JP4707107B2 - ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミド、これを含む医薬 - Google Patents

Description

本発明は、ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミド、これを含む組成物又は医薬に関する。

インフルエンザは毎年のように世界中で流行している感染症で、ワクチンが存在するにもかかわらず、多くの人が毎年感染し、発熱、頭痛、筋関節痛などに悩まされる。また合併症であるインフルエンザ脳炎・脳症にかかることにより最悪の場合死に至る。ワクチンが存在するにもかかわらずインフルエンザウイルスがここまで恐れられている原因は、インフルエンザウイルスが遺伝子突然変異を起こしやすく、抗原の形が変化しワクチンによって体内に増加した抗体がそれを認識しなくなりワクチンの効き目が低下してしまうことにある。このように毎年どのような型のインフルエンザが流行するかある程度予測がついたとしても、突然新型のウイルスが発生したりするので、適切なワクチンを迅速に供給できないことが問題となっている。そこで多種のインフルエンザウイルスに効き目があるような特効薬を開発する必要がある。近年、インフルエンザウイルスの感染機構、分子・遺伝子レベルでの解明が科学技術の飛躍的な進歩により実現でき、さまざまなインフルエンザウイルス感染阻害剤の合成が検討されている。
インフルエンザウイルスの感染、増殖の機構は以下の通りである。まずウイルスが生体内に侵入し、宿主細胞に近づくとウイルス表層上のヘマグルチニンという３量体のタンパク質が宿主細胞上のレセプターであるシアリル糖鎖に特異的に結合する。シアリル糖鎖は末端にシアル酸を含み、主にこのシアル酸がヘマグルチニンとの結合に関与している。次に、ウイルスと宿主細胞の膜融合が起こり、ウイルスのＲＮＡが宿主細胞内に流れ込み、次いでウイルス遺伝子がそこで複製され、子ウイルスが出現する。そして宿主細胞外にウイルスが出芽し増殖が完了する。ウイルスが出芽する際に、再度ヘマグルチニンとシアリル糖鎖が結合してしまうが、同じウイルス表層上にあるシアリダーゼという酵素がシアリル糖鎖からシアル酸を切り離し、出芽することができる。
近年、このウイルス感染の最終段階で起こるシアリダーゼ反応の作用を阻害する新しい治療薬が作られた。それがザナミビル（商品名：リレンザ、グラクソ・ウエルカム社）とリン酸オセルタミビル（商品名：タミフル、日本ロシュ社）である。しかし、この２つのシアリダーゼ阻害剤は感染の最終段階を阻害するのでウイルスの増殖がピークに達してからでは効果が少なく、発症後４８時間以内の投与が望ましい。このことから、効果的な治療薬として、ウイルスが宿主細胞に結合する最初の段階を阻害するような化合物を合成することが望まれている。
ヘマグルチニン阻害剤の開発において、すでに単価性のシアリル糖鎖誘導体よりもシアリル糖鎖を分子内に複数持つ多価性シアリル糖鎖誘導体のほうがインフルエンザウイルスに対して高い阻害作用を持つことが知られている。これは、ウイルス表面上に多数存在するヘマグルチニンに複数の単価性シアリル糖鎖誘導体が結合するよりも分子内に多数、シアリル糖鎖誘導体が結合した多価性分子が結合するほうが、リガンドとレセプターの親和力が増大するためである。
現在までに、このような効果を期待して多価性シアリル糖鎖誘導体が多数合成されている。蟹江らはシアリルラクトースを結合したスチレンポリマー（１）を合成しインフルエンザとの結合を調べたところ、シアリル糖鎖タンパク質であるフェツインに比べて１０００倍強い阻害活性があることを示した。

また、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓらはシアル酸誘導体を結合したポリアクリルアミドポリマー（２）を合成し高分子のポリマーであるほど阻害活性が高いことを示した。

しかし、高分子化合物であるポリマーは、さまざまな分子量を持つポリマーの混合物であるため構造がはっきりしない。また、もしその化合物内に６０ＫＤａ以上の分子量を持つものが含まれていれば、それらは分子量が大きすぎて腎臓のマルピーギ小体でボーマン嚢にろ過されず体外に排出されないため体内に残存し、肝臓における代謝のバランスを崩し、人体に害を与える可能性を持っている。そのためＦＤＡ（Ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は実際このようなポリマー型の化合物は有効なインフルエンザ感染阻害剤であっても安全性に問題があるとして承認していない。
本発明の目的は新規なジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミド、これを含む組成物又は医薬を提供することにある。
また本発明の目的は優れたウイルス感染及び／又は増殖阻害作用を有するインフルエンザウイルス感染症などのウイルス疾患の予防剤及び／又は治療剤を提供することにある。

本発明は、ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドに係る。
また本発明はジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドを含む組成物又は医薬に係る。
また本発明はジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンを含む医薬に係る。
本発明のジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドは、ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンと脂肪酸を反応させて得られる化合物である。
ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンは下記に示される糖鎖アスパラギン（３）である。

このジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンは、例えば特願２００２−１９６８２１の参考例１に従って合成することができる。
本発明において脂肪酸アミドを構成する脂肪酸としては、炭素数６〜３２の脂肪族飽和もしくは脂肪族不飽和脂肪酸ならびにこれらの２種以上の併用が挙げられる。脂肪族飽和脂肪酸としては、直鎖もしくは分岐のヘキサン酸（カプロン酸、２−エチルブタン酸等）、ヘプタン酸（エナント酸等）、オクタン酸（カプリル酸、２−エチルヘキサン酸等）、ノナン酸（ペラルゴン酸等）、デカン酸（カプリン酸等）、ウンデカン酸（ウンデシル酸等）、ドデカン酸（ラウリン酸、２−エチルデカン酸等）、トリデカン酸（トリデシル酸等）、テトラデカン酸（ミリスチン酸等）、ヘキサデカン酸（パルミチン酸等）、オクタデカン酸（ステアリン酸等）、エイコサン酸（アラキン酸等）、ドコサン酸（ベヘン酸等）、テトラコサン酸（リグノセリン酸等）などが挙げられる。
脂肪族不飽和脂肪酸としては、直鎖もしくは分岐のオクテン酸、デセン酸、ウンデセン酸（ウンデシレン酸等）、ドデセン酸、オクタデセン酸（オレイン酸、エライジン酸等）、リノール酸およびリノレン酸等が挙げられる。これらの脂肪酸のうち好ましいのは炭素数８〜２４、さらに好ましくは酸素数１０〜２２の脂肪酸であり、特に好ましくはデカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、エイコサン酸、ドコサン酸およびオクタデセン酸であり、最も好ましくは直鎖のものであって、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸およびオレイン酸である。
ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンと脂肪酸の反応は好ましくは反応活性化剤の存在下に反応させるのが良い。反応活性化剤としては例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）等を挙げることができる。
ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンと脂肪酸の反応割合はジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン１モルに対して脂肪酸を約０．１〜１０モル使用するのが好ましい。反応活性化剤はジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン１モルに対して約０．１〜１０モル使用するのが好ましい。反応は通常０〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃で行うのが良く、通常約１０分〜５時間で終了する。
得られたジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドは、例えば濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で精製することができる。これら化合物の同定はＮＭＲ、ＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム）でＵＶにおける検出時間等により行うことができる。
本発明のジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドはジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンの親水基と、長い炭素鎖を有する脂肪酸の疎水基の両方を併せ有するため、水溶液中では図１に示すようなミセル化が容易に起こり、低分子型で分子量、構造が明確な多価性糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
このように単価性分子のミセル化を利用すれば分子量の差異もなく、化合物を低分子に抑えられ、ポリマーよりも比較的簡単に合成できる。そしてミセル化し多価性にすることにより、例えばインフルエンザウイルスに対して極めて優れた阻害活性を示すことができる。
本発明の医薬は上記ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドを有効成分として含有するものである。また本発明の医薬はジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンを有効成分として含有するものである。
本発明の医薬は、上記有効成分と製剤用添加物（担体、賦形剤など）とを含む医薬組成物の形態で提供される。担体としては、例えば、乳糖、グリセリン等を例示することができる。賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等を例示することができる。医薬中の有効成分の量は約０．０１〜９５重量％、好ましくは約１〜８０重量％が良い。
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。本発明の医薬の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。
本発明の医薬の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。本発明の医薬の投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．００１μｇ／ｋｇ体重／日〜１０００μｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００μｇ／ｋｇ体重／日である。

第１図はジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドのミセルを示す図である。
第２図は実施例１〜４の各ジシアロウンデカアスパラギン−脂肪酸アミドの化学式を示す図である。
第３図はＤａｎｓｙｌ−ＬａｃＮＡｃのシアリル化の反応スキームを示す図である。
第４図は各阻害剤のシアル酸量を基準にしたシアリダーゼ阻害活性を示す図である。
第５図は各阻害剤のモル濃度を基準にしたシアリダーゼ阻害活性を示す図である。

以下に参考例、実施例、試験例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、何らこれに限定されるものではない。
１Ｈ−ＮＭＲはＢｒｕｋｅｒのＡＶＡＮＣＥ ４００（４００ＭＨｚと表記）で測定した。重溶媒を用いたときは溶媒ピークを基準とした。化学シフトは、δ（ｐｐｍ）で結合定数はＪ（Ｈｚ）で示した。反応検出用（以下ＴＬＣ）としてはＥ．Ｍｅｒｃｋ社製ＤＣ−Ｐｌａｔｔｅｎ Ｋｉｅｓｅｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ａｒｔ １，０５７１５）を使用した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のカラムはナカライテスク社のＣＯＳＭＯＳＩＬ ＰＡＣＫＥＤ ＯＤＳＣＯＬＵＭＮ（φ４．６×１５０ｍｍ）、昭和電工社製のＳｈｏｄｅｘ Ｃ１８−５Ｂを使用した。分光蛍光光度計はＪＡＳＣＯ社製のＦＰ−２１０ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いた。
参考例１ ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−１の合成
粗精製のＳＧＰ（シアリルグリコペプチド）（２３８．３ｍｇ，８０．６μｍｏｌ）とアジ化ナトリウム（４．７７ｍｇ，８０．８μｍｏｌ）をトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（ＴＲＩＺＵＭＡ ＢＡＳＥ ０．０５ｍｏｌ／ｌ，塩化カルシウム０．０１ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ＝７．５）７．１５ｍｌに溶解させた。そこにアクチナーゼ−Ｅ（５３．８ｍｇ）を加え、３７℃で反応させた。１６５時間後、ＴＬＣで反応終了確認後、濾過し、濾液を凍結乾燥した。凍結乾燥後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ φ２．５ｃｍ×１００ｃｍ）で精製し、目的物のアスパラギンジシアロウンデカ糖１（収量１００．５ｍｇ，収率５３％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ ５．２２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ−Ｈ_１），５．０４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ_１），４．８６（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ_１），４．７０−４．６８（３Ｈ，ｍ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ_１ ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ_１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ_１），４．３４（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ３−Ｈ_２），４．２８（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ_２），４．２０（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４−Ｈ_２），３．０３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．９５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１７．１Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ｅｑ），２．１４（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．８０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１２．１Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）
実施例１ ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−デカン酸アミド３の合成
デカン酸（２２ｍｇ，１２７．６μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１ｍｌに溶かし、そこにジシクロヘキシルカルボジイミド（２３．９ｍｇ，１１５．８μｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１３．４ｍｇ，１１６．４μｍｏｌ）を加え、室温で反応させた。６時間後、濾過し、濾液を濃縮し残留物（デカン酸スクシイミド体）を取り出した。次にアスパラギンジシアロウンデカ糖１（１０．０ｍｇ，４．２７μｍｏｌ）を水０．８ｍｌに溶かし、そこに炭酸水素ナトリウム（１．４ｍｇ，１６．７μｍｏｌ）を加えた。そこにアセトン１．２ｍｌに溶かしたデカン酸スクシイミド体（３．２ｍｇ，１１．８μｍｏｌ）を加え室温で攪拌した。１８０分後ＴＬＣで原料消失を確認し溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ φ１．０ｃｍ×２０ｃｍ）で精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ カラムφ４．６×１５０ｍｍ展開溶媒はグラジエント６０分で水１００％→アセトニトリル１００％ 流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、目的物のデカン酸−アスパラギンジシアロウンデカ糖３（収量７．７ｍｇ，収率７２％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ ５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ_１），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ−Ｈ_１），５．０４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ_１），４．８７（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ_１），４．７１−４．６９（３Ｈ，ｍ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ_１ ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ_１），４．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，８．０Ｈｚ，Ａｓｎ−αＣＨ），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ_１），４．３４（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ３−Ｈ_２），４．２９（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ_２），４．２１（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４−Ｈ_２），２．８８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７８−２．７０（３Ｈ，ｍ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ｅｑ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，ＣＯＣＨ_２），２．１４（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．８０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１２．０Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ａｘ），１．７１−１．６０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２），１．４２−１．３０（１２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２），０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，ＣＨ_３）
実施例２ ジシアロウンデカアスパラギン−ミリスチン酸アミド４の合成
ミリスチン酸（２２．０ｍｇ，９６．３μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１ｍｌに溶かし、そこにジシクロヘキシルカルボジイミド（１８．２ｍｇ，８８．２μｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１１．９ｍｇ，９６．７μｍｏｌ）を加え、室温で反応させた。６時間後、濾過し、濾液を濃縮し残留物（ミリスチン酸ベンゾトリアゾール体）を取り出した。次にアスパラギンジシアロウンデカ糖１（６ｍｇ，２．５７μｍｏｌ）を水０．８ｍｌに溶かし、そこに炭酸水素ナトリウム（０．８６ｍｇ，１０．３μｍｏｌ）を加えた。そこにアセトン１．２ｍｌに溶かしたミリスチン酸ベンゾトリアゾール体（２．８ｍｇ，７．７０μｍｏｌ）を加え室温で攪拌した。１８０分後ＴＬＣで原料消失を確認し溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ φ１．０ｃｍ×２０ｃｍ）で精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳカラムφ４．６×１５０ｍｍ 展開溶媒はグラジエント６０分で水１００％→アセトニトリル１００％流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、目的物のミリスチン酸−アスパラギンジシアロウンデカ糖４（収量５．３ｍｇ，収率８１％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ ５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ_１），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ−Ｈ_１），５．０４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ_１），４．８７（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ_１），４．７０−４．６９（３Ｈ，ｍ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ_１ ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ_１），４．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，８．１Ｈｚ，Ａｓｎ−αＣＨ），４．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ_１），４．３４（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ３−Ｈ_２），４．２９（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ_２），４．２０（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４−Ｈ_２），２．８８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１５．６Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８３−２．７０（３Ｈ，ｍ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ｅｑ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，ＣＯＣＨ_２），２．１４（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．８０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１２．１Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ａｘ），１．７１−１．６０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２），１．４２−１．３０（２０Ｈ，ｍ，ＣＨ_２），０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，ＣＨ_３）
実施例３ ジシアロウンデカアスパラギン−ステアリン酸アミド５の合成
ステアリン酸（２２．０ｍｇ，７７．３μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１ｍｌに溶かし、そこにジシクロヘキシルカルボジイミド（１４．４ｍｇ，６９．８μｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（９．５ｍｇ，７７．２μｍｏｌ）を加え、室温で反応させた。６時間後、濾過し、濾液を濃縮し残留物（ステアリン酸ベンゾトリアゾール体）を取り出した。次にアスパラギンジシアロウンデカ糖１（８．０ｍｇ，３．３６μｍｏｌ）を水１．２ｍｌに溶かし、そこに炭酸水素ナトリウム（３．２ｍｇ，３８．１μｍｏｌ）を加えた。そこにアセトン１．８ｍｌに溶かしたステアリン酸ベンゾトリアゾール体（８．８ｍｇ，２０．２μｍｏｌ）を加え３７℃で攪拌した。１９５分後ＴＬＣで反応終了を確認し溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ φ１．０ｃｍ×２０ｃｍ）で精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳカラムφ４．６×１５０ｍｍ 展開溶媒はグラジエント６０分で水１００％→アセトニトリル１００％流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、目的物のステアコリン酸−アスパラギンジシアロウンデカ糖５（収量６．２ｍｇ，収率６９％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ ５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ_１），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ−Ｈ_１），５．０４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ_１），４．８６（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ_１），４．７１−４．６９（３Ｈ，ｍ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ_１ ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ_１），４．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，８．２Ｈｚ，Ａｓｎ−αＣＨ），４．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ_１），４．３４（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ３−Ｈ_２），４．２９（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ_２），４．２０（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４−Ｈ_２），２．８８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７８−２．７０（３Ｈ，ｍ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ｅｑ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＯＣＨ_２），２．１６（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．８０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１２．１Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ａｘ），１．７１−１．６０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２），１．４２−１．３０（２８Ｈ，ｍ，ＣＨ_２），０．９６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，ＣＨ_３）
実施例４ ジシアロウンデカアスパラギン−ベヘン酸アミド６の合成
ベヘン酸（２０．０ｍｇ，５８．７μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３ｍｌに溶かし、そこにジシクロヘキシルカルボジイミド（１０．３ｍｇ，５０．０μｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６．８ｍｇ，５０．３μｍｏｌ）を加え、室温で反応させた。１９時間後、濾過し、濾液を濃縮し残留物（ベヘン酸ベンゾトリアゾール体）を取り出した。次にアスパラギンジシアロウンデカ糖１（５ｍｇ，２．１μｍｏｌ）を水１．２ｍｌに溶かし、そこに炭酸水素ナトリウム（２．０ｍｇ，２１．０μｍｏｌ）を加えた。そこにアセトン１．８ｍｌに溶かしたベヘン酸ベンゾトリアゾール体（８．８ｍｇ，１８．９μｍｏｌ）を加え３７℃で攪拌した。２０時間後ＴＬＣで反応終了を確認し溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ φ１．０ｃｍ×２０ｃｍ）で精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳカラムφ４．６×１５０ｍｍ展開溶媒はグラジエント６０分で水１００％→アセトニトリル１００％ 流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、目的物のベヘン酸−アスパラギンジシアロウンデカ糖６（収量３．２４ｍｇ，収率５７％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ ５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ_１），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ−Ｈ_１），５．０４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ_１），４．８６（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ_１），４．７０−４．６９（３Ｈ，ｍ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ_１ ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ_１），４．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，８．０Ｈｚ，Ａｓｎ−αＣＨ），４．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ_１），４．３４（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ３−Ｈ_２），４．２９（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ_２），４．２１（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４−Ｈ_２），２．８８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１６．４Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７８−２．７０（３Ｈ，ｍ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ｅｑ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．３５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＯＣＨ_２），２．１３（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．８０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１２．０Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ），１．７１−１．６０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２），１．４２−１．３０（３６Ｈ，ｍ，ＣＨ_２），０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，ＣＨ_３）
上記実施例１〜４の各ジシアロウンデカアスパラギン−脂肪酸アミドの化学式を図２に示す。
試験例１
インフルエンザウイルス感染阻害剤のシアリダーゼ阻害活性の測定
（１）蛍光標識したＮ−アセチルラクトサミン誘導体のシアリル化
ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドが水溶液中で実際にミセル化するかどうかを調べた。そこで蛍光標識したシアリル糖鎖に対するシアリダーゼ阻害活性を測定し、ＩＣ_５０を求めた。もし、蛍光標識したシアリル糖鎖７に対してジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン１及び、合成した４つの糖脂質誘導体をそれぞれ共存させシアリダーゼ阻害活性を測定し、炭素鎖の長さに依存して阻害活性が増加すればそれはミセル化の効果と考えられる。まず蛍光標識したシアリル糖鎖を合成した。蛍光標識にはＤａｎｓｙｌ基を使用した。Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体をＤａｎｓｙｌ標識した６−［（Ｎ−Ｄａｎｓｙｌ）ａｍｉｎｏ］−ｈｅｘｙｌ−Ｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｌａｎｏｓｙｌ−（１→４）−２−ａｃｅｔｏａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（以後Ｄａｎｓｙｌ−ＬａｃＮＡｃと表記する）を合成し、それにα（２，６）シアリルトランスフェラーゼを用いてガラクトースにシアル酸を転移させＤａｎｓｙｌ標識したシアリル糖鎖（以後ＮｅｕＡｃ−ＬａｃＮＡｃ−Ｄａｎｓｙｌと表記する）を合成した。
Ｄａｎｓｙｌ−ＬａｃＮＡｃ、ＣＭＰ−シアル酸、α（２，６）シアリルトランスフェラーゼ、アルカリンホスファターゼ、牛血清アルブミンをカコジル酸緩衝溶液（ｐＨ６．０，５０ｍＭ）に溶かし３７℃で６５時間反応させ、高速液体クロマトグラフィーで精製し、ＮｅｕＡｃ−ＬａｃＮＡｃ−Ｄａｎｓｙｌ７を６９％の収率で得ることができた。化合物７の^１ＨＮＭＲを測定したところ、シアル酸に特有のピークである３位のエカトリアル、アキシャルのプロトンピークが２．７４ｐｐｍ、１．８０ｐｐｍに確認できた。また、原料のＤａｎｓｙｌ−ＬａｃＮＡｃの１ＨＮＭＲと比較したところ７のガラクトースの１位のプロトンピークが原料のピークに比べて高磁場にシフトしていたのでガラクトース６位にシアル酸が結合していることがわかった。このようにして化合物７を同定した。上記反応を図３に示す。
（２）ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドのシアリダーゼ阻害活性測定
ＮｅｕＡｃ−ＬａｃＮＡｃ−Ｄａｎｓｙｌをシアリダーゼにより加水分解させる実験に、合成した糖脂質誘導体３，４，５，６及びシアリルラクトース、ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン１を阻害剤として加えそれぞれに対してＩＣ５０を求めた。反応条件は以下の通りである。１００μＭのＮｅｕＡｃ−ＬａｃＮＡｃ−Ｄａｎｓｙｌにそれぞれの阻害剤を１０μＭ、１００μＭ、３００μＭの３つの条件で加え（溶媒は牛血清アルブミンを溶かしたＨＥＰＥＳ緩衝溶液）、そこにシアリダーゼを加えて３７℃で３０分間インキュベートした。そして蛍光標識したＮｅｕＡｃ−ＬａｃＮＡｃ−Ｄａｎｓｙｌの分解率を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、その結果からＩＣ５０を算出した。そしてその結果を基質別にグラフにまとめた。これらのグラフの縦軸は酵素反応を５０％阻害するために必要な阻害剤の濃度（ＩＣ５０）である。図４のグラフは系内のシアル酸量に対してＩＣ５０を求めたものである。アスパラギンジシアロウンデカ糖は分子内に２つシアル酸を含んでいるのでシアル酸の量に対してＩＣ５０を求める実測値を２倍した。図４のようになる。
インヒビター自体のモル濃度に対して実測したＩＣ５０を求めるとシアリルラクトース以外のインヒビターのＩＣ５０は、図４の値の半分になる（図５）。図４のグラフから、一番炭素鎖の短いデカン酸が疎水基としてアスパラギンジシアロウンデカ糖１に結合するだけでＩＣ５０の値が、疎水基の結合していないジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン１の値の４分の３になることがわかった。これは親水基であるジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンに疎水基のカルボン酸が結合することによりその化合物がミセル化し、１つの分子内に多くのジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンを含むために、シアリダーゼに囚われる頻度が上昇し、ＮｅｕＡｃ−ＬａｃＮＡｃ−Ｄａｎｓｙｌのシアル酸除去が阻害される力が高まるためと考えられる。また疎水基の炭素鎖が長くなるほど（デカン酸→ミリスチン酸→ステアリン酸→ベヘン酸）ＩＣ５０の値が系統的に小さくなることが判明した。これは疎水基の炭素鎖が長くなるほどミセル体の表面積が上昇し、その分子表面内に含まれるジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンの数が上昇するためにＮｅｕＡｃ−ＬａｃＮＡｃ−Ｄａｎｓｙｌのシアル酸の加水分解を阻害する能力が高まったものと考えられる。また、図５から、分子内のシアリルラクト系が１つ増えるだけで、シアリダーゼに対する阻害活性が高まり、さらに炭素鎖の長いほどその効果がより強くなることがわかった。
（３）ジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドのインフルエンザウイルス阻害活性測定
実施例１〜４のジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミド（図２の誘導体３，４，５，６）を阻害剤として加えそれぞれに対してをインフルエンザウイルス（ヘマグルチニン）阻害活性求めた。反応条件は以下の通りである。
使用したインフルエンザウイルスは、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）を使用した。
鶏受精卵に接種し、しょう尿膜液を採取し超遠心精製、ホルマリン不活化したものを精製ウイルス抗原として使用した。これをエーテル処理してＨＡ（ヘマグルチニン）分画を集めたものをＨＡ ｓｐｌｉｔ分画とした。
１）上記図２の誘導体３，４，５，６の各２ｍｇをＰＢＳ １ｍｌに溶解した。
２）サンプルを原液、２倍、４倍、８倍にＰＢＳで希釈した。
３）９６穴 Ｕ プレート（三光純薬）にサンプル各１０μｌとウイルス希釈液４０μｌを混和した。
４）４℃ ６０分 静置した。
５）ｍｉｘｔｕｒｅに５０μｌ ＰＢＳを加えて５０μｌの２倍階段希釈を作る。
６）ニワトリ赤血球（日本バイオテスト研究所）を０．５％になるように調整する。
７）各ｗｅｌｌに血球浮遊液５０μｌを加えて混和し４℃、６０分静置した。
８）インフルエンザウイルス（ヘマグルチニン）阻害活性を測定した結果、誘導体３：１９０．０μｍｏｌ、誘導体４：９５．０μｍｏｌ、誘導体５：４７．５μｍｏｌ、誘導体６：３７．５μｍｏｌで阻害活性を示した。

本発明のジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミド並びにジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンは、特に優れたウイルス感染及び／又は増殖阻害作用を有し、例えばインフルエンザウイルス感染症などのウイルス疾患の予防剤及び／又は治療剤として優れた効果を奏する。

Claims (9)

1. 下記に示されるジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン（３）と炭素数８〜２４の脂肪酸とを反応させて得られるジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミド。
   

   
2. 脂肪酸が炭素数１０〜２２の脂肪酸である請求の範囲第１項に記載のジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミド。
3. 脂肪酸がカプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸およびオレイン酸からなる群から選ばれる１種以上である請求の範囲第２項に記載のジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミド。
4. 請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドならびに製剤用添加物からなる組成物。
5. 製剤用添加物が乳糖、グリセリン、ブドウ糖、ショ糖およびマンニトールからなる群から選ばれる１種以上の添加物である請求の範囲第４項記載の組成物。
6. 下記に示されるジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン（３）と炭素数８〜２４の脂肪酸とを反応させて得られるジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミドを含む医薬。
   

   
7. 下記に示されるジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン（３）と炭素数８〜２４の脂肪酸とを反応させて得られるジシアロウンデカ糖鎖アスパラギン−脂肪酸アミド及びジシアロウンデカ糖鎖アスパラギンから選ばれる１種以上ならびに製剤用添加物からなる医薬。
   

   
8. ウイルス疾患の予防剤及び／又は治療剤である請求の範囲第６項または第７項記載の医薬。
9. インフルエンザウイルス感染症の予防剤及び／又は治療剤である請求の範囲第６〜８項のいずれか１項に記載の医薬。

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