CN111494380B

CN111494380B - Db-1在制备防治nlrp3炎症小体相关疾病的药物中的应用及其药物组合物

Info

Publication number: CN111494380B
Application number: CN202010483840.3A
Authority: CN
Inventors: 徐莉莉; 狄斌; 尤淞涛; 代祯; 杨帆; 陈小意
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-06-01
Filing date: 2020-06-01
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2040-06-01
Also published as: CN111494380A

Abstract

本发明公开了DB‑1在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用及其药物组合物。式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物能直接与NLRP3蛋白的NACHT域的ATP结合位点结合，从而有效地抑制NLRP3炎症小体活化，抑制促炎性细胞因子IL‑1β的成熟和分泌，对于NLRP3炎症小体相关疾病具有良好的防治作用，尤其是对于溃疡性结肠炎(UC)，具有显著的防治效果。

Description

DB-1在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用及其药物组合物

技术领域

本发明属于医药范畴，特别是涉及—种化合物DB-1在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。

背景技术

炎症小体是宿主固有免疫系统的重要组成部分。NLRP3炎症小体是目前研究最为透彻的炎症小体，由三部分组成：Nod样受体家族含热蛋白结构域蛋白3 (NLRP3)、ASC和pro-caspase-1。NLRP3炎症小体是一种模式识别受体(PRR)，能被多种危险相关分子模式(DAMP)和病原体相关分子模式(PAMP)激活，包括晶体和颗粒物质(例如尿酸晶体，硅石，石棉和明矾)、细胞外ATP、成孔毒素以及病毒、细菌、真菌和原生动物病原体等。在细胞应对外界危险信号时， NLRP3能活化caspase-1，通过调节IL-1β和IL-18等促炎性细胞因子的成熟与释放，参与先天性免疫防御。但是，NLRP3炎症小体的过度激活，会导致多种疾病的发生，例如Ⅰ型Stargardt疾病、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、心房纤颤、骨关节炎和癌症等。迄今为止，NLRP3相关疾病的临床治疗主要以IL-1β为靶点，治疗药物以IL-1β抗体或重组IL-1β受体拮抗剂(如canakinumab和anakinra)为主。此类间接抑制剂的主要缺点之一是尚未完全阐明其确切靶标，因此存在脱靶效应引起的潜在风险。与阻断细胞因子相比，对NLRP3的直接抑制是一种特异性高、成本低且有效的抗炎途径。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供如式(I)所示的化合物 (DB-1)或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用，式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物能直接与NLRP3蛋白的NACHT域的ATP结合位点结合，从而有效地抑制NLRP3 炎症小体活化，在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。为研究针对NLRP3介导的疾病的预防和治疗作用的具有重要意义。

本发明还提供一种防治NLRP3炎症小体相关疾病的的药物组合物。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的如式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。

其中，所述式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物能直接与NLRP3蛋白的NACHT域的ATP结合位点结合，从而有效地抑制NLRP3炎症小体活化，在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。

其中，所述NLRP3炎症小体相关疾病为家族性寒冷性自身炎性综合征、穆- 韦氏综合征、婴儿慢性神经皮肤关节综合征、急慢性肾脏病、非免疫介导的间质性肾损伤、非酒精性脂肪肝、急性肺损伤、痛风、关节炎、Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、乳糜泻、牛皮癣、缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、阿尔兹海默病、肌萎缩侧索硬化症、老年性黄斑变性、炎症性肠病、败血症。

作为优选，所述NLRP3炎症小体相关疾病为结肠炎。

进一步地，所述结肠炎为溃疡性结肠炎(UC)。

更进一步地，所述溃疡性结肠炎为急性溃疡性结肠炎。

其中，所述式(I)化合物其药学上可接受的盐为金属离子或药学上可接受的胺、铵离子或胆碱形成的盐。

本发明所述防治NLRP3炎症小体相关疾病的的药物组合物，其特征在于，其中含有治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为活性成份和药学上可接受的辅料。

其中，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂、乳液、溶液、悬浮液或酊剂。

在其中一些实施例中，所述药物的剂型为口服溶液；和/或，所述药物的给药方式为口服；和/或，所述药物用于哺乳动物或人。

作为优选，所述辅料包括赋形剂、填料、增容剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收加速剂、吸附剂、稀释剂、增溶剂、乳化剂、润滑剂、润湿剂、悬浮剂、矫味剂或香料。具体地，所述辅料可选自以下组分中的至少一种。

在本发明的药物组合物中可任意混合的辅料根据剂型、给药形式等可以改变。辅料包括赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂和甜味剂等。所述药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜或静脉等。所述药物组合物可以是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂等制剂学上常规的制剂形式。

(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；

(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；

(c)保湿剂，例如，甘油；

(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；

(e)缓溶剂，例如，石蜡；

(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；

(g)润湿剂，例如，鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯；

(h)吸附剂，例如，高岭土；

(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

除了活性成分外，液体剂型可包含惰性稀释剂，如水或其它溶剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。可包含适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂，例如水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明的DB-1的结构式为

其分子式为C₂₆H₂₆N₂O₈S₃，分子量为590.7。

DB-1的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：称量7-硝基四氢喹啉(II,48g,0.27mol)于反应瓶，向其中依次加入二氯甲烷100mL，三乙胺(74.8mL,0.54mol)，冰浴下搅拌15min，逐滴滴入甲磺酰氯(21mL,0.27mol)，搅拌1h后，恢复室温反应至TLC监测至原料完全消失。依次用稀盐酸、饱和食盐水洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂。加甲醇1g/1mL打浆1h，过滤得白色固体62.9g，即为1-(甲基磺酰基)-7-硝基 -1,2,3,4-四氢喹啉(III)，收率91.2％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.56(d,J＝2.1 Hz,1H),7.89(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),7.31(d,J＝8.2Hz,1H),3.87-3.84(m,2H),3.03(s, 3H),2.97(t,J＝6.6Hz,2H),2.17-2.00(m,2H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ149.34, 140.33,138.77,133.03,121.23,119.81,48.84,41.79,30.12,24.34.HRMS(ESI) calcd for C₁₀H₁₂N₂NaO₄S[M+Na]⁺279.0410,found 279.0306.HPLC(10％-100％ methanol in water),t_R＝18.00min,>99.99％。

步骤b：称量化合物Ⅲ(19g,74.2mmol)于反应瓶，向其中加入二氯甲烷60 mL，10％钯碳(10％Pd on carbon)1.9g，氢气氛围下，室温反应48h，TLC监测原料消失。硅藻土过滤，减压除去溶剂，用甲醇(30mL)打浆，过滤得到白色固体14g，即为1-(甲基磺酰基)-1,2,3,4-四氢喹啉-7-胺(IV)，收率83.3％。¹H NMR (300MHz,CDCl₃)δ7.11(d,J＝2.0Hz,1H),6.90(d,J＝8.1Hz,1H),6.45(dd,J＝8.1, 2.1Hz,1H),3.83-3.75(m,2H),3.63(s,2H),2.89(s,3H),2.74(t,J＝6.6Hz,2H), 2.01-1.87(m,2H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ145.29,137.48,130.39,118.65, 111.98,108.82,746.64,38.35,26.34,22.29.HRMS(ESI)calcd forC₁₀H₁₅N₂O₂S [M+H]⁺227.0849,found 227.0878.HPLC(10％-100％methanol in water),t_R＝9.43 min,>97.60％。

步骤c：称量化合物IV(200mg,0.885mmol)于反应瓶，依次向其中加入5mL 二氯甲烷和三乙胺(368μL,2.66mmol)，称取对乙酰基苯磺酰氯(387mg,1.77 mmol)溶于5mL二氯甲烷中，并将乙酰基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液逐滴加入反应瓶中，室温搅拌过夜。反应停止后，将混合物用二氯甲烷稀释至溶解完全，并依次用稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，用甲醇(1mL)打浆，过滤得到白色固体301mg，即为4- 乙酰基-N-((4-乙酰基苯基)磺酰基)-N-(1-(甲基磺酰基)-1,2,3,4-四氢喹啉 -7-基)苯磺酰胺(DB-1)，收率57.5％。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.21(d, J＝8.5Hz,4H),7.99(d,J＝8.5Hz,4H),7.31-7.26(m,2H),6.78(dd,J＝8.1,2.0Hz, 1H),3.72-3.69(m,2H),2.96(s,3H),2.85(t,J＝6.4Hz,2H),2.68(s,6H),1.94-1.90 (m,2H).¹³C NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ197.69,142.22,141.56,137.98,132.56, 131.43,131.26,129.71,128.83,126.70,124.55,46.20,38.45,27.58,26.98,21.42.IR (cm^-1,KBr film):1694.16,1602.56,1572.66,1492.15,1384.16,1340.77,1172.99, 854.31.HRMS(ESI)calcd.forC₂₆H₃₀N₃O₈S₃[M+NH₄]⁺608.1190,found 608.1229. HPLC(60％acetonitrile in water),t_R＝8.08min,99.09％。

本发明人在研究中发现，DB-1可以直接与NLRP3蛋白中NACHT域的 ATPase位点结合，有效地抑制NLRP3炎症小体活化，抑制促炎性细胞因子IL-1β的成熟和分泌，对于NLRP3炎症小体相关疾病具有良好的防治作用，尤其是对于溃疡性结肠炎(UC)，具有显著的防治效果。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次提供了化合物DB-1在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用，化合物DB-1对于NLRP3炎症小体相关疾病具有良好的防治作用，尤其是对于溃疡性结肠炎(UC)，具有显著的防治效果。

本发明的DB-1能抑制NLRP3炎症小体活化相关的促炎因子释放，其中对NLRP3炎症小体的启动过程具有轻微抑制作用，对NLRP3炎症小体激活过程的抑制作用是主要的。此外，本发明的DB-1对NLRP3炎症小体的抑制作用不是通过抑制钾离子外流或抑制ROS产生而实现的，而是直接与NLRP3 NACHT域结合，抑制其ATPase活性，从而通过抑制NLRP3的自身寡聚化来抑制NLRP3炎症小体的激活。这种与NLRP3结合的直接抑制剂能避免脱靶效应引起的潜在风险。

本发明的DB-1是NLRP3炎症小体激活的特异性抑制剂，其并不能抑制 NLRC4和AIM2(黑素瘤缺乏因子2)炎症小体活化相关的促炎因子释放，说明本发明的DB-1对于NLRP3炎症小体具有选择性和特异性。

附图说明

图1为DB-1对NLRP3炎症小体活化相关促炎因子释放的抑制图；

图2为DB-1对NLRP3炎症小体上游信号传导的抑制图；

图3为DB-1靶向作用于NLRP3的NACHT结构域并抑制ATPase活性图；

图4为DB-1对NLRP3、NLRC4和AIM2炎症小体的抑制以及对K⁺外流或 ROS的抑制图；

图5为DB-1在体内对NLRP3炎症小体的抑制图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明不受到这些实施例的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。如无特殊说明，均为常规实验方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实验材料：佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)(ab120297，Abcam)、 LPS(Sigma-Aldrich)、ATP(A3377，Sigma-Aldrich)、鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白(Invivogen)、聚脱氧腺苷基-脱氧胸苷酸钠盐(P0883，Sigma-Aldrich)、脂质体2000(Invitrogen)、Mitotracker Red(Beyotime)、MitoSOX(M36008， Invitrogen)。

各实施例中所涉及到的具体实验方法如下：

细胞培养：人源THP-1细胞获自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，上海细胞库。将人源THP-1细胞在含10％胎牛血清(FBS，Gibco，纽约州格兰德岛)的RPMI 1640培养基(Gibco，纽约州格兰德岛)(1％青霉素/链霉素)中，于37℃、5％CO₂培养箱内培养。用100ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸酯 -13-乙酸酯(PMA)将THP-1细胞分化为巨噬细胞，持续12h。

炎症小体的刺激：将人源THP-1细胞以5×10⁵/mL的浓度接种在48孔板中，并用100ng/mL的PMA分化过夜。第二天早晨除去培养基，并用新鲜配制的含有DMSO(1:200)和DB-1的1640培养基替换24h，再用LPS(100ng/mL)处理细胞3h，然后将NLRP3激活剂ATP(5mM)或尼日利亚菌素(10μM)加入培养物中，继续培养1h。为了诱导AIM2/NLRC4炎症小体活化，用LPS(100 ng/mL)处理分化的细胞，3h后，移除培养基，并用含DB-1的无血清培养基替换24h，然后用脂质体2000转染的聚脱氧腺苷基-脱氧胸苷酸钠盐(Poly dA： dT)(1μg/mL)刺激细胞4h或鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白(100ng/mL)刺激细胞2h。

酶联免疫吸附测定(ELISA)：根据制造商的说明书，分析了来自THP-1细胞培养物的上清液或血清中的人源IL-1β(Boster，武汉，中国)、裂解的caspase-1 (ab219633，Abcam)、TNF-α(Boster，武汉，中国)和小鼠IL-1β(Boster，武汉，中国)。

蛋白质印迹(Western blotting)：将细胞以2000rpm离心并在80.0μL裂解液(P0013，Beyotime)中冰浴裂解1h，裂解液含有20.0mM Tris(pH7.5)、150.0 mM NaCl、1％Triton X-100、焦磷酸钠、β-甘油磷酸酯、EDTA、Na₃VO₄、亮肽素和1％PMSF。将细胞在4℃下以12000rpm离心20min，得到上清液。通过使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(23227,Thermo)在562nm下进行的BCA测定法来确定蛋白质浓度。蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶分离，并通过湿转移系统转移到PVDF膜(Immobilon-PSQ膜，Merck Millipore)上。在室温下，将转好的PVDF膜在含1％牛血清白蛋白(BSA)的0.5％TBS-T中孵育2h。然后将膜与一抗在室温下孵育2h，并在4℃下过夜。之后，将膜用辣根过氧化物酶 (HRP)偶联的二抗在TBS-T中处理1.5h。将膜与ECL Western Blotting检测试剂(P90719，Millipore)孵育，并用ChemiDoc ImagingSystems(Chemidoc XRS +，Bio-Rad)观察。研究中使用的一抗是IL-1β抗体(1：1000，3A6，Cell Signaling Technology)、pro-caspase-1抗体(1：1000，D7F10，Cell SignalingTechnology)、 NLRP3抗体(1：500，D4D8T，Cell Signaling Technology)、ASC抗体(1：1000，E1E31，Cell Signaling Technology)、β-肌动蛋白抗体(1：1000，MKA005B，MyBioScience)；使用的HRP二级抗体是抗兔IgG(1：2000，A0208，Beyotime) 和抗小鼠IgG(1：2000，A0216，Beyotime)。

实时定量PCR(qRT-PCR)：通过qRT-PCR分析基因表达。使用TRIzol (155960-26)提取总RNA，并使用PrimeScript RT Master Mix(RR036A，Takara) 逆转录为cDNA。以GAPDH为内参，使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Q111-02，Vazyme)和

96Real-Time PCR System(Roche)对cDNA 进行实时定量PCR(qRT-PCR)。该基因的引物序列如下：

NLRP3-F 5’-AACATTCGGAGATTGTGGTTGGG-3’；

NLRP3-R 5’-GTGCGTGAGATTCTGATTAGTGCTG-3’；

Caspase 1-F 5’-TTACAGACAAGGGTGCTGAACAA-3’；

Caspase 1-R 5’-TGAGGAGCTGGAAAGGAAGAAAG-3’；

IL-1β-F 5’-AGGCTGCTCTGGGATTC-3’；

IL-1β-R 5’-GCCACAACAACTGACGC-3’；

GAPDH-F 5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3’；

GAPDH-R 5’-AGATGATGACCCTTTTGGCTC-3’。

免疫共沉淀：用DB-1、LPS和ATP处理后，收集PMA分化的THP-Ms细胞(1×10⁷/mL)，并用含有蛋白酶抑制剂的IP裂解缓冲液裂解。将1.0μg IgG和 20μL A/G-beads加入细胞裂解液上清液中，并在平板振荡器上于4℃孵育1h。将混合物在4℃下2000g离心5min，得到上清液。将ASC抗体(1：100， ab151700，Abcam)添加到裂解液上清液中(使用于相同量的IgG当作沉淀的阴性对照)，在4℃下孵育过夜。将20μL A/G-beads加入细胞裂解物上清液中，并在4℃下孵育2h。通过在4℃下以1000g离心5min获得免疫沉淀的复合物，然后进行蛋白质印迹分析。

细胞内K⁺浓度的测定：为了测量细胞内K⁺浓度，将人源THP-1细胞以 2×10⁵/mL的浓度接种在12孔板中，并用100ng/mL的PMA分化过夜。第二天，除去培养基，并用新鲜配制的含有DMSO(1:200)和DB-1(15,30,45μM)的培养基替换24h，然后，用100ng/mL LPS刺激细胞3h，用ATP(5mM)诱导 1h。将培养基完全除去，用无钾缓冲液(含139mM NaCl、1.7mM NaH₂PO₄和 10mM Na₂HPO₄，pH 7.2)洗涤细胞3次，加入65％HNO₃，将样品转移到玻璃瓶中，在80℃的温度下加热30min，并加入双蒸水至10mL。用钪作为内标，通过Thermo fisher ICAP-Q进行细胞内K⁺的检测。

NLRP3 ATPase活性测定：将人源重组蛋白NLRP3(0.875ug/孔)与指定浓度的DB-1在反应缓冲液(150mM NaCl,25mM Tris-HCl,10mM MgCl₂,1mM EDTA,pH 7.5)中孵育37min，然后加入ATP(1μM)，反应混合物在37℃下继续孵育1h。根据制造商提供的实验流程，使用Kinase-LumiTM发光激酶试剂盒(Biyotime，S0150S)通过ATP的残留量检测NLRP3水解ATP的能力。NLRP3 ATPase活性的测定结果表示为剩余ATPase活性与用载体处理的酶的百分比。

生物膜干涉技术(BLI)测定相互作用力：将NHS-生物素试剂(10mM) 以5:1的比例加入人重组NLRP3蛋白(0.5mg/mL)溶液中，在4℃下孵育2h。用透析膜(MWCO：3.5Kd)去除过量的生物素试剂。将生物素化的人重组蛋白加入到96孔板中，并固定在超级链霉亲和素生物传感器(Forte′Bio)上。将10 mM的DB-1母液用PBS缓冲液稀释至200μL的四种浓度溶液(5μM，20μM， 40μM，80μM)。将PBS缓冲液(200μL)作为每种浓度的非特异性结合物加入至96孔板。使用Octet Red96系统(Forte′Bio)进行目标化合物与人重组NLRP3 蛋白相互作用的测定，并使用Forte′Bio Octet Data Analysis软件(10.0)进行分析。

H&E染色：用4％多聚甲醛固定小鼠的结肠。然后将样品脱水，包埋在石蜡中。用苏木精或曙红对小鼠结肠的组织学切片染色，并通过光学显微镜进行观察。

免疫组织化学(IHC)研究：从多聚甲醛固定并用石蜡包埋的结肠组织中制备样品。根据试剂盒操作规程(凯基生物，中国南京)对IL-1β抗体(Cell Signaling Technology,1:100)、NLRP3抗体(Cell Signaling Technology,1:100)和ASC抗体(abcam,1:100)进行了染色。将小鼠结肠的组织学切片置于10mM柠檬酸钠缓冲液(含0.1％Tween 20)中并在100℃水浴中用微波孵育20min。用5％过氧化氢和4％酪蛋白胨封闭切片20min以减少非特异性染色。将载玻片与一抗在含5％BSA和10％山羊血清的PBS中37℃下孵育2h，然后添加生物素化的抗兔第二抗体，并在室温下孵育30min。加入链霉亲和素-HRP，并在30min后用 DAB底物观察切片。最后，使用苏木精进行复染。

激光共聚焦显微镜：将人源THP-1细胞以1×10⁵/mL的密度接种在培养皿中，并用100ng/mL的PMA分化过夜。第二天早晨，将培养基替换为含30μM DB-1 的新鲜配制培养基，继续培养24h，然后用LPS(100ng/mL)刺激3h，用ATP (5mM)诱导1h。除去培养基，细胞用Mitotracker红(50nM)染色30min 或MitoSOX(5μM)染色10min，用PBS洗涤3次细胞，在室温下用4％多聚甲醛固定30min，用PBS洗涤3次，细胞用DAPI(2μM)染色30min，用PBS 洗涤3次，最后在激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss LSM 700)下观察细胞。

分子对接：运用分子对接技术对目标DB-1与NLRP3蛋白之间的相互作用进行深入研究。使用DS3.0 Prepare Protein模块以默认方案(例如除水、加氢和修复侧链)对NLRP3蛋白结构进行了准备。NLRP3蛋白的活性位点是通过“受体腔”模式定义的。通过“准备配体”模块处理目标DB-1，以生成不同的构象并修复错误。然后使用CDOCKER对目标化合物之间进行对接，并根据 CDOCKER分数选择DB-1与NLRP3蛋白之间的最佳对接结构。

为了验证DB-1的效果，本发明的发明人首先在体外实验进行了DB-1对 NLRP3炎症小体的抑制作用的验证，并探究了DB-1抑制NLRP3炎症小体活化的机理，然后建立了急性NLRP3炎症小体相关疾病动物模型，再用DB-1进行预防和治疗，以观察其在动物水平对炎症小体的抑制作用。

实施例1

验证DB-1对NLRP3炎症小体激活的抑制作用

DB-1抑制ATP诱导的NLRP3炎症小体活化相关的促炎因子释放：先用15、 30、45μMDB-1分别处理三批经PMA诱导贴壁后的THP-1细胞(THP-Ms细胞)，再用LPS刺激，最后用ATP诱导(具体实验过程详见上述炎症小体的刺激)，用 IL-1β抗体、Caspase-1抗体、NLRP3抗体和ASC抗体进行western blot分析(具体实验过程详见上述蛋白质印迹)，用ELISA法测定THP-Ms细胞上清液中酶切的IL-1β及活性caspase-1的含量(具体实验过程详见上述酶联免疫吸附测定)，结果见图1A-1C，结果显示，在第一信号LPS和第二信号ATP的共同作用下，炎症小体活化，caspase-1和IL-1β成熟并分泌到上清液中。使用不同浓度的DB-1 进行预处理，能有效地抑制caspase-1和IL-1β的成熟和分泌，这种抑制效果是剂量依赖的。

DB-1与阳性对照CY-09抑制ATP诱导的NLRP3炎症小体活化相关的促炎因子释放的比较：先用5、10、15μM DB-1分别处理三批THP-Ms细胞，再用 LPS刺激，然后用ATP进行诱导(具体实验过程详见上述炎症小体的刺激)。最后，用ELISA法测定THP-Ms细胞上清液中的IL-1β含量(具体实验过程详见上述酶联免疫吸附测定)。结果见图1D和1E，结果显示，在5μM剂量下，DB-1 对ATP诱导的IL-1β释放的抑制明显强于CY-09；在10μM剂量下，两者抑制效果相当；在15μM剂量下，DB-1对ATP诱导的IL-1β释放的抑制稍弱于CY-09。

在LPS刺激前后使用DB-1处理THP-Ms细胞，均能抑制NLRP3炎症小体活化相关的促炎因子释放：分别在LPS刺激前后用DB-1处理，然后用ATP诱导(具体实验过程详见上述炎症小体的刺激)，最后用ELISA法测定THP-Ms细胞上清液中的IL-1β含量(具体实验过程详见上述酶联免疫吸附测定)，结果见图1E和1F，结果显示，在LPS刺激之前或之后，用DB-1处理的THP-Ms细胞中成熟IL-1β的分泌均被显著抑制。

DB-1抑制nigericin诱导的NLRP3炎症小体活化相关的促炎因子释放：先用 LPS刺激，然后用5、10、15μM DB-1分别处理三批THP-Ms细胞，再分别用 ATP或尼日利亚菌素进行诱导(具体实验过程详见上述炎症小体的刺激)。最后，用ELISA法测定THP-Ms细胞上清液中的IL-1β含量(具体实验过程详见上述酶联免疫吸附测定)，结果见图1G，结果显示，DB-1还能以浓度依赖的方式阻断尼日利亚菌素诱导的IL-1β释放。

实施例1中的所有实验结果，表明DB-1能抑制NLRP3炎症小体活化相关的促炎因子释放，从而证明其能有效抑制NLRP3炎症小体的激活。

实施例2

验证DB-1是否可以抑制NLRP3炎症小体的上游信号传导

在LPS刺激前后用DB-1处理THP-Ms细胞，比较两种方式下NLRP3和IL-1β的表达：分别在LPS刺激前后用15、30、45μM DB-1分别处理三批THP-Ms细胞，然后用ATP诱导(具体实验过程详见上述炎症小体的刺激)，最后用IL-1β抗体、caspase-1抗体、NLRP3抗体对THP-Ms细胞的细胞溶解产物进行western blot分析(具体实验过程详见上述蛋白质印迹)。结果见图2A和2B，结果显示，与LPS刺激后用DB-1处理相比，在LPS刺激之前用DB-1处理的THP-Ms细胞中NLRP3和IL-1β的表达受到轻微抑制。

DB-1对ATP诱导的NLRP3炎症小体活化相关蛋白mRNA水平的影响：先用15、30、45μMDB-1分别处理三批THP-Ms细胞，再用LPS刺激，然后用 ATP进行诱导(具体实验过程详见上述炎症小体的刺激)。利用实时定量PCR的手段，以GAPDH作为内参，检测NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA水平(具体实验过程详见上述实时定量PCR)。结果见图2C，结果显示，DB-1的处理导致IL-1βmRNA水平略有下降，但NLRP3和caspase-1mRNA水平没有显著差异。

DB-1对LPS诱导的TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的影响：先用5、10、15μM DB-1分别处理三批THP-Ms细胞，再用LPS刺激，然后用ATP进行诱导(具体实验过程详见上述炎症小体的刺激)。最后，用ELISA法测定THP-Ms细胞上清液中的TNF-α含量(具体实验过程详见上述酶联免疫吸附测定)。结果见图2D，结果显示，DB-1在指定剂量下对LPS诱导的TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的产生没有影响，然而在该剂量下，对NLRP3炎症小体的激活起显著的抑制作用(图1E和1F)。

实施例2中所有实验结果证明，DB-1对NLRP3炎症小体的启动过程具有轻微抑制作用，对NLRP3炎症小体激活过程的抑制作用是主要的。

实施例3

DB-1靶向作用于NLRP3的NACHT结构域并抑制ATPase活性

运用计算机药物辅助设计，模拟出DB-1与NLRP3 NACHT结构域的结合模式，对接位点来自在NLRP3(PDB 6NPY)的结合位点中共结晶的ADP的位置，见图3A-3B。图中氢键用绿色虚线表示，Pi-Pi堆积相互作用用李红色虚线表示，静电相互作用用黄色虚线表示。配体的碳原子和NLRP3 NACHT残基的颜色为浅绿色和灰色虚线。从图中结合模式来看，DB-1与NLRP3 NACHT结构域的活性口袋之间相互作用的关键残基为165Arg、232Ile、410Pro、506Phe、519Ile和 520His。DB-1通过氢键相互作用和Pi-Pi相互作用与NLRP3蛋白中NACHT域的这些关键氨基酸残基相互作用。

DB-1与NLRP3之间的直接相互作用及其对ATPase的抑制：运用生物膜干涉技术(BLI)，测量DB-1与NLRP3之间的直接相互作用(具体实验过程详见上述生物膜干涉技术测定相互作用力)，结果见图3C，测得的平衡解离常数(KD) 为17.2μM。用各种浓度的DB-1或等体积的PBS缓冲液对NLRP3的NACHT 域进行ATPase活性测定(具体实验过程详见上述NLRP3ATPase活性测定)，测定结果见图3D，结果显示，DB-1表现出剂量依赖性的ATPase活性抑制作用。

DB-1对NLRP3-ASC相互作用的影响：对THP-Ms细胞进行了不同浓度的 DB-1预处理，然后用LPS和ATP刺激(具体实验过程详见上述炎症小体的刺激)，对此细胞中ASC和NLRP3进行免疫共沉淀(Co-IP)(具体实验过程详见上述免疫共沉淀)和蛋白质印迹(WB)检测(具体实验过程详见上述蛋白质印迹)。结果见图3E，结果显示，DB-1在THP-Ms细胞中略微抑制ATP诱导的ASC与 NLRP3之间的相互作用，表明DB-1对NLRP3炎症小体的组装影响有限。

实施例3中所有实验结果证明，DB-1直接与NLRP3 NACHT域结合，抑制其ATPase活性，从而通过抑制NLRP3的自身寡聚化来抑制NLRP3炎症小体的激活。

实施例4

DB-1特异性地抑制NLRP3炎症小体并且不阻止K⁺外流和活性氧(ROS) 的产生

DB-1对NLRC4和AIM2(黑素瘤缺乏因子2)炎症小体的抑制作用：先用LPS刺激细胞，然后分别用鼠伤寒沙门氏菌鞭毛和转染的聚脱氧腺苷基-脱氧胸苷酸钠盐进行诱导，激活NLRC4和AIM2(黑素瘤缺乏因子2)炎症小体，再用5、10、15μM剂量的DB-1处理(具体实验过程详见上述炎症小体的刺激)，最后，用ELISA法测定THP-Ms细胞上清液中的IL-1β含量(具体实验过程详见上述酶联免疫吸附测定)。结果见图4A和图4B，结果表明，5-15μM剂量的 DB-1并不能抑制NLRC4和AIM2(黑素瘤缺乏因子2)炎症小体活化相关的促炎因子释放。而相同剂量的DB-1在THP-Ms细胞中显示出对ATP诱导的NLRP3 炎症小体活化相关促炎因子释放的显著抑制作用(图4C)。

DB-1对K⁺外排的影响：先用LPS刺激细胞，然后用ATP诱导，再用15、 30、45μM DB-1分别处理三批THP-Ms细胞(具体实验过程详见上述炎症小体的刺激)，最后，通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定细胞内的K⁺浓度(具体实验过程详见上述细胞内K⁺浓度的测定)。结果见图4D，结果表明，经LPS刺激、ATP诱导的THP-Ms细胞中确实发现了细胞内K⁺的显著减少，但是即使经过浓度为45μM的高浓度DB-1的处理，也无法阻止它的发生。

DB-1对活性氧(ROS)产生的影响：先用30μM剂量的DB-1处理THP-Ms 细胞，然后LPS刺激并用ATP诱导(具体实验过程详见上述炎症小体的刺激)，再用MitoTracker红(图4E)或MitoSOX(图4F)染色，细胞核用DAPI染色，利用激光共聚焦显微镜进行观察分析(具体实验过程详见上述激光共聚焦显微镜)。结果显示，DB-1对细胞外ATP诱导的线粒体膜电位降低和活性氧(ROS) 的产生没有影响。

实施例4中所有实验结果证明，DB-1是NLRP3炎症小体激活的特异性抑制剂，并且其抑制作用不是通过抑制钾离子外流或抑制ROS产生而实现的。

实施例5

DB-1在体内抑制NLRP3炎症小体激活并减轻小鼠模型的结肠炎严重程度

研究表明，由葡聚糖硫酸钠(DSS)引起的结肠炎是一种实验性NLRP3炎症小体依赖性的炎症疾病，因此为了探索DB-1在体内的抗炎活性，采用了DSS 诱导的急性溃疡性结肠炎的小鼠模型。

选取6-8周龄的健康雌性C57BL/6小鼠40只，来自扬州大学比较医学中心，随机分为4组，每组10只，分别为对照组、模型组、给药低剂量组和给药高剂量组。实验方案见图5F，开始1-7以及15-21天，四组均正常饮水，8-14天对照组正常饮水，其余3组均饮用2.5％DSS溶液；1-21天腹腔注射给药DB-1，按小鼠体重，低剂量组给药剂量为40mg/kg，高剂量组给药剂量为80mg/kg，每天一次。第22天摘眼球取血，全血于室温放置30min后，4℃下，4000rpm离心10min，转移上层血清于另一1.5ml离心管，用ELISA法测定血清中IL-1β的含量(具体实验过程详见上述酶联免疫吸附测定)；解剖，取出结肠部位，用生理盐水洗去浮血和肠内容物，用H&E染色制备切片(具体实验过程详见上述 H&E染色)，进行组织病理学分析；对结肠组织进行免疫组织化学分析(具体实验过程详见上述免疫组织化学研究)；对结肠组织中IL-1β和caspase-1进行 western blot分析(具体实验过程详见上述蛋白质印迹)。

组织病理学分析结果见图5A，结果表明，在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，结肠组织的病理变化主要涉及黏膜损伤、隐窝坏死和固有层炎性细胞浸润，DB-1 显著减轻了这些症状。免疫组织化学分析结果见图5B-5E，结果表明，给药组的 NLRP3、ASC和IL-1β的蛋白水平明显下调。血清中IL-1β的ELISA法测定结果见图5G，结果表明，DB-1以剂量依赖的方式抑制了IL-1β的分泌。结肠组织中IL-1β和caspase-1的western blot分析结果见图5H，结果表明，与模型组相比， DB-1对IL-1β的表达具有显著的抑制作用。

实施例5中所有实验结果证明，DB-1在体内通过抑制NLRP3炎症小体的激活有效地减轻了小鼠模型的结肠炎严重程度。

由上述实验可知，DB-1可以有效地抑制NLRP3炎症小体活化所形成的活化信号分子caspase-1和炎症细胞因子IL-1β的成熟和分泌，对于NLRP3炎症小体相关疾病具有良好的防治作用，尤其是对于溃疡性结肠炎，具有显著的防治效果。

Claims

1.如式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用，所述NLRP3炎症小体相关疾病为急性溃疡性结肠炎；

。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐能直接与NLRP3蛋白的NACHT域的ATP结合位点结合，从而有效地抑制NLRP3炎症小体活化，在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用，所述NLRP3炎症小体相关疾病为急性溃疡性结肠炎。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述式（I）化合物其药学上可接受的盐为金属离子或药学上可接受的胺、铵离子或胆碱形成的盐。