ES2339531T3 - Procedimiento para la preparacion de productos de hidrolisis de la pectina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención de productos de la hidrólisis de la pectina, en donde la pectina o el material vegetal que contiene pectina en solución o suspensión acuosa, se trata en un primer paso de procedimiento, con una enzima A hidrolizante de la pectina, y en un segundo paso de procedimiento, con una enzima B hidrolizante de la pectina, en el cual se obtienen los productos de la hidrólisis de la pectina con una proporción de galacturónidos, los cuales contienen por lo menos una molécula de ácido galacturónico sin saturar en 4,5 y se esterifican con metanol hasta >=q 20%.
Description
Procedimiento para la preparación de productos
de hidrólisis de la pectina.
La invención se refiere a un procedimiento para
la preparación de hidrolizados de pectina, en particular de un
preparado farmacéutico o dietético para la disminución y/o la
inhibición de la adhesión de substancias y organismos patógenos a
las células eucariotas, en particular células de mamíferos o para la
inhibición de acciones recíprocas célula-célula y/o
célula-matriz, inducidas por la
galectina-3, las cuales conducen al desarrollo de
enfermedades tumorales, un procedimiento para el bloqueo de la
fijación de substancias u organismos patógenos en las células
eucariotas, un procedimiento para la inhibición de las acciones
recíprocas célula-célula y/o
célula-matriz inducidas por la
galectina-3, así como los hidrolizados y preparados
de pectina preparados por medio de este procedimiento.
Los organismos patógenos aunque también las
substancias perjudiciales para las células deben adherirse solamente
a la superficie de las células diana, para poder desarrollar una
infección o respectivamente un perjuicio a las células atacadas.
Esta adhesión o pegado está inducida por ejemplo por una dependencia
ligando-receptor en la cual las glicoestructuras
juegan un papel importante. Cuando estas glicoestructuras se
bloquean sobre la superficie de las células diana, o en los
ligandos, se puede inhibir una infección.
Las glicoestructuras juegan también un papel
importante en la formación de tumores y formación de metástasis
(Liotta y col., Annu. Rev. Cell Biol., 55 (1986),
1037-1057). La formación de tumores comprende
interacciones celulares que son inducidas por componentes de la
superficie celular, en particular proteínas unidas a hidratos de
carbono. Así, la adhesión de las células tumorales es inducida por
moléculas de adhesión celular. Muchos pasos de la formación de
metástasis comprenden también acciones recíprocas célula- célula o
respectivamente acciones recíprocas entre células y la matriz
extracelular (ECM), la cual es inducida por los componentes de la
superficie de la célula. La matriz extracelular (ECM) se compone
principalmente de laminina, fibronectina y proteoglicanos, de los
cuales se glicosidan muchos, y cuyas cadenas laterales de
oligosacáridos son determinantes de reconocimiento para las
moléculas de adhesión celular. La laminina es una glicoproteína
unida al -N, la cual tiene secuencias de
poli-N-acetillactosamina. La
colonización por metástasis tiene lugar cuando los aglomerados
circulantes de células tumorales, trombocitos y linfocitos toman
contacto con el endotelio de los capilares mediante moléculas de
adhesión. Esta toma de contacto suministra la señal para la apertura
de las funciones de las células endoteliales. De esta forma las
células tumorales pueden unirse, mediante otras moléculas de
adhesión, a los receptores sobre la membrana basal. Después de la
destrucción de la membrana basal, las células tumorales tienen
entrada directa al estoma, en donde de nuevo, como en la primera
invasión tumoral, tienen lugar interacciones entre la laminina y la
fibronectina y los receptores correspondientes.
Importantes representantes de las proteínas
unidas a hidratos de carbono, son la galectina-1 y
la galectina-3 unidas a galactósidos (Raz y Lotan,
Cáncer Metastasis Rev. 6 (1987), 433; Gabius, Biochim. Biophys.
Acta, 1071 (1991), 1). De la galectina-3 es sabido
que fomenta la dispersión tumoral embólica en el circuito sanguíneo,
y aumenta la formación de metástasis. La
galectina-3 se expresa sobre la superficie celular
de muchas células tumorales, en las cuales la expresión de la
galectina-3 aumenta con un progresivo desarrollo
tumoral. La galectina-3 se expresa igualmente a
partir de macrófagos activos y células transformadas o congénitas o
respectivamente células de metástasis. La
galectina-3 posee una alta afinidad para los
oligosacáridos, los cuales comprenden la polilactosamina, en donde
la galectina-3 se une en particular a dos
glicoproteínas, las cuales se encuentran en varios tipos de
células, por ejemplo las células del carcinoma del intestino grueso
humano y las células del carcinoma de mama humano. Otro ligando de
la galectina-3 es por ejemplo la laminina. La
galectina-3, que se expresa también sobre la
superficie de las células endoteliales, participa igualmente en la
adhesión de las células tumorales a las células endoteliales.
La patente US 5.834.442 describe un
procedimiento para el tratamiento de las enfermedades cancerígenas
en los mamíferos, en particular para el tratamiento de carcinomas
de próstata, en donde el tratamiento de las enfermedades
cancerígenas incluida la inhibición de la formación de metástasis
mediante la administración oral de pectina modificada, tiene lugar
preferiblemente en la citruspectina de pH modificado, soluble en
agua. Para la preparación de la pectina de pH modificado se
despolimeriza una solución de pectina elevando el valor del pH a
10,0 y a continuación disminuyendo el valor del pH a 3,0. La pectina
modificada posee un peso molecular de aproximadamente 1 a 15 kd.
Ratas, a las cuales se administró citruspectina modificada en agua
potable, mostraron en comparación con grupos de control sin tratar,
una formación significativamente disminuida de metástasis
pulmonares. Experimentos in vitro, mostraron que la adhesión
de la galectina-3 que se expresa en células
endoteliales MLL en las células endoteliales de la aorta de la rata
(RAEC) en presencia de citruspectina modificada fue casi
completamente inhibida. En otros experimentos se investigó la acción
de la citruspectina de pH modificado sobre la formación de colonias
de células endoteliales MLL. La capacidad de crecimiento de las
células en un medio semisólido (con independencia de la fijación)
puede emplearse como criterio para la transformación y el potencial
de invasión de las células, puesto que el crecimiento de las células
en un medio semisólido fomenta la migración de las células y la
formación de colonias. A este respecto se estableció que la
citruspectina modificada podría reducir tanto el número de colonias
MLL formadas como también podía reducir significativamente su
tamaño. La citruspectina modificada parece a este respecto ejercer
más bien un efecto citostático que un efecto citotóxico. También se
investigó el efecto de la citruspectina modificada sobre las
relaciones recíprocas célula-célula y las acciones
recíprocas célula- matriz, las cuales se basan en mecanismos
inducidos por hidratos de carbono, en particular interacciones
inducidas por la galectina-3. A este respecto, se
mostró, que la citruspectina modificada al contrario de la
citruspectina sin modificar, inhibió la adhesión de las células de
melanoma B16-F1 en la laminina. De la laminina se
conoce que sirve como ligando para la galectina-3,
soluble.
A partir de la patente EP 0 716 605, se conoce
que mediante una sopa de zanahorias particularmente preparada,
"Blasentee" ("té de vejiga"), leche de coco, etc., la
adherencia de microorganismos patógenos, como por ejemplo el E.
coli, en células, en particular en las células epiteliales del
tracto gastrointestinal y urogenital puede ser reducida
esencialmente (es decir, hasta un 90%). Según ese documento, este
efecto debe atribuirse a la pectina que se encuentra en los
productos vegetales, esencialmente se trata de galacturónidos unidos
1,4-\alpha-glicosidicamente en
cadenas, cuyos grupos ácidos están esterificados desde un 20 hasta
un 80% con metanol, y pueden contener eventualmente junto al ácido
galacturónico, otros elementos fundamentales de azúcar, como por
ejemplo glucosa, galactosa, xilosa, y arabinosa. Además, puede
todavía deducirse del documento, que el ácido monogalacturónico no
muestra ningún bloqueo de la adhesión, mientras que con el
digalacturónido y el trigalacturónido puede comprobarse un bloqueo
de hasta el 91,7% o respectivamente el 84,6%. En este documento se
comprueba claramente que el ácido galacturónico monómero no presenta
ningún bloqueo de la adhesión y que el efecto bloqueante deseado
disminuye a la vez que aumenta el peso molecular de los
galacturónidos. De ello se deduce que el grado de polimerización de
los galacturónidos deseados es de DP 2 ó respectivamente 3. Además
se reivindicó que el grado de esterificación era < 2%. Los
productos de la hidrólisis de la pectina preparados según el método
allí descrito, contienen sin embargo una parte muy pequeña de los
di- y trigalacturónidos descritos como efectivos (aproximadamente
el 12% referido al producto crudo). Este método de obtención hace
inútil toda investigación y conduce a problemas del medio ambiente,
pues-to que los productos secundarios, que se
producen en gran proporción no son aprovechables y deben ser
desechados.
desechados.
Otros galacturónidos están descritos por Kester
et al. (J. Biol. Chem., 274 (1999),
37053-37059) y Endress et al. (Lebensm.
-Wiss. u. -Technol., 24 (1991), 80-85). Un efecto
biológico de estos galacturónidos no está descrito.
El problema técnico que constituye el fundamento
de la presente invención, consiste en preparar otros procedimientos
y medios para la lucha contra las infecciones y para la disminución
y/o inhibición de la adhesión de substancias y organismos
perjudiciales, en particular patógenos, en las células eucariotas,
en particular células de mamíferos, así como para el bloqueo de
acciones recíprocas entre células de mamíferos, en particular
células tumorales, las cuales son inducidas mediante la molécula de
galectina-3 unida a hidratos de carbono que se
encuentra en la superficie de la célula, y son responsables del
desarrollo particularmente de enfermedades tumorales, y para el
tratamiento de enfermedades tumorales, particularmente para la
inhibición de formaciones metastásicas en los mamíferos.
Este problema técnico se resuelve mediante el
procedimiento previsto según la invención para la preparación de
productos de la hidrólisis de la pectina, los cuales conducen a la
preparación de oligogalacturónidos con una parte lo más pequeña
posible de monómeros, una alta proporción de moléculas siempre por
lo menos con un doble enlace así como con un grado de
esterificación de \geq 20%, y los cuales pueden obtenerse con un
rendimiento esencialmente mayor que el descrito en el estado actual
de la técnica.
El problema se resuelve particularmente tratando
una solución o suspensión acuosa de una pectina o de un material
que contiene pectina, en particular vegetal, de preferencia una
pectina con un alto grado de esterificación, en un primer paso de
procedimiento con una primera enzima A hidrolizante de la pectina, y
a continuación en un segundo paso de procedimiento con una segunda
enzima B hidrolizante de la pectina. Se obtiene un producto de
hidrólisis de la pectina antes definido, el cual presenta magníficas
propiedades como medio para la disminución o inhibición de la
adhesión para funciones vitales y/o reproductoras, de células
perjudicialles, como por ejemplo substancias u organismos patógenos
alérgenos, infecciosos o tóxicos, por ejemplo microorganismos como
levaduras, hongos, gérmenes, bacterias, virus, esporas, viroides,
priones.
En el caso de la enzima A empleada, puede
tratarse por ejemplo de una pectinliasa (EC 4.2.2.10) ó una
endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15) aunque de preferencia, una
pectinliasa. En el caso de la enzima B empleada puede tratarse de
una endopoligalacturonasa o de una pectinliasa, de preferencia sin
embargo de una endopoligalacturonasa.
Según la invención, se comprobó
sorprendentemente que los galacturónidos, que tienen en la molécula
enlaces dobles, en el caso del bloqueo de la adhesión de gérmenes
por ejemplo patógenos y substancias perjudiciales para la célula en
las células epiteliales del tracto gastrointestinal y urogenital son
particularmente efectivas. Además, es necesario para una
particularmente eficiente inhibición y/o disminución, por ejemplo el
bloqueo, un mayor grado de esterificación, en particular \geq 20,
de preferencia \geq 30, \geq 40, \geq 50, con particular
preferencia \geq 60, \geq 65, \geq 70 ó \geq 7%. La forma de
trabajar descrita en el estado actual de la técnica, conduce sin
embargo solamente a galacturónidos, que no presentan ningún enlace
doble y prácticamente están totalmente sin esterificar.
Bajo el concepto de grado de esterificación se
entiende en relación con la presente invención, la proporción de
grupos ácidos que existen en un galacturónido fundamentalmente
disponibles para llevar a cabo una esterificación, los cuales se
esterifican con un alcohol, en particular, con metanol.
En relación con la presente invención se
entiende como moléculas de ácido galacturónico no saturadas, en
particular las moléculas de ácido galacturónico no saturadas en la
posición 4,5.
En una forma de ejecución de la invención está
previsto después del tratamiento con la enzima B, añadir un
tratamiento con una tercera enzima C. En el caso de la enzima C aquí
utilizada, se trata de una pectinesterasa (EC 3.1.1.11). Con ello
puede ajustarse el grado de esterificación de los productos de forma
particularmente adecuada.
En otra versión de la invención está previsto
que después del tratamiento enzimático efectuado según la invención,
los componentes que permanecen sin disolver se separen de la
solución mediante centrifugación y/o ultrafiltración.
En otra versión, está previsto que después del
tratamiento enzimático realizado según la invención, y clarificación
mediante centrifugación o respectivamente ultrafiltración, la
solución obtenida mediante uno de los métodos de por sí ya
conocidos, se transforme en su forma seca, por ejemplo en forma
molida, en grano, granulada o pulverulenta.
La solución obtenida después del tratamiento
enzimático según la invención, o el producto seco obtenido a partir
de la misma, muestran una acción excelente en relación al bloqueo de
la adhesión de por ejemplo gérmenes patógenos y substancias
perjudiciales para la célula, por ejemplo en células epiteliales del
tracto gastrointestinal y urogenital en el ser humano y animales.
En consecuencia, pueden emplearse por ejemplo en piensos para
animales por ejemplo para la inhibición de enfermedades diarreicas
en la cría de lechones.
La solución o suspensión empleada según la
invención, de la pectina o respectivamente de material que contiene
pectina, en particular vegetal, presenta un valor del pH en un
margen de 3,5 a 5,5, o/y en otra versión preferida, una
concentración de pectina del 3% al 25%.
Los tratamientos con las enzimas A y B y
eventualmente C, se efectúan con un valor del pH de 3,5 a 5,5, con
una duración de 2 horas a 24 horas, a una temperatura de 25ºC a
60ºC, y una concentración de las enzima A y B eventualmente C, de
10 a 30 ml/kg de pectina.
En otra versión preferida está previsto que la
proporción de galacturónidos en el hidrolizado de pectina (% en
peso respecto a la substancias seca) es por lo menos de 60, \geq
70, \geq 75, \geq 80, ó en particular de preferencia por lo
menos de un 85% en peso.
En otra versión preferida, está previsto que en
el hidrolizado de pectina, la proporción de hidratos de carbono con
un DP-1 (monómeros) en el total de hidratos de
carbono del hidrolizado de pectina sea <25, <20, <10,
<8, <5, con particular preferencia, <4% en peso (referido a
la substancia seca).
En otra versión preferida, está previsto que la
proporción en hidratos de carbono, en particular los galacturónidos
con un grado de polimerización DP>10 referido al contenido total
de hidratos de carbono del hidrolizado de pectina, es menor de 10,
<8, con particular preferencia <5% en peso (referido a la
substancia seca).
En otra versión preferida está previsto que la
proporción de galacturónidos no saturados en el contenido total de
los galacturónidos en el hidrolizado de pectina es por lo menos de
10, de preferencia >15, >20, >25, >30, en particular,
36,5% en peso hasta 46% en peso (referido a la substancias
seca).
Los hidrolizados de pectina obtenidos según la
invención presentan en una versión preferida una proporción de por
lo menos 60, \geq70, \geq75, \geq80, ó con particular
preferencia por lo menos el 85% (referido a la substancia seca) de
hidratos de carbono, en particular galacturónidos con un grado de
polimerización del 2 al 10, de preferencia del 3 al 8, con
particular preferencia de 4,5 (% en peso de substancia seca,
referida al contenido total de hidratos de carbono del hidrolizado
de pectina).
La pectina empleada es, en una versión
particularmente preferida, la citruspectina, pectina de manzana, o
pectina de zanahoria azucarera.
El material conteniendo pectina, en particular
material conteniendo pectina de origen vegetal, es en una versión
preferida, orujo de manzana, rebanadas de zanahoria azucarera, o
bolitas de citrus, a saber residuos secos, por ejemplo de la
fabricación de jugo de naranja, jugo de limón, y/o jugo de lima.
Los hidrolizados de pectina obtenidos según la
invención, a saber los productos de la hidrólisis de la pectina,
son magnificamente adecuados como preparados farmacéuticos o
respectivamente dietéticos para la lucha contra las enfermedades
infecciosas o/y para la lucha contra la adición de substancias
perjudiciales y/o por organismos en células de mamíferos, en
particular células del ser humano.
Los hidrolizados de pectina obtenidos según la
invención son igualmente muy bien apropiados como preparados
farmacéuticos para la inhibición de los relaciones recíprocas
célula-célula y/o acciones recíprocas entre células
y la matriz extracelular en un humano o en un animal mamífero, en
particular aquellas acciones recíprocas que están inducidas por las
moléculas de galectina-3 que se encuentran en la
superficie de las células. Los productos de la hidrólisis de la
pectina según la invención son por ello apropiados en particular
para la inhibición de las acciones recíprocas
célula-célula y/o las acciones recíprocas
célula-matriz, a las cuales pertenecen las células
tumorales, y las cuales son por ello responsables del desarrollo de
enfermedades, en particular enfermedades tumorales en un ser humano
o en un animal mamífero. Los hidrolizados de pectina según la
invención, así como también el preparado farmacéutico, son por lo
tanto apropiados para el tratamiento de enfermedades tumorales, en
particular para la reducción del crecimiento del tumor y/o para la
reducción o la formación de metástasis en las enfermedades
cancerosas, puesto que inhiben la adhesión a la célula tumoral
inducida por la galectina-3 y/o el potencial de
invasión de las células
tumorales.
tumorales.
La invención se refiere por lo tanto también a
los hidrolizados de pectina obtenidos según la invención y una
proporción de hidratos de carbono presentes con un
DP-1 en los hidratos de carbono totales del
hidrolizado de pectina de menos del 25% en peso (referido a la
substancia seca), a saber preparados farmacéuticos y preparados
dietéticos que contienen productos de hidrolizado de pectina, los
cuales pueden prepararse por ejemplo como alimentos o saborizantes,
por ejemplo, productos lácteos, yogur, cereales, artículos de
pastelería, etc.
La invención se refiere también al empleo de los
antes citados productos de la hidrólisis de la pectina para la
preparación de medicamentos para inhibir la adición o adhesión de
substancias y/o organismos perjudiciales en células de mamíferos,
en particular células humanas, en particular para combatirlos, es
decir para la profilaxis y terapia de enfermedades infecciosas,
envenenamientos, alergias, etc.
La invención se refiere también al empleo de los
antes citados productos de la hidrólisis de la pectina para la
inhibición de la adición o adhesión de substancias perjudiciales y/o
por organismos, sobre las células de animales mamíferos, en
particular células humanas, en particular para combatir las
enfermedades infecciosas, envenenamientos, alergias, etc.
Las infecciones combatidas según la invención
pueden ser en particular infecciones del sistema sanguíneo, de las
vías respiratorias, del tracto urogenital, de la cámara nasal y
faríngea, o del tracto gastrointestinal.
Otro ámbito de empleo es el constituido por la
alimentación humana, en donde por ejemplo, ayuda a la inhibición de
enfermedades diarreicas en los lactantes pero también en los
adultos.
La invención se refiere también al empleo de los
productos de la hidrólisis de la pectina antes citados para la
inhibición de las acciones recíprocas célula-célula
y/o las acciones recíprocas entre células y la matriz extracelular,
en particular las relaciones recíprocas que son inducidas sobre las
moléculas de galectina-3 unidas a hidratos de
carbono que se encuentran en la superficie de la célula, y que son
responsables del desarrollo de enfermedades humanas o de animales
mamíferos, en particular enfermedades tumorales. En el caso de estas
enfermedades se trata en particular de carcinomas de próstata,
carcinomas de riñones, sarcomas de Kaposi, formas del curso de la
leucemia crónica, carcinomas de mama, adenocarcinomas de mama,
sarcomas, carcinomas ovárico, carcinomas del recto, carcinomas de
laringe, melanomas, tumores del intestino delgado, carcinomas del
intestino grueso, tumores de vejiga, mastocitomas, carcinomas de
pulmón, carcinomas bronquiales, carcinomas de epitelio en placas de
laringe, carcinomas gastrointestinales y carcinomas de estómago. Los
productos de la hidrólisis de la pectina según la invención pueden
emplearse en particular para la reducción del potencial de invasión
de células tumorales metastásicas y/o para la inhibición de la
adhesión de células tumorales. De preferencia, los productos de la
hidrólisis de la pectina preparados según la invención se
administran por vía oral.
Otra versión preferida de la invención se
refiere al empleo de los productos de la hidrólisis de la pectina
según la invención para el tratamiento de enfermedades tumorales de
un ser humano o de un animal mamífero. Los hidrolizados de pectina
según la invención se pueden emplear de preferencia para el
tratamiento de aquellos tumores, que se basan sobre acciones
recíprocas célula-célula y/o acciones recíprocas
entre células y la matriz extracelular, en particular aquellas
acciones recíprocas que son inducidas por las moléculas de
galectina-3 unidas a hidratos de carbono que se
encuentran sobre la superficie celular. Con el empleo de los
hidrolizados de pectina según la invención pueden ser tratados por
lo tanto de preferencia los carcinomas de próstata, los carcinomas
de riñones, el sarcoma de Kaposi, las formas del curso de la
leucemia crónica, carcinomas de mama, adenocarcinomas de mama,
sarcomas, carcinomas ováricos, carcinomas del recto, carcinomas de
faringe, melanomas, tumores del intestino delgado, carcinomas del
intestino grueso, tumores de la vesícula, mastocitomas, carcinomas
de pulmón, carcinomas bronquiales, carcinomas epiteliales en placas
de la faringe, carcinomas gastrointestinales y carcinomas del
estómago. El empleo de los hidrolizados de pectina según la
invención para el tratamiento de tumores tiene por finalidad en
particular la inhibición de la adhesión de las células tumorales y/o
la disminución del potencial de invasión metastásica de células
tumorales.
La invención se refiere igualmente al empleo de
los productos de la hidrólisis de pectina antes citados para la
preparación de un preparado farmacéutico para la inhibición de las
acciones recíprocas célula-célula y/o las acciones
recíprocas entre células y la matriz extracelular, en particular
aquellas acciones recíprocas que son inducidas por las moléculas de
galectina-3 unidas a hidratos de carbono que se
encuentran en la superficie de la célula, y las cuales son
responsables del desarrollo de enfermedades humanas o de animales
mamíferos, en particular las enfermedades tumorales antes
descritas. El preparado farmacéutico para la inhibición de las
acciones recíprocas célula-célula y/o las acciones
recíprocas entre células y la matriz extracelular, se administra
preferentemente por vía oral.
Otra versión preferida de la invención se
refiere también al empleo de los productos y de la hidrólisis de la
pectina según la invención para la preparación de un preparado
farmacéutico que puede ser empleado para el tratamiento de las
enfermedades tumorales antes descritas, a saber para el tratamiento
de tumores que se basan sobre las acciones recíprocas
célula-célula y/o las acciones recíprocas entre
células y la matriz extracelular, en particular aquellas acciones
recíprocas que son inducidas por las moléculas de galactina 3 unidas
a hidratos de carbono que se encuentran en la superficie de la
célula. Según la invención está previsto que el preparado
farmacéutico para la reducción del crecimiento tumoral y/o para la
reducción de la formación de metástasis puede emplearse, en donde
el preparado según la invención inhibe en particular la adhesión de
células tumorales y/o reduce el potencial de invasión de las
células tumorales. De preferencia el preparado farmacéutico según
la invención se administra por vía oral.
La presente invención se refiere igualmente a un
procedimiento para el bloqueo de la adición de substancias u
organismos perjudiciales en particular patógenos, a las células de
un cuerpo humano o de un animal mamífero, el cual comprende la
administración de los productos de la hidrólisis de la pectina
preparados según la invención, a un ser humano o a un animal
mamífero en una cantidad, la cual es suficiente para bloquear la
adición de las substancias u organismos perjudiciales a las células
de mamíferos, e inhibir la aparición de una infección. De
preferencia los productos de la hidrólisis de la pectina preparados
según la invención, se administran por vía oral.
La invención se refiere igualmente a un
procedimiento para la inhibición de las acciones recíprocas
célula-célula y/o las acciones recíprocas entre
células y la matriz extracelular, las cuales son inducidas por las
moléculas de galactina-3 unidas a hidratos de
carbono que se encuentran sobre la superficie celular, y son
responsables del desarrollo de enfermedades en humanos o animales
mamíferos, en particular las antes citadas enfermedades tumorales,
el cual procedimiento comprende la administración de los productos
de la hidrólisis de la pectina preparados según la invención a un
ser humano o a un animal mamífero con una enfermedad tumoral en una
cantidad suficiente para reducir y/o inhibir las acciones
recíprocas célula-célula y/o
célula-matriz inducidas por la
galactina-3. De preferencia, los productos de la
hidrólisis de la pectina preparados según la invención se
administran por vía oral.
La presente invención se refiere también a
preparados farmacéuticos que contienen los productos de la
hidrólisis de la pectina según la invención en cantidades
farmacéutica o terapéuticamente activas. En conexión con la
presente invención, se entiende con la expresión "preparado
farmacéutico", una mezcla empleada para fines diagnósticos,
terapéuticos y/o profilácticos, la cual contiene los productos de la
hidrólisis de la pectina según la invención como substancias
activas en una forma de cómoda aplicación para un paciente como para
un animal mamífero. El preparado farmacéutico puede ser una mezcla
tanto sólida como también liquida. La expresión "en cantidades
farmacéutica o terapéuticamente activas", significa que las
substancias activas contenidas en el preparado farmacéutico están
contenidas en una dosis suficiente para impedir la aparición de una
enfermedad, por ejemplo una enfermedad infecciosa o una enfermedad
tumoral, curar el estado de una enfermedad de este tipo,
interrumpir la progresión de una enfermedad de este tipo y/o aliviar
los síntomas de una enfermedad de este tipo. Los preparados
farmacéuticos según la invención presentan en una versión preferida,
además de los productos de la hidrólisis de la pectina según la
invención, soportes farmacéuticamente compatibles, así como
evenmente diluyentes, separadores, suavizantes, auxiliares, cargas,
edulcorantes, substancias aromáticas, colorantes, saborizantes, u
otras substancias farmacéuticamente activas.
En los preparados dietéticos previstos según la
invención, los productos de la hidrólisis de la pectina se emplean
igualmente en una cantidad farmacéuticamente activa.
Otras versiones preferidas se mencionan en las
reivindicaciones secundarias.
La invención se aclara con más detalle con la
ayuda de los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
A 1 litro de una solución de citruspectina (30 g
de pectina altamente esterificada en 1 litro de agua) se añadieron
0,3 ml de una pectinliasa (por ejemplo Rohapect PTE de Röhm), y la
solución se incubó, agitando a pH 5,0 y 45ºC durante dos horas. A
continuación se añadieron 0,75 ml de una endopoligalacturonasa (por
ejemplo, la pectinasa PL de Amano), y sin variar las condiciones de
reacción, se incubó durante 3 horas más. A continuación se
inactivaron las enzimas, elevando la temperatura a 95ºC. El residuo
insoluble se separó por centrifugación, la solución clara se
evaporó hasta sequedad y se pesó la substancia sólida resultante. La
pesada fue de 25,8 g (correspondiente a un rendimiento de 75,6%
referido a la primera materia empleada).
El producto empleado fue investigado mediante
los métodos de análisis conocidos en general, resultando la
siguiente composición:
\vskip1.000000\baselineskip
A 1 litro de una solución de citruspectina (30 g
de pectina altamente esterificada en 1 litro de agua), se añadieron
0,3 ml de una pectinliasa (por ejemplo el Rohapect PTE de Rohm), y
la solución se incubó agitando, a pH 5,0 y 45ºC durante 2 horas. A
continuación, se añadieron 0,75 ml de una endopoligalacturonasa (por
ejemplo la pectinasa PL de Amano), y sin alterar las condiciones de
reacción se incubó durante otras 3 horas. A continuación se
inactivaron las enzimas aumentando la temperatura a 95ºC.
El residuo insoluble se separó por
centrifugación y la solución clara se ultrafiltró (límite de
separación 10.000). El permeato se secó, resultando 22,8 g de
substancia sólida (rendimiento 66,8% referido a la materia prima
empleada).
\vskip1.000000\baselineskip
A 1 litro de una solución de citruspectina (30 g
de pectina altamente esterificada en 1 litro de agua), se añadieron
0,3 ml de una pectinliasa (por ejemplo el Rohapect PTE de Rohm), y
la solución se incubó agitando, a pH 5,0 y 45ºC durante 2 horas. A
continuación, se añadieron 0,75 ml de una endopoligalacturonasa (por
ejemplo la pectinasa PL de Amano), y sin alterar las condiciones de
reacción se incubó durante otras 3 horas. A continuación se
añadieron 0,5 ml de una pectinesterasa (por ejemplo la Rheozyme de
Novo Nordisk) y se incubó durante otros 45 minutos. A continuación
se inactivaron las enzimas aumentando la temperatura a 95ºC. El
residuo insoluble se separó por centrifugación y la solución clara
se evaporó a sequedad.
El producto obtenido se investigó mediante los
métodos de análisis ya conocidos en general. Se comprobó a
diferencia del ejemplo 1 un grado de esterificación del 35%.
\vskip1.000000\baselineskip
Mondaduras secas de naranja o bolitas de citrus
se trituraron hasta un tamaño de partícula de aproximadamente
1-5 mm, y 100 g de los mismos se introdujeron en 400
ml de agua, removiendo, y se dejaron en remojo. A continuación, se
añadió ácido nítrico concentrado (10 g) y la suspensión se calentó a
85ºC y a esta temperatura se agitó durante 1,5 horas. A
continuación, se enfrió a 45ºC, se aumentó el valor del pH con NaOH
a 4,5 y después de la adición de 0,3 ml de una pectinliasa (por
ejemplo el Rohapect PTE de Rohm), se incubó durante 2 horas. A
continuación se añadieron 0,75 ml de una endopoligalacturonasa (por
ejemplo la pectinasa PL de Amano), y manteniendo inalteradas las
condiciones de reacción se incubó durante 3 horas más. A
continuación se inactivaron las enzimas aumentando la temperatura a
95ºC, se concentró, y la suspensión se secó en un secador de
cilindros.
\vskip1.000000\baselineskip
Mondaduras secas de naranja o bolitas de citrus
se trituraron hasta un tamaño de partícula de aproximadamente
1-5 mm, y 100 g de las mismas se introdujeron en 400
ml de agua removiendo, y se dejaron en remojo. A continuación, se
añadió HCl concentrado (8 g) y la suspensión se calentó a 85ºC y a
esta temperatura se agitó durante 1,5 horas. A continuación, se
enfrió a 45ºC, se aumentó el valor del pH con NaOH a 4,5 y después
de la adición de 0,3 ml de una pectinliasa (por ejemplo el Rohapect
PTE de Rohm), se incubó durante 2 horas. A continuación se
añadieron 0,75 ml de una endopoligalacturonasa (por ejemplo la
pectinasa PL de Amano), y manteniendo inalteradas las condiciones
de reacción se incubó durante 3 horas más. A continuación se
inactivaron las enzimas aumentando la temperatura a 95ºC, se
concentró, y la suspensión se secó en un secador de cilindros.
\vskip1.000000\baselineskip
Para este ensayo se emplearon células
uroepiteliales humanas, obtenidas mediante centrifugación de la
orina matutina, así como dos cepas de Staphylococcus aureus
y dos cepas de E. Coli, cada una en forma de suspensión con
10^{9} gérmenes/ml.
Las células epiteliales y la suspensión de
gérmenes se incubaron juntamente, a 37ºC durante 30 minutos. A
continuación se separaron las células epiteliales de los gérmenes no
agredidos mediante filtración por membrana (8 \mu). Los filtros
se lavaron varias veces, se introdujeron en solución fisiológica de
sal común, y las células epiteliales se suspendieron en la misma.
Después de centrifugar la suspensión en solución de sal común, se
colocó la bolita formada sobre el porta objetos, y se tiñó según la
técnica de May-Grünwald y Giemsa. Se contó el
número de gérmenes adheridos a 50 células epiteliales. El número dio
el valor del blanco. Como controles se emplearon las células
epiteliales sin adición de la suspensión de gérmenes.
En el ensayo principal, se incubaron células
epiteliales en primer lugar con soluciones acuosas de diferentes
concentraciones, preparadas según la invención (correspondientes al
ejemplo 1), de los productos de la hidrólisis de la pectina,
durante 1, 2, ó respectivamente 3 horas). A continuación, se
incorporaron juntamente con la suspensión de gérmenes, y siguieron
tratándose como se ha descrito más arriba. El número de gérmenes
adheridos a las 50 células epiteliales dio el valor de
medición.
En el caso de los hidratos de carbono
"neutrales" empleados como comparación, como por ejemplo la
rafinosa, nistosa e isomelecitosa, no se comprobó ninguna
disminución de los gérmenes adheridos a las células epiteliales.
Con los productos de la hidrólisis de la pectina según la invención
se impidió casi completamente la adherencia de todos los
microorganismos ensayados (bloqueo: > 95%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 1,5 g del permeato seco obtenido
en el ejemplo 2, en 100 ml de solución de acetato de Na 50 mM, con
un valor del pH de 5,0, y a continuación se añadieron a una columna
(2,6 x 30 cm) llena con el intercambiador de aniónes AG 1 X2 (de la
firma BioRad), la cual había sido equilibrada con solución 50 mM de
acetato de Na con un valor del pH de 5,0. Se analizaron las cabezas
eluídas de la columna mediante HPAEC (cromatografía de intercambio
aniónico de alta resolución), así como se hidrolizaron con HCl 1 N a
95ºC durante una hora.
En comparación con la Raftiline (de la firma
Orafti) como estándar, los oligosacáridos eluídos de la columna
presentaron una distribución del DP de 2-12.
El análisis de los hidrolizados mediante un
analizador de azúcares (de la firma Biotronik) dio como resultado
del contenido de monosacáridos, principalmente la galactosa (70%),
junto con arabinosa (23%) así como trazas de glucosa y manosa. En
total se obtuvieron 8,3% de productos conteniendo galacturónidos
como oligosacáridos conteniendo azúcares neutros en las
cabezas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron líneas celulares del carcinoma de
colon humano HT-29 ó respectivamente
Caco-2, con una densidad de células de 1 x 10^{4}
/ml, sobre cápsulas de Petri de 15 mm, y se cultivaron en medio RPMI
1640 con adición del 10% de suero bovino fetal (FCS)
(HT-29), ó respectivamente MEM, con adición del 10%
de FCS (Caco-2) a 37ºC en una atmósfera conteniendo
el 5% de CO_{2}. Las células se dejaron crecer hasta la
confluencia, durante 1 a 2 días. A continuación se lavaron las
cápsulas una vez con PBS, a continuación se incubaron con PBS y
0,5% de Tritón X-100 durante 30 minutos a
temperatura ambiente, en un dispositivo de agitación, y a
continuación se lavaron 3 veces con PBS. A continuación se
sembraron de nuevo las líneas celulares descritas anteriormente
sobre las cápsulas con las capas de ECM así preparadas. Se determinó
entonces la influencia del hidrolizado de pectina sobre el
crecimiento de las células por medición del número de células. A
continuación se disolvieron de nuevo las células después de 48
horas mediante una solución de tripsina/EDTA en HBSS (10 minutos) y
se lavaron en solución de PBS. A continuación se tiñeron el número
de células vivas con solución de azul Tryphan (650 mg de azul
Tryphan en 400 ml de NaCl al 0,9%, 1:1 (v/v) en una cámara de
contaje Neubauer. Como controles se efectuaron experimentos con
glucosa. Los resultados están resumidos en la tabla 1.
De la tabla 1 se desprende que la glucosa no
tuvo ninguna influencia sobre el crecimiento de las líneas celulares
H 29 y Caco-2, mientras que el hidrolizado de
pectina redujo el crecimiento de las células en función de la
concentración empleada, alrededor de hasta un 75%.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigó la acción del hidrolizado de
pectina sobre la capacidad de invasión de las células de
Caco-2 mediante el empleo del ensayo de invasión
descrito por Erkell y Schirrmacher (Cancer Research
("Investigación del cáncer"), 48 (1988),
6933-6937). El ensayo se basa en la migración de las
células a través de los poros de un filtro de policarbonato
Nucleopore en un gel de proteína, el cual contiene proteínas de
diferentes ECM como por ejemplo el colágeno tipo I y III,
fibronectina y laminina, sobre un filtro de nitrocelulosa. Las
células se añadieron juntamente con el hidrolizado de pectina en el
sistema de ensayo y a continuación, se evaluaron cuantitativamente
las células migradas a través de la capa de proteína a la capa
inferior de nitrocelulosa. Para el control se investigó el efecto
de la glucosa sobre la capacidad invasora de las células de
Caco-2.
Los resultados de estas investigaciones están
representados en la tabla 2. Los resultados muestran que el
hidrolizado de pectina según la invención puede reducir en parte
considerablemente la capacidad de invasión de las células
Caco-2 en función de la concentración empleada,
mientras que la glucosa solamente en concentraciones más altas,
ocasiona una muy pequeña reducción de la capacidad de invasión de
las células Caco-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la expresión de la
galectina-3 sobre las células del carcinoma de colon
mediante el empleo de un anticuerpo monoclonal específico
anti-galectina-3 (Ig de ratón) y un
correspondiente anticuerpo secundario copulado
anti-ratón-FITC, mediante el
procedimiento de inmunofluorescencia/citometría de flujo.
Concentraciones crecientes del hidrolizado de pectina y de glucosa
como controles fueron incubarodos juntamente con el anticuerpo
primario sobre células diana, y a continuación se midió el efecto
inhibidor de la substancia de azúcar soluble sobre la unión
anti-galectina-3.
El efecto del hidrolizado de pectina sobre la
unión anti-galectina-3, está
mostrado en la tabla 3. A partir de la tabla 3, se desprende que la
glucosa no reduce, o solamente reduce muy poco, la reacción de unión
del anticuerpo monoclonal
anti-galectina-3, mientras que el
hidrolizado de pectina disminuye en parte considerablemente la
unión del anticuerpo en función de la concentración empleada.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (26)
1. Procedimiento para la obtención de productos
de la hidrólisis de la pectina, en donde la pectina o el material
vegetal que contiene pectina en solución o suspensión acuosa, se
trata en un primer paso de procedimiento, con una enzima A
hidrolizante de la pectina, y en un segundo paso de procedimiento,
con una enzima B hidrolizante de la pectina, en el cual se obtienen
los productos de la hidrólisis de la pectina con una proporción de
galacturónidos, los cuales contienen por lo menos una molécula de
ácido galacturónico sin saturar en 4,5 y se esterifican con metanol
hasta \geq 20%.
2. Procedimiento para la obtención de productos
de la hidrólisis de la pectina según la reivindicación 1, en donde
los productos de la hidrólisis líquidos obtenidos en el segundo paso
de procedimiento son tratados en un tercer paso de procedimiento
con una enzima C, en donde dicha enzima C es una pectinesterasa (EC
3.1.1.11).
3. Procedimiento para la obtención de productos
de la hidrólisis de la pectina según la reivindicación 1 ó 2, en
donde los productos de la hidrólisis líquidos obtenidos en el
segundo o tercer paso del procedimiento, se liberan por filtración
y/o centrifugación de los componentes insolubles y se transforman en
forma sólida.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque, la pectina
empleada es la pectina de cítricos, la pectina de manzana o la
pectina de remolacha azucarera.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque, el material que
contiene pectina son recortes de remolacha azucarera, restos de
manzana, o residuos secos de la fabricación de jugo de naranja,
jugo de limón y/o jugo de lima.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, la enzima A es
una endopoligalacturonasa o una pectinliasa (EC 4.2.2.10).
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 al 6, caracterizado porque, la enzima B es
una endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15) ó una pectinliasa.
8. Productos de la hidrólisis de la pectina, que
pueden obtenerse según uno de los procedimientos según una de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde en los productos de la hidrólisis
de la pectina, la proporción de hidratos de carbono con un
DP-1 en los hidratos de carbono totales del
hidrolizado de la pectina es <25% en peso (referido a la
substancia seca).
9. Preparado farmacéutico o dietético, que
contiene un producto de la hidrólisis de la pectina según la
reivindicación 8, eventualmente junto con un soporte
farmacéuticamente compatible.
10. Empleo de los productos de la hidrólisis de
la pectina, obtenidos según uno de los procedimientos según una de
las reivindicaciones 1 a 7, para la elaboración de un preparado
farmacéutico para combatir una infección.
11. Empleo según la reivindicación 10, en donde
el preparado farmacéutico se administra por vía oral.
12. Empleo de los productos de la hidrólisis de
la pectina obtenidos según uno de los procedimientos según una de
las reivindicaciones 1 a 7, como componente de determinados
productos alimenticios para la alimentación humana.
13. Empleo de los productos de la hidrólisis de
la pectina obtenidos según uno de los procedimientos según una de
las reivindicaciones 1 a 7, como componente de piensos animales.
14. Empleo de los productos de la hidrólisis de
la pectina obtenidos según uno de los procedimientos según una de
las reivindicaciones 1 a 7, para la elaboración de un preparado
farmacéutico para la inhibición de acciones recíprocas
células-célula y/o acciones recíprocas entre las
células y la matriz extracelular en un ser humano o en un animal
mamífero.
15. Empleo según la reivindicación 14, en donde
las acciones recíprocas células-célula y/o
célula-matriz, se inducen mediante moléculas de
galectina-3 unidas a hidratos de carbono que se
encuentran en la superficie de las células.
16. Empleo según la reivindicación 14 ó 15, en
donde las células son células tumorales y las acciones recíprocas
células-célula y/o célula-matriz son
responsables del desarrollo de enfermedades tumorales de humanos o
animales mamíferos.
17. Empleo según una de las reivindicaciones 14
a 16, en donde las enfermedades tumorales son el carcinoma de
próstata, el carcinoma de riñón, el sarcoma de Kaposi, formas del
curso de leucemias crónicas, carcinomas de mama, adenocarcinomas de
mama, sarcomas, carcinomas de ovario, carcinomas del recto,
carcinomas de la laringe, melanomas, tumores del intestino delgado,
carcinomas del intestino grueso, tumores laríngeos, mastocitomas,
carcinomas pulmonares, carcinomas bronquiales, carcinomas
epiteliales en placas de la laringe, carcinomas gastrointestinales
y/o tumores del estómago.
18. Empleo según una de las reivindicaciones 14
a 17, en donde el hidrolizado de pectina inhibe la adherencia de
las células tumorales y/o el potencial de invasión de las células
tumorales metastásicas.
19. Empleo según una de las reivindicaciones 14
a 18, en donde el preparado farmacéutico se administra por vía
oral.
20. Empleo de los productos de la hidrólisis de
la pectina obtenidos según uno de los procedimientos según una de
las reivindicaciones 1 al 7, para la elaboración de un preparado
farmacéutico para el tratamiento de enfermedades tumorales de un
ser humano o de un animal mamífero.
21. Empleo según la reivindicación 20, en donde
las enfermedades tumorales se basan en acciones recíprocas
célula-célula y/o acciones recíprocas entre células
y la matriz.
22. Empleo según la reivindicación 20 ó 21, en
donde las acciones recíprocas célula-célula y/o
celulas-matriz son inducidas por moléculas de
galectina-3 unidas a hidratos de carbono que se
encuentran en la superficie de las células.
23. Empleo según una de las reivindicaciones 20
a 22, en donde las enfermedades tumorales son el carcinoma de
próstata, el carcinoma de riñón, el sarcoma de Kaposi, formas del
curso de la leucemia crónica, carcinomas de mama, adenocarcinomas
de mama, sarcomas, carcinomas de ovario, carcinomas del recto,
carcinomas de la laringe, melanomas, tumores del intestino delgado,
carcinomas del intestino grueso, tumores laríngeos, mastocitomas,
carcinomas pulmonares, carcinomas bronquiales, carcinomas
epiteliales en placas de la laringe, carcinomas gastrointestinales
y/o tumores del estómago.
24. Empleo según una de las reivindicaciones 20
a 23, en donde el preparado farmacéutico para la reducción del
crecimiento de tumores, se emplea en particular para la inhibición
de la adherencia de células tumorales.
25. Empleo según una de las reivindicaciones 20
a 24, en donde el preparado farmacéutico para la reducción de la
formación de metástasis se emplea en particular para la reducción
del potencial de invasión de las células tumorales.
26. Empleo según una de las reivindicaciones 20
a 25, en donde el preparado farmacéutico se administra por vía
oral.
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