JP3390965B2

JP3390965B2 - 糖結合スフィンゴシンを含有するポリマー化合物

Info

Publication number: JP3390965B2
Application number: JP00019498A
Authority: JP
Inventors: 治蟹江; ウオングチーウエイ; 浩上高原
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1998-01-05
Publication date: 2003-03-31
Anticipated expiration: 2018-01-05
Also published as: US6358919B1; JPH11147951A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は医薬の発明に関する
ものである。より具体的に言うと、本発明は糖結合スフ
ィンゴシンを含有するポリマー化合物、及び該ポリマー
化合物を有効成分として含む医薬の発明に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】ウイルス感染の予防には一般的にワクチ
ンが用いられている。しかしながら、インフルエンザウ
イルスやエイズウイルスなど変異の激しいウイルスに対
しては、ワクチンは十分な予防効果を達成することがで
きないため、変異の激しいウイルスに対しても有効な抗
ウイルス剤の開発が望まれている。

【０００３】例えば、インフルエンザウイルスが保持ず
る２種のタンパク、すなわちシアリダーゼとヘマグルチ
ニンはそれぞれの役割を異にしていることが知られてい
る。シアリダーゼは、ウイルスが細胞から発芽する際に
細胞表面のシアリルオリゴ糖からシアル酸残基を切断す
るのに用いられる酵素であり、最近、シアリダーゼ阻害
作用を有するシアル酸誘導体が開発され、抗インフルエ
ンザウイルス剤として臨床への応用が図られている。

【０００４】一方、ヘマグルチニンは、感染の際に特定
の結合様式のシアリルオリゴ糖を認識してウイルスに宿
主特異性を与えるとともに、エンドサイトーシスにより
細胞内に移行し、そのコンフォーメーションを変化させ
て膜融合を誘発することによりウイルスゲノムRNA を宿
主細胞内へ注入する鍵を握る３量体タンパクである。ヘ
マグルチニンの阻害剤に関しては、シアル酸をポリアク
リルアミドに導入した化合物を用いた基礎的な研究がな
されているにすぎない（Mammen, M., et al.,J. Med. C
hem., 38, pp.4179-4190, 1995)。

【０００５】また、腸炎ビブリオ菌の産生するコレラ毒
素は激しい下痢を引き起こすことが知られている。この
毒素はＡサブユニットとＢサブユニットからなってお
り、５量体であるＢサブユニットがリガンドに対するレ
セプターとして作用し、毒素本体であるＡサブユニット
を細胞質内へと注入する役割を担っている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明の課題は、種々のウイルスに対して抗ウ
イルス作用を発揮でき、医薬の有効成分として有用な化
合物を提供することにある。本発明者らは上記の課題を
解決すべく鋭意努力した結果、糖結合スフィンゴシンを
含有するポリマーからなる化合物が、例えばインフルエ
ンザウイルスなどのウイルスに対して強力な抗ウイルス
作用を発揮できることを見出した。本発明は上記の知見
を基にして完成されたものである。

【０００７】すなわち本発明は、スフィンゴ糖脂質を含
む生分解性ポリマーからなるポリマー化合物又はその塩
を提供するものである。この発明の好ましい態様によれ
ば、スフィンゴ糖脂質がリゾスフィンゴ糖脂質であり、
さらに好ましくはリゾガングリオシドであり、特に好ま
しくはリゾガングリオシドGM₃である上記ポリマー化合
物又はその塩が提供される。また、別の好ましい態様に
よれば、スフィンゴ糖脂質と生分解性ポリマーとがスペ
ーサーを介して結合した上記ポリマー化合物又はその
塩；及び、生分解性ポリマーがポリグルタミン酸、より
好ましくはＮ末端アセチル化ポリグルタミン酸である上
記ポリマー化合物又はその塩が提供される。これらの塩
としてはナトリウム塩を好適に用いることができる。

【０００８】本発明の最も好ましい態様として、下記式
(I) ：

【化３】（式中、R¹は水素原子又はアセチル基を示し；R²は水素
原子又は蛍光性官能基を示し、m 及びn はそれぞれ独立
に10ないし40の整数を示す）で表されるポリマー化合物
又はその塩が提供される。このポリマー化合物又はその
塩の好ましい態様によれば、R¹がアセチル基であり、R²
がBODIPY基などの蛍光性官能基であり、mが15ないし25
の整数であり、n が20ないし40の整数であり、リゾガン
グリオシドGM₃の導入量が１ないし10モル％であるポリ
マー化合物又はそのナトリウム塩が提供される。これら
のうち、m が19であり、n が27であり、リゾガングリオ
シドGM₃の導入量が５モル％であるポリマー化合物又は
そのナトリウム塩が最も好ましい。

【０００９】本発明の別の態様によれば、上記ポリマー
化合物からなる医薬が提供される。この発明の好ましい
態様によれば、抗ウイルス剤及び／又は解毒剤として用
いる上記医薬が提供される。また、本発明のさらに別の
態様によれば、下記式(II)：

【化４】（式中、R³は水素原子又はアミノ基の保護基を示し；R⁴
は水素原子又は蛍光性官能基を示す）で表されるリゾカ
ングリオシドGM₃誘導体が提供される。この化合物は、
上記ポリマー化合物の製造中間体として有用である。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のポリマー化合物は、スフ
ィンゴ糖脂質残基を含む生分解性ポリマーからなること
を特徴としている。スフィンゴ糖脂質残基が由来するス
フィンゴ糖脂質としては、炭素数16〜20の長鎖アミノア
ルコール（スフィンゴイド）を含む糖脂質であればいか
なるものを用いてもよいが、好ましくはスフィンゴシ
ン、特に好ましくは天然型スフィンゴシン［D(+)-eryth
ro-1,3- ジヒドロキシ-2- アミノ-4-trans- オクタデセ
ン］を含む糖脂質を用いることができる。スフィンゴ糖
脂質の部分構造に相当する糖脂質残基としては、例え
ば、１個の糖残基とシアル酸残基とが結合して形成され
る糖脂質残基、又は２個以上の糖残基からなるオリゴ糖
残基の非還元末端とシアル酸残基とが結合して形成され
る糖脂質残基などを好適に用いることができる。

【００１１】スフィンゴ糖脂質残基としては、例えば、
リゾスフィンゴ糖脂質残基を好適に用いることができ
る。それらのうち、リゾガングリオシド残基（本明細書
において「リゾガングリオシド」という用語は、ガング
リオシド中セラミドの脱アシル体、すなわちシアル酸含
有オリゴ糖鎖がスフィンゴシンにグリコシド結合した化
合物を意味するものとして用いる）がより好ましく、リ
ゾガングリオシドGM₃(Lyso GM₃)残基が特に好ましい。

【００１２】生分解性ポリマーの種類は、生体内、好ま
しくはヒトの生体内に存在する酵素により容易に分解可
能なポリマーであって、実質的に抗原性がなく、生体に
対する毒性が低いものであれば特に限定されない。この
ような生分解性ポリマーは多数知られており、当業者が
適宜のものを容易に入手し、かつ利用できる。例えば、
ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリサッカライドな
どのほか、合成ポリマーを用いることも可能である。生
分解性ポリマーの血中半減期があまりに短いと所望の抗
ウイルス作用が十分に発揮されない場合がある。一方、
血中半減期が長すぎると体内への蓄積性が問題になるこ
ともある。したがって、スフィンゴ糖脂質の種類、所望
の生物学的作用の種類などに応じて、生分解性ポリマー
の種類を適宜選択することが望ましい。

【００１３】例えば、生分解性ポリマーとしてポリグル
タミン酸などのポリペプチドを好適に用いることができ
る。生分解性ポリマーとしてポリグルタミン酸を用いる
場合には、例えば重合度が 100〜1,000 程度のもの、好
ましくは 300〜700 程度のもの、特に好ましくは 500〜
600 程度のものを用いることができる。上記の一般式
(I) で表されるポリマー化合物において、m が15ないし
25の整数であり、n が20ないし40の整数であることが好
ましく、リゾガングリオシドGM₃の導入量が１ないし10
モル％であることが好ましい。

【００１４】本発明のポリマー化合物では、生分解性ポ
リマーとスフィンゴ糖脂質残基とが直接結合していても
よいが、適宜のスペーサーを介して結合していてもよ
い。生分解性ポリマーとスフィンゴ糖脂質残基との結合
に関しては、一般的には、生分解性ポリマーに存在する
カルボキシル基とスフィンゴイドに存在するアミノ基と
が両者の結合に関与していることが好ましい。両者が直
接結合する場合には、これらのカルボキシル基及びアミ
ノ基の間で酸アミド結合が形成されていることが好まし
い。

【００１５】両者がスペーサーを介して結合している場
合には、例えば、１個のアミノ酸残基からなるスペーサ
に存在するカルボキシル基及びアミノ基が、それぞれス
フィンゴイドに存在するアミノ基及び生分解性ポリマー
に存在するカルボキシル基と酸アミド結合を形成してい
てもよい。あるいは、２個以上のアミノ酸残基からなる
オリゴペプチドスペーサーのＣ末端及びＮ末端が、それ
ぞれスフィンゴイドに存在するアミノ基及び生分解性ポ
リマーに存在するカルボキシル基と酸アミド結合を形成
していることが好ましい。もっとも、スペーサーの種類
や生分解性ポリマーとスフィンゴ糖脂質残基との結合の
種類は上記のものに限定されることはなく、種々の利用
可能なスペーサー及び結合方法から当業者が適宜選択で
きることは言うまでもない。例えば、ジアミノ化合物や
酸無水物を反応させてスペーサーとして用いてもよい
し、結合としてエステル結合などを用いてもよい。

【００１６】本発明のポリマー化合物は、例えば、ウイ
ルスとの結合後の細胞内移行を視覚的に追跡できるよう
に蛍光性官能基を有していてもよい。このような蛍光性
官能基は、例えば、スペーサー部分に導入されているこ
とが好ましい。蛍光性官能基の種類は特に限定されない
が、例えば、BODIPY基 (4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-
bora-3α,4α-diaza-s-indacene-3-propionic acid) な
どを用いることができる。このような蛍光性官能基をス
ペーサーに導入する場合には、１個のアミノ酸残基から
なるスペーサーとして、例えば、リジンなどの３官能性
アミノ酸を用いることが好適である。

【００１７】本発明のポリマー化合物はナトリウム塩、
カリウム塩などの塩の形態で存在していてもよく、水和
物や溶媒和物として存在していてもよい。また、本発明
のポリマー化合物は、水酸基、カルボキシル基、アミノ
基などが適宜の保護基で保護されていてもよい。このよ
うな保護基は特に限定されず、当業者に利用可能なもの
ならばいかなるものを用いてもよい。さらに、本発明の
ポリマー化合物は光学活性体やジアステレオ異性体など
の純粋な形態の異性体、又はそれらの任意の混合物（例
えばラセミ体やジアステレオ異性体混合物）として存在
していてもよい。ここで説明した物質はいずれも本発明
の範囲に包含される。

【００１８】本発明の好ましいポリマー化合物のうち、
特に好適な化合物（ナトリウム塩）を以下に示すが、本
発明のポリマー化合物はこの化合物に限定されることは
ない（式中、m は19であり、n は27であり、リゾガング
リオシドGM₃の導入量は５モル％である）。

【化５】

【００１９】本発明のポリマー化合物は、分子内に極性
部と非極性部とを有しており、水溶液中で自己ミセルを
形成して生体内で天然型の糖タンパクと同様の挙動を示
す。いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、上
記の［化５］で示した本発明の好適なポリマー化合物
は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン、コレラ
毒素などのシアリルオリゴ糖認識レセプタータンパクに
特異的に認識され、ヘマグルチニンやコレラ毒素などと
結合した後、自己会合状態から直鎖構造に移行して、疎
水結合によりタンパクの疎水性アミノ酸側鎖又はウイル
ス膜と強固に結合する。たとえ、インフルエンザウイル
スのシアリダーゼによってシアル酸が切断されても、露
出したガラクトース残基がマクロファージによって捕捉
され、ウイルス自体がマクロファージにより貪食され
る。

【００２０】従って、本発明のポリマー化合物は、ウイ
ルス及び微生物による感染症の予防及び／又は治療のた
めの医薬の有効成分として有用である。一般的に、ウイ
ルスは特定の糖脂質や脂質を特異的に認識する性質を有
しているので、本発明のポリマー化合物のスフィンゴ糖
脂質残基の糖脂質部分を適宜選択することにより、特定
のウイルス及び微生物に対して特異的に作用する医薬を
製造することができる。その例として、インフルエンザ
ウイルスに特異的に作用するポリマー化合物を上記の
［化５］に示した。また、数種類のウイルス群に共通し
て認識される糖脂質を選択することにより、複数のウイ
ルスに対して作用する医薬を製造することも可能であ
る。

【００２１】本発明の医薬の好適な適用対象として、例
えば、ウイルス性肝炎 (A, B, C,若しくは E型など）；
インフルエンザ；ウイルス性肺炎；ウイルス性気管支
炎；ヘルペス感染症、ポリオ、AIDS、成人Ｔ細胞白血
病、パピローマ、麻疹、風疹、突発性発疹、伝染性紅
斑、ウイルス脳炎、ウイルス性髄膜炎、サイトメガロウ
イルス感染症、流行性耳下腺炎、水痘、狂犬病、ウイル
ス性腸炎などを挙げることができる。これらのうち、イ
ンフルエンザは特に好適な適用対象である。もっとも、
本発明の医薬の適用対象はこれらのウイルス性疾患に限
定されることはない。また、上記ポリマー化合物の糖脂
質部分を適宜選択することにより、あるいはそのままの
形で本発明の医薬をバクテリアなどの微生物感染症に用
いることも可能である。

【００２２】本発明の医薬としては、上記のポリマー化
合物自体または生理学的に許容されるその塩自体を用い
てもよいが、通常は、当業者に利用可能な製剤用添加物
を用いて上記の物質を有効成分として含む医薬組成物を
製造して投与することが好ましい。本発明の医薬の投与
経路は特に限定されないが、一般的には、注射剤、点滴
剤、坐剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻
剤、点耳剤などを用いて非経口的に投与することが好ま
しい。生分解性ポリマーの種類によっては本発明の医薬
を経口投与できる場合があるが、その場合には、錠剤、
カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、またはシロップ剤
などの経口投与用製剤を用いることができる。

【００２３】薬理学的及び製剤学的に許容しうる製剤用
添加物として、例えば、注射用蒸留水などの水性媒体；
用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤ないし溶解補助
剤；ブドウ糖などの等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩
基、又は有機塩基などのpH調節剤を用いることができ
る。本発明の医薬の投与量は対象となる疾患の種類、患
者の症状や年齢、予防や治療の目的など種々の条件に応
じて適宜増減されるべきであり、その量は当業者がこれ
らの因子を考慮して適宜選択できる。

【００２４】本発明のポリマー化合物の製造方法の一例
として、上記の一般式(II)で表されるリゾカングリオシ
ドGM₃誘導体（R³はアミノ基の保護基であるFmoc基であ
り、R⁴はBODIPY基である）を製造中間体として用いる方
法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、これ
らの方法を参照することにより、さらに出発原料、反応
試薬、反応条件などを適宜修飾ないし改変することによ
り、一般式(I) に包含される所望のポリマー化合物をい
ずれも容易に製造できる。もっとも、本発明のポリマー
化合物の製造方法は下記実施例に記載された方法に限定
されることはない。

【００２５】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されるこ
とはない。例１ (a) N-末端アセチル−ポリ（L-グルタミン酸スクシンイ
ミジルエステル）ポリL-グルタミン酸(43.4 mg) の水溶
液 (1.0 ml) に 10% Na₂CO₃(約 150μl)及び無水酢酸
(60μl)を加えた。反応混合液をスーパーローズ 12 pg
カラム（ファルマシア・バイオテク）（溶離液：水）で
精製し、凍結乾燥してアセチル体を得た。このアセチル
体 (32.1 mg)、N-ヒドロキシスクシンイミド、及びEDC
(N-ethyl-N'-3-dimethylaminopropylcarbodiimide・ HC
l, 6.1 mg)の DMF懸濁液 (25 ml)に室温で 1,4- ジオキ
サン (12.5 ml)及び酢酸エチル (12.5μl)を加えた。こ
の反応混合液を 27 日間攪拌した。不溶性物質を濾取し
て、酢酸エチルで洗浄した。濾液及び洗浄液を合わせて
酢酸エチルで希釈し、有機相を水及び飽和食塩水で洗浄
して、Na₂SO₄上で乾燥した後、減圧留去してスクシンイ
ミド体 (38.6 mg)を得た。¹H-NMR測定によりモノマー・
ユニットの約 50%がエステル化されていることを確認し
た。¹ H-NMR (CDCl₃): δ 6.32 (m, NHα), 3.69 (m, 1H, C
α-H), 2.8-2.9 (m, Cβ-H, C γ-H), 2.82 (s, スクシ
ンイミド),¹³C-NMR : δ 169.7, 169.1, 167.0, 151.6,
37.3, 31.5, 25.5, 25.4.

【００２６】(b) Nε-Fmoc-リジン L-リジンジヒドロクロライド(100 mg)を熱水 (1 ml) に
溶解し、CuCO₃Cu(OH)₂H₂O (70 mg) を加えた。この混合
物を濾過し、水で洗浄した。濾液及び洗浄液を合わせた
溶液に 10% Na₂CO₃水溶液 (1 ml) を加えて塩基性にし
た。この溶液に、9-フルオレニルメチル・スクシンイミ
ジル・カーボネート (Fmoc-E) (184 mg,1.2当量) の1,2
-ジメトキシエタン (4 ml) 溶液を 0℃で滴下混合し
た。２時間後にこの反応混合液を常温に戻し、一晩攪拌
した。緑色沈殿を濾取し、水、EtOH、及び Et₂O で洗浄
した後、この沈殿を減圧乾燥した。

【００２７】エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (102 mg)
の 0.33 M HCl (4 ml)懸濁液をこの沈殿に加えた。３時
間後、白色沈殿を濾取して水で洗浄した。この沈殿を E
tOH/H₂O (7/3, v/v)の熱溶液に溶解し、不溶性画分を濾
取して EtOH/H₂O (7/3, v/v)溶液で洗浄した。洗浄液及
び濾液を合わせた溶液から析出したN ε-Fmoc-リジンの
結晶を EtOH 及び Et₂O で洗浄して中和し、減圧乾燥し
て目的物を得た (96.7mg, 58.2%) 。 mp = 188℃（分解） Rf = 0.06 (CHCl₃/CH₃OH/AcOH = 95/10/3, v/v/v)¹ H-NMR (D₂O/CD₃OD (1/1, v/v), 25.5℃, ref 4.8 pp
m): δ 7.8 (d, 2H, Fmoc), 7.6 (d, Fmoc), 7.4 (t, F
moc), 7.3 (t, Fmoc), 4.3-4.5, 4.1-4.3 (Fmoc),3.5-
3.7 (1H, Cα-H), 2.9-3.1 (m, 2H, Cε-H), 1.7-1.9
(dd, 2H, J = 5.9, 10.6, Cβ-H), 1.2-1.4 (m, 2H, C
γ-H), 1.3-1.5 (m, 2H, Cd-H) Anal. Calcd For C₂₁H₂₄O₄N₂ : C, 68.46; H, 6.57; N,
7.61. Found : C, 67.86; H, 6.56; N, 7.54.

【００２８】(c) Nα-BODIPY-N ε-Fmoc-リジン Nε-Fmoc-リジン (5.4 mg, 1.5x10^-2 mM, 2当量) の Me
OH (1 ml)懸濁液に 4,4- ジフルオロ -5,7-ジメチル -4
-ボラ-3α,4α- ジアザ-s- インダセン-3- プロピオン
酸・スクシンイミジル・エステル (BODIPY FL C3-SE)
(3.0 mg, 7.7x10^-3 mM, 1当量) の CH₂Cl₂溶液 (1 ml)
を加えた。この懸濁液に 10% Na₂CO₃水溶液 (約 50 m
l) を室温で加えた。この反応混合液を２時間攪拌し、
酢酸エチルで希釈した後、0.33 M HCl、水、及び塩水で
洗浄し、Na₂SO₄で乾燥して減圧留去した。残渣を PTLC
（溶離液: 20% MeOH/CHCl₃, v/v)で精製して、N α-BOD
IPY-N ε-Fmoc-リジンを得た (4.3 mg, 収率 87%) 。

【００２９】[α] ^D= -173°(c = 0.40 in MeOH) Rf = 0.5 (CHCl₃/CH₃OH/AcOH = 95/10/3, v/v/v)¹ H-NMR (CDCl₃): δ 7.0 (NHα), 5.33(NHε), 4.3-4.4
(m, 1H, Cα-H), 3.03(m, 2H, C ε-H), 1.76 (m, 2H,
Cβ-H), 1.62 (m, 2H, C γ-H), 1.33 (m, 2H, C δ-
H), 7.69 (d, 2H, J = 7.5, Fmoc), 7.52 (d, 2H, J =
7.3, Fmoc), 7.38 (t, 2H, J = 6.9, Fmoc), 7.22 (t,
2H, J = 7.3, Fmoc), 4.29 (d, J = 6.3,Fmoc), 4.11
(broad dd, J = 6.3, 13.2, Fmoc), 6.96 (s, 1H, BODI
PY), 6.75(d, 1H, J = 4.0, BODIPY), 6.20 (d, 1H, J
= 3.3, BODIPY), 5.98 (s, 1H, BODIPY), 2.42 (s, 3H,
BODIPY-CH₃), 2.12 (s, 3H, BODIPY-CH₃), 3.22, 2.63
(dd, dd, 2H, 2H, BODIPY-CH₂-) FAB-MS calcd for Pos [M + Na] ⁺: 665.3, found: 66
5.3

【００３０】(d) Nα-BODIPY-N ε-Fmoc-リジン・スク
シンイミジル・エステル Nα-BODIPY-N ε-Fmoc-リジン (5.4 mg, 8.5 ×10^-3 m
M)及び N- ヒドロキシスクシンイミド (1.2 mg, 1.2 当
量) の CH₂Cl₂溶液 (1 ml) に 1,3- ジイソプロピルカ
ルボジイミド (1.6 ml, 1.2 当量) を０℃で加えた。こ
の反応混合液を2.5時間攪拌して酢酸エチルで希釈し、
0.33 M HCl、水、及び塩水で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥し
た後、減圧留去して Nα-BODIPY- Nε-Fmoc-リジン・ス
クシンイミジル・エステル (8.1 mg) を得た。

【００３１】Rf = 0.33 (10% CH₃OH/CHCl₃, v/v)¹ H-NMR (CDCl₃): δ 6.42 (broad d, NHα), 5.12 (bro
ad t, NHε), 4.94 (m,1H, C α-H), 3.14 (m, 2H, C
ε-H), 1.85 (m, 2H, C β-H), 1.49 (m, 2H, Cδ-H),
1.33 (m, 2H, C γ-H), 7.75 (d, 2H, J = 7.6, Fmoc),
7.58 (d, 2H, J= 7.3, Fmoc), 7.38 (t, 2H, J = 7.6,
Fmoc), 7.29 (t, 2H, J = 7.3, Fmoc),4.38 (d, J =
6.9, Fmoc), 4.18 (t, 1H, Fmoc), 7.07 (s, 1H, BODIP
Y), 6.85(d, 1H, J = 4.0, BODIPY), 6.27 (d, 1H, J =
3.6, BODIPY), 6.09 (s, 1H, BODIPY), 2.54 (s, 3H,
BODIPY-CH₃), 2.22 (s, 3H, BODIPY-CH₃), 3.29, 2.72
(broad t, m, 2H, 2H, BODIPY-CH₂-), 2.79 (s, 4H,ス
クシンイミド).

【００３２】(e) Nα-BODIPY-N ε-Fmoc-リジン-C- リ
ゾ GM₃ DMF とメタノール中 100 mM トリエチルアミンとの混合
物 (7/3, v/v) (20 ml) に溶解したリゾ GM₃ (100 mg)
に対して、DMF とメタノール中 100 mM トリエチルアミ
ンとの混合物 (7/3, v/v) (20 ml) に溶解したN α-BOD
IPY-N ε-Fmoc-リジン・スクシンイミジル・エステル粗
化合物 (0.5 mg, 約 5当量) を加え、この反応混合液を
室温で２時間攪拌した。この反応混合液を減圧濃縮し、
残渣を PTLC （溶離液: CHCl₃/MeOH/15 mM CaCl₂ = 60/
BR>35/8) で精製して、定量収率でNα-BODIPY-N ε-Fmo
c-リジン-C- リゾGM₃を得た。

【００３３】Rf = 0.33 (CHCl₃/CH₃OH/15 mM CaCl₂ = 6
0/35/8, v/v/v) 600 MHz ¹H-NMR (CD₃OD): δ 7.68 (d, 2H, J = 7.7, F
moc), 7.53 (d, 2H, J =5.9, Fmoc), 7.28 (t, 2H, J =
7.7, Fmoc), 7.19 (t, 2H, J = 7.3, Fmoc), 7.30 (s,
1H, BODIPY), 6.90 (d, 1H, J = 4.4, BODIPY), 6.22
(d, 1H, BODIPY), 6.10 (s, 1H, BODIPY), 3.13 (m, 2
H, -CH₂-, BODIPY), 2.58 (m, 2H, -CH₂-,BODIPY), 2.4
1 (s, 3H, BODIPY-CH₃), 2.16 (s, 3H, BODIPY-CH₃),
4.2 (1H, Cα-H), 2.99 (m, 2H, C ε-H), 1.63 (m, 2
H, C β-H), 1.5 (m, 2H, Cγ-H), 1.39 (m, 2H, C δ-
H), 4.20-4.24 (1H, Glc-H-1), 4.32 (d, 1H, J = 7.7,
Gal-H-1), 3.95 (dd, 1H, J = 2.9, 9.9, Gal-H-3),
3.84 (broad s, 1H, Gal-H-4),2.76 (dd, 1H, Neu5Ac-H
-2eq.), 1.6 (1H, Neu5Ac-H-2ax.), 1.91 (3H, Neu5Ac-
NHCOCH₃),; 5.31-5.36 (m, 1H, スフィンゴシン−オレ
フィニック R-4), 5.56-5.61 (m, 1H,スフィンゴシン−
オレフィニック R-5), 1.19 (16H, スフィンゴシン・メ
チレン) 、0.79 (スフィンゴシン・ターミナル・メチ
ル) ESI-MS calcd. for Pos [M + 2Na - H] ⁺: 1584, foun
d: 1584; calcd. for Neg [M-H] ^-: 1538, found: 153
8.

【００３４】(e) Nα-BODIPY-リジン-C- リゾ GM₃ Nα-BODIPY-N ε-Fmoc-リジン-C- リゾ GM₃ (約 0.2 m
g)のDMF 溶液 (50 ml)にピペリジン (50 ml)を加えた。
この反応混合液を室温で２分間攪拌し、N₂気流下で濃縮
した。残渣を PTLC （溶離液: CHCl₃/MeOH/15 mM CaCl₂
= 60/35/8) で精製して、N α-BODIPY-リジン-C- リゾ
GM₃を収率 34.6%で得た（約 505 nm での吸収を分光測
光法により測定した); Rf = 0.27 (CHCl₃/CH₃OH/15 mM CaCl₂ = 60/35/8, v/v/
v) 600 MHz ¹H-NMR (CD₃OD): δ 7.34 (s, 1H, BODIPY),
6.93 (d, 1H, BODIPY), 6.26 (d, 1H, BODIPY), 6.13
(s, 1H, BODIPY), 3.13 (m, 2H, -CH₂-, BODIPY),2.62
(t, 2H, -CH₂-, BODIPY), 2.42 (s, 3H, BODIPY-CH₃),
2.19 (s, 3H, BODIPY-CH₃), 4.2-4.3 (1H, C α-H), 3.
03 (m, 2H, C ε-H), 1.5-1.65 (m, 4H, Cβ-H, C γ-
H), 1.69 (m, 2H, C δ-H), 4.21 (d, 1H, J = 8.1, Gl
c-H-1), 4.32 (d, 1H, J = 8.1, Gal-H-1), 3.93-3.95
(1H, Gal-H-3), 3.80 (broad s, 1H,Gal-H-4), 2.81 (d
d, 1H, Neu5Ac-H2eq.), 1.54 (1H, Neu5Ac-H2ax.), 1.9
1 (3H, Neu5Ac-NHCOCH₃),; 5.32-5.38 (m, 1H,スフィン
ゴシン−オレフィニック R-4), 5.56-5.59 (m, 1H,スフ
ィンゴシン−オレフィニック R-5), 1.19 (16H, スフィ
ンゴシン・メチレン), 0.80(スフィンゴシン・ターミナ
ル・メチル),ESI-MS calcd. for Pos [M + 2Na - H]
⁺: 1362, found: 1362; calcd for Neg[M + Na] ⁺:
1340, found: 1340; calcd for Neg [M - H]^- : 1316,
found:1316

【００３５】(f) 本発明のポリマー化合物の製造 N-末端アセチル−ポリ（L-グルタミン酸スクシンイミジ
ルエステル） (0.8 mg) の CH₂Cl₂/MeOH (7/3, v/v) 溶
液 (100 μl)に Nα-BODIPY-リジン-C- リゾ GM₃ (約
0.04 mg) の CH₂Cl₂/MeOH (7/3, v/v) 溶液 (400 μl)
を加えた。この反応混合液を常温で一晩攪拌した。この
混合液を減圧濃縮して、スーパーローズ 12 pgカラム
（ファルマシア・バイオテク）（溶離液：水）で精製
し、減圧留去して本発明のポリマー化合物を定量的に得
た。この化合物のGM₃-含量 (%)は、グルタミン酸単位の
5% についてカップリング反応に使用する試薬により評
価し、NMR 分析により確認した。 270 MHz ¹H-NMR (D₂O): δ 3.6-3.8 (m), 3.3-3.4 (m),
2.4-2.6 (m), 1.98, 1.96 (s, CH₃), 0.86(スフィンゴ
シン・ターミナル・メチル).

【００３６】上記ポリマー化合物のGPC 分析は、ウォー
ターズ 600E システム・コントローラー、486 回転式吸
光度検出器、横河 LC 100 システム・カラム・オーブン
を用いて行った。カラムとしてウォーターズ・ウルトラ
ハイドロゲル・ライナー (7.8 x 300 mm i.d.)を用い
て、流速 1 ml/分の 0.1 M NaNO₃で溶出し、40℃で500n
mにおける u.v. 又は屈折率により検出した。データ分
析にはミレニウム 2010及び GPCソフトウェアを使用し
た。ポリエチレン・オキシドを標準に用いた。 HPLC-GPCプロフィール: Mw = 175,017, Mw/Mn = 2.10.

【００３７】例２：コレラトキシンB (CTB) に対する作
用 PVDFメンブレンにガングリオシドGM_1aをスポットし（66
0pmol, 1μl 溶液）、1%BSA 溶液を用いて室温で２時間
処理してブロッキングした後、リン酸緩衝生理食塩水で
洗浄した (５分間，５回）。メンブレンを A) 西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ(POD) 結合コレラトキシンB (CTB:
単量体として660 pmol)(CTB-POD)、又はB) 例１で得た
本発明の化合物（GM₃として660 pmol）の存在下に37℃
で１時間プレインキュベートしたCTB-POD と37℃で２時
間インキュベートし、その後、リン酸緩衝生理食塩水で
洗浄した( ５分間，５回）。メンブレンに結合したCTB
は、ニトロテトラゾリウム・ブルー（NTB)、フェノー
ル、過酸化水素、NADHを含むPOD Immunostain Set (和
光純薬工業株式会社製）を加えて室温で10分間処理する
ことにより可視化した。この結果、例１で得られた本発
明の化合物がコレラトキシンB とガングリオシドGM_1aと
の結合をほぼ完全に阻害していることが示された。

【００３８】例３：コレラトキシンB に対する作用コレラトキシンB に対する本発明の化合物（例１）の阻
害活性を以下のようにELISAによりアッセイした。50 pm
ol の GM_1aを含む水溶液を 12-ウェルのマイクロウェ
ルブロッタープレートのウェル中に入れた各ニトロセル
ロース(NC)メンブレンに加えた。室温で10分間 NC メン
ブレン中に浸透させた後、濾過して溶媒を除去し、つい
で1% BSAを含む水 25 mlを用いて室温で３時間処理して
メンブレン上に残存する結合部位をブロックした。その
後 BSA溶液を除去し、 NC メンブレンを水 250 ml で４
回洗浄した。

【００３９】本発明の化合物 (200 pmol）の水による２
倍希釈系列を50 pmol の CTB-POD共役体を含む水溶液と
共に室温で３時間プレインキュベートした後、上記ウェ
ルに加え、メンブレンを室温で３時間インキュベートし
た。水で６回洗浄した後、メンブレンに固定されている
GM_1aに結合した CTB-PODを検出するために上記メンブ
レンを 25 mlの POD免疫染色セット（和光純薬、日本）
と室温で10分間反応させた。水を加えて反応を停止し、
CTB-HRP結合活性を ATTO デンシトグラフソフトウェア
ライブラリー・レーンアナライザー (ATTOコーポレーシ
ョン、日本）を用いて発色の形態で測定した。GM_1a (20
0 pmol) 、及び GM₃ (25.6 nmol)の２倍希釈系列を対照
として試験した。結果を表１に示す（表中、^*を付した
カッコ内のIC₅₀値はシアル酸１残基あたりの値であ
る）。

【００４０】

【表１】

【００４１】例４：インフルエンザウイルスとの結合作
用ヒト胎盤から分離精製したガングリオシドGM₃及び例１
で製造した本発明の化合物を用いて、シアリル2-3 ガラ
クトースを認識するインフルエンザウイルス［ヒトイン
フルエンザウイルスA/PR/8/34 (H1N1)］に対する結合実
験を行った。GM₃及び例１で製造した本発明の化合物の
それぞれのエタノール溶液（シアル酸として 20 nmol/m
l)を調製し、エタノールで原液から1024倍まで倍々希釈
した。マイクロタイタープレートの各ウェルに各希釈液
（50μl)を添加し、プレートを37℃で静置してエタノー
ルを蒸発させた後、5%ウシ血清アルブミンを含有するリ
ン酸緩衝液(pH7.0) を各ウェルに200 μl ずつ加えて12
時間以上静置した。

【００４２】上記のプレートをリン酸緩衝液で洗浄した
後、0.2%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝液で
32HAU に調製したヒトインフルエンザウイルスA/PR/8/3
4 (H1N1)の懸濁液を各ウェルに50μl ずつ加え、4 ℃で
12時間反応させた。ウェルをリン酸緩衝液で洗浄した
後、0.2%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝液で
500 倍に希釈した抗A/PR/8/34(H1N1) ウサギ抗体を50μ
l ずつ加え、４℃で３時間反応させた。ウェルをリン酸
緩衝液で洗浄した後、0.2%ウシ血清アルブミンを含有す
るリン酸緩衝液で1000倍に希釈した西洋ワサビペルオキ
シダーゼ結合プロテインA 溶液を50μl ずつ加え４℃で
２時間反応させた。

【００４３】各ウェルをリン酸緩衝液で洗浄した後、O-
フェニレンジアミン(0.4mg/ml)と0.01% 過酸化水素を含
有する0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液(pH5.0) の基質溶液
を100 μl ずつ加え、25℃で15分間反応させた。その
後、各ウェルに0.4N硫酸溶液を100 μl ずつ加えて反応
を停止し、インフルエンザウイルスの結合による発色を
マイクロプレートリーダー（コロナ社製）を用いて測定
波長492nm 、対照波長630nm にて測定した。この結果、
本発明の化合物は対照のガングリオシドGM₃に比べて少
なくとも16倍強い結合を有することが示された。

【００４４】例５：インフルエンザウイルスに対する阻
害作用インフルエンザウィルス A/PR/8/34(H1N1)に対する本発
明の化合物（例１）の阻害活性を、以下のように酵素結
合免疫吸着体アッセイ(ELISA) によりアッセイした。1
nmolの GM₃を含むエタノール溶液を 96-ウェルのマイク
ロウェルプレートの各ウェルに加え、37℃で溶媒を留去
した後、2% BSAを含む PBS 200μl で４℃、12時間処理
してウェル上に残存する結合部位をブロックした。PBS
で５回洗浄した後、本発明の化合物 (200 pmol）の 0.2
% BSA-PBS による２倍希釈系列を50μl のインフルエン
ザウィルス懸濁液(32HAU) と共に４℃で２時間プレイン
キュベートした後、上記ウェルに加えた。

【００４５】このプレートを４℃で12時間インキュベー
トした。PBS で５回洗浄した後、 0.2% BSA-PBS で希釈
(1000倍) した抗インフルエンザウィルス抗体 50 μl
を加えてプレートを４℃で２時間インキュベートし、溶
液Ａで希釈 (1000倍) したHRP-共役プロテインＡと４℃
で２時間反応させた。ウェルに固定された GM₃結合ビリ
オンを 100 mM リン酸−クエン酸バッファー(pH 5.0)中
に 4 mg OPD 及び 0.01% H₂O₂を含むo-フェニレンジア
ミン(OPD) 溶液で検出した。4 N H₂SO₄で反応を停止
し、630 nmを対照波長として 492 nm における発色とい
う形態でウィルス結合活性を測定した。シアリルラクト
ース(2μmol)、PGA(800pmol)、及びリソGM₃(20 nmol)
の２倍希釈系列を対照として試験した。結果を表２に示
す（表中、^*を付したカッコ内のIC₅₀値はシアル酸１残
基あたりの値であり、^**を付した結果は、対照として用
いたPGA ではアッセイで使用した最大濃度である 1×10
^-9mol までの濃度範囲で阻害が認められなかったことを
示す）。

【００４６】

【表２】

【００４７】また、ウィルス溶液に本発明の化合物（例
１）を加えると、直ちにBODIPYの蛍光発光 (λ_em 510、
λ_ex 480 nm)の増大が観察された。このことは折りたた
まれていた本発明の化合物がデフォールドしたことを示
唆している。その後、10℃でさらにインキュベートする
と発光強度は低下した。これはヘマグルチニン(HA)の芳
香族アミノ酸残基へのエネルギー転移が生じたためであ
ると考えられる。従って、この結果は、(A) 特異的リガ
ンド（例１の化合物においてはシアリルラクトース）を
有する本発明の化合物（折り畳み構造）がヘマグルチニ
ン(HA)に接近した後、(B) リガンドとレセプターとの相
互作用が起こり、本発明の化合物がデホールドされ、さ
らに(C) デホールドされた本発明の化合物とヘマグルチ
ニンとの間で疎水性相互作用が起こりさらに安定な複合
体が形成されることを示している。

【００４８】

【発明の効果】本発明のポリマー化合物は、ウイルス感
染の予防及び／又は治療などに用いる医薬の有効成分と
して有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開平７−228688（ＪＰ，Ａ) 特開平５−178986（ＪＰ，Ａ) 特開平３−287545（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−133232（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C08G 69/00 - 69/50 ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】スフィンゴ糖脂質を含む生分解性ポリマ
ーからなるポリマー化合物又はその塩。
【請求項２】スフィンゴ糖脂質と生分解性ポリマーと
がスペーサーを介して結合した請求項１に記載のポリマ
ー化合物又はその塩。
【請求項３】スフィンゴ糖脂質がリゾガングリオシド
GM₃である請求項１又は２に記載のポリマー化合物又は
その塩。
【請求項４】生分解性ポリマーがＮ末端アセチル化ポ
リグルタミン酸である請求項１ないし３のいずれか１項
に記載のポリマー化合物又はその塩。
【請求項５】下記式(I) ：【化１】（式中、R¹は水素原子又はアセチル基を示し；R²は水素
原子又は蛍光性官能基を示し、m 及びn はそれぞれ独立
に10ないし40の整数を示す）で表されるポリマー化合物
又はその塩。
【請求項６】 R¹がアセチル基であり、R²がBODIPY基で
あり、m が19であり、nが27であり、リゾガングリオシ
ドGM₃の導入量が５モル％である請求項５に記載のポリ
マー化合物又は塩。
【請求項７】請求項１ないし６のいずれか１項に記載
のポリマー化合物又は生理学的に許容されるその塩を有
効成分として含む医薬。
【請求項８】抗ウイルス剤として用いる請求項７に記
載の医薬。
【請求項９】解毒剤として用いる請求項７に記載の医
薬。
【請求項１０】下記式(II)：【化２】（式中、R³は水素原子又はアミノ基の保護基を示し；R⁴
は水素原子又は蛍光性官能基を示す）で表されるリゾカ
ングリオシドGM₃誘導体。