KR20060022707A

KR20060022707A - 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴―지방산 아미드, 이것을포함하는 의약

Info

Publication number: KR20060022707A
Application number: KR1020057024437A
Authority: KR
Inventors: 야스히로 가지하라; 히로아키 마에다; 가즈히로 후카에
Original assignee: 오츠카 가가쿠 가부시키가이샤; 야스히로 가지하라
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-29
Publication date: 2006-03-10
Also published as: KR100731869B1; CN100500694C; JP4707107B2; US20070105813A1; AU2004252028A1; JPWO2005000906A1; CA2529162A1; EP1640383B1; WO2005000906A1; AU2004252028B2; EP1640383A1; US7687478B2; TWI293956B; CA2529162C; CN1809594A; TW200510461A; EP1640383A4

Abstract

디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드, 이것을 포함하는 의약 및 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴을 포함하는 의약.

디시알로운데카 당사슬, 아스파라긴, 지방산 아미드, 의약

Description

디시알로운데카 당사슬 아스파라긴―지방산 아미드, 이것을 포함하는 의약{Disialoundecasaccharide chain asparagine/fatty acid amide and medical drug containing the same}

본 발명은 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드, 이것을 포함하는 조성물 또는 의약에 관한 것이다.

인플루엔자는 매년 같이 전세계에서 유행하고 있는 감염증으로, 백신이 존재함에도 불구하고, 많은 사람이 매년 감염되어, 발열, 두통, 근관절통 등으로 고생하고 있다. 또한 합병증인 인플루엔자 뇌염·뇌증(腦症)에 걸림으로써 최악의 경우 사망에 이른다. 백신이 존재함에도 불구하고 인플루엔자 바이러스를 이토록 두려워하는 이유는, 인플루엔자 바이러스가 유전자 돌연변이를 일으키기 쉬워, 항원의 형태가 변화되어 백신에 의해 체내에 증가된 항체가 그것을 인식하지 않게 되어 백신의 효능이 저하되어 버리는 것에 있다. 이와 같이 매년 어떠한 형태의 인플루엔자가 유행할지 어느 정도 예측할 수 있었다 하더라도, 돌연 신형의 바이러스가 발생하거나 하기 때문에, 적절한 백신을 신속하게 공급할 수 없는 것이 문제로 되어 있다. 따라서 다종(多種)의 인플루엔자 바이러스에 효능이 있는 특효약을 개발할 필요가 있다. 최근, 인플루엔자 바이러스의 감염 메커니즘, 분자·유전자 레벨에서의 해명을 과학기술의 비약적인 진보에 의해 실현할 수 있어, 다양한 인플루엔자 바이러스 감염 저해제의 합성이 검토되고 있다.

인플루엔자 바이러스의 감염, 증식의 메커니즘은 이하와 같다. 먼저 바이러스가 생체 내에 침입하여, 숙주세포에 접근하면 바이러스 표층 상의 헤마글루티닌(hemagglutinin)이라고 하는 3량체의 단백질이 숙주세포 상의 리셉터인 시알릴 당사슬에 특이적으로 결합한다. 시알릴 당사슬은 말단에 시알산(sialic acid)을 포함하고, 주로 이 시알산이 헤마글루티닌과의 결합에 관여하고 있다. 다음으로, 바이러스와 숙주세포의 막융합이 일어나, 바이러스의 RNA가 숙주세포 내로 흘러 들어가고, 이어서 바이러스 유전자가 거기서 복제되어, 새끼 바이러스가 출현한다. 그리고 숙주세포 밖으로 바이러스가 출아(出芽)되어 증식이 완료된다. 바이러스가 출아될 때에, 다시 헤마글루티닌과 시알릴 당사슬이 결합되어 버리지만, 동일한 바이러스 표층 상에 있는 시알리다아제(sialidase)라고 하는 효소가 시알릴 당사슬로부터 시알산을 잘라내어, 출아할 수 있다.

최근, 이 바이러스 감염의 최종단계에서 일어나는 시알리다아제반응의 작용을 저해하는 새로운 치료약이 제작되었다. 그것이 자나미비르(Zanamivir)(상품명: 릴렌자(Relenza), 글락소·웰컴사(Glaxo Wellcome K.K.))와 인산 오셀타미비르(Oceltamivir phosphate)(상품명: 타미플루(Tamiflu), 닛폰 로슈사(Japanese Roche Corp.))이다. 그러나, 이 2개의 시알리다아제 저해제는 감염의 최종단계를 저해하기 때문에 바이러스의 증식이 피크에 도달한 다음부터는 효과가 적어, 발증 후 48시간 이내의 투여가 바람직하다. 이 사실로부터, 효과적인 치료약으로서, 바이러스 가 숙주세포에 결합하는 최초의 단계를 저해하는 화합물을 합성하는 것이 요망되고 있다.

헤마글루티닌 저해제의 개발에 있어서, 이미 단가성(monovalent) 시알릴 당사슬 유도체 보다도 시알릴 당사슬을 분자 내에 복수 갖는 다가성(polyvalent) 시알릴 당사슬 유도체 쪽이 인플루엔자 바이러스에 대해 높은 저해작용을 갖는 것이 알려져 있다. 이것은, 바이러스 표면 상에 다수 존재하는 헤마글루티닌에 복수의 단가성 시알릴 당사슬 유도체가 결합하는 것 보다도 분자 내에 다수, 시알릴 당사슬 유도체가 결합된 다가성 분자가 결합하는 쪽이, 리간드(ligand)와 리셉터의 친화력(affinity)이 증대되기 때문이다.

현재까지, 이러한 효과를 기대하여 다가성 시알릴 당사슬 유도체가 다수 합성되어 있다. 가니에 등은 시알릴 락토오스(sialyl lactose)를 결합한 스티렌 폴리머(1)을 합성하여 인플루엔자와의 결합을 조사한 바, 시알릴 당사슬 단백질인 페투인(fetuin)에 비해 1000배 강한 저해활성이 있는 것을 나타내었다.

또한, Whitesides 등은 시알산 유도체를 결합한 폴리아크릴아미드 폴리머(2) 를 합성하여 고분자의 폴리머일수록 저해활성이 높은 것을 나타내었다.

그러나, 고분자화합물인 폴리머는, 여러 가지 분자량을 갖는 폴리머의 혼합물이기 때문에 구조가 명확하지 않다. 또한, 만일 그 화합물 내에 60 KDa 이상의 분자량을 갖는 것이 포함되어 있으면, 그들은 분자량이 지나치게 커서 신장의 말피기소체(Malpighian corpuscle)에서 보우만 주머니(Bowman's capsule)에 여과되지 않아 체외로 배출되지 않기 때문에 체내에 잔존하여, 간장에 있어서의 대사의 균형을 무너뜨려, 인체에 해를 줄 가능성을 가지고 있다. 그 때문에 FDA(The Food Drug Administration)는 실제 이러한 폴리머형의 화합물은 유효한 인플루엔자 감염 저해제이더라도 안전성에 문제가 있다고 하여 승인하지 않고 있다.

본 발명의 목적은 신규한 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드, 이것을 포함하는 조성물 또는 의약을 제공하는 것에 있다.

또한 본 발명의 목적은 우수한 바이러스 감염 및/또는 증식 저해작용을 갖는 인플루엔자 바이러스 감염증 등의 바이러스 질환의 예방제 및/또는 치료제를 제공하는 것에 있다.

발명의 개시

본 발명은, 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드를 포함하는 조성물 또는 의약에 관한 것이다.

또한 본 발명은 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴을 포함하는 의약에 관한 것이다.

본 발명의 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드는, 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴과 지방산을 반응시켜서 얻어지는 화합물이다.

디시알로운데카 당사슬 아스파라긴은 하기에 나타내어지는 당사슬 아스파라긴(3)이다.

이 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴은, 예를 들면 일본국 특허출원 제2002-196821의 참고예 1에 따라 합성할 수 있다.

본 발명에 있어서 지방산 아미드를 구성하는 지방산으로서는, 탄소수 6~32의 지방족 포화 또는 지방족 불포화 지방산 및 이들의 2종류 이상의 병용을 들 수 있다. 지방족 포화 지방산으로서는, 직쇄(straight chain) 또는 분지의 헥산산(카프론산(caproic acid), 2-에틸부탄산 등), 헵탄산(에난트산(enanthic acid) 등), 옥탄산(카프릴산(caprylic acid), 2-에틸헥산산 등), 노난산(nonanoic acid)(페랄곤산(peralgonic acid) 등), 데칸산(decanoic acid)(카프르산(capric acid) 등), 운데칸산(undecanoic acid)(운데실산(undecylic acid) 등), 도데칸산(dodecanoic acid)(라우르산(lauric acid), 2-에틸데칸산 등), 트리데칸산(트리데실산(tridecylic acid) 등), 테트라데칸산(미리스트산(myristic acid) 등), 헥사데칸산(팔미트산(palmitic acid) 등), 옥타데칸산(스테아르산(stearic acid) 등), 에이코산산(eicosanic acid)(아라킨산(arachic acid) 등), 도코산산(docosanoic acid)(베헨산(behenic acid) 등), 테트라코산산(리그노세르산(lignoceric acid) 등) 등을 들 수 있다.

지방족 불포화 지방산으로서는, 직쇄 또는 분지의 옥텐산(octenoic acid), 데센산(decenoic acid), 운데센산(undecenoic acid)(운데실렌산(undecylenic acid) 등), 도데센산, 옥타데센산(올레산(oleic acid), 에라이딘산(eraidic acid) 등), 리놀산(linoleic acid) 및 리놀렌산(linolenic acid) 등을 들 수 있다. 이들 지방산 중 바람직한 것은 탄소수 8~24, 더욱 바람직하게는 산소수 10~22의 지방산이며, 특히 바람직하게는 데칸산, 도데칸산, 테트라데칸산, 헥사데칸산, 옥타데칸산, 에이코산산, 도코산산 및 옥타데센산이고, 가장 바람직하게는 직쇄의 것으로서, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라킨산, 베헨산 및 올레산이다.

디시알로운데카 당사슬 아스파라긴과 지방산의 반응은 바람직하게는 반응활성화제의 존재하에 반응시키는 것이 좋다. 반응활성화제로서는 예를 들면 N-히드록시숙신이미드, N-히드록시벤조트리아졸(HOBT) 등을 들 수 있다.

디시알로운데카 당사슬 아스파라긴과 지방산의 반응비율은 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴 1몰에 대해 지방산을 약 0.1~10몰 사용하는 것이 바람직하다. 반응활성화제는 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴 1몰에 대해 약 0.1~10몰 사용하는 것이 바람직하다. 반응은 통상 0~80℃, 바람직하게는 10~60℃에서 행하는 것이 좋고, 통상 약 10분~5시간에서 종료된다.

얻어진 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드는, 예를 들면, 여과, 고속액체 크로마토그래피(HPLC) 등으로 정제할 수 있다. 이들 화합물의 동정(identification)은 NMR, HPLC(ODS 칼럼)로 UV에 있어서의 검출시간 등에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드는 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴의 친수기(hydrophilic group)와, 긴 탄소사슬(long carbon chain)을 갖는 지방산의 소수기(hydrophobic group) 양쪽을 모두 갖기 때문에, 수용액 중에서는 도 1에 나타내는 바와 같은 미셀화가 용이하게 일어나, 저분자형으로 분자량, 구조가 명확한 다가성 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻을 수 있다.

이와 같이 단가성 분자의 미셀화를 이용하면 분자량의 차이도 없고, 화합물을 저분자로 억제할 수 있어, 폴리머 보다도 비교적 간단하게 합성할 수 있다. 그리고 미셀화하여 다가성으로 함으로써, 예를 들면 인플루엔자 바이러스에 대해 매우 우수한 저해활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 의약은 상기 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드를 유효성분으로서 함유하는 것이다. 또한 본 발명의 의약은 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴을 유효성분으로서 함유하는 것이다.

본 발명의 의약은, 상기 유효성분과 제제용 첨가물(담체, 부형제 등)을 포함하는 의약 조성물의 형태로 제공된다. 담체로서는, 예를 들면, 유당(乳糖), 글리세린 등을 예시할 수 있다. 부형제로서는, 예를 들면, 유당, 포도당, 수크로오스, 만니톨 등을 예시할 수 있다. 의약 중의 유효성분의 양은 약 0.01~95 중량%, 바람직하게는 약 1~80 중량%가 좋다.

본 발명의 의약의 투여경로는 특별히 한정되지 않고, 경구투여 또는 비경구투여(예를 들면, 근육내투여, 정맥내투여, 피하투여, 복강내투여, 비강 등으로의 점막투여, 또는 흡입투여 등) 중 어느 것이어도 된다. 본 발명의 의약의 형태는 특별히 한정되지 않고, 경구투여를 위한 제제로서는 예를 들면, 정제, 캡슐제, 세립제(fine grains), 분말제, 과립제, 액제, 시럽제 등을 들 수 있고, 비경구투여를 위한 제제로서는 예를 들면, 주사제, 점액제, 좌제, 흡입제, 경점막흡수제, 경피흡수제, 점비제(nose drop), 점이제(ear drop) 등을 들 수 있다.

본 발명의 의약의 형태, 사용해야 할 제제용 첨가물, 제제의 제조방법 등은, 모두 당업자가 적절히 선택 가능하다. 본 발명의 의약의 투여량은, 환자의 성별, 연령 또는 체중, 증상의 중증도(重症度), 예방 또는 치료라고 하는 투여 목적, 또는 그 밖의 합병증상의 유무 등을 종합적으로 고려하여 적절히 선택할 수 있다. 투여량은, 일반적으로는 0.001 ㎍/㎏ 체중/일~1000 ㎍/㎏ 체중/일, 바람직하게는 0.001 ㎍/㎏ 체중/일~100 ㎍/㎏ 체중/일이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드의 미셀(micell)을 나타내는 도면이다.

도 2는 실시예 1~4의 각 디시알로운데카 아스파라긴-지방산 아미드의 화학식을 나타내는 도면이다.

도 3은 Dansyl-LacNAc의 시알릴화의 반응 스킴(reaction scheme)을 나타내는 도면이다.

도 4는 각 저해제의 시알산량을 기준으로 한 시알리다아제 저해활성을 나타내는 도면이다.

도 5는 각 저해제의 몰농도를 기준으로 한 시알리다아제 저해활성을 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하에 참고예, 실시예, 시험예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 조금도 이것에 한정되는 것은 아니다.

1H-NMR은 Bruker의 AVANCE 400(400 MHz로 표기)으로 측정하였다. 중용매(heavy solvent)를 사용했을 때는 용매 피크를 기준으로 하였다. 화학 시프트 (chemical shift)는 δ(ppm)로, 결합정수는 J(Hz)로 나타내었다. 반응검출용(이하 TLC)으로서는 E. Merck사제 DC-Platten Kiesegel 60 F254(Art 1, 05715)를 사용하였다. 고속액체 크로마토그래피(HPLC)의 칼럼은 나칼라이 테스크사의 COSMOSIL PACKED ODS COLUMN(φ4.6×150 mm), 쇼와 덴코사제의 Shodex C18-5B를 사용하였다. 분광형광광도계는 JASCO사제의 FP-210 Spectrofluorometer를 사용하였다.

참고예 1 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-1의 합성

조정제(粗精製)의 SGP(시알릴 글리코펩티드)(238.3 ㎎, 80.6 μmol)와 아지드화나트륨(sodium azide)(4.77 ㎎, 80.8 μmol)을 트리스-염산·염화칼슘 완충용액(TRIZUMA BASE 0.05 mol/l, 염화칼슘 0.01 mol/l, pH=7.5) 7.15 ㎖에 용해시켰다. 거기에 액티나아제-E(Actinase-E)(53.8 ㎎)를 첨가하고, 37℃에서 반응시켰다. 165시간 후, TLC로 반응종료 확인 후, 여과하고, 여액을 동결건조하였다. 동결건조 후, 잔류물을 겔여과 칼럼크로마토그래피(sephadex G-25 φ2.5 ㎝×100 ㎝)로 정제하여, 목적물인 아스파라긴 디시알로운데카당 1(수량 100.5 ㎎, 수율 53%)을 얻었다.

실시예 1 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-데칸산 아미드 3의 합성

데칸산(22 ㎎, 127.6 μmol)을 디메틸포름아미드 1 ㎖에 용해하고, 거기에 디시클로헥실 카르보디이미드(23.9 ㎎, 115.8 μmol)와 N-히드록시숙신이미드(13.4 ㎎, 116.4 μmol)를 첨가하여, 실온에서 반응시켰다. 6시간 후, 여과하고, 여액을 농축하여 잔류물(데칸산 숙신이미드체)을 꺼냈다. 다음으로 아스파라긴 디시알로운데카당 1(10.0 ㎎, 4.27 μmol)을 물 0.8 ㎖에 용해하고, 거기에 탄산수소나트륨(1.4 ㎎, 16.7 μmol)을 첨가하였다. 거기에 아세톤 1.2 ㎖에 용해한 데칸산 숙신이미드체(3.2 ㎎, 11.8 μmol)를 첨가하고 실온에서 교반하였다. 180분 후 TLC로 원료소실을 확인하고 용액을 동결건조하였다. 동결건조 후, 잔류물을 겔여과 칼럼크로마토그래피(sephadex G-25, φ1.0 ㎝×20 ㎝)로 정제하고, 동결건조하였다. 동 결건조 후, 고속액체 크로마토그래피(ODS 칼럼 φ 4.6×150 mm 전개용매(eluent)는 그라디언트(gradient) 60분에서 물 100%→아세토니트릴 100% 유속 1.0 ㎖/min)로 정제하여, 목적물인 데칸산-아스파라긴 디시알로운데카당 3(수량 7.7 ㎎, 수율 72%)을 얻었다.

실시예 2 디시알로운데카 아스파라긴-미리스트산 아미드 4의 합성

미리스트산(22.0 ㎎, 96.3 μmol)을 디메틸포름아미드 1 ㎖에 용해하고, 거기에 디시클로헥실 카르보디이미드(18.2 ㎎, 88.2 μmol)와 N-히드록시벤조트리아졸(11.9 ㎎, 96.7 μmol)을 첨가하여, 실온에서 반응시켰다. 6시간 후, 여과하고, 여액을 농축하여 잔류물(미리스트산 벤조트리아졸체)을 꺼냈다. 다음으로 아스파라긴 디시알로운데카당 1(6 ㎎, 2.57 μmol)을 물 0.8 ㎖에 용해하고, 거기에 탄산수소나트륨(0.86 ㎎, 10.3 μmol)을 첨가하였다. 거기에 아세톤 1.2 ㎖에 용해한 미리스트산 벤조트리아졸체(2.8 ㎎, 7.70 μmol)를 첨가하고 실온에서 교반하였다. 180분 후 TLC로 원료소실을 확인하고 용액을 동결건조하였다. 동결건조 후, 잔류물을 겔여과 칼럼크로마토그래피(sephadex G-25 φ1.0 ㎝×20 ㎝)로 정제하고, 동결건조하였다. 동결건조 후, 고속액체 크로마토그래피(ODS 칼럼 φ4.6×150 mm 전개용매는 그라디언트 60분에서 물 100%→아세토니트릴 100% 유속 1.0 ㎖/min)로 정제하여, 목적물인 미리스트산-아스파라긴 디시알로운데카당 4(수량 5.3 ㎎, 수율 81%)를 얻었다.

실시예 3 디시알로운데카 아스파라긴-스테아르산 아미드 5의 합성

스테아르산(22.0 ㎎, 77.3 μmol)을 디메틸포름아미드 1 ㎖에 용해하고, 거기에 디시클로헥실 카르보디이미드(14.4 ㎎, 69.8 μmol)와 N-히드록시벤조트리아졸(9.5 ㎎, 77.2 μmol)을 첨가하여, 실온에서 반응시켰다. 6시간 후, 여과하고, 여액을 농축하여 잔류물(스테아르산 벤조트리아졸체)을 꺼냈다. 다음으로 아스파라긴 디시알로운데카당 1(8.0 ㎎, 3.36 μmol)을 물 1.2 ㎖에 용해하고, 거기에 탄산수소나트륨(3.2 ㎎, 38.1 μmol)을 첨가하였다. 거기에 아세톤 1.8 ㎖에 용해한 스테아르산 벤조트리아졸체(8.8 ㎎, 20.2 μmol)를 첨가하고 37℃에서 교반하였다. 195분 후 TLC로 반응종료를 확인하고 용액을 동결건조하였다. 동결건조 후, 잔류물을 겔여과 칼럼크로마토그래피(sephadex G-25 φ1.0 ㎝×20 ㎝)로 정제하고, 동결건조하였다. 동결건조 후, 고속액체 크로마토그래피(ODS 칼럼 φ4.6×150 mm 전개용매는 그라디언트 60분에서 물 100%→아세토니트릴 100% 유속 1.0 ㎖/min)로 정제하여, 목적물인 스테아르산-아스파라긴 디시알로운데카당 5(수량 6.2 ㎎, 수율 69%)를 얻었다.

실시예 4 디시알로운데카 아스파라긴-베헨산 아미드 6의 합성

베헨산(20.0 ㎎, 58.7 μmol)을 디메틸포름아미드 3 ㎖에 용해하고, 거기에 디시클로헥실 카르보디이미드(10.3 ㎎, 50.0 μmol)와 N-히드록시벤조트리아졸(6.8 ㎎, 50.3 μmol)을 첨가하여, 실온에서 반응시켰다. 19시간 후, 여과하고, 여액을 농축하여 잔류물(베헨산 벤조트리아졸체)을 꺼냈다. 다음으로 아스파라긴 디시알로운데카당 1(5 ㎎, 2.1 μmol)을 물 1.2 ㎖에 용해하고, 거기에 탄산수소나트륨(2.0 ㎎, 21.0 μmol)을 첨가하였다. 거기에 아세톤 1.8 ㎖에 용해한 베헨산 벤조트리아졸체(8.8 ㎎, 18.9 μmol)를 첨가하고 37℃에서 교반하였다. 20시간 후 TLC로 반응종료를 확인하고 용액을 동결건조하였다. 동결건조 후, 잔류물을 겔여과 칼럼크로마토그래피(sephadex G-25 φ1.0 ㎝×20 ㎝)로 정제하고, 동결건조하였다. 동결건조 후, 고속액체 크로마토그래피(ODS 칼럼 φ4.6×150 mm 전개용매는 그라디언트 60분에서 물 100%→아세토니트릴 100% 유속 1.0 ㎖/min)로 정제하여, 목적물인 베헨산-아스파라긴 디시알로운데카당 6(수량 3.24 ㎎, 수율 57%)을 얻었다.

상기 실시예 1~4의 각 디시알로운데카 아스파라긴-지방산 아미드의 화학식을 도 2에 나타낸다.

시험예 1

인플루엔자 바이러스 감염 저해제의 시알리다아제 저해활성의 측정

(1) 형광표지한 N-아세틸 락토사민 유도체의 시알릴화

디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드가 수용액 중에서 실제로 미셀화되는지의 여부를 조사하였다. 이를 위해, 형광표지한 시알릴 당사슬에 대한 시알리다아제 저해활성을 측정하여, IC₅₀을 구하였다. 만일, 형광 표지한 시알릴 당사슬 7에 대해 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴 1 및 합성한 4개의 당지질 유도체를 각각 공존시켜 시알리다아제 저해활성을 측정하여, 탄소사슬의 길이에 의존하여 저해활성이 증가하면 그것은 미셀화의 효과라고 생각할 수 있다. 먼저, 형광 표지한 시알릴 당사슬을 합성하였다. 형광 표지에는 Dansyl기를 사용하였다. N-아세틸 락토사민 유도체를 Dansyl 표지한 6-[(N-Dansyl)amino]-hexyl-O-β-D-galactopylanosyl-(1→4)-2-acetoamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside(이후 Dansyl-LacNAc로 표기한다)를 합성하고, 거기에 α(2,6)시알릴 트랜스페라아제를 사용하여 갈락토오스에 시알산을 전이시켜 Dansyl 표지한 시알릴 당사슬(이후 NeuAc-LacNAc-Dansyl로 표기한다)을 합성하였다.

Dansyl-LacNAc, CMP-시알산, α(2,6)시알릴 트랜스페라아제, 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase), 소혈청 알부민을 카코딜산(cacodylic acid) 완충용액(pH 6.0, 50 mM)에 용해하고 37℃에서 65시간 반응시켜, 고속액체 크로마토그래피로 정제하여, NeuAc-LacNAc-Dansyl 7을 69%의 수율로 얻을 수 있었다. 화합물 7의 ¹HNMR을 측정한 바, 시알산에 특유의 피크인 3번 위치의 에콰토리알(equatorial), 악시알(axial)의 프로톤 피크가 2.74 ppm, 1.80 ppm에서 확인할 수 있었다. 또한, 원료인 Dansyl-LacNAc의 ¹HNMR과 비교한 바, 7의 갈락토오스의 1번 위치의 프로톤 피크가 원료의 피크에 비해 고자장(higher magnetic field)으로 시프트되어 있었기 때문에 갈락토오스 6번 위치에 시알산이 결합되어 있는 것을 알 수 있었다. 이와 같이 하여 화합물 7을 동정하였다. 상기 반응을 도 3에 나타낸다.

(2) 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드의 시알리다아제 저해활성 측정

NeuAc-LacNAc-Dansyl을 시알리다아제에 의해 가수분해시키는 실험에, 합성한 당지질 유도체 3, 4, 5, 6 및 시알릴 락토오스, 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴 1을 저해제로서 첨가하고, 각각에 대해 IC₅₀을 구하였다. 반응조건은 이하와 같다. 100 μM의 NeuAc-LacNAc-Dansyl에 각각의 저해제를 10 μM, 100 μM, 300 μM의 3가지 조건으로 첨가하고(용매는 소혈청 알부민을 용해한 HEPES 완충용액), 거기에 시알리다아제를 첨가하여 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 그리고 형광 표지한 NeuAc-LacNAc-Dansyl의 분해율을 고속액체 크로마토그래피에 의해 정량하고, 그 결과로부터 IC₅₀을 산출하였다. 그리고 그 결과를 기질(substrate)별로 그래프에 정리하였다. 이들 그래프의 세로축은 효소반응을 50% 저해하기 위해 필요한 저해제의 농도(IC₅₀)이다. 도 4의 그래프는 계내(系內)의 시알산량에 대해 IC₅₀을 구한 것이다. 아스파라긴 디시알로운데카당은 분자 내에 2개 시알산을 포함하고 있기 때문에 시알산의 양에 대해 IC₅₀을 구하는 실측값을 2배로 하였다. 도 4와 같이 된다.

인히비터(inhibitor) 자체의 몰농도에 대해 실측한 IC₅₀을 구하면 시알릴 락토오스 이외의 인히비터의 IC₅₀은, 도 4의 값의 절반이 된다(도 5). 도 4의 그래프로부터, 가장 탄소사슬이 짧은 데칸산이 소수기로서 아스파라긴 디시알로운데카당 1에 결합하는 것 만으로 IC₅₀의 값이, 소수기가 결합되어 있지 않은 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴 1의 값의 4분의 3이 되는 것을 알 수 있었다. 이것은 친수기인 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴에 소수기인 카르복실산이 결합함으로써 그 화합물이 미셀화되어, 1개의 분자 내에 많은 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴을 포함하기 때문에, 시알리다아제에 의해 일어나는 빈도가 상승하여, NeuAc-LacNAc-Dansyl의 시알산 제거가 저해되는 힘이 높아지기 때문인 것으로 생각된다. 또한 소수기의 탄소사슬이 길어질수록(데칸산→미리스트산→스테아르산→베헨산) IC₅₀의 값이 계통적으로 작아지는 것이 판명되었다. 이것은 소수기의 탄소사슬이 길어질수록 미셀체의 표면적이 상승하여, 그 분자 표면 내에 포함되는 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴의 수가 상승하기 때문에 NeuAc-LacNAc-Dansyl의 시알산의 가수분해를 저해하는 능력이 높아진 것으로 생각된다. 또한, 도 5로부터, 분자 내의 시알릴 락토계가 1개 늘어나는 것만으로, 시알리다아제에 대한 저해활성이 높아지고, 더욱이 탄소사슬이 길수록 그 효과가 보다 강해지는 것을 알 수 잇었다.

(3) 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드의 인플루엔자 바이러스 재해활성 측정

실시예 1~4의 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드(도 2의 유도체 3, 4, 5, 6)를 저해제로서 첨가하고, 각각에 대해서 인플루엔자 바이러스(헤마글루티닌) 저해활성을 구하였다. 반응조건은 이하와 같다.

사용한 인플루엔자 바이러스는 A/뉴칼레도니아(New Caledonia)/20/99(H1N1) 를 사용하였다.

닭 수정란에 접종하고, 장뇨막액(chorioallantoic fluid)을 채취하여 초원심정제, 포르말린 불활성화한 것을 정제 바이러스 항원으로서 사용하였다. 이것을 에테르처리하여 HA(헤마글루티닌) 분획을 모은 것을 HA split 분획으로 하였다.

1) 상기 도 2의 유도체 3, 4, 5, 6의 각 2 ㎎을 PBS 1 ㎖에 용해하였다.

2) 샘플을 원액, 2배, 4배, 8배로 PBS로 희석하였다.

3) 96웰 U 플레이트(산코 쥰야쿠)에 샘플 각 10 ㎕와 바이러스 희석액 40 ㎕를 혼화(混和)하였다.

4) 4℃에서 60분간 정치(靜置)하였다.

5) mixture에 50 ㎕ PBS를 첨가하여 50 ㎕의 2배 계단희석을 제조한다.

6) 닭 적혈구(닛폰 바이오테스트 연구소)를 0.5%가 되도록 조정한다.

7) 각 웰에 혈구 부유액 50 ㎕를 첨가하여 혼화하고 4℃에서 60분간 정치하였다.

8) 인플루엔자 바이러스(헤마글루티닌) 저해활성을 측정한 결과, 유도체 3: 190.0 μmol, 유도체 4: 95.0 μmol, 유도체 5: 47.5 μmol, 유도체 6: 37.5 μmol로 저해활성을 나타내었다.

본 발명의 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드 및 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴은, 특히 우수한 바이러스 감염 및/또는 증식 저해작용을 가져, 예를 들면 인플루엔자 바이러스 감염증 등의 바이러스 질환의 예방제 및/또 는 치료제로서 우수한 효과를 나타낸다.

Claims

디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드.
제1항에 있어서, 지방산이 탄소수 8~24의 지방산인 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드.
제2항에 있어서, 지방산이 탄소수 10~22의 지방산인 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드.
제3항에 있어서, 지방산이 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라킨산, 베헨산 및 올레산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종류 이상인 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드 및 제제용 첨가물로 되는 조성물.
제5항에 있어서, 제제용 첨가물이 유당, 글리세린, 포도당, 수크로오스 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종류 이상의 첨가물인 조성물.
디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드를 포함하는 의약.
디시알로운데카 당사슬 아스파라긴-지방산 아미드 및 디시알로운데카 당사슬 아스파라긴으로부터 선택되는 1종류 이상 및 제제용 첨가물로 되는 의약.
제7항 또는 제8항에 있어서, 바이러스 질환의 예방제 및/또는 치료제인 의약.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염증의 예방제 및/또는 치료제인 의약.