CN102603912B - 天然普鲁兰多糖纳米药物载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体，由羧甲基化普鲁兰和肼缩合反应而成，所述羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与肼的氨基的缩合反应度为60～90％。该载体载药后在水中自组装形成纳米粒子，其粒径为60nm～200nm。其制备方法的工艺步骤如下：(1)制备羧甲基化普鲁兰糖；(2)用去离子水将羧甲基化普鲁兰糖配制成浓度为0.01～0.10g/ml的溶液，用去离子水将肼配制成浓度为0.1～0.5g/ml的溶液，在搅拌下于室温、常压将羧甲基化普鲁兰糖水溶液加入到肼溶液中，搅拌均匀后，加入浓度为0.5～1g/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，在搅拌下反应2～6小时，反应时间届满后，用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到天然普鲁兰多糖纳米药物载体。
Description
技术领域
本发明属于药物载体领域，特别涉及天然普鲁兰多糖纳米药物载体及其制备方法。
背景技术
药物载体是一种药物传送系统，智能型纳米药物载体有利于实现靶向给药，征服癌症等疑难病症。肿瘤组织由于其组织的特点，可使纳米粒子药物传送系统经EPR现象被动集中于肿瘤部位，以内吞的形式摄入胞内。在胞内的初级溶酶体及次级溶酶体内，由于其内部pH值低于人体血液循环系统的pH值，这种pH的变化使纳米粒子药物传送系统所载药物与其在酸性条件下分离，从而实现肿瘤的环境敏感型被动靶向治疗。因此，纳米粒子药物载体的研究一直倍受关注。
Ludianxiang等人公开了一种具有pH敏感性的纳米药物载体[见“Journal of BiomedicalMaterials Research(part B)”,89（B）卷第一期177-183页，（2009年）]，所述纳米药物载体由羧甲基化的普鲁兰多糖和水合肼缩合反应而成，虽然具有良好的生物相容性，且对心脏毒性小，但由于羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与水合肼的氨基的缩合反应度仅为10%左右，因而载药量偏低（只有3%-4%）。
Rong Liu等人研究了一种具有pH敏感性的聚乙二醇-聚（L-组氨酸）-聚（L-丙交酯）三嵌段共聚物纳米药物传递系统[见“Journal of Controlled Release”,152卷49-56页，（2011年）]，聚（L-组氨酸）具有pH响应性，所形成的胶束最大载药量达到了14.7%。但载药纳米粒径在pH=7.4时达到803.6nm,pH=5.0时达到1140nm，粒径过大，进入体内很难通过EPR效应进入肿瘤部位。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型的天然普鲁兰多糖纳米药物载体及制备方法，所述纳米药物载体不仅能提高载药量，而且能对肝脏靶向性给药。
本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体，由羧甲基化普鲁兰多糖与肼缩合反应而成，结构式如下：
上述结构式中R为：
所述羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与肼的氨基的缩合反应度为60～90%。
从上述结构式可以看出，本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体以天然普鲁兰多糖作为主链（亲水链），在主链上连接肼，通过肼作为连接臂连接阿霉素等抗肿瘤药物，在水中自组装形成纳米粒子，其粒径为60nm～200nm。肼与阿霉素等抗肿瘤药物形成的腙键具有pH敏感性，在酸性（pH=1～6）环境中腙键将断裂，释放出药物。
本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体的载药操作（以载阿霉素为例）：
将所述普鲁兰糖纳米药物载体用去离子水配制成浓度为0.1～0.5g/ml的溶液，然后加入盐酸阿霉素，所述盐酸阿霉素的加入量以混合液中普鲁兰糖药物载体与盐酸阿霉素的质量比达到1:0.1～0.8为限；在搅拌下于常压、室温避光反应至少12小时，反应时间届满后，在乙醇中沉淀，离心收集沉淀，反复用乙醇震荡冲洗以除去未反应的盐酸阿霉素，将离心所得沉淀真空抽干，即得到载有阿霉素的纳米药物载体。
本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体的制备方法，工艺步骤如下：
（1）将异丙醇加入天然普鲁兰多糖水溶液中，再加入氢氧化钠水溶液，在常压、50～80℃下搅拌，直至形成透明溶液；所述天然普鲁兰多糖水溶液的浓度为0.1～0.5g/ml，所述异丙醇与天然普鲁兰多糖水溶液体积比为
所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.1～0.5g/ml，氢氧化钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氢氧化钠的摩尔比=1:1～1.5为限；
（2）将氯乙酸钠水溶液和异丙醇同时加入到步骤（1）所制备的混合溶液中，在搅拌下于常压、50～80℃反应2～5小时；所述氯乙酸钠水溶液的浓度为0.5～1.0g/ml，所述氯乙酸钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氯乙酸钠的摩尔比=1:0.5～0.75为限，所述异丙醇与氯乙酸钠水溶液的体积比为
（3）在步骤（2）所得到的反应液中同时加入氯乙酸钠水溶液和异丙醇，在搅拌下于常压、50～80℃反应2～5小时，所述氯乙酸钠水溶液的浓度和加入量与步骤（2）相同，所述异丙醇的加入量与步骤（2）相同；
（4）将步骤（3）形成的含反应产物的混合液用盐酸调pH值至2～5，然后用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到羧甲基化普鲁兰多糖；
（5）用去离子水将步骤（4）得到的羧甲基化普鲁兰多糖配制成浓度为0.01～0.10g/ml的溶液，用去离子水将肼配制成浓度为0.1～0.5g/ml的溶液，在搅拌下于室温、常压将羧甲基化普鲁兰多糖水溶液加入到肼的水溶液中，搅拌均匀后，加入浓度为0.5～1g/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，在搅拌下反应2～6小时，反应时间届满后，用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到天然普鲁兰多糖纳米药物载体；
所述羧甲基化普鲁兰多糖水溶液与肼的水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与肼的摩尔比达到1:10～30为限，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比达到1:1～1.2为限。
上述方法中，所述肼为水合肼、草酸二酰肼、丁二酸二酰肼、己二酸二酰肼中的一种。
本发明具有以下有益效果：
1、采用本发明所述方法制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，所述羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与肼的氨基的缩合反应度为60～90%，因而大大提高了载药量，最大载药量接近50%（见实施例4）。
2、由于本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体以天然多糖普鲁兰作为主链，该主链可以跟肝癌细胞的去唾液酸糖蛋白受体相结合，因而可实现对肝脏的靶向性给药。
3、用本发明所述方法制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，载药后形成的纳米粒子粒度均匀，分散好，不团聚，有利于提高治疗效果。
4、本发明所述方法原料易于获取，操作简单，使用的设备为常规设备，便于工业化生产。
附图说明
图1是红外谱图，其中，A为羧甲基化普鲁兰糖的红外谱图，B为本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体的红外谱图，C为本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体载药后的红外谱图。
图2是核磁谱图，其中，1为本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体的核磁谱图，2为本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体载药后的核磁谱图，3为盐酸阿霉素的核磁谱图。
图3是本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体载药后的粒径分布图。
图4是本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体载药后的透射电镜图。
图5是本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体所载阿霉素的药物释放曲线图。
图6是盐酸阿霉素与载有阿霉素的本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体的体外细胞杀伤效果图，其中，图6（1）为对人肝癌细胞杀伤效果实验结果图（培养24小时），图6（2）为对人肝癌细胞杀伤效果实验结果图（培养48小时），图6（3）为对人宫颈癌细胞杀伤效果实验结果图（培养24小时），图6（4）为对人宫颈癌细胞杀伤效果实验结果图（培养48小时），图6（5）为对正常细胞L929（小鼠成纤维细胞）杀伤效果实验结果图（培养24小时），图6（6）为对正常细胞L929（小鼠成纤维细胞）杀伤效果实验结果图（培养48小时）。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体及其制备方法作进一步说明。下述实施例中，所用原料均可从市场购买，所用化学试剂均为分析纯。
实施例1
本实施例的工艺步骤如下：
（1）将异丙醇加入天然普鲁兰多糖溶水液中，再加入氢氧化钠水溶液，在常压、50℃下搅拌，直至形成透明溶液；所述天然普鲁兰多糖水溶液用去离子水配制，浓度为0.1g/ml，所述异丙醇与天然普鲁兰多糖水溶液体积比为1:10；所述氢氧化钠水溶液用去离子水配制，浓度为0.1g/ml，氢氧化钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氢氧化钠的摩尔比=1:1为限；
（2）将氯乙酸钠水溶液和异丙醇同时加入到步骤（1）所制备的混合溶液中，在搅拌下于常压、50℃反应2小时；所述氯乙酸钠水溶液的浓度为0.5g/ml，所述氯乙酸钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氯乙酸钠的摩尔比=1:0.5为限，所述异丙醇与氯乙酸钠水溶液的体积比为1:10；
（3）在步骤（2）所得到的反应液中同时加入氯乙酸钠水溶液和异丙醇，在搅拌下于常压、50℃反应2小时，所述氯乙酸钠水溶液的浓度和加入量与步骤（2）相同，所述异丙醇的加入量与步骤（2）相同；
（4）将步骤（3）形成的含反应产物的混合液用盐酸调pH值至2，然后用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到羧甲基化普鲁兰多糖；
（5）用去离子水将步骤（4）得到的羧甲基化普鲁兰多糖配制成浓度为0.01g/ml的溶液，用去离子水将水合肼配制成浓度为0.5g/ml的溶液，在搅拌下于室温、常压将羧甲基化普鲁兰多糖水溶液加入到水合肼的水溶液中，搅拌均匀后，加入浓度为1g/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，在搅拌下反应2小时，反应时间届满后，用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到天然普鲁兰多糖纳米药物载体；所述羧甲基化普鲁兰多糖水溶液与水合肼的水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与水合肼的摩尔比达到1:30为限，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比达到1:1。
本实施例所制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体的红外谱图见图1中的B图，核磁谱图见图2中的1图。
（6）在四个容器中各放入100mg本实施例制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，然后均用去离子水配制成浓度为5mg/ml的水溶液；将10mg盐酸阿霉素、20mg盐酸阿霉素、30mg盐酸阿霉素、40mg盐酸阿霉素分别加入上述四个容器中，在搅拌下于常压、室温避光反应12小时，然后分别用乙醇沉淀，离心收集沉淀，反复冲洗，真空抽干，即得到四种载有阿霉素的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，其形貌见图4，粒径分布见图3。该四种载有阿霉素的多糖普鲁兰糖纳米药物载体中，载药量分别为13.59%、16.76%、21.20%、28.49%，最大载药量为28.49%，由加入40mg盐酸阿霉素的容器中的反应液获得。
在常压、37℃下将载药量为13.59%的天然普鲁兰多糖纳米药物载体分别放入pH=5.0的PBS缓冲液、PH=7.4的PBS缓冲液中，其释药曲线见图5，从图5可以看出，12个小时内，在pH=5.0的PBS缓冲液环境中释放总量达90%，在PH=7.4的PBS缓冲液环境中释放总量在10%以内。
实施例2
本实施例的工艺步骤如下：
（1）将异丙醇加入天然普鲁兰多糖水溶液中，再加入氢氧化钠水溶液，在常压、80℃下搅拌，直至形成透明溶液；所述天然普鲁兰多糖水溶液用去离子水配制，浓度为0.5g/ml，所述异丙醇与天然普鲁兰多糖水溶液体积比为所述氢氧化钠水溶液用去离子水配制，浓度为0.5g/ml，氢氧化钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氢氧化钠的摩尔比=1:1.5为限；
（2）将氯乙酸钠水溶液和异丙醇同时加入到步骤（1）所制备的混合溶液中，在搅拌下于常压、80℃反应5小时；所述氯乙酸钠水溶液的浓度为1.0g/ml，所述氯乙酸钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氯乙酸钠的摩尔比=1:0.75为限，所述异丙醇与氯乙酸钠水溶液的体积比为
（3）在步骤（2）所得到的反应液中同时加入氯乙酸钠水溶液和异丙醇，在搅拌下于常压、80℃反应5小时，所述氯乙酸钠水溶液的浓度和加入量与步骤（2）相同，所述异丙醇的加入量与步骤（2）相同；
（4）将步骤（3）形成的含反应产物的混合液用盐酸调pH值至5，然后用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到羧甲基化普鲁兰多糖；
（5）用去离子水将步骤（4）得到的羧甲基化普鲁兰多糖配制成浓度为0.1g/ml的溶液，用去离子水将草酸二酰肼配制成浓度为0.1g/ml的溶液，在搅拌下于室温、常压将羧甲基化普鲁兰多糖水溶液加入到草酸二酰肼水溶液中，搅拌均匀后，加入浓度为0.5g/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，在搅拌下反应4小时，反应时间届满后，用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到天然普鲁兰多糖纳米药物载体；所述羧甲基化普鲁兰多糖水溶液与草酸二酰肼水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与草酸二酰肼的摩尔比达到1:20为限，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比达到1:1.2。
本实施例所制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体的红外谱图类似于图1中的B图，核磁谱图类似于图2中的1图。
（6）在四个容器中各放入100mg本实施例制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，然后均用去离子水配制成浓度为5mg/ml的水溶液；将20mg盐酸阿霉素、30mg盐酸阿霉素、40mg盐酸阿霉素、50mg盐酸阿霉素分别加入上述四个容器中，在搅拌下于常压、室温避光反应12小时，然后分别用乙醇沉淀，离心收集沉淀，反复冲洗，真空抽干，即得到四种载有阿霉素的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，其外形类似于图4，粒径分布类似于图3。该四种载有阿霉素的天然普鲁兰多糖纳米药物载体中，载药量分别为10.58%、15.54%、27.23%、34.39%，最大载药量为34.39%，由加入50mg盐酸阿霉素的容器中的反应液获得。
在常压、37℃下将载药量为15.54%的天然普鲁兰多糖纳米药物载体分别放入pH=5.0的PBS缓冲液、PH=7.4的PBS缓冲液中，其释药曲线类似于图5，在12个小时内，在pH=5.0的PBS缓冲液环境中释放总量达90%，在PH=7.4的PBS缓冲液环境中释放总量在10%以内。
实施例3
本实施例的工艺步骤如下：
（1）将异丙醇加入天然普鲁兰多糖水溶液中，再加入氢氧化钠水溶液，在常压、60℃下搅拌，直至形成透明溶液；所述天然普鲁兰多糖水溶液用去离子水配制，浓度为0.3g/ml，所述异丙醇与天然普鲁兰多糖水溶液体积比为1:9；所述氢氧化钠水溶液用去离子水配制，浓度为0.2g/ml，氢氧化钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氢氧化钠的摩尔比=1:1.4为限；
（2）将氯乙酸钠水溶液和异丙醇同时加入到步骤（1）所制备的混合溶液中，在搅拌下于常压、60℃反应3小时；所述氯乙酸钠水溶液的浓度为0.8g/ml，所述氯乙酸钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氯乙酸钠的摩尔比=1:0.6为限，所述异丙醇与氯乙酸钠水溶液的体积比为1:9；
（3）在步骤（2）所得到的反应液中同时加入氯乙酸钠水溶液和异丙醇，在搅拌下于常压、60℃反应3小时，所述氯乙酸钠水溶液的浓度和加入量与步骤（2）相同，所述异丙醇的加入量与步骤（2）相同；
（4）将步骤（3）形成的含反应产物的混合液用盐酸调pH值至4，然后用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到羧甲基化普鲁兰多糖；
（5）用去离子水将步骤（4）得到的羧甲基化普鲁兰多糖配制成浓度为0.025g/ml的溶液，用去离子水将丁二酸二酰肼配制成浓度为0.25g/ml的溶液，在搅拌下于室温、常压将羧甲基化普鲁兰多糖水溶液加入到丁二酸二酰肼水溶液中，搅拌均匀后，加入浓度为0.8g/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，在搅拌下反应6小时，反应时间届满后，用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到天然普鲁兰多糖纳米药物载体；所述羧甲基化普鲁兰多糖水溶液与丁二酸二酰肼水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与丁二酸二酰肼的摩尔比达到1:10为限，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比达到1:1.1。
本实施例所制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体的红外谱图类似于图1中的B图，核磁谱图类似于图2中的1图。
（6）在六个容器中各放入100mg本实施例制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，然后均用去离子水配制成浓度为5mg/ml的水溶液；将10mg盐酸阿霉素、20mg盐酸阿霉素、30mg盐酸阿霉素、40mg盐酸阿霉素、50mg盐酸阿霉素、60mg盐酸阿霉素分别加入上述六个容器中，在搅拌下于常压、室温避光反应12小时，然后分别用乙醇沉淀，离心收集沉淀，反复冲洗，真空抽干，即得到六种载有阿霉素的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，其外形类似于图4，粒径分布类似于图3。该六种载有阿霉素的天然普鲁兰多糖纳米药物载体中，载药量分别为17.63%、22.93%、29.29%、33.78%、39.19%、41.76%，最大载药量为41.76%，由加入60mg盐酸阿霉素的容器中的反应液获得。
在常压、37℃下将载药量为17.63%的天然普鲁兰多糖纳米药物载体分别放入pH=5.0的PBS缓冲液、PH=7.4的PBS缓冲液中，其释药曲线类似于图5，在12个小时内，在pH=5.0的PBS缓冲液环境中释放总量达90%，在PH=7.4的PBS缓冲液环境中释放总量在10%以内。
实施例4
本实施例的工艺步骤如下：
（1）将异丙醇加入天然普鲁兰多糖水溶液中，再加入氢氧化钠水溶液，在常压、70℃下搅拌，直至形成透明溶液；所述天然普鲁兰多糖水溶液用去离子水配制，浓度为0.3g/ml，所述异丙醇与天然普鲁兰多糖水溶液体积比为1:8；所述氢氧化钠水溶液用去离子水配制，浓度为0.3g/ml，氢氧化钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氢氧化钠的摩尔比=1:1.2为限；
（2）将氯乙酸钠水溶液和异丙醇同时加入到步骤（1）所制备的混合溶液中，在搅拌下于常压、70℃反应4小时；所述氯乙酸钠水溶液的浓度为0.8g/ml，所述氯乙酸钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氯乙酸钠的摩尔比=1:0.75为限，所述异丙醇与氯乙酸钠水溶液的体积比为1:8；
（3）在步骤（2）所得到的反应液中同时加入氯乙酸钠水溶液和异丙醇，在搅拌下于常压、70℃反应4小时，所述氯乙酸钠水溶液的浓度和加入量与步骤（2）相同，所述异丙醇的加入量与步骤（2）相同；
（4）将步骤（3）形成的含反应产物的混合液用盐酸调pH值至3，然后用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到羧甲基化普鲁兰多糖；
（5）用去离子水将步骤（4）得到的羧甲基化普鲁兰多糖配制成浓度为0.075g/ml，用去离子水将己二酸二酰肼配制成浓度为0.25g/ml的溶液，在搅拌下于室温、常压将羧甲基化普鲁兰多糖水溶液加入到己二酸二酰肼水溶液中，搅拌均匀后，加入浓度为1g/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，在搅拌下反应2小时，反应时间届满后，用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到天然普鲁兰多糖纳米药物载体；所述羧甲基化普鲁兰多糖水溶液与己二酸二酰肼水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与己二酸二酰肼的摩尔比达到1:10为限，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比达到1:1.2。
本实施例所制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体的红外谱图类似于图1中的B图，核磁谱图类似于图2中的1图。
（6）在六个容器中各放入100mg本实施例制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，然后均用去离子水配制成浓度为5mg/ml的水溶液；将10mg盐酸阿霉素、20mg盐酸阿霉素、30mg盐酸阿霉素、40mg盐酸阿霉素、50mg盐酸阿霉素、60mg盐酸阿霉素分别加入上述六个容器中，在搅拌下于常压、室温避光反应12小时，然后分别用乙醇沉淀，离心收集沉淀，反复冲洗，真空抽干，即得到六种载有阿霉素的多糖普鲁兰糖纳米药物载体，其外形类似于图4，粒径分布类似于图3。该六种载有阿霉素的多糖普鲁兰糖纳米药物载体中，载药量分别为11.37%、18.77%、23.78%、29.16%、35.69%、47.67%，最大载药量为47.67%，由加入60mg盐酸阿霉素的容器中的反应液获得。
在常压、37℃下将载药量为11.37%的天然普鲁兰多糖纳米药物载体分别放入pH=5.0的PBS缓冲液、PH=7.4的PBS缓冲液中，其释药曲线类似于图5，在12个小时内，在pH=5.0的PBS缓冲液环境中释放总量达90%，在PH=7.4的PBS缓冲液环境中释放总量在10%以内。
实施例5
将人肝癌细胞（HepG2）、人宫颈癌细胞(Hela)和小鼠成纤维细胞（L929）用含有10%小牛血清的DMEM培养基分别连续培养，取对数生长期的细胞，胰酶消化后加上述培养基稀释，按每孔1×104个/ml的细胞密度接种于96孔板；
用含有10%小牛血清的DMEM培养基和盐酸阿霉素配制含盐酸阿霉素的六种培养基，所述培养基中，阿霉素含量分别为0.01mg/L、0.1mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、20mg/L、50mg/L；用含有10%小牛血清的DMEM培养基和实施例1制备的载药量为13.59%的天然多糖普鲁兰糖纳米药物载体，配制含载有阿霉素的天然普鲁兰多糖纳米药物载体的六种培养基，所述培养基中，阿霉素含量分别为0.01mg/L、0.1mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、20mg/L、50mg/L；
待接种于96孔板的细胞贴壁生长后，将上述12种培养基（用于实验组）和含有10%小牛血清的DMEM培养基（用于空白对照组）分别加入96孔板，继续培养24小时和48小时用MTT法观察体外细胞生长情况，计算细胞杀伤率：
细胞杀伤百分率=（空白组OD值-实验组OD值）×100%/空白组OD值
盐酸阿霉素和含载有阿霉素的实施例1制备的天然普鲁兰多糖纳米药物载体（简称含阿霉素载体）的体外肿瘤细胞杀伤性能的MTT分析结果见图6。
从图6（1）、图6（2）可以看出，含阿霉素载体在含不同浓度的阿霉素时对人肝癌细胞（HepG2）具有不同的杀伤能力，随着阿霉素含量的增多，依次表现出更强的杀伤力；含阿霉素载体表现出与盐酸阿霉素相当的肿瘤细胞杀伤能力。
由于阿霉素的主要作用是阻断细胞核内mRNA的合成并导致肿瘤细胞凋亡，因而以上结果说明载阿霉素载体能够有效地将阿霉素传递到细胞核内部。
从图6（3）、图6（4）、图6（5）、图6（6）可以看出，盐酸阿霉素对人宫颈癌细胞(Hela)和小鼠成纤维细胞（L929）的杀伤作用随阿霉素浓度增加而增强，其趋势与对人肝癌细胞（HepG2）的作用类似。而含阿霉素载体随所含阿霉素浓度的增加对人宫颈癌细胞(Hela)和小鼠成纤维细胞（L929）的生长没有明显的影响，直到48h时，依然没有表现出很强的杀伤作用。
上述结果表明，含阿霉素载体能够有效地聚集于人肝癌细胞（HepG2）中，与肝癌细胞膜表面的去唾液酸糖蛋白受体相结合，因而可实现对肝脏的靶向性给药。
Claims (4)
1.天然普鲁兰多糖纳米药物载体，其特征在于由羧甲基化普鲁兰多糖与肼缩合反应而成，结构式如下：
上述结构式中R为：
所述羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与肼的氨基的缩合反应度为60～90%。
2.根据权利要求1所述的天然普鲁兰多糖纳米药物载体，其特征在于该载体载药后在水中自组装形成纳米粒子，其粒径为60nm～200nm。
3.一种天然普鲁兰多糖纳米药物载体的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：
（1）将异丙醇加入天然普鲁兰多糖水溶液中，再加入氢氧化钠水溶液，在常压、50～80℃下搅拌，直至形成透明溶液；所述天然普鲁兰多糖水溶液的浓度为0.1～0.5g/ml，所述异丙醇与天然普鲁兰多糖水溶液体积比为
所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.1～0.5g/ml，氢氧化钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氢氧化钠的摩尔比=1:1～1.5为限；
（2）将氯乙酸钠水溶液和异丙醇同时加入到步骤（1）所制备的混合溶液中，在搅拌下于常压、50～80℃反应2～5小时；所述氯乙酸钠水溶液的浓度为0.5～1.0g/ml，所述氯乙酸钠水溶液的量以混合溶液中天然普鲁兰多糖的葡萄糖单元与氯乙酸钠的摩尔比=1:0.5～0.75为限，所述异丙醇与氯乙酸钠水溶液的体积比为
（3）在步骤（2）所得到的反应液中同时加入氯乙酸钠水溶液和异丙醇，在搅拌下于常压、50～80℃反应2～5小时，所述氯乙酸钠水溶液的浓度和加入量与步骤（2）相同，所述异丙醇的加入量与步骤（2）相同；
（4）将步骤（3）形成的含反应产物的混合液用盐酸调pH值至2～5，然后用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到羧甲基化普鲁兰多糖；
（5）用去离子水将步骤（4）得到的羧甲基化普鲁兰多糖配制成浓度为0.01～0.10g/ml的溶液，用去离子水将肼配制成浓度为0.1～0.5g/ml的溶液，在搅拌下于室温、常压将羧甲基化普鲁兰多糖水溶液加入到肼的水溶液中，搅拌均匀后，加入浓度为0.5～1g/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，在搅拌下反应2～6小时，反应时间届满后，用去离子水透析除去小分子杂质，冷冻干燥，即得到天然普鲁兰多糖纳米药物载体；
所述羧甲基化普鲁兰多糖水溶液与肼的水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与肼的摩尔比达到1:10～30为限，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液的量以反应液中羧甲基化普鲁兰多糖的羧基与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比达到1:1～1.2为限。
4.根据权利要求3所述天然普鲁兰多糖纳米药物载体的制备方法，其特征在于所述肼为水合肼、草酸二酰肼、丁二酸二酰肼、己二酸二酰肼中的一种。
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