加入到柱中。在用8升的0.2M氯化钙洗涤后，通过用0-4M的氯化钠的线型梯度洗脱来展开。在这样洗脱组分中，将检测到了含有糖醛酸的组分(氯化钠浓度：大约0.9M或更低，含硫酸岩藻糖多糖-U)和不含有糖醛酸的组分(氯化钠浓度：大约1.2M，含硫酸岩藻糖多糖-F)分别脱盐并冷冻干燥。这样，分别获得了1.4g和4.8g的干燥制品。
实施例13
将实施例1中所获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物用黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的内-岩藻依聚糖分解酶处理。成了具有下列结构的低聚糖：
Figure C20041003969000771
Figure C20041003969000781
本发明人进行了下面所述的酶促反应，并且获得了上述的低聚糖。
也就是说，将80ml 2.5％的实施例1的含硫酸岩藻糖多糖混合物的溶液、60ml的50mM磷酸盐缓冲液溶液(pH7.5)、20ml 4M氯化钠和40ml的32mU/ml内-岩藻依聚糖分解酶溶液混合，并且在25℃下反应48小时。
然后，将反应混合物通过使用Cellulofine GCL-300柱(由生化学工业社制造)进行分子量分级分离，并将分子量为2,000或更小的组分组合。在使用Micro Acilyzer G3脱盐后，通过使用DEAE-Sepharose FF将其分成三个组分，然后再一次脱盐并冷冻干燥。这样，分别获得了250mg、310mg和52mg上述化学式(I)、(II)和(III)代表的低聚糖。
实施例14
将10g在实施例1获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物溶解在500ml 0.2M柠檬酸中，并将所得溶液的pH值调整到2.9。然后在100℃下处理3小时。在所得的水解产物中加入150ml 1M乙酸钙溶液。在通过离心除去所形成的沉淀后，通过凝胶过滤使用Cellulofine GCL-25(分子量：＞5,000、5,000-3,000、3,000-2,000、2,000-1,000、1,000-500、＜500)。按照分子量由高到低的顺序将所获得的组分命名为GFd-Oli-l、Gfd-Oli-2、GFd-Oli-3、GFd-Oli-4、GFd-Oli-5和GFd-Oli-6。将这六个组分都进行脱盐和冷冻干燥。这样，分别获得了2.3g、1.7g、0.88g、1.8g、1.4g和0.72g的干燥制品。
实施例15
从实施例1中所获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物中称量出60g，并溶解在20升的人工海水中。接下来，向其中加入200g蛋白胨和4g酵母提取物。在将其加入到30升的发酵罐并灭菌后，用黄杆菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)接种，并在25℃下培养24小时。通过离心除去菌体后，使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纤维的超滤器将培养基超滤。在完全除去低分子量物质后，通过离心和过滤除去不溶物质，然后进行冷冻干燥。冻干的含硫酸岩藻糖多糖-F的重量为36g。
实施例16
将5kg的刺参Stichopus japonicus切开。然后除去内脏并收集体壁。在200g湿体壁中加入500ml丙酮。在使用匀浆器处理后，将混合物过滤，用丙酮洗涤残留物直到完全除去着色物质物质。然后将残留物抽吸过滤得到140g的干燥产物。将所得的干燥产物溶解在2.8升的0.4M氯化钠水溶液中。在100℃下处理1小时后，将混合物过滤，并用0.4M氯化钠水溶液彻底洗涤残留物。这样得到了3.7升的提取物。向所得的提取物中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓盐，直到不再产生沉淀为止。然后通过离心收集沉淀，并将所获得的沉淀再次悬浮在0.4M氯化钠水溶液中并离心。将所得的沉淀加入1升4M氯化钠水溶液中，并使用匀浆器处理所得的混合物。在搅拌的条件下加入4升乙醇，在搅拌1小时后，将混合物过滤，因此得到沉淀。将获得的沉淀悬浮在80％乙醇中并离心。重复上述过程，直到上清液在260nm的吸收率为0。将沉淀悬浮在2升的2M氯化钠的水溶液中，并通过离心除去不溶解的物质。使用具有30,000排阻分子量的超滤器超滤将上清液完全脱盐。在冷冻干燥后，获得了3.7g的含硫酸岩藻糖多糖。
实施例17
用自由粉碎机(由奈良机械制作所)将2kg彻底干燥的墨角藻研成粉末。将获得的干燥粉末悬浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下处理2小时。然后将混合物通过滤纸过滤得到残留物，将残留物按照与上述过程相同的方法用乙醇重复洗涤和过滤三次，因此得到用乙醇洗涤后残留物。将残留物悬浮在40升水中，并在100℃下处理2小时，然后过滤。将过滤物加入氯化钠，使其浓度为0.5M。此外，所得的溶液中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓盐，直到不再产生沉淀为止。然后通过离心收集沉淀，并将其悬浮在3升的0.4M氯化钠的水溶液中，然后离心并洗涤。在重复三次洗涤过程后，向沉淀中加入250g的氯化钠，并将其悬浮在3升的乙醇中。然后将悬液离心以得到沉淀。将所得的沉淀悬浮在80％乙醇中并离心。重复上述过程，直到上清液在260nm的吸收率为0。将沉淀溶解在3升的2M氯化钠的水溶液中。在通过离心除去不溶解的物质后，将其加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化学工业社制造)中并搅拌。接下来，通过过滤除去加入的树脂。将滤液加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纤维的超滤器将未吸收的组分超滤以完全除去着色物质和氯化钠。接下来，通过离心和过滤除去不溶物质，然后进行冷冻干燥。冻干的含硫酸岩藻糖多糖混合物的重量为92g。
实施例18
用自由粉碎机(由奈良机械制作所)将2kg彻底干燥的裙带菜Undariapinnatifida研成粉末。将获得的干燥粉末悬浮在9升乙醇中，并在75℃下处理1小时。然后将混合物通过滤纸过滤得到残留物，向残留物中加入9升80％的乙醇，并将混合物搅拌，然后在80℃下处理1小时，其后，将混合物通过滤纸过滤得到残留物。将残留物按照与上述过程相同的方法用乙醇重复洗涤和过滤三次，因此得到1,908g的用乙醇洗涤后的残留物。将684g残留物悬浮在9升的0.2M乙酸钙溶液中，并在95℃下处理1小时。在放置24小时后得到了上清液。将通过除去上清液所获得的沉淀加入9升的0.2M乙酸钙溶液，并把所得的混合物搅拌，然后放置1小时以得到上清液。将所得的上清液和上述获得的上清液组合。其后，使用具有100,00或更低的排阻分子量的中空纤维的超滤器将所得的组分超滤，并且浓缩到350ml。然后将浓缩物离心。在除去沉淀后，加入2mM氯化钠进行超滤。在完全除去乙酸钙后，将残留物冷冻干燥，因此得到了3.2g的冻干产物。此冻干产物中含有3.1g含硫酸岩藻糖多糖。
实施例19
(1)Kjellmaniella crassifolia含硫酸岩藻糖多糖的混合物的制备
用自由粉碎机(由奈良机械制作所)将2kg彻底干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末。在80℃下将获得的干燥粉末用4.5倍的80％乙醇处理2小时，然后过滤。将获得的残留物按照与上述过程相同的方法用80％乙醇重复洗涤和过滤三次，因此得到1870g的用乙醇洗涤后的残留物。将36升水中加入到残留物，并将混合物在100℃下处理2小时以得到提取物。将提取物的盐浓度调节到与400mM氯化钠溶液相同的水平。向所得的滤液中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓盐，直到不再产生沉淀为止。离心后，将沉淀再次用80％乙醇洗涤以完全除去氯化十六烷基吡啶鎓盐。接下来，将其溶解在3升的2M氯化钠溶液中。在通过离心除去不溶解的物质后，将其悬浮在用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中。将此悬液搅拌，然后过滤以除去树脂。将滤液加入到用2M氯化钠水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，将流出的组分脱盐，并通过使用超滤器(膜的排阻分子量：100,000)除去低分子量物质。通过离心除去所得的沉淀。将上清液冷冻干燥，因此，得到了82.2g的纯化的Kjellmaniellacrassifolia含硫酸岩藻糖多糖的混合物。
(2)含硫酸岩藻糖多糖-F的制备
将6g上述的来源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸岩藻糖多糖混合物溶于600ml含有0.2M氯化钙的20mM的乙酸钠(pH 6.0)中。然后，先将此溶液加入到预先用含有0.2M氯化钙的20mM的乙酸钠(pH 6.0)平衡的3600ml DEAE-Sepharose FF柱中，并通过使用0-2M的氯化钠的线型梯度洗脱来展开。收集在0.75M或更高氯化钠浓度洗脱的含硫酸岩藻糖多糖-F组分，并通过使用具有10000排阻分子量的超滤膜的超滤器进行浓缩脱盐。在冷冻干燥后，得到了3.3g的含硫酸岩藻糖多糖-F的冻干制剂。
(3)含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的制备
将Alteromonas sp.SN-1009(FERM BP-5747)接种到600ml的含有人工海水(pH8.2，Jamarin实验室制造)的600ml培养基中，其中在人工海水中含有0.25％的葡萄糖、1.0％的蛋白胨和已经转移到2升锥形瓶并灭菌(120℃，20分钟)的0.05％酵母提取物。然后，在25℃将菌株培养25小时以得到种培养物。在一个30升的发酵罐中加入18升含有200g蛋白胨、4g酵母提取物和4ml的脱泡剂(KM70，由信越化学工业制造)的人工海水(pH8.0)的培养基，并在120℃灭菌20分钟。在冷却后，将培养基用20g的用实施例8的方法制备的Kjellmaniella crassifolia的含硫酸岩藻糖多糖-F(已经分别溶于2升的在120℃灭菌15分钟的人工海水中)和600ml上述的种子培养物接种，然后以10l/分钟的速率充气和125rpm搅拌，在24℃下将其培养24小时。在培养完成后，将培养基离心以得到菌体和培养物上清液。
当使用含硫酸岩藻糖多糖-F作为底物进行测量时，培养上清液显示出具有5mU/ml培养基的本发明的含硫酸岩藻糖多糖降解酶的活性。
将所得的培养物上清液用具有10,000分级分子量的超滤器浓缩，并且通过离心除去形成的沉淀。然后使用85％硫酸铵盐析。将所得的沉淀进行离心，并用含有稀释了10倍的人工海水(Jamarin S)的20mM Tris盐酸缓冲液(pH 8.2)彻底透析。这样就得到了400ml酶的粗提物。
通过用含有5mM叠氮化钠和稀释10倍的人工海水(Jamarin S)的20mM Tris盐酸缓冲液(pH 8.2)平衡的DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化学工业社制造)吸附所得的酶粗提物溶液。然后使用同一缓冲液彻底洗涤所吸附的物质，并使用含有100mM、200mM、300mM、400mM和600mM氯化钠的溶液洗脱到同一缓冲液中。将活性组分组合。
当通过使用含硫酸岩藻糖多糖-F作为底物测量时，部分纯化的酶显示出10,200mU(10.2U)的活性。所说的酶中不含有其它的含硫酸岩藻糖多糖降解酶。
将所得的部分纯化的酶使用Sephacryl S-200进行凝胶过滤，所使用的Sephacryl S-200是用含有5mM叠氮化钠和稀释10倍的人工海水(JamarinS)的10mM Tris盐酸缓冲液(pH 8.0)平衡的。这样测定的此酶的分子量大约为100,000。
(4)通过分别使用上述获得的部分纯化的酶和PA-FF作为酶源和底物，测定了钙浓度对此酶活性的影响。
在酶促反应中，使用了含有50mM乙酸、咪唑和Tris盐酸的缓冲液(pH7)。在反应混合物中，加入氯化钠以使其之终浓度为400mM。
当把反应混合物中的氯化钙浓度从0变化至100mM时，测量了酶活性。图23中显示了所得的结果，其中纵坐标代表相对活性(％)，而横坐标代表反应混合物中的钙浓度(mM)。
因此表明所说的酶的活性在钙盐存在下有很大的提高。
(5)在5℃下将本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶在用下面详细说明的六种缓冲液透析保存20小时后，测量了此酶的剩余活性。
1.20mM Tris盐酸缓冲液(pH 8.2)。
2.含有5mM叠氮化钠的20mM Tris盐酸缓冲液(pH 8.2)。
3.含有5mM叠氮化钠和50mM氯化钠的20mM Tris盐酸缓冲液(pH 8.2)。
4.含有5mM叠氮化钠和500mM氯化钠的20mM Tris盐酸缓冲液(pH 8.2)。
5.含有5mM叠氮化钠、50mM氯化钠和10mM氯化钙的20mM Tris盐酸缓冲液(pH 8.2)。
6.含有5mM叠氮化钠和稀释10倍的人工海水(Jamarin S)的20mMTris盐酸缓冲液(pH 8.2)。
结果，当使用缓冲液1、2和3透析时，本发明的含硫酸岩藻糖多糖降解酶失活；而使用缓冲液4、5和6透析时，所说的酶仍然保持活性。
基于这些结果，表明此酶在500mM氯化钠或10mM钙离子存在下稳定。
(6)称量出5g上述实施例制备的含硫酸岩藻糖多糖-F，并将其与471ml50mM咪唑缓冲液(pH 8)、12.5ml 4M氯化钠、6.25ml 4M氯化钙和10ml(相当于6mU)实施例19-(3)中获得的本发明部分纯化的含硫酸岩藻糖多糖降解酶混合。在25℃下反应120小时后，得到含硫酸岩藻糖多糖-F的小分子降解产物。
图25和26分别显示出上面得到的降解产物的IR和NMR分析数据。图24显示出Cellulofine GCL-300的凝胶过滤结果。也就是说，表明此物质分子量分布为1,000至30,000。
此物质包含46％硫酸根(按照SO4计算，分子量：96)，并且表现出含有中性糖类组分的岩藻糖和半乳糖(100∶4)。
在图24至26的每个图中，纵坐标和横坐标的意义分别与在图2至4中的意义相同。
实施例20
将人类前髓细胞的白血病细胞HL-60(ATCC CRL-1964)培养在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培养基中(由Gibco制造)(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在ASF104培养基(由味之素有限公司制造)中，使最终浓度为5×105细胞/9ml。向四份9ml的这种悬液中加入实施例1、12和15中获得的溶解在生理盐水中的1ml 5mg/ml含硫酸岩藻糖多糖的溶液中，所说的多糖已经通过乙酸纤维素滤膜(孔大小为：0.20μm，由Corning制造；在接下来的滤膜处理中使用同样的滤膜)过滤处理，在5％的CO2存在下，37℃下温育40小时后通过离心从上清液中分离细胞。将所获得的细胞悬浮在20μl 50mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.8)中，所说的缓冲液含有10mM乙二胺四乙酸盐和0.5％的月桂酰肌氨酸钠。然后加入1μl的10mg/ml的核糖核酸酶A(由Sigma制造)，在50℃下将混合物处理30分钟。加入1μl浓度为10mg/ml蛋白酶K后，50℃下处理混合物1小时。将所处理的细胞作为样品，100V恒压下，在2％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。将此凝胶浸没在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溶液中30分钟，然后通过使用透照器检测凝胶中的DNA状态。结果观察到了代表细胞凋亡的DNA梯度。为了进一步证实，使用10μg/ml的放线菌素D(被认为是诱导诱导细胞凋亡的试剂)溶液代替含硫酸岩藻糖多糖来重复上述的过程。结果，在温育20小时后观察到与含硫酸岩藻糖多糖所得的结果相似的DNA梯度。
基于这些结果，说明可以通过实施例1、12和15获得的含硫酸岩藻糖多糖来诱导HL-60细胞的细胞凋亡。
将在实施例1、12和15中所获得的含硫酸岩藻糖多糖分别溶解在含有120mM氯化钠的30mM Hepes缓冲液(pH 7.2)中，以便使其浓度达到5mg/ml，并在121℃下在高压灭菌器中处理20分钟。然后以与上述相同的方式检测这些含硫酸岩藻糖多糖对HL-60细胞(ATCC CCL-240)诱导细胞凋亡的作用。获得了相同的结果。
实施例21
将人类前髓细胞的白血病细胞HL-60(ATCC CRL-1964)培养在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在ASF104培养基(由味之素有限公司制造)中，使最终浓度为5×105细胞/9ml。向9ml的这种悬液中加入实施例15中获得的溶解在生理盐水中的1ml 5mg/ml含硫酸岩藻糖多糖的溶液中，所说的多糖溶液已经通过滤膜处理。在5％的CO2存在下，37℃下温育20小时后通过离心从上清液中分离细胞。将所获得的细胞按照《细胞凋亡实验通则》(Apoptosis实验Protocol)(秀润社，田沼靖一主编，93-95，1995)中所描述的方法进行Giemsa染色。也就是说，使用Carnoy固定液(乙酸∶甲醇＝1∶3)将所获得的细胞固定在载玻片上，用Giemsa染料(由Merck公司制造)染色，并在光学显微镜下观察。这样，观察到了细胞凋亡的特有的核片段。此事实表明实施例15所获得的含硫酸岩藻糖多糖能诱导HL-60细胞的细胞凋亡。
将实施例15中所获得的含硫酸岩藻糖多糖分别溶解在含有120mM氯化钠的30mM Hepes缓冲液(pH 7.2)中，以使其浓度达到5mg/ml，并在121℃下在高压灭菌器中处理20分钟。然后以与上述相同的方式检测这些含硫酸岩藻糖多糖诱导细胞凋亡的作用。获得了相同的结果。
实施例22
将人类前髓细胞的白血病细胞HL-60(ATCC CRL-240)培养在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在ASF104培养基(由味之素有限公司制造)中，使最终浓度为5×105细胞/4.5ml。向四份4.5ml的这种悬液中加入0.5ml的浓度为10mg/ml的实施例1、15和18所获得的含硫酸岩藻糖多糖的溶液，所说的多糖溶解在含有120mM氯化钠的30mM Hepes缓冲液(pH 7.2)(此溶液已经在121℃下在高压灭菌器中处理了20分钟)中。在5％的CO2存在下，37℃下温育24小时和40小时后，通过锥虫蓝染色方法计算细胞。
结果如图27所示，此图显示出培养时间和HL-60细胞的培养基中的活细胞数之间的关系，其中所说的培养基中已经加入在实施例1、15和18中所获得的含硫酸岩藻糖多糖，所加入的量使其终浓度为1mg/ml。在此图中，横坐标代表培养时间(小时)，纵坐标代表培养基中的活细胞数(×105细胞/5ml)。在图27中，空正方形代表对照(未加入所说的多糖)；+代表实施例1所获得的含硫酸岩藻糖多糖；●代表实施例15中所获得多糖；×代表实施例18中所获得的多糖。
在这种情况下，死细胞显示出细胞凋亡的形态学特征(如细胞的收缩和断裂)。也就是说，这些结果表明实施例1、15和18中获得含硫酸岩藻糖多糖能够诱导HL-60细胞的细胞凋亡，并且大大抑制了这些细胞的增殖。
将在实施例1、15和18中所获得的含硫酸岩藻糖多糖溶解在含有120mM氯化钠的30mM Hepes缓冲液(pH 7.2)中，使其终浓度为10mg/ml，并用滤膜处理。然后，以与上述相同的方式检测这些含硫酸岩藻糖多糖诱导细胞凋亡的作用。得到相同的结果。
实施例23
将人急性淋巴母细胞性白血病细胞MOLT-3(ATCC CRL-1552)悬浮在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培养基中(由Gibco制造)(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，使最终浓度为5×105细胞/9ml。向五份9ml这种悬液中加入1ml实施例1、2、12和16中获得的溶解在生理盐水中的5mg/ml含硫酸岩藻糖多糖的溶液中，所说的多糖溶液已经通过滤膜处理。在5％的CO2存在下，37℃下温育60小时后通过离心从上清液中分离细胞。将所获得的细胞悬浮在20μl 50mMTris盐酸缓冲液(pH 7.8)中，所说的缓冲液含有10mM乙二胺四乙酸盐和0.5％的月桂酰肌氨酸钠。然后加入1μl的10mg/ml的核糖核酸酶A(由Sigma制造)，在50℃下将混合物处理30分钟。加入1μl浓度为10mg/ml蛋白酶K后，在50℃下处理混合物1小时。将所处理的细胞作为样品，在100V恒压下，在2％琼脂糖凝胶上进行电泳。将此凝胶浸没在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溶液中30分钟，然后通过使用透照器检测凝胶中的DNA状态。结果观察到了代表细胞凋亡的DNA梯度。为了进一步证实，使用10μg/ml的放线菌素D(被认为是诱导诱导细胞凋亡的试剂)溶液代替上述的含硫酸岩藻糖多糖来重复上述的过程。结果，在温育20小时后观察到与含硫酸岩藻糖多糖所得的结果相似的DNA梯度。
基于这些结果，说明可以通过实施例1、2、12和16获得的含硫酸岩藻糖多糖来诱导MOLT-3细胞的细胞凋亡。
将在实施例1、2、12和16中所获得的含硫酸岩藻糖多糖分别溶解在PBS(所说的PBS是通过将8g氯化钠、0.2g氯化钾、2.9g十二水合磷酸氢二钠和0.2g磷酸二氢钾溶解在1升水中而制备的)中，得到终浓度为5mg/ml的多糖溶液，并在121℃下在高压灭菌器中处理20分钟。然后以与上述相同的方式检测这些含硫酸岩藻糖多糖诱导细胞凋亡的作用。获得了相同的结果。
实施例24
将人急性淋巴母细菌性白血病细胞(ATCC CRL-1552)培养在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在RPMI 1640培养基中，使最终浓度为5×103细胞/ml。然后将悬液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所说的悬液中加入0.2ml浓度为0.5mg/ml的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖、实施例12中获得的含硫酸岩藻糖多糖-F、实施例15和17中获得的含硫酸岩藻糖多糖及葡聚糖硫酸酯(分子量：500,000；由和光纯药社制造)溶液，所说的溶液溶解在PBS中并进行灭菌，之后在5％的CO2存在下，37℃下温育。作为对照，只加入等量的PBS，并以同样的方式进行温育。在培养起始后的2、4、6和8天，由锥虫蓝方法计算细胞。
结果如图28所示，此图显示出温育时间和MOLT-3细胞的培养基中的活细胞数之间的关系，其中所说的培养基中已经加入了实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖、实施例12中获得的含硫酸岩藻糖多糖-F、实施例15和17中获得的含硫酸岩藻糖多糖及葡聚糖硫酸酯，所加入的量使其终浓度为0.5mg/ml。在此图中，横坐标代表培养时间(天)，纵坐标代表培养基中的活细胞数(×104细胞/2ml)。在图28中，○代表对照(未加入所说的多糖)；●代表实施例12中所获得含硫酸岩藻糖多糖-F；空正方形代表实施例1所获得的含硫酸岩藻糖多糖；空三角形代表实施例17中所获得的多糖，■代表实施例15所获得的多糖。葡聚糖硫酸酯显示的曲线实质上与使用实施例15所获得的含硫酸岩藻糖多糖所获得的曲线相同。
在这种情况下，死细胞显示出细胞凋亡的形态学特征(如细胞的收缩和断裂)。也就是说，这些结果表明实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖、实施例12中获得的含硫酸岩藻糖多糖-F、实施例15和17中获得的含硫酸岩藻糖多糖及葡聚糖硫酸酯能够诱导MOLT-3细胞的细胞凋亡，并且大大抑制了这些细胞的生长。
将实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖、实施例15和17中获得的含硫酸岩藻糖多糖及葡聚糖硫酸酯(分子量：500,000；由和光纯药社制造)分别溶解在PBS中，得到终浓度为5mg/ml的多糖溶液，并在121℃下在高压灭菌器中处理20分钟。然后以与上述相同的方式检测这些多糖诱导细胞凋亡的作用。获得了相同的结果。
实施例25
37℃下，将人类前髓细胞的白血病细胞HL-60(ATCC CRL-240)培养在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在ASF104培养基(由味之素有限公司制造)中，使最终浓度为5×104细胞/900μl。向9份900μl的这种悬液中分别加入100μl的生理盐水，其中分别含有浓度为10mg/ml的实施例1的含硫酸岩藻糖多糖、F-Fd-1至F-Fd-4和实施例13获得的三种含硫酸岩藻糖低聚糖的生理盐水溶液，所说的多糖生理盐水溶液已经用滤膜进行了处理。在5％的CO2存在下，37℃下温育40小时后，在显微镜下观察所说的细胞，以便检查细胞的生长程度和细胞的形态。
结果，加入了含硫酸岩藻糖多糖制剂、F-Fd-1至F-Fd-4、和三种含硫酸岩藻糖低聚糖的HL-60细胞都显示出细胞凋亡的特征(如细胞收缩和断裂)。加入了生理盐水的HL-60细胞的细胞数目增加了大约4倍，而加入了含硫酸岩藻糖多糖制剂、F-Fd-1至F-Fd-4、和三种含硫酸岩藻糖多糖的HL-60细胞则没有增加或者降低到原来的1/10或更少。这些结果表明由于含硫酸岩藻糖多糖制剂、F-Fd-1至F-Fd-4、和三种含硫酸岩藻糖低聚糖的诱导细胞凋亡的作用而抑制了HL-60细胞的生长。
为了进一步证实，使用10μg/ml的放线菌素D(被认为是诱导诱导细胞凋亡的试剂)溶液代替上述的含硫酸岩藻糖多糖来重复上述的过程。结果，在温育20小时后观察到了与含硫酸岩藻糖多糖所得的结果相似的细胞收缩和断裂。基于这些结果，说明可以通过含硫酸岩藻糖多糖制剂、F-Fd-1至F-Fd-4、和实施例13中获得的三种含硫酸岩藻糖低聚糖来诱导HL-60细胞的细胞凋亡。
将在实施例1获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂、F-Fd-1至F-Fd-4和实施例13获得的三种含硫酸岩藻糖低聚糖分别溶解在含有120mM氯化钠的30mM Hepes缓冲液(pH 7)中，使其终浓度为10mg/ml，并于121℃下在高压灭菌器中处理20分钟。然后，以与上述相同的方式检测它们诱导细胞凋亡的作用。得到相同的结果。
实施例26
将肺癌细胞A-549(ATCC CCL-185)、SV40-转化的肺细胞WI-38VA13(ATCC CCL-75.1)和肝癌细胞Hep G2(ATCC HE-8065)分别悬浮在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，使最终浓度为104细胞/1.8ml。向每个细胞系的1.8ml悬液中加入200μl的生理盐水和浓度为1mg/ml的实施例1和实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖、实施例14获得的六种含有硫酸岩藻糖的低聚糖溶液，所说的多糖溶解在生理盐水中并已经用滤膜进行了处理。在5％的CO2存在下，37℃下温育6天后，在显微镜下观察所说的细胞，以便检查细胞的生长程度和细胞的形态。
结果，加入了实施例1和实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖、实施例14获得的六种含有硫酸岩藻糖的低聚糖中的三种分子量为2,000或更多的组分的肺癌细胞A-549、SV40-转化的肺细胞WI-38VA13)和肝癌细胞HepG2都显示出细胞凋亡的特征(如细胞收缩和断裂)。加入了生理盐水的癌细胞系的细胞数目明显增加，而加入了实施例1和实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖、实施例14获得的六种含有硫酸岩藻糖的低聚糖中的三种分子量为2,000或更多的组分的那些细胞每一种的细胞数目都降低了。这些结果表明由于这些含硫酸岩藻糖多糖和低聚糖的诱导细胞凋亡的作用而抑制了每一种癌细胞系的生长。
将在实施例1和实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖、实施例14获得的六种含有硫酸岩藻糖的低聚糖分别溶解在PBS中，使其终浓度为1mg/ml，并于121℃下在高压灭菌器中处理20分钟。然后，以与上述相同的方式检测它们诱导细胞凋亡的作用。得到相同的结果。
实施例27
将结肠癌细胞HCT 116(ATCC CCL-247)和胃癌细胞AGS(ATCCCCL-1739)分别悬浮在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的McCoy 5a培养基(由Gibco制造)和Ham F12培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，使最终浓度为104细胞/1.8ml。向每个细胞系的1.8ml悬液中加入200μl的生理盐水和浓度为10mg/ml的实施例1、12和15获得的含硫酸岩藻糖多糖和四种含有硫酸岩藻糖的低聚糖F-Fd-1至F-Fd-4，所说的多糖溶解在生理盐水中并已经用滤膜进行了处理。在5％的CO2存在下，37℃下温育48小时后，在显微镜下观察所说的细胞，以便检查细胞的生长程度和细胞的形态。
结果，加入了实施例1、12和15获得的含硫酸岩藻糖多糖和四种含有硫酸岩藻糖的低聚糖F-Fd-1至F-Fd-4的结肠癌细胞HCT 116和胃癌细胞AGS都显示出细胞凋亡的特征(如细胞收缩和断裂)。加入了生理盐水的癌细胞系的细胞数目明显增加，而加入了实施例1、12和15获得的含硫酸岩藻糖多糖和四种含有硫酸岩藻糖的低聚糖F-Fd-1至F-Fd-4的那些细胞每一种的细胞数目都降低了。这些结果表明由于这些含硫酸岩藻糖多糖和低聚糖的诱导细胞凋亡的作用而抑制了每一种癌细胞系的生长。
将在实施例1、12和15获得的含硫酸岩藻糖多糖和四种含有硫酸岩藻糖的低聚糖F-Fd-1至F-Fd-4分别溶解在PBS中，使其终浓度为10mg/ml，并于121℃下在高压灭菌器中处理20分钟。然后，以与上述相同的方式检测它们诱导细胞凋亡的作用。得到相同的结果。
实施例28
37℃下将人结肠癌细胞HCT 116培养在含有10％胎牛血清(由JRHBioscience制造)的McCoy 5a培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在McCoy 5a培养基中，使最终浓度为5×103细胞/ml。然后将悬液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所说的悬液中加入0.2ml浓度为10mg/ml的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂和含硫酸岩藻糖多糖的混合物、实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F和含硫酸岩藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖溶液(所说的溶液溶解在PBS中)、5mg/ml的肝素(由和光纯药社制造)和葡聚糖硫酸酯溶液(分子量：500,000，由和光纯药社制造)(这些溶液都已经在121℃下在高压灭菌器中处理20分钟)，之后在5％的CO2存在下，37℃下温育。作为对照，只加入等量的PBS，并以同样的方式进行温育。在培养起始后的1、2、3、4天，按照《组织培养技术》(第二版)，朝仓出版，由日本组织培养学会编辑，26-28(1990)描述的方法(也就是说锥虫蓝染色方法)在计数室中计算活细胞数目。
结果如图29所示，此图显示出温育时间和HCT 116细胞的培养基中的活细胞数之间的关系，其中所说的培养基中已经加入了实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂和含硫酸岩藻糖多糖的混合物、实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F和含硫酸岩藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖(浓度均为1mg/ml)，肝素和葡聚糖硫酸酯(两种的浓度均为0.5mg/ml)。在此图中，横坐标代表培养时间(天)，纵坐标代表培养基中的活细胞数(×104细胞/2ml)。在图29中，○代表对照(未加入所说的多糖)；●代表实施例1中所获得含硫酸岩藻糖多糖；■代表实施例1获得的含硫酸岩藻糖多糖的混合物。实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F和含硫酸岩藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖显示的曲线实质上与实施例1的含硫酸岩藻糖多糖的混合物的曲线相同。另一方面，肝素和葡聚糖硫酸酯显示曲线实质上与实施例1的含硫酸岩藻糖多糖的曲线相同。
结果，加入了PBS的HCT 116细胞的细胞数目明显增加，而加入了实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂和实施例1的含硫酸岩藻糖多糖的混合物、实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F和含硫酸岩藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及肝素和葡聚糖硫酸酯那些细胞的细胞数目都几乎没有增加或减少。
结果，加入了实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂和含硫酸岩藻糖多糖的混合物、实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F和含硫酸岩藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖、肝素和葡聚糖硫酸酯的HCT 116细胞都显示出细胞凋亡的特征(如细胞收缩和断裂)。
也就是说，已经发现由于这些含硫酸岩藻糖多糖和低聚糖的诱导细胞凋亡的作用而抑制了HCT 116细胞的生长。
将在实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂和含硫酸岩藻糖多糖的混合物、实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F和含硫酸岩藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖分别溶解在PBS中，使其终浓度为10mg/ml。肝素和葡聚糖硫酸酯也分别溶解在PBS中，使其终浓度为5mg/ml。这些溶液都用滤膜处理，然后以与上述相同的方式检测它们诱导细胞凋亡的作用。得到相同的结果。
实施例29
37℃下将人结肠癌细胞HCT 116培养在含有10％胎牛血清(由JRHBioscience制造)的McCoy 5a培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在McCoy 5a培养基中，使最终浓度为5×103细胞/ml。然后将悬液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所说的悬液中加入0.2ml浓度为20mg/ml、30mg/ml和50mg/ml的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂溶液(所说的溶液溶解在PBS中，并且已经在121℃下在高压灭菌器中处理20分钟)，之后在5％的CO2存在下，37℃下温育。作为对照，只加入等量的PBS，并以同样的方式进行温育。培养后，按照《组织培养技术》(第二版)，朝仓出版，由日本组织培养学会编辑，26-28(1990)描述的方法(也就是说锥虫蓝染色方法)，在一定的时间间隔，在计数室中计算活细胞数目。
结果如图30所示，此图显示出温育时间和HCT 116细胞的培养基中的活细胞数之间的关系，其中所说的培养基中已经加入了各种浓度的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂。在此图中，横坐标代表培养时间(小时)，纵坐标代表培养基中的活细胞数(×104细胞/2ml)。在图30中，○代表对照(未加入所说的多糖)；●代表加入2mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂；■代表加入3mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂；▲代表加入5mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂。
结果，加入了PBS的HCT 116细胞的细胞数目明显增加，而加入了实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂的那些细胞的细胞数目都减少。
加入了实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂的HCT 116细胞都显示出细胞凋亡的特征(如细胞收缩和断裂)。
也就是说，已经发现实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖的制剂在浓度至少为2mg/ml时能够诱导HCT 116细胞的细胞凋亡，因此抑制了这些细胞的生长。
将在实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂溶解在PBS中，使其终浓度为20mg/ml、30mg/ml、50mg/ml，并用滤膜处理。然后以与上述相同的方式检测它们诱导细胞凋亡的作用。得到相同的结果。
实施例30
37℃下将人胃癌细胞AGS培养在含有10％胎牛血清(由JRHBioscience制造)的Ham F12培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在Ham F12培养基中，使最终浓度为5×103细胞/ml。然后将悬液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所说的悬液中加入0.2ml浓度为20mg/ml、30mg/ml和50mg/ml的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂溶液(所说的溶液溶解在PBS中，并且已经在121℃下在高压灭菌器中处理20分钟)，之后在5％的CO2存在下，37℃下温育。作为对照，只加入等量的PBS，并以同样的方式进行温育。培养后，按照《组织培养技术》(第二版)，朝仓出版，由日本组织培养学会编辑，26-28(1990)描述的方法(也就是说锥虫蓝染色方法)，在一定的时间间隔，在计数室中计算活细胞数目。
结果如图31所示，此图显示出温育时间和AGS细胞的培养基中的活细胞数之间的关系，其中所说的培养基中已经加入了各种浓度的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂。在此图中，横坐标代表培养时间(小时)，纵坐标代表培养基中的活细胞数(×104细胞/2ml)。在图31中，○代表对照(未加入所说的多糖)；●代表加入2mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂；■代表加入3mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂；▲代表加入5mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂。
结果，加入了PBS的AGS细胞的细胞数目明显增加，而加入了实施例1的含硫酸岩藻糖多糖制剂(最终浓度为3mg/ml或更高)的那些细胞的细胞数目都减少，加入2mg/ml实施例1的含硫酸岩藻糖多糖制剂则大大抑制了所说的细胞的生长。
加入了实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂的AGS细胞都显示出细胞凋亡的特征(如细胞收缩和断裂)。
也就是说，已经发现实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖的制剂在浓度至少为2mg/ml时能够诱导AGS细胞的细胞凋亡，因此抑制了这些细胞的生长。
将在实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂溶解在PBS中，使其终浓度为20mg/ml、30mg/ml、50mg/ml，并用滤膜处理。然后以与上述相同的方式检测它们诱导细胞凋亡的作用。得到相同的结果。
实施例31
37℃下将人结肠癌细胞SW480(ATCC CCL-228)培养在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的L-15培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在L-15培养基中，使最终浓度为5×103细胞/ml。然后将悬液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所说的悬液中加入0.2ml浓度为10mg/ml、30mg/ml和50mg/ml的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂溶液(所说的溶液溶解在PBS中，并且已经在121℃下在高压灭菌器中处理20分钟)，之后在5％的CO2存在下，37℃下温育。作为对照，只加入等量的PBS，并以同样的方式进行温育。培养后，按照《组织培养技术》(第二版)，朝仓出版，由日本组织培养学会编辑，26-28(1990)描述的方法(也就是说锥虫蓝染色方法)，在一定的时间间隔，在计数室中计算活细胞数目。
结果如图32所示，此图显示出温育时间和SW480细胞的培养基中的活细胞数之间的关系，其中所说的培养基中已经加入了各种浓度的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂。在此图中，横坐标代表培养时间(小时)，纵坐标代表培养基中的活细胞数(×104细胞/2ml)。在图32中，○代表对照(未加入所说的多糖)；●代表加入1mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂；■代表加入3mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂；▲代表加入5mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂。
结果，加入了PBS的SW480细胞的细胞数目明显增加，而加入了实施例1的含硫酸岩藻糖多糖制剂(最终浓度为3mg/ml或更高)的那些细胞的细胞数目都明显减少，加入1mg/ml实施例1的含硫酸岩藻糖多糖制剂则大大抑制了所说的细胞的生长。
加入了实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂的SW480细胞都显示出细胞凋亡的特征(如细胞收缩和断裂)。
也就是说，已经发现实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖的制剂在浓度至少为1mg/ml时能够诱导SW480细胞的细胞凋亡，因此抑制了这些细胞的生长。
将在实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂溶解在PBS中，使其终浓度为10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml，并用滤膜处理。然后以与上述相同的方式检测它们诱导细胞凋亡的作用。得到相同的结果。
实施例32
37℃下将人结肠癌细胞WiDr(ATCC CCL-218)培养在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)和1％NEAA(由大日本制药公司制造)的DMEM培养基(由大日本制药公司制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在上述的培养基中，使最终浓度为5×103细胞/ml。然后将悬液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所说的悬液中加入0.2ml浓度为10mg/ml的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物溶液、实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖(所说的溶液溶解在PBS中，并且已经在121℃下在高压灭菌器中处理20分钟)，之后在5％的CO2存在下，37℃下温育。作为对照，只加入等量的PBS，并以同样的方式进行温育。培养后，按照《组织培养技术》(第二版)，朝仓出版，由日本组织培养学会编辑，26-28(1990)描述的方法(也就是说锥虫蓝染色方法)，在一定的时间间隔，在计数室中计算活细胞数目。
结果如图33所示，此图显示出温育时间和WiDr细胞的培养基中的活细胞数之间的关系，其中所说的培养基中已经加入了最终浓度均为1mg/ml的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物溶液、实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖。在此图中，横坐标代表培养时间(小时)，纵坐标代表培养基中的活细胞数(×104细胞/2ml)。在图33中，○代表对照(未加入所说的多糖)；■代表实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F；●代表实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖。F-Fd-3和F-Fd-4显示的曲线实质上都与实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖所显示的曲线相同。
结果，加入了PBS的WiDr细胞的细胞数目明显增加，而加入了的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物溶液、实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖的那些细胞的细胞数目都有所减少。
加入了的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物溶液、实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖的WiDr细胞都显示出细胞凋亡的特征(如细胞收缩和断裂)。
也就是说，已经发现实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物溶液、实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖能够诱导WiDr细胞的细胞凋亡，因此可以抑制这些细胞的生长。
将在的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖混合物溶液、实施例12获得的含硫酸岩藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、实施例15获得的含硫酸岩藻糖多糖分别溶解在PBS中，使其终浓度为10mg/ml，并用滤膜处理。然后以与上述相同的方式检测它们诱导细胞凋亡的作用。得到相同的结果。
实施例33
37℃下将人结肠癌细胞WiDr(ATCC CCL-218)培养在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)和1％NEAA(由大日本制药公司制造)的DMEM培养基(由大日本制药公司制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在上述的培养基中，使最终浓度为5×103细胞/ml。然后将悬液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所说的悬液中加入0.2ml浓度为10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂溶液(所说的溶液溶解在PBS中，并且已经在121℃下在高压灭菌器中处理20分钟)，之后在5％的CO2存在下，37℃下温育。作为对照，只加入等量的PBS，并以同样的方式进行温育。培养后，按照《组织培养技术》(第二版)，26-28(1990)描述的方法(也就是说锥虫蓝染色方法)，在一定的时间间隔，在计数室中计算活细胞数目。
结果如图34所示，此图显示出温育时间和WiDr细胞的培养基中的活细胞数之间的关系，其中所说的培养基中已经加入了各种浓度的实施例1获得的含硫酸岩藻糖多糖的制剂。在此图中，横坐标代表培养时间(小时)，纵坐标代表培养基中的活细胞数(×104细胞/2ml)。在图34中，○代表对照(未加入所说的多糖)；●代表加入1mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂；■代表加入3mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂；▲代表加入5mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖的制剂。
结果，加入了PBS的WiDr细胞的细胞数目明显增加，而加入了最终浓度为3mg/ml或更高的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂的那些细胞的细胞数目都明显减少，并且加入1mg/ml实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖的制剂则大大抑制了这些细胞的生长。
加入了的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂的WiDr细胞都显示出细胞凋亡的特征(如细胞收缩和断裂)。
也就是说，已经发现实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂在浓度至少为1mg/ml时能够诱导WiDr细胞的细胞凋亡，因此抑制了这些细胞的生长。
将在的实施例1中获得的含硫酸岩藻糖多糖制剂溶解在PBS中，使其终浓度为10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml，并用滤膜处理。然后以与上述相同的方式检测它们诱导细胞凋亡的作用。得到相同的结果。
实施例34
37℃下将人前髓细胞白血病细胞HL-60(ATCC CCL-240)培养在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，然后悬浮在ASF104培养基(由味之素有限公司制造)中，使最终浓度为5×104细胞/900μl。然后将悬液移到6-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔4.5毫升。向所说的悬液中加入0.5ml浓度为10mg/ml实施例19中描述的冷冻干燥的含硫酸岩藻糖多糖-F的降解产物(所说的溶液溶解在含有120mM氯化钠的30mMHepes缓冲液中溶解(pH7)中)，然后通过滤膜处理，之后在5％的CO2存在下，37℃下温育。作为对照，只加入等量的上述缓冲液，并以同样的方式进行温育。培养22和46小时后，按照《组织培养技术》(第二版)，朝仓出版，由日本组织培养学会编辑，26-28(1990)描述的方法(也就是说锥虫蓝染色方法)，在一定的时间间隔，在计数室中计算活细胞数目。
结果表明含硫酸岩藻糖多糖-F的上述冻干的降解产物诱导HL-60细胞的细胞凋亡，这样就抑制细胞增殖速率。
实施例35
将人前髓细胞白血病细胞HL-60(ATCC CCL-240)悬浮在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，使最终浓度为5×104细胞/900μl。向6份所说的悬液中加入100μl浓度为10mg/ml实施例19(2)中描述的含硫酸岩藻糖多糖-F、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4溶液(所说的溶液溶解在含有120mM氯化钠的30mM Hepes缓冲液中溶解(pH7)中)，然后通过滤膜处理，之后在5％的CO2存在下，37℃下温育46小时。
培养开始22和46小时后，对培养基中的活细胞进行计数。
另外，将人前髓细胞白血病细胞HL-60(ATCC CCL-240)悬浮在ASF104培养基(由味之素有限公司制造)，使最终浓度为5×104细胞/900μl。向6份所说的悬液中加入100μl浓度为10mg/ml实施例19(2)中描述的含硫酸岩藻糖多糖-F、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4溶液(所说的溶液溶解在含有120mM氯化钠的30mM Hepes缓冲液中溶解(pH7)中)，然后通过滤膜处理，之后在5％的CO2存在下，37℃下温育40小时。
培养开始16和40小时后，对培养基中的活细胞进行计数。
在显微镜下观察这两种方式所培养的细胞，以检验细胞的生长程度和形态学特征。
结果，在ASF104培养基培养的细胞中，加入了含硫酸岩藻糖多糖-F、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4的培养基培养的所有细胞表现出细胞凋亡的特征(例如细胞的收缩和断裂)。在这些情况下，观察到了活细胞数量稍有增加或者细胞几乎完全死亡。相反，在只加入缓冲液的培养基的活细胞数量几乎增加了3倍。另一方面，对于培养在RPMI1640培养基中的细胞来说，培养在加入F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4的培养基中的所有细胞表现出细胞凋亡的特征(例如细胞收缩和断裂)。此时，细胞几乎完全死亡。相反，在只加入缓冲液的培养基的活细胞数量几乎增加了3倍，而培养在加入含硫酸岩藻糖多糖-F的培养基中的细胞大约增加了2.5倍。
基于这些结果，表明含硫酸岩藻糖多糖-F对不含血清的培养基中的癌细胞表现出强大的诱导细胞凋亡效应，而F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4对不含血清的培养基和含有血清的培养基中的癌细胞表现出强大的诱导细胞凋亡效应。
为了进一步证实上述结果，将人前髓细胞白血病细胞HL-60悬浮在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培养基(由Gibco制造)中(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)，使最终浓度为5×104细胞/900μl。向2份9ml所说的悬液中加入1ml含有120mM氯化钠的30mM Hepes缓冲液和溶于上述缓冲液的10mg/ml F-Fd-4溶液，并通过滤膜处理。在5％的CO2存在下，37℃下温育16小时后，通过离心从上清液中分离细胞。
将这样获得的细胞悬浮在20μl 50mM Tris盐酸缓冲液(Ph7.8)，所说的缓冲液含有10mM乙二胺四乙酸盐和0.5％的月桂酰肌氨酸钠。然后加入1μl的10mg/ml的核糖核酸酶A(由Sigma制造)，在50℃下将混合物处理30分钟。加入1μl浓度为10mg/ml蛋白酶K后，在50℃下处理混合物30分钟。将所处理的细胞作为样品，并在100V恒压下，在2％琼脂糖凝胶上进行电泳。将此凝胶浸没在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溶液中30分钟，然后通过使用透照器检测凝胶中的DNA状态。结果观察到了代表细胞凋亡的DNA梯度。为了进一步证实，使用放线菌素D(被认为是诱导诱导细胞凋亡的试剂)代替上述的F-Fd-4来重复上述的过程。结果，观察到与F-Fd-4所得的结果相似的DNA梯度。
基于这些结果，说明使用本发明的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶降解含硫酸岩藻糖多糖-F时可以改进这种多糖诱导癌细胞细胞凋亡的作用。
实施例36
从健康女性(21岁)和健康男性(32)体内收集静脉血并用，下列溶液稀释两倍，所说的溶液每升含有100mg葡萄糖、0.74mg CaC12·H2O、19.92mg  MgCl2、40.26mg KCl、7371mg NaCl和1756.5mg Tris盐酸。接下来，将静脉血以两倍于用于分离淋巴细胞的溶液(大日本制药公司出售，该溶液已预先置于离心管中)的体积轻轻地置于该溶液上，然后在18-20℃下以400Xg离心30分钟。离心后，取出用于分离淋巴细胞的溶液的上层淋巴细胞组分。
将上述获得的正常淋巴细胞加入到24-孔平板上，每孔1.9×105个细胞，之后向其中加入1.8ml含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(所说的胎牛血清在56℃下处理30分钟)和0.2ml 5mg/ml上述实施例获得的每种含硫酸岩藻糖多糖及其降解产物。然后，在37℃下温育这些淋巴细胞。作为对照，只加入生理盐水代替含硫酸岩藻糖多糖的溶液。在培养开始后，在显微镜下检测每个孔中细胞的形态变化和活细胞数。结果，在包含各种含硫酸岩藻糖多糖的孔、含有这些多糖的降解产物孔中和对照孔中没有观察到这些细胞的形态具有差别。另外，在活细胞数上也无差别。在第13天，每个孔中的几乎所有细胞都已死亡。基于这些结果，表明含硫酸岩藻糖多糖和其降解产物即使在足以诱导癌细胞细胞凋亡的浓度下，对正常的细胞无任何毒性。
实施例37
含硫酸岩藻糖多糖-U对固形癌的抗肿瘤效应：
将小鼠固形癌MethA(4X106细胞/鼠)皮下注射到雄性BALB/c小鼠(8周龄，体重大约20g)的腹部中。其后，将实施例6中所描述的含硫酸岩藻糖多糖-U以100mg/kg/天的剂量注射到相同的部位，共注射10天。在对照组中，以相同的方式注射生理盐水。2周后，在小鼠的腹部取出形成的癌组织，并称重。结果如表2所示。也就是说，对照组的肿瘤重量平均为1.25g，而施用含硫酸岩藻糖多糖-U的组的肿瘤重量平均为0.28G，这表明其具有显著(和对照相比，P＜0.01)的抗肿瘤作用。抑制率为77.6％。
表2
 小鼠(n)   肿瘤重量(g)(平均±SD)   抑制率(％)
 对照(8)   1.25±0.10   -
 本发明(8)给予含硫酸岩藻糖多糖U   0.28±0.07   77.6
实施例38
含硫酸岩藻糖多糖的制癌作用：
(1)向十九只雄性Spragure-Dawley大鼠(6周)的背部皮下施用7.4mg/kg的氧化偶氮甲烷(由Nacalai Tesque制造)。其后，将所说的化学药品皮下施用到这些动物的背部，每周一次共10周。施用时，将氧化偶氮甲烷溶解在含有0.9％氯化钠的0.1M磷酸酸缓冲液(pH6.5)中，控制溶液的浓度使每次给药量为100μl。
第一次施用氧化偶氮甲烷的同时，将按照实施例1中所描述的方法制备的Kjellmaniella crassifolia 70ml热水提取物以饮水的方式施用给十九只大鼠中的五只，如上所述每天施用至第30周。所说的热水提取物含有2mg/ml的含硫酸岩藻糖多糖混合物。这样，就将含硫酸岩藻糖多糖混合物以140mg/kg/天的剂量每天口服施用。
对于上述十九中大鼠中的十四只而言，以自来水而不是含硫酸岩藻糖多糖作为饮用水，这些动物称为对照组。
直到第30周，在对照组所有十四只大鼠中都观察到了外耳病灶癌的发生。与此相反，在施用含硫酸岩藻糖多糖混合物的组中，五只大鼠中只有一只患有癌症，这表明所说的多糖具有显著的制癌作用。
到第30周时，在对照组中有三只大鼠死亡，而施用了含硫酸岩藻糖多糖混合物的组中所有的动物都存活下来。在第30周，对照组和施用了含硫酸岩藻糖多糖混合物的组的平均体重分别为716g和817g。另一方面，没有施用氧化偶氮甲烷组(五只大鼠)的平均体重为788g。这就是说，施用含硫酸岩藻糖多糖混合物组的体重的增加相当于没有施用氧化偶氮甲烷的组的体重。
接下来，从对照组中选择四只大鼠，每天将40ml上述的Kjellmaniellacrassifolia热水提取物的(包含80mg含硫酸岩藻糖多糖的混合物)作为饮用水从第30周起口服施用给这些大鼠。在第36周，在四个中有两只大鼠表现出外耳病灶癌萎缩，这表明含硫酸岩藻糖多糖具有抗肿瘤作用。
如上所述，已发现口头施用含硫酸岩藻糖多糖对于防治由致癌化学药物引起的癌症、防止由致癌化学药物引起的体重下降和消退癌组织方面是有效的。
实施例39注射液
将实施例1中所产生的含硫酸岩藻糖多糖混合物溶解在注射用蒸馏水中，以得到用于注射的5％溶液。将这些溶液以每瓶50mg含硫酸岩藻糖多糖的量分装冷冻干燥用小瓶冷冻干燥中。另将2ml生理盐水作为溶剂分别加入到瓶中。
实施例40注射液
根据下列配方制备注射液：
含硫酸岩藻糖多糖-U(实施例12)      40mg
生理盐水                          q.s.
                               
                                2ml/安瓿
同样，使用实施例12的含硫酸岩藻糖多糖-F制备另一种注射液。
实施例41：片剂
根据下列配方制备片剂：
含硫酸岩藻糖多糖制剂(实施例1)       10mg
玉米淀粉                            65mg
羧甲基纤维素                        20mg
聚乙烯吡咯烷酮                      3mg
硬脂酸镁                            2mg
                                      
                                    100mg/片
实施例42注射液
将F-Fd-1溶解在水中，以得到用于注射的5％溶液。将这些溶液以每瓶50mg含硫酸岩藻糖多糖的量分装冷冻干燥用的小瓶中冷却干燥。将2ml生理盐水作为溶剂分别加入到瓶中。
实施例43注射液
根据下列配方制备注射液：
含硫酸岩藻糖多糖-F的
冷冻干燥降解产物(在实施例19(6)中获得)     40mg
生理盐水                                  q.s.
                                            
                                          2ml/安瓿
实施例44：片剂
根据下列配方产生片剂：
含硫酸岩藻糖多糖-F的
冷冻干燥的降解产物(在实施例19(6)中获得)   10mg
玉米淀粉                                  65mg
羧甲基纤维素                              20mg
聚乙烯吡咯烷酮                            3mg
硬脂酸镁                                  2mg
                                            
                                         100mg/片
本发明的效果
本发明提供了对无用的或病原细胞具有诱导细胞凋亡作用的药物，这种药物能够诱导和细胞反常增殖有关的疾病(例如癌)和病毒性疾病中的病变细胞的细胞凋亡，因此它对于预防和治疗上述各种疾病是有用的。特别是，在消化系统的癌症(如大肠癌和胃癌)中，通过口服施用本发明的药物可以诱导癌细胞的细胞凋亡。因此，本发明的药物中包含来源于天然食品的含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物作为活性成分，这种药物是非常适合于消化系统癌症的抗癌药物。本发明的药物还具有制癌作用，因此能够防止致癌的化学药品引起的致癌作用。由于本发明的药物来源于可食用的物质(如可食用的褐藻和海参)，因此能够以较低的价格大量得到它们，并且这种药物具有高度的安全性。此外，日常摄取包含含硫酸岩藻糖多糖和/或其降解产物的食品和饮料有助于维持和改善人的健康状况。本发明还提供了用于方便地诱导细胞凋亡的方法(此方法适用于揭示细胞凋亡机理的研究)和开发细胞凋亡诱导抑制剂的方法，等等。
本发明还提供了在糖链工程领域和医药等等领域有用的含硫酸岩藻糖多糖-U和其降解产物，这些物质实质上不含含硫酸岩藻糖多糖-F，并且其中已经除去了具有高度反应活性的着色物质。另外，本发明也提供了有效产生这些物质的方法。
本发明还提供了在糖链工程领域和医药等等领域有用的含硫酸岩藻糖多糖-F和其降解产物，这些物质实质上不含含硫酸岩藻糖多糖-U，并且其中已经除去了具有高度反应活性的着色物质。另外，本发明也提供了有效产生这些物质的方法。
本发明还提供了含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶，这种酶在分析含硫酸岩藻糖多糖-F的结构、降解含硫酸岩藻糖多糖-F、产生在检测含硫酸岩藻糖多糖-F的生物活性方面有用的含硫酸岩藻糖多糖-F的降解产物方面是有用；本发明还通过了产生这种酶的过程；具有很强的诱导癌细胞细胞凋亡作用的含硫酸岩藻糖多糖的降解产物，所说的产物是通过使用这种酶产生的。
根据本发明，还可以在钙离子存在下，以极高稳定性生产含内-硫酸岩藻糖多糖-F的降解酶，通过常规方法不能稳定地生产这种酶。此外，按照本发明，含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶在钙离子存在下可以有效地发挥作用。

Claims (10)

1.含硫酸岩藻糖多糖，来自厚叶解氏藻(Kjellmaniella crassifolia)，具有下列理化性质：
(1)组成糖类：实际上不含有糖醛酸；和
(2)不能被黄杆菌(Flavobacterium)sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的岩藻依聚糖分解酶降解而低分子化，
其特征在于，该含硫酸岩藻糖多糖是采用包含如下任一步骤的方法制备的：
a)从厚叶解氏藻用热水或者稀酸提取出含硫酸岩藻糖多糖的混合物，使用黄杆菌sp.SA-0082产生的岩藻依聚糖分解酶在底物浓度0.1～10％、温度20～40℃、pH6～9的条件下、或者以黄杆菌sp.SA-0082在温度15～30℃、pH5～9的条件下，处理该含硫酸岩藻糖多糖的混合物，然后收集含硫酸岩藻糖多糖；
b)在0.6～2M的氯化钠或氯化钙的存在下，从厚叶解氏藻用热水或者稀酸提取出含硫酸岩藻糖多糖的混合物，向该含硫酸岩藻糖多糖的混合物中加入氯化十六烷基吡啶鎓，回收沉淀出的含硫酸岩藻糖多糖。
2.权利要求1中所述的含硫酸岩藻糖多糖的制造方法，其特征在于，包括下述步骤：从厚叶解氏藻用热水或者稀酸提取出含硫酸岩藻糖多糖的混合物，使用黄杆菌sp.SA-0082产生的岩藻依聚糖分解酶在底物浓度0.1～10％、温度20～40℃、pH6～9的条件下、或者以黄杆菌sp.SA-0082在温度15～30℃、pH5～9的条件下，处理该含硫酸岩藻糖多糖的混合物，然后收集含硫酸岩藻糖多糖。
3.权利要求1中所述的含硫酸岩藻糖多糖的制造方法，其特征在于包括下述步骤：在0.6～2M的氯化钠或氯化钙的存在下，从厚叶解氏藻用热水或者稀酸提取出含硫酸岩藻糖多糖的混合物，向该含硫酸岩藻糖多糖的混合物中加入氯化十六烷基吡啶鎓，回收沉淀出的含硫酸岩藻糖多糖。
4.权利要求2或3所述的含硫酸岩藻糖多糖的制造方法，其特征在于包括通过使用多糖物质或者具有阴离子交换基团的物质除去共存的着色物质的步骤。
5.权利要求2或3记载的含硫酸岩藻糖多糖混合物的制造方法，其特征在于提取含硫酸岩藻糖多糖的混合物时，是在乙酸根离子和钙离子共存下进行的。
6.权利要求4记载的含硫酸岩藻糖多糖混合物的制造方法，其特征在于提取含硫酸岩藻糖多糖的混合物时，是在乙酸根离子和钙离子共存下进行的。
7.含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶，是由交替单胞菌(Alteromonas)sp.SN 1009(FERM BP-5747)产生的，具有下列理化性质：
(i)功能：作用于权利要求1记载的含硫酸岩藻糖多糖并降解该含硫酸岩藻糖多糖，使之低分子化，
不作用于具有下列理化性质的含硫酸岩藻糖多糖：
(a)组成糖类：含有糖醛酸；和
(b)能被黄杆菌sp.SA-0082产生的岩藻依聚糖分解酶降解低分子化以形成至少一种由下列化学式(I)、(II)和(III)表示的化合物：
Figure C2004100396900004C1
Figure C2004100396900005C1
(ii)该酶的最适pH值：pH 7-8；
(iii)该酶的最适温度：30-35℃；
(iv)分子量：以凝胶过滤法测定，为10万。
8.酶组合物，含有钙源和如权利要求7所述的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶。
9.产生如权利要求7所述的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶的方法，其特征在于培养交替单胞菌sp.SN 1009(FERM BP-5747)，从培养物中回收所述的酶。
10.含硫酸岩藻糖多糖的降解产物，其特征在于是通过使用如权利要求7所述的含内-硫酸岩藻糖多糖的降解酶处理如权利要求1所述的含硫酸岩藻糖多糖获得的。
CNB2004100396908A 1996-01-26 1997-01-21 细胞凋亡诱导物 Expired - Fee Related CN100406023C (zh)

Applications Claiming Priority (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP31187/1996 1996-01-26
JP31187/96 1996-01-26
JP3118796 1996-01-26
JP45593/1996 1996-02-08
JP45583/96 1996-02-08
JP45583/1996 1996-02-08
JP45593/96 1996-02-08
JP4558396 1996-02-08
JP4559396 1996-02-08
JP171658/96 1996-06-12
JP17165896 1996-06-12
JP171658/1996 1996-06-12
JP204187/1996 1996-07-16
JP204187/96 1996-07-16
JP20418796 1996-07-16

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB971918554A Division CN1150003C (zh) 1996-01-26 1997-01-21 细胞凋亡诱导物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1528340A CN1528340A (zh) 2004-09-15
CN100406023C true CN100406023C (zh) 2008-07-30

Family

ID=27521306

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB971918554A Expired - Fee Related CN1150003C (zh) 1996-01-26 1997-01-21 细胞凋亡诱导物
CNB2004100396908A Expired - Fee Related CN100406023C (zh) 1996-01-26 1997-01-21 细胞凋亡诱导物

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB971918554A Expired - Fee Related CN1150003C (zh) 1996-01-26 1997-01-21 细胞凋亡诱导物

Country Status (9)

Country Link
US (2) US6207652B1 (zh)
EP (1) EP0919237A4 (zh)
JP (1) JP3555766B2 (zh)
KR (2) KR100555845B1 (zh)
CN (2) CN1150003C (zh)
AU (1) AU720004B2 (zh)
CA (1) CA2243543A1 (zh)
EA (2) EA003902B1 (zh)
WO (1) WO1997026896A1 (zh)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1735097A (en) * 1996-03-15 1997-10-01 Takara Shuzo Co., Ltd. A product of heat treatment of uronic acid, food, drink or drug including the product
US6573250B2 (en) * 1996-06-12 2003-06-03 Takara Shuzo Co., Ltd. Food or beverage additive containing fucoidan and food and beverage containing fucoidan
WO1999041288A1 (fr) * 1998-02-17 1999-08-19 Takara Shuzo Co., Ltd. Saccharides sulfates
CN1637146A (zh) 1998-04-23 2005-07-13 宝生物工程株式会社 Dna的合成方法
KR100601330B1 (ko) * 1999-02-23 2006-07-14 다카라 바이오 가부시키가이샤 황산화 푸코갈락탄
EP1175907A4 (en) * 1999-04-15 2004-12-29 Takara Bio Inc REMEDIES
KR100641977B1 (ko) * 1999-06-11 2006-11-02 다카라 바이오 가부시키가이샤 항푸코이단 항체
WO2001013925A1 (fr) * 1999-08-20 2001-03-01 Takara Shuzo Co., Ltd. Medicaments
CN100480381C (zh) * 2000-04-21 2009-04-22 宝生物工程株式会社 硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖
CA2412600C (en) * 2000-07-10 2011-09-27 The University Of Mississippi Potent immunostimulatory polysaccharides extracted from microalgae
AU2001269508A1 (en) * 2000-07-13 2002-01-30 Takara Bio Inc. Drugs or cosmetics
EP1327448A4 (en) * 2000-09-13 2005-06-15 Takara Bio Inc AGENTS MAINTAINING HOMEOSTASE
KR20040008145A (ko) * 2001-04-18 2004-01-28 다카라 바이오 가부시키가이샤 황산화 푸코글루쿠로노만난
EP1424396A4 (en) 2001-09-05 2006-08-16 Takara Bio Inc GENE OF THE ENZYME OF DIGESTION OF FUCOGALACTANE SULFATE
EP1306389B1 (en) 2001-10-24 2004-12-29 Takara Bio Inc. Sulfated fucan oligosaccharide
US20050255564A1 (en) * 2002-01-18 2005-11-17 Takara Bio Inc Sulfated fucan
AU2003242486A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-06 Takara Bio Inc. Enzyme for decomposition of sulfated fucan derived from sea cucumber
US20040254357A1 (en) * 2002-12-19 2004-12-16 Zaloga Gary P. Fatty acid phenolic conjugates
JP5679663B2 (ja) * 2007-02-23 2015-03-04 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 海藻抽出物からのフコイダン精製のためのプロセスの方法
JP5819189B2 (ja) * 2009-03-25 2015-11-18 国立大学法人鳥取大学 軟骨生成促進剤および軟骨損傷由来疾病の予防治療剤
EP3417865A1 (en) 2011-07-19 2018-12-26 Baxalta GmbH Resorption enhancers as additives to improve the oral formulation of non-anticoagulant sulfated polysaccharides
EP3594686A3 (en) 2012-08-14 2020-04-08 Baxalta GmbH Methods and systems for screening compositions comprising non-anticoagulant sulfated polysaccharides
CN103880975B (zh) * 2014-04-03 2015-10-21 中国海洋大学 一种岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法和在制备抗流感病毒药物中的应用
CN105924480B (zh) * 2016-05-10 2018-09-25 浙江大学 含岩藻糖三糖硫酸酯及其制备方法和应用
CN109055460B (zh) * 2018-09-13 2021-06-29 青岛创通生物科技有限公司 一种低分子量岩藻多糖及其在制备化妆品中的应用
CN111217932A (zh) * 2020-02-25 2020-06-02 浙江工业大学 一种裙带菜硫酸化多糖及其应用
CN112553162B (zh) * 2020-12-15 2023-01-13 湖北盛齐安生物科技股份有限公司 细胞凋亡诱导剂和载药囊泡及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0491027A (ja) * 1990-08-02 1992-03-24 Taiho Yakuhin Kogyo Kk 抗ヒト免疫不全症ウィルス剤
JP4091027B2 (ja) * 2004-03-19 2008-05-28 富士通株式会社 光変調器の駆動方法、並びに、それを用いた光送信機および光伝送システム

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6158587A (ja) * 1984-08-30 1986-03-25 Seitetsu Kagaku Co Ltd α−Ｌ−フコシダ−ゼおよびその製造方法
JPS62155086A (ja) * 1985-12-26 1987-07-10 Takara Shuzo Co Ltd α−Ｌ−フコシダ−ゼの製造法
FR2605185B1 (fr) * 1986-10-17 1993-08-20 Meiji Seika Kaisha Procede de culture des plantes
IL85145A (en) * 1987-01-23 1994-08-26 Univ Australian Anti-metastatic pharmacological or veterinary preparations containing modified herpin with reduced anticoagulant activity
US5519010A (en) * 1989-02-06 1996-05-21 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Sulfated polysaccharide, pharmaceutically acceptable salt thereof, process for preparing same and medicament containing same as effective component
AU620218B2 (en) * 1989-02-10 1992-02-13 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-hiv drug
FR2648463B1 (fr) * 1989-06-14 1993-01-22 Inst Fs Rech Expl Mer Polysaccharides sulfates, agent anticoagulant et agent anticomplementaire obtenus a partir de fucanes d'algues brunes et leur procede d'obtention
JPH0349682A (ja) * 1989-07-18 1991-03-04 Sumitomo Seika Chem Co Ltd 新規なα―Ｌ―フコシダーゼおよびその製造方法
JPH0398583A (ja) * 1989-09-12 1991-04-24 Takara Shuzo Co Ltd 新規α―Ｌ―フコシダーゼ
JPH04126078A (ja) * 1990-09-14 1992-04-27 Sumitomo Seika Chem Co Ltd 新規なα―Ｌ―フコシダーゼおよびその製造法
JPH0662852A (ja) * 1992-08-21 1994-03-08 Tousa Kogaku Kenkyusho:Kk フコイダン分解酵素
JP3403496B2 (ja) * 1993-09-24 2003-05-06 株式会社ヤクルト本社 抗潰瘍剤およびヘリコバクター・ピロリの定着阻害剤
JP3714426B2 (ja) * 1994-02-01 2005-11-09 株式会社糖鎖工学研究所 フコイダンオリゴ糖組成物含有癌転移抑制剤
JPH08266A (ja) * 1994-06-15 1996-01-09 Tousa Kogaku Kenkyusho:Kk フコース硫酸遊離酵素及びその製造方法
US6054577A (en) * 1995-04-28 2000-04-25 Takara Shuzo Co., Ltd. Oligosaccharides from enzymatic cleavage of fucoidan
EP0884383A4 (en) * 1996-02-29 2001-12-05 Takara Shuzo Co METHOD FOR CLEANING AND REMOVING VIRUSES.
CA2253573C (en) * 1996-06-12 2005-12-06 Takara Shuzo Co., Ltd. Fucoidan-containing foods or beverages
WO1998001537A1 (fr) * 1996-07-10 1998-01-15 Takara Shuzo Co., Ltd. Compositions cellulaires

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0491027A (ja) * 1990-08-02 1992-03-24 Taiho Yakuhin Kogyo Kk 抗ヒト免疫不全症ウィルス剤
JP4091027B2 (ja) * 2004-03-19 2008-05-28 富士通株式会社 光変調器の駆動方法、並びに、それを用いた光送信機および光伝送システム

Also Published As

Publication number Publication date
KR100555845B1 (ko) 2006-11-23
US6207652B1 (en) 2001-03-27
JP3555766B2 (ja) 2004-08-18
CN1209749A (zh) 1999-03-03
KR19990072022A (ko) 1999-09-27
US6593311B2 (en) 2003-07-15
EP0919237A1 (en) 1999-06-02
US20010034335A1 (en) 2001-10-25
KR20050044909A (ko) 2005-05-13
EA199800662A1 (ru) 1999-02-25
CA2243543A1 (en) 1997-07-31
CN1150003C (zh) 2004-05-19
EA003902B1 (ru) 2003-10-30
KR100555844B1 (ko) 2006-12-13
EP0919237A4 (en) 2004-10-13
CN1528340A (zh) 2004-09-15
EA200300499A1 (ru) 2003-08-28
AU1399997A (en) 1997-08-20
WO1997026896A1 (en) 1997-07-31
EA005580B1 (ru) 2005-04-28
AU720004B2 (en) 2000-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100406023C (zh) 细胞凋亡诱导物
US6277616B1 (en) Endo-fucoidan-lyase
JP3110064B2 (ja) 新規ヘパリチナーゼ、その製造法及びその生産菌
EP0265970A2 (en) Lactobacillus bifidus proliferation promoting composition
US4603197A (en) Mannoglucan derivatives
JP3734504B2 (ja) 新規なケラタン硫酸分解酵素
CN110373356A (zh) 一种抑制产肠毒素大肠杆菌生长的解淀粉芽孢杆菌胞外多糖
KR100491186B1 (ko) 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양법에 의해 생성된이소플라본-베타디글루칸 및 그의 제조방법
JP5314955B2 (ja) 新規微生物、イヌリナーゼ、イヌリン分解剤、イヌロオリゴ糖の製造方法及びイヌリナーゼの製造方法
JP3916394B2 (ja) フコース硫酸含有多糖
TWI237026B (en) Fucose sulfuric acid-containing polysaccharide, the preparing method thereof and the anti-cancer agent and preventing agent for inducement of cancer
KR20030035913A (ko) 황산화 푸칸 올리고당
JP3503821B2 (ja) エンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素
JP2001226407A (ja) フコース硫酸含有多糖
JP2001224394A (ja) 低分子化物
JP2000157262A (ja) β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途
NO159452B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av en carcinostatisk substans.
TWI243853B (en) Glucuronofucan sulfate
JP3991043B2 (ja) 糖化合物
JPH0367048B2 (zh)

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: TAKARA BIO INC.; APPLICANT

Free format text: FORMER OWNER: TAKARA SHUZO CO., LTD.; APPLICANT

Effective date: 20060616

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20060616

Address after: Shiga

Applicant after: Takara Bio Inc.

Co-applicant after: Sugar Lock Engineering Institute Co., Ltd.

Address before: Kyoto Japan

Applicant before: Takara Shuzo Co., Ltd.

Co-applicant before: Sugar Lock Engineering Institute Co., Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080730

Termination date: 20100221