CN108371713B

CN108371713B - 利用可见光诱导交联的普鲁兰多糖载药系统及其制备方法

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Publication number: CN108371713B
Application number: CN201810142521.9A
Authority: CN
Inventors: 李桦楠; 于晨浩; 张菁霓; 李发琪; 方廖琼
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2018-02-11
Filing date: 2018-02-11
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2038-02-11
Also published as: CN108371713A

Abstract

本发明提供一种利用可见光诱导交联的普鲁兰多糖载药系统的制备方法，包括如下步骤：1)制备双硒化合物；2)制备含有双硒化合物的普鲁兰载体；3)将去盐酸化阿霉素与普鲁兰载体分别溶于DMSO，混合，透析，可见光辐照，诱导交联，得到负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统。本发明的纳米载药系统将普鲁兰‑双硒化合物作为载体，实现对阿霉素的载药，并且利用可见光诱导交联，提高了纳米载药系统的稳定性，使得纳米载药系统在体内稳定安全地将药物靶向递送到病灶部位。

Description

利用可见光诱导交联的普鲁兰多糖载药系统及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物载体技术领域，特别是涉及一种利用可见光诱导交联的普鲁兰多糖载药系统及其制备方法。

背景技术

近年来，纳米载药系统在恶性肿瘤的治疗方面取得了长足的进步。目前应用于临床的紫杉醇-脂质体(力朴素)、紫杉醇-白蛋白纳米粒子(Abraxane)、阿霉素(DOX)-脂质体(凯莱)、G-CSF-聚乙二醇纳米粒子(Lonquex)以及氟尿嘧啶-聚乳酸纳米粒子(中人氟安)等纳米载药系统可在一定程度上提高药物疗效，减轻毒副作用。但是，当实施纳米载药系统治疗以后，肿瘤暂时得到抑制，之后往往再次复发和转移。

目前纳米载药系统没有很好地解决这一科学问题，其原因主要是载药系统稳定性不足：1、只有小于150nm的纳米粒子才能有效穿透肿瘤血管内皮细胞间隙，而大多数纳米载药系统即使在体外小于150nm，但因其稳定性不足，进入体内后易团聚或分散，团聚后粒径过大很快被网状内皮系统清除(大于200nm)，分散后粒径过小(小于10nm)则通过外渗作用从组织中清除，导致治疗效果不理想；2、大多数纳米载药系统均以物理方式包载药物，这一方式本身就极易造成药物泄漏，并且进入体内后浓度往往降低至临界胶束浓度以下，此时则会因其稳定性不足无法继续自组装而造成药物提前释放。

为了解决载药纳米载体的困境，许多共价修饰的药物递送系统已经被用于解决这些问题，但共价连接的给药系统合成过程复杂，规模化生产能力有限，成本较高，载药系统稳定性因非特异性药物释放、治疗活动的改变而受影响，稳定性差。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种利用可见光诱导交联的普鲁兰多糖载药系统及其制备方法，用于解决现有技术中纳米载体的合成过程复杂、无法规模化生产、成本高、稳定性不足等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种利用可见光诱导交联的普鲁兰多糖载药系统的制备方法，包括如下步骤：

1)制备双硒化合物；

2)制备含有双硒化合物的普鲁兰载体；

3)将去盐酸化阿霉素与普鲁兰载体分别溶于DMSO，混合，透析，可见光辐照，诱导交联，得到负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统。

在本发明的一些实施例中，步骤3)中，可见光的功率为10-50W。

优选地，步骤3)中，可见光的功率为25W。

在本发明的一些实施例中，步骤3)中，可见光的光照度为160-190Lux。

在本发明的一些实施例中，步骤3)中，可见光的光照度为182-184Lux。

在本发明的一些实施例中，步骤3)中，可见光的辐照时间为0.5-3h。

优选地，步骤3)中，可见光的辐照时间为0.5-3h。

在本发明的一些实施例中，步骤3)中，可见光的辐照距离为29cm。

在本发明的一些实施例中，步骤3)中，可见光辐照后，超滤得到负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统。

在本发明的一些实施例中，步骤3)中，超滤膜的孔径为0.22μm。

在本发明的一些实施例中，步骤1)中，制备双硒化合物的方法包括如下步骤：

a)将硒粉与氢氧化钠加入DMF中，得到第一反应液；

b)将水合肼加入所述第一反应液中，再加入4-溴苄醇，加热反应，得到第二反应液；

c)加水稀释所述第二反应液，再加入萃取剂萃取，收集上层液，除水，得第三反应液；

d)将所述第三反应液固液分离，对所得液体旋转蒸发，得到所述双硒化合物。

在本发明的一些实施例中，步骤a)中，硒粉与氢氧化钠的摩尔量比值≤1，优选为0.8-1，更优选为0.9-1，氢氧化钠可稍微过量。

在本发明的一些实施例中，步骤b)中，水合肼与硒粉的摩尔量比值≥0.25，优选为0.25-0.3，更优选为0.25-0.27，水合肼可稍微过量。

在本发明的一些实施例中，步骤b)中，4-溴苄醇与硒粉的摩尔量比值≥0.5，优选为0.5-0.7，更优选为0.5-0.6，4-溴苄醇可稍微过量。

在本发明的一些实施例中，步骤b)中，加入4-溴苄醇后，加热至160℃进行反应。

在本发明的一些实施例中，步骤b)中，反应时间为4h。

在本发明的一些实施例中，步骤b)中，加入4-溴苄醇后，将反应液置于油浴中加热反应。

在本发明的一些实施例中，步骤b)中，加热反应时，对蒸发的物质进行冷凝回流。

在本发明的一些实施例中，步骤c)中，所述萃取剂为乙酸乙酯。

在本发明的一些实施例中，步骤c)中，收集上层液后，加入无水硫酸钠进行除水处理。

在本发明的一些实施例中，步骤c)中，加入无水硫酸钠后，静置2h以上。

在本发明的一些实施例中，步骤d)中，固液分离的方式为抽滤。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中，将羧甲基普鲁兰多糖水溶液、EDC水溶液混合，再将溶解有双硒化合物的DMF加入混合液中，滴加DMF，反应结束后，向反应液中加入萃取剂，反应结束后，静置，取下层液，透析，将透析液冻干，得到普鲁兰载体。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中，所述羧甲基普鲁兰中羧甲基的摩尔数：所述EDC的摩尔数＝1:1.5。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中，滴加DMF至溶液澄清透亮后，反应5-10h。

在本发明的一些实施例中，步骤2)中，所述萃取剂为乙酸乙酯。

在本发明的一些实施例中，步骤3)中，按质量计，普鲁兰载体：阿霉素＝2:1。此处普鲁兰载体即普鲁兰双硒化合物，是用羧甲基普鲁兰和双硒化合物反应后得到的固体产物。

本发明第二方面提供上述方法制得的普鲁兰多糖载药系统。

本发明第三方面提供上述普鲁兰多糖载药系统在制备治疗肿瘤药物中的用途。

如上所述，本发明的一种利用可见光诱导交联的普鲁兰多糖载药系统及其制备方法，具有以下有益效果：本发明将普鲁兰-双硒化合物作为载体，实现对阿霉素的载药，并且利用可见光诱导交联，提高了纳米载药系统的稳定性，使得纳米载药系统在体内稳定安全地将药物靶向递送到病灶部位，提高其治疗效果。

附图说明

图1显示为本发明实施例的可见光诱导DOX-ND/Pu-PBSe纳米粒子粒径分布图。

图2显示为本发明实施例中荷瘤鼠的死亡曲线图。

图3显示为本发明实施例中肿瘤抑制曲线图。

图4显示为辐照时间对比实验中辐照0.5h的表面电荷检测结果图。

图5显示为辐照时间对比实验中辐照1h的表面电荷检测结果图。

图6显示为辐照时间对比实验中辐照1.5h的表面电荷检测结果图。

图7显示为辐照时间对比实验中辐照2h的表面电荷检测结果图。

图8显示为辐照时间对比实验中辐照2.5h的表面电荷检测结果图。

图9显示为辐照时间对比实验中辐照3h的表面电荷检测结果图。

图10显示为辐照时间对比实验中辐照3.5h的表面电荷检测结果图。

图11显示为辐照时间对比实验中辐照4h的表面电荷检测结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

本发明使用可见光作为一种温和、方便的方法，在保持药物特异性降解与释放的效能时，使载药纳米颗粒的简易交联成为一种可行的策略来克服这些困难。

以下实施例中，DMF是指二甲基甲酰胺，EDC是指1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。

以下实施例中所涉及的化学反应如下：

以下各实施例中，盐酸阿霉素去盐酸化的步骤如下：

1)取14mg盐酸阿霉素溶于5mL去离子水中，得到盐酸阿霉素水溶液；

2)取5.6g氢氧化钾固体溶于1L水中，取该溶液逐滴加入盐酸阿霉素水溶液中，至pH为9.6，将溶液离心，去除上清液，干燥沉淀，即得去盐酸化阿霉素。

以下各实施例中的透析均是采用去离子水，目的是去除小分子物质和其他杂质。

实施例1

一种利用可见光诱导交联的普鲁兰多糖载药系统的制备方法，包括如下步骤：

1.取100mL DMF，将1.98g硒粉与1.52g固体氢氧化钠逐渐加入其中，机械搅拌反应得第一反应液。

2.取水合肼1mL加入第一反应液中，再缓慢加入4.675g4-溴苄醇，置于160℃油浴锅中冷凝回流4小时，之后停止加热，待其自然冷却，得第二反应液。

3.第二反应液中加水100mL稀释，再加入100mL乙酸乙酯萃取，收集上层液，加入无水硫酸钠，静置2h，得第三反应液。

4.采用布氏漏斗抽滤第三反应液，所得液体旋转蒸发，即得双硒化合物。

5.取羧甲基普鲁兰50mg，加入1mL水，磁力搅拌助溶，得第四反应液。

6.取15.53mg EDC溶于0.5mL水中，将其加入第四反应液中，磁力搅拌0.5h，得第五反应液；由于EDC极其容易潮解，会和空气中的物质发生反应，此步骤要尽快完成，所以，EDC溶液的配制要在羧甲基普鲁兰水溶液配制之后进行。

7.称取上述所得双硒化合物197.8mg，溶于2mL DMF中，将第五反应液逐渐加入其中，在磁力搅拌下缓慢滴加DMF至溶液澄清透亮，反应5h，得第六反应液。

8.向第六反应液中加入4mL乙酸乙酯，摇晃均匀，静置0.5h，取下层液，透析2h，取出透析液冻干，即得普鲁兰载体材料(Pu-PBSe)。

9.取10mg去盐酸化阿霉素溶于2mLDMSO中，得到第一溶液。

10.将步骤8所得普鲁兰载体材料20mg溶于1mLDMSO中，将所得溶液加入第一溶液中，超声震荡0.5h，透析2h，再用白炽灯(25w，184Lux)辐照3h，辐照距离为29cm，得第七反应液。

对于可见光交联的光照强度范围为182-184Lux，本实验中采用的强度为184Lux。实验中采用可见光功率为25w，即198lm。流明(lumen，符号lm)是光通量的国际单位。一流明是相当数量光散发在1球面角单位，从光源向各个方向发散出等量能量。由公式198lm/4πr²＝184lux，得出r≈0.29m，即光照距离约为0.29m。

11.将第七反应液超滤得负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统。

本实验采用雌性4周龄裸鼠进行实验，建立皮下肿瘤模型，通过裸鼠尾静脉分别注射PBS(空白)、盐酸阿霉素、阿霉素-普鲁兰多糖纳米药物、可见光诱导交联的阿霉素-普鲁兰多糖纳米药物，浓度为5-10mg/kg。

图1显示为本实施例中可见光诱导DOX-ND/Pu-PBSe纳米粒子粒径分布图，从图1可以发现，可见光诱导交联的阿霉素-普鲁兰多糖纳米载药系统的粒径大小在81.4纳米左右，粒径较小，分布较窄，有利于体内的靶向分布。

图2为本实施例中荷瘤鼠死亡曲线图，图中，从左到右依次为(1)：空白对照组；(2)：盐酸阿霉素组；(3)：阿霉素-普鲁兰多糖药物组；(4)：可见光诱导交联的阿霉素-普鲁兰多糖纳米药物组，各组溶液中阿霉素的注射浓度为5mg/kg体重。通过对比可以发现，可见光诱导交联的阿霉素-普鲁兰多糖纳米载药系统能够明显延长动物死亡时间，展示出优良的疗效。

图3为本实施例中荷瘤鼠肿瘤生长抑制曲线图，图中，从上到下依次为(1)：空白对照组；(2)：盐酸阿霉素组；(3)：阿霉素-普鲁兰多糖药物组；(4)：可见光诱导交联的阿霉素-普鲁兰多糖纳米药物组，各组溶液中阿霉素的注射浓度为5mg/kg体重。通过对比可以发现，可见光诱导交联的阿霉素-普鲁兰多糖纳米载药系统能够明显抑制肿瘤生长，疗效良好。

实施例2

6.取15.53mg EDC溶于0.5mL水中，将其加入第四反应液中，磁力搅拌0.5h，得第五反应液。

7.称取上述所得双硒化合物197.8mg，溶于2mL DMF中，将第五反应液逐渐加入其中，在磁力搅拌下缓慢滴加DMF至溶液澄清透亮，反应10h，得第六反应液。

9.取10mg去盐酸化阿霉素溶于2mLDMSO中，得到第一溶液。

10.将步骤8所得普鲁兰载体材料20mg溶于2mLDMSO中，将所得溶液加入第一溶液中，超声震荡0.5h，透析2h，再用白炽灯(25w，184Lux)辐照3h(辐照距离为29cm)，得第七反应液。

实施例3

9.取10mg去盐酸化阿霉素溶于2mLDMSO中，得到第一溶液。

10.将步骤8所得普鲁兰载体材料20mg溶于5mLDMSO中，将所得溶液加入第一溶液中，超声震荡0.5h，透析2h，再用白炽灯(25w，182Lux)辐照3h(辐照距离为29cm)，得第七反应液。

实施例2和实施例3所制得的天然普鲁兰多糖载药系统类似于实施例1。

辐照时间对比实验

将实施例1中步骤8所得普鲁兰载体材料20mg溶于2mL DMSO中，加入第一溶液，超声震荡0.5h，透析2h，将所得溶液分为8等份，以0.5小时为梯度，给予0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4小时的辐照，分别做表面电荷检测，具体采用马尔文仪器(型号：MAL1140774)进行ZETA测定。实验结果如图4-图11所示，从图4可以发现，0.5小时辐照后，表面电荷为-49mv，单峰；从图5可以发现，1小时辐照后，表面电荷为-47.2mV，单峰；从图6可以发现，1.5小时辐照后，表面电荷为-45.9mV，单峰；从图7可以发现，2小时辐照后，表面电荷为-43.4mV，单峰；从图8可以发现，2.5小时辐照后，表面电荷为-41.7mV，单峰；从图9可以发现，3小时辐照后，表面电荷为-35.8mV，单峰；从图10可以发现，3.5小时辐照后，表面电荷为-15.5mV，双峰；从图11可以发现，4小时辐照后，表面电荷为-12.0mV，双峰。根据实验结果，辐照时间优选为3h。

综上所述，本发明将普鲁兰-双硒化合物作为载体，实现对阿霉素的载药，并且利用可见光诱导交联，提高了纳米载药系统的稳定性，使得纳米载药系统在体内稳定安全地将药物靶向递送到病灶部位，提高其治疗效果。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种利用可见光诱导交联的普鲁兰多糖载药系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备双硒化合物，包括如下步骤：

a)将硒粉与氢氧化钠加入DMF中，硒粉与氢氧化钠的摩尔量比值≤1，得到第一反应液；

b)将水合肼加入所述第一反应液中，水合肼与硒粉的摩尔量比值≥0.25，再加入4-溴苄醇，4-溴苄醇与硒粉的摩尔量比值≥0.5，加热反应，得到第二反应液；

d)将所述第三反应液固液分离，对所得液体旋转蒸发，得到所述双硒化合物；

2)制备含有双硒化合物的普鲁兰载体：将羧甲基普鲁兰多糖水溶液、EDC水溶液混合，再将溶解有双硒化合物的DMF加入混合液中，滴加DMF，反应结束后，向反应液中加入萃取剂，反应结束后，静置，取下层液，透析，将透析液冻干，得到普鲁兰载体；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，可见光的辐照时间为0.5-3h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，可见光光源的功率为10-50W，可见光的光照度为160-190Lux。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，可见光的辐照时间为3h，可见光光源的功率为25W，可见光的光照度为182-184Lux。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤a)中，硒粉与氢氧化钠的摩尔量比值为0.8-1；

和/或，步骤b)中，水合肼与硒粉的摩尔量比值为0.25-0.3；

和/或，步骤b)中，4-溴苄醇与硒粉的摩尔量比值为0.5-0.7；

和/或，步骤b)中，加入4-溴苄醇后，加热至160℃进行反应；

和/或，步骤b)中，反应时间为4h；

和/或，步骤b)中，加入4-溴苄醇后，将反应液置于油浴中加热反应；

和/或，步骤b)中，加热反应时，对蒸发的物质进行冷凝回流；

和/或，步骤c)中，所述萃取剂为乙酸乙酯；

和/或，步骤c)中，收集上层液后，加入无水硫酸钠进行除水处理；

和/或，步骤d)中，固液分离的方式为抽滤。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤a)中，硒粉与氢氧化钠的摩尔量比值为0.9-1；

和/或，步骤b)中，水合肼与硒粉的摩尔量比值为0.25-0.27；

和/或，步骤b)中，4-溴苄醇与硒粉的摩尔量比值为0.5-0.6。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述羧甲基普鲁兰中羧甲基的摩尔数：所述EDC的摩尔数＝1:1.5；

和/或，步骤2)中，滴加DMF至溶液澄清透亮后，反应5-10h；

和/或，步骤2)中，所述萃取剂为乙酸乙酯。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，可见光辐照后，超滤得到负载阿霉素的天然普鲁兰多糖载药系统。

9.根据权利要求1至8中任意一项所述的制备方法制得的普鲁兰多糖载药系统。

10.根据权利要求9所述普鲁兰多糖载药系统在制备治疗肿瘤药物中的用途。