CN105924480B

CN105924480B - 含岩藻糖三糖硫酸酯及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105924480B
Application number: CN201610305433.7A
Authority: CN
Inventors: 崔艳丽; 毛旸易; 李顺尧; 牟晓洲
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-05-10
Filing date: 2016-05-10
Publication date: 2018-09-25
Anticipated expiration: 2036-05-10
Also published as: CN105924480A

Abstract

本发明属于化学合成的糖脂分子应用于抗肿瘤生物活性的领域，具体涉及含岩藻糖三糖硫酸酯及其制备方法和应用。本发明以全三甲基硅烷基保护的岩藻糖基碘作为糖给体，以三乙胺作为反应促进剂，单羟基的三甲基硅烷基保护的二糖为糖受体，采用一锅法合成了以单一的α‑糖苷键结合的三糖，再经过两步，随后对新合成的三糖用SO₃·NEt₃进行硫酸酯化处理得到含岩藻糖三糖硫酸酯。本发明的含岩藻糖三糖硫酸酯的体外抗肿瘤活性，其在1.0 mg/mL时对人源肿瘤细胞体外增殖有明显的抑制作用，比天然的褐藻搪胶的抑制效果好。

Description

含岩藻糖三糖硫酸酯及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化学合成的糖脂分子应用于抗肿瘤生物活性的领域，具体涉及到人工设计并合成的含岩藻糖的三糖硫酸酯在体外表现出强于天然褐藻搪胶的抗肿瘤活性。

背景技术

岩藻聚糖硫酸酯作为海带等褐藻所固有的细胞间多糖，存在于褐藻细胞壁基质中，是褐藻所特有的生物活性物质。因其天然含有硫酸根，从而具有阴离子高分子化合物的特性。研究表明，岩藻聚糖硫酸酯具有改善胃肠道、降血脂、降血糖、预防肥胖、抗肿瘤、抗病毒、增强机体免疫机能、辅助改善记忆等多种生理活性。至于岩藻聚糖硫酸酯的抗肿瘤作用机理，现主要包括以下：一）多数细胞具有生命周期，到达一定时间即会因自然凋亡作用而自然死亡，但癌细胞本身缺乏自然凋亡能力，因此会不断增生或转移。岩藻聚糖硫酸酯具有启动癌细胞“自杀信号”的开关，促使癌细胞分裂最后走向凋亡。二）当癌细胞发展到一定大小后，若要继续分裂增殖就不能没有营养和氧气的供给，因此癌细胞会发出信号，促使周围微血管的增生以取得养分。岩藻聚糖硫酸酯在实验中可明显抑制血管新生，阻断癌细胞取得营养及氧气的机会，进而达到抑制癌细胞增生与扩散的作用。三）在免疫反应中，自然杀手细胞可识别体内肿瘤细胞及受病毒感染细胞并加以毒杀，是重要的初期免疫防御机制之一。当自然杀手细胞发现癌细胞时，不需使用抗体或其他免疫系统感应体就能直接杀死癌细胞。岩藻聚糖硫酸酯能活化巨噬细胞、B细胞、T细胞及自然杀手细胞等免疫细胞活性，并调节免疫系统对外来病原体的抵抗力等。

对岩藻聚糖硫酸酯的研究分析始终存在三个难点：一是不同的文献中使用的岩藻聚糖硫酸酯的来源包括其分子结构、组成单位不同，二是即使文献中的岩藻聚糖硫酸酯都来自于同一种海藻，但是提取得到的岩藻聚糖硫酸酯在组成、硫酸化程度、硫酸化位点等方面也有较大的差异，三是由于海藻中还具有其它的生物活性物质如多酚等，因此不纯的岩藻聚糖硫酸酯由于其纯度不够高，由此得到的研究数据也不够精确。天然的岩藻聚糖硫酸酯因其提取得到的产物的复杂性，包括分子结构的组成、硫酸化的位点、硫酸化的程度、产物的纯度等多方面因素，目前的研究面临较大的挑战，进展较为缓慢，因此，通过定向合成得到结构清晰明确的岩藻聚糖硫酸酯至关重要。但是糖分子中多个羟基及α-和β-异构体的存在以及糖分子羟基选择性地保护和脱保护的繁琐性，使得寡糖的合成成为研究糖化学的难点。目前关于寡糖合成中因保护与脱保护过程所增加的反应步骤以及由增加的步骤所可能引发的副产物等问题，以及为结构清晰明确的岩藻聚糖硫酸酯进行针对性的生物活性研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供含岩藻糖三糖硫酸酯及其制备方法和应用的技术方案。

本发明具体是通过如下技术方案来实现的：

以全三甲基硅烷基（TMS）保护的岩藻糖基碘作为糖给体，以三乙胺作为反应促进剂，单羟基的三甲基硅烷基保护的二糖为糖受体，采用一锅法合成了以单一的α-糖苷键结合的三糖（其中采用化学方法见同研究组崔艳丽等人专利201510607428.7，201410655465.0），TMS保护的三糖转化为全乙酰化三糖，全乙酰化三糖去乙酰基获得三糖，随后对新合成的三糖用SO₃·NEt₃进行硫酸酯化处理得到含岩藻糖三糖硫酸酯。优选含岩藻糖三糖硫酸酯FL的化学结构式如下：

。

该含岩藻糖三糖硫酸酯的结构特点是：岩藻糖的1位与乳糖的非还原糖基的6位以α-糖苷键相连接；三糖的羟基全部硫酸酯化。

本发明所述的含岩藻糖三糖硫酸酯的制备方法，其特征在于所述的一锅法反应中新合成的三甲基硅烷基三糖采用乙酐与DMAP，在DMF溶剂中，室温下TMS全部转化成乙酰基保护。

本发明所述的含岩藻糖三糖硫酸酯的制备方法，其特征在于所述TMS保护的三糖转化为全乙酰化三糖，三糖还原端基为α-糖苷键。

本发明所述的含岩藻糖三糖硫酸酯的制备方法，其特征在于所述的新合成的三糖用SO₃·NEt₃进行硫酸酯化处理，获得三糖的羟基全部硫酸酯化。

本发明所述的含岩藻糖三糖硫酸酯的制备方法，其特征在于所述的新合成的三糖的羟基全部硫酸酯化。三糖还原端基为α-糖苷键或β-糖苷键。

本发明的含岩藻糖三糖硫酸酯的体外抗肿瘤活性，还可用于抑制其他肿瘤细胞。

本发明所述的在进行含岩藻糖三糖硫酸酯的抗肿瘤活性评估时，采用的人源肿瘤细胞分别为肝癌细胞Huh7、胰腺癌细胞BxPC-3、胃癌细胞BGC-823等，并与常规的化疗药物5-氟尿嘧啶与日本产天然褐藻搪胶进行了阳性对照和空白试验。

本发明的含岩藻糖三糖硫酸酯的体外抗肿瘤活性，其在1.0 mg/mL时对人源肿瘤细胞体外增殖有明显的抑制作用，优选含岩藻糖三糖硫酸酯FL对胰腺肿瘤细胞BxPC-3体外增殖有明显的抑制作用，比天然的褐藻搪胶的抑制效果好。

本发明的含岩藻糖三糖硫酸酯的体外抗肿瘤活性，其在1.0 mg/mL时肝肿瘤细胞体外增殖有明显的抑制作用，优选含岩藻糖三糖硫酸酯FL对肝肿瘤细胞Huh7体外增殖有明显的抑制作用，比天然的褐藻搪胶的抑制效果好。

本发明的含岩藻糖三糖硫酸酯的体外抗肿瘤活性，其在1.0 mg/mL时对人源胃肿瘤细胞体外增殖有明显的抑制作用，优选含岩藻糖三糖硫酸酯FL对人源胃肿瘤细胞BGC-823体外增殖有明显的抑制作用，比天然的褐藻搪胶的抑制效果好。

本发明的含岩藻糖三糖硫酸酯可用于新的抗肿瘤药物、食疗品、营养品和食品的添加剂。

本发明的有益效果如下：

1.确定的含岩藻糖三糖硫酸酯合成路线短，TMS作为保护基团在加上和脱除时操作条件温和方便，利于产品工业化。2. 含岩藻糖三糖硫酸酯的是全硫酸酯化，水溶性提高，有利于糖分子与目标细胞的作用。3.新设计的含岩藻糖三糖硫酸酯对多种肿瘤细胞有明显的抑制作用，在0.1 mg/mL、0.4 mg/mL、1.0 mg/mL浓度下对多种肿瘤细胞抑制效果比天然的褐藻搪胶的好；在1.0 mg/mL浓度下比化疗药物5-氟尿嘧啶的抑制效果还要好。4.克服了天然的褐藻搪胶的有效结构不明的缺点，更有针对性用药，可减少服用量。5. 含岩藻糖三糖硫酸酯与天然糖结构相似，与人体的生物相容性好，据观察并与天然褐藻搪胶的抗肿瘤通路相似，可避免化疗药物对病人的毒副作用。6. 含岩藻糖三糖硫酸酯用途广泛，还可以由于治疗其他疾病、并可以用于食品、营养品的添加剂等的潜力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作详细说明：

实施例1

岩藻糖三糖硫酸酯合成

第一步 TMS保护的三糖的合成

在30 mL的烧瓶中加入0.17 g（0.37 mmol）的全TMS的岩藻糖，并在氮气保护下加入3.7 mL干燥的二氯甲烷，随后在0 ℃条件下逐滴滴加50 μL（0.37 mmol）的TMSI，在0 ℃条件下搅拌15 min后，将溶剂减压旋干，再在氮气保护条件下加入3.7 mL二氯甲烷溶液溶解，将此瓶标为瓶1待用。另取一个30 mL的烧瓶，在其中加入6’-OH TMS保护的乳糖 0.11 g（0.12 mmol），4 Å分子筛100 mg，ⁿBu₄NI 0.30 g（0.81 mmol），并在氮气保护条件下加入3.7mL二氯甲烷和51 μL（0.37 mmol）的三乙胺，常温下搅拌20 min，将此瓶标为瓶2，随后，将刚刚标记为瓶1中的溶液逐滴滴加至瓶2中，随后，反应在室温下搅拌12 h， TLC 检测（石油醚／乙酸乙酯＝15/1），反应完全。将溶剂减压旋干，得到85.0 mg无色粘稠液体，收率为58.6%。

第二步：TMS保护的三糖转化为全乙酰化三糖

在上述得到的O-(2,3,4-四-O-乙酰-α-L-岩藻糖)-(1→6)-2,3,4-四-O-乙酰-β-D-半乳糖-(1→4)-1,2,3,6-四-O-乙酰-α-D-葡萄糖85.0 mg（0.07 mmol）中加入4.0 mg的DMAP，溶于DMF中，并加入35 μL 的Ac₂O，室温下搅拌12 h，TLC 检测（R_f= 0.46，石油醚／乙酸乙酯＝1/1），反应完全，然后减压旋干，用石油醚／乙酸乙酯＝2/1 过柱，得到63.23 mg无色泡沫状固体，收率为99%。

第三步：全乙酰化三糖去乙酰基获得三糖

在30 mL 的圆底烧瓶中加入O-(2,3,4-四-O-乙酰-α-L-岩藻糖)-(1→6)-2,3,4-四-O-乙酰-β-D-半乳糖-(1→4)-1,2,3,6-四-O-乙酰-α-D-葡萄糖62.23 mg（0.069 mmol），接着在氮气保护下加入10 mL 0.05M 的甲醇钠／甲醇溶液，室温下搅拌16 h，TLC 检测（二氯甲烷／甲醇／水＝20/5/1），反应完全。随后用1 M的盐酸溶液中和至中性，减压旋干，得到32.0 mg 白色固体，收率为95%。

第四步：三糖的硫酸酯化反应

将32.0 mg（0.065 mmol）的O-(α-L-岩藻糖)-(1→6)-β-D-半乳糖-(1→4)-α-D-葡萄糖加入到5 mL的DMF中，再向其中加入1.75 g（9.68 mmol）的SO₃·NEt₃，反应在0 ℃下搅拌10 min，随后在-20 ℃条件下逐滴加入10 μL（0.104 mmol）的T_fOH，之后温度回升，反应在20 ℃下搅拌24 h。TLC 检测（氯仿／甲醇／水＝10/5/2），反应完全。然后减压旋干，再溶于少量水中，用凝胶LH-20柱过柱，得到79.4 mg无色泡沫状固体，收率为81%。¹H NMR (101MHz, D₂O) δ =5.95(1 H), 5.02(2 H), 4.79(1 H), 4.64-4.56(4 H), 4.51-4.42(3 H),4.57-4.50(3 H), 4.27-4.08(10 H), 4.04-3.98(3 H), 3.92(1 H)，1.49(3 H)¹³C NMR(101 MHz, D₂O) δ = 100.85, 96.89, 96.22, 95.55, 95.06, 89.86, 83.45, 83.28,78.73, 76.85, 75.79, 75.66, 75.23, 73.83, 72.42, 72.21, 72.04, 71.25, 68.27,68.06, 67.70, 67.59, 65.46, 64.54, 44.85, 34.71, 16.32.ESIMS[M-2Na]1461.56。

实施例2

生物实验所采用的细胞为人源肝癌细胞Huh7、胰腺癌细胞BxPC-3、胃癌细胞BGC-823等，培养体系均为DMEM培养液，内含10%的胎牛血清，然后置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度下培养。含岩藻糖三糖硫酸酯以及对照物5-氟尿嘧啶、天然的褐藻糖胶均用DMSO分别配制成10 mg/mL、40 mg/mL、100 mg/mL的母液，所有样品均需充分溶解。

（1）选取处于对数生长期的肿瘤细胞制成单细胞悬液，分别接种在不同的96孔平面培养板中，调整细胞数目使一致，每个孔的细胞数为3000个，悬液200 μL。

（2）将培养板置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度下培养24 h，随后分为实验孔、阳性对照孔和空白对照孔。实验孔分别加入体积为2 μL的浓度为10 mg/mL、40 mg/mL、100 mg/mL的样品母液；阳性对照孔为2组，加入同浓度、同体积的5-氟尿嘧啶母液和天然的褐藻糖胶母液；空白对照孔只加相同体积的DMSO，每组分别设置4个平行孔。

（3）在此环境下继续培养72 h，在每孔中分别加入相同体积的配制好的MTT溶液（5mg/mL），继续培养4 h，随后，停止反应，小心吸弃上清液，再在每孔中分别加入相同体积的DMSO，待紫蓝色结晶体完全溶解后用酶标仪490 nm的波长测出各个孔的吸光度值。

细胞存活率的计算方法：细胞存活率＝（实验组平均吸光度值／空白对照组平均吸光度值）×100%

不同底物、不同剂量对细胞的增殖活性有不同的影响，不同细胞对同一化合物的敏感性也不完全一致。抑制作用较强的化合物可直接引起培养细胞凋亡坏死而脱壁悬浮。

实施例3

具体步骤参见实例2

本次MTT实验采用了胰腺癌细胞BxPC-3。样品为合成的含岩藻糖三糖硫酸酯FL，用与样品结构类似的天然褐藻糖胶和常用的化疗药5-氟尿嘧啶作为阳性对照。实验结果如下表所示。

表1 不同底物对胰腺癌细胞BxPC-3体外增殖活性的影响

实验结果显示，当处理浓度为0.1 mg/mL时，样品对胰腺癌细胞BxPC-3增殖的抑制作用不明显，当处理浓度为0.4 mg/mL时，样品细胞增殖的抑制作用有一定的增强，比天然褐藻搪胶增强快；当处理浓度增至1.0 mg/mL时，样品对细胞的增殖抑制作用显著增强，此时细胞存活率已经低于30%，甚至强于常见的化疗药5-氟尿嘧啶的抑制作用。当处理浓度为0.1 mg/mL时，5-氟尿嘧啶对细胞的增殖抑制作用明显，但随着浓度增加，抑制效果增加不明显，可以推测5-氟尿嘧啶与合成样品FL抑制肿瘤细胞的通路不同。

实施例4

具体步骤参见实例2

本次MTT实验采用了肝癌细胞Huh7。样品为合成的含岩藻糖三糖硫酸酯FL，用与样品结构类似的天然褐藻糖胶和常用的化疗药5-氟尿嘧啶作为阳性对照。实验结果如下表所示。

表2 不同底物对肝癌细胞Huh7体外增殖活性的影响

实验结果显示，当处理浓度为0.1 mg/mL时，样品对肝癌细胞Huh7的增殖的抑制作用较小，当处理浓度为0.4 mg/mL时，样品对细胞增殖的抑制作用显著增强，此时细胞存活率已经低于55%，当处理浓度增至1.0 mg/mL时，样品对细胞的增殖抑制作用进一步增强，此时细胞存活率已经低于30%，并且远强于5-氟尿嘧啶的抑制作用（表2）。样品对细胞Huh7的增殖抑制增强趋势强于天然褐藻搪胶。当处理浓度为0.1 mg/mL时，5-氟尿嘧啶对细胞的增殖抑制作用明显，但随着浓度增加，抑制效果增加不明显；5-氟尿嘧啶对肝癌细胞Huh7没有对胰腺癌细胞BxPC-3和胃癌细胞BGC-823敏感。

实施例5

具体步骤参见实例2

本次MTT实验采用了胃癌细胞BGC-823。样品为合成的含岩藻糖三糖硫酸酯FL，与样品结构类似的天然褐藻糖胶和常用的化疗药5-氟尿嘧啶作为阳性对照。实验结果如下表所示。

表3 不同底物对胃癌细胞BGC-823体外增殖活性的影响

实验结果显示，当处理浓度为0.1 mg/mL时，样品对胃癌细胞BGC-823的增殖具有一定的抑制作用，当处理浓度为0.4 mg/mL时，样品对胃癌细胞BGC-823增殖的抑制作用显著增强，此时细胞存活率已经低于30%，并且远远强于5-氟尿嘧啶的抑制作用，当处理浓度增至1.0 mg/mL时，样品对细胞的增殖抑制作用进一步增强，此时细胞存活率已经低于20%（表3）。样品对细胞BGC-823的增殖抑制增强趋势强于天然褐藻搪胶。当处理浓度为0.1 mg/mL时，5-氟尿嘧啶对细胞的增殖抑制作用明显，但随着浓度增加，抑制效果增加不明显，可以推测5-氟尿嘧啶与合成样品FL抑制肿瘤细胞的通路不同。

结合以上不同的细胞实验结果可以看出，相较于样品来说，褐藻糖胶对上述三种癌细胞的增殖抑制作用不是太明显，由于的褐藻糖胶其中具有生物活性的岩藻糖硫酸酯的片段不集中，相对浓度低，从而活性略低。同时可以发现，随着底物处理浓度的逐渐增加，样品对肿瘤细胞增殖的抑制作用逐渐增强，当含岩藻糖三糖硫酸酯FL的处理浓度为1.0 mg/mL时，对上述三种肿瘤细胞的增殖均有显著的抑制作用，同样处理浓度抑制肿瘤细胞的作用次序，胃癌细胞BGC-823＞肝癌细胞Huh7∽胰腺癌细胞BxPC-3。由此证实新合成的含岩藻糖三糖硫酸酯FL具有良好的体外抗肿瘤活性，可见岩藻糖硫酸酯的生物活性与糖的组成、结构、分子量等方面均有关系。

以上列举的仅是本发明的部分具体实施例，显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

项目资助：国家自然科学基金30870553；国家国际科技合作项目2010DFA34370；浙江省国际科技合作专项2013C14012。

Claims

1.含岩藻糖三糖硫酸酯FL，其特征在于其化学结构式如下：

。

2.如权利要求1所述的含岩藻糖三糖硫酸酯的制备方法，其特征在于所述的包括以下步骤：以全三甲基硅烷基保护的岩藻糖基碘作为糖给体，单羟基的三甲基硅烷基保护的二糖为糖受体，采用一锅法合成了以单一的α-糖苷键结合的三糖，TMS保护的三糖转化为全乙酰化三糖，全乙酰化三糖去乙酰基获得三糖，然后对新合成的三糖进行硫酸酯化处理得到含岩藻糖三糖硫酸酯。

3.如权利要求2所述的含岩藻糖三糖硫酸酯的制备方法，其特征在于所述的一锅法反应中新合成的TMS三糖采用乙酐与DMAP，在DMF溶剂中，室温下TMS全部转化成乙酰基保护。

4.如权利要求2所述的含岩藻糖三糖硫酸酯的制备方法，其特征在于所述TMS保护的三糖转化为全乙酰化三糖，三糖还原端基为α-糖苷键。

5.如权利要求2所述的含岩藻糖三糖硫酸酯的制备方法，其特征在于所述的新合成的三糖用SO₃·NEt₃进行硫酸酯化处理，获得三糖的羟基全部硫酸酯化。

6.如权利要求2所述的含岩藻糖三糖硫酸酯的制备方法，其特征在于所述的新合成的三糖的羟基全部硫酸酯化，三糖还原端基为α-糖苷键或β-糖苷键。

7.如权利要求1所述的含岩藻糖三糖硫酸酯在制备抑制人源肿瘤细胞增殖药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的人源肿瘤细胞为肝癌细胞Huh7、胰腺癌细胞BxPC-3和胃癌细胞BGC-823。