JP4728572B2 - アレルギー体質改善剤 - Google Patents
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Description
しかしながら、トシル酸スプラタスト等の化合物には副作用等の問題があり、上述のグルコマンナンでは、効果が不十分である、微細加工に特殊の装置・技術を必要とする、作用発現にまで時間がかかる、注射剤としては不適であり製剤処方に制限がある等の問題がある。
尚、斯かる食品には、さらに、一般にアレルギーに効果があるとされる、茶、紫蘇、甜茶、月見草、タンポポ、柿葉、よもぎ、柑橘類等を配合しても良い。
(1)コンニャクグルコマンナン加水分解物の調製
コンニャクグルコマンナン(和光純薬)20mgを蒸留水2.4mlに懸濁し、50℃の水浴中で2時間振盪してコンニャクゲルを調製した。これに塩酸を終濃度0.2Nとなるように加えて2時間振盪した。室温に戻し水酸化ナトリウムを添加して塩酸を中和し、さらに0.5Mリン酸緩衝液((pH 6.5)を0.5ml添加して溶液のpHを6.5に調整した。得られた加水分解物を遠心分離(10000rpm、10min)して不溶物を除き、Sephacryl S-200(1×45cm)(Amersham Bioscience社)カラムに懸け10mMリン酸緩衝液(pH6.5)で分画溶出した。得られた画分の全糖をフェノール硫酸法によって測定したところ、溶出液量18〜22.5mlの位置にコンニャクグルコマンナンの加水分解物が溶出されることが分かった。この画分を集めリン酸緩衝液に対して透析した後限外濃縮器によって濃縮した。この加水分解物の糖としての濃度をフェノール硫酸法によって測定した。
Balb/cマウス(8週齢、♂)の脾臓をISCOV培地中でほぐして細胞懸濁液を調製し、さらにLympholite-M(CedarLane Laboratories社)を用いた比重遠心分離法によりリンパ球分画を回収した。調製したリンパ球をIL-4(R&D社、最終濃度100ng/ml)、抗CD-40抗体(Serotec社、最終濃度200ng/ml)、及び2-mercaptoethanol(最終濃度50nM)を含むISCOV培地で2×106/mlの濃度になるように調整し、96-wellマイクロプレートの各wellに180μL/Wellずつ分注した。これにPBS(-)10μL及びコンニャクグルコマンナン加水分解物10μLを添加し、炭酸ガス培養器中で7日間培養した。培養後、Wellの培養上清を回収し産生された抗体濃度を測定した。IgEの測定は、Bethyl社のMouse IgE Quantitative ELISAキットを用い、製品付属の取扱説明書の方法に従って行った。
(1)ガラクトマンナン加水分解物の調製
グアーガム(Guar Gum)又はイナゴマメガム(Locust Bean Gum)(シグマ)20mgを蒸留水2.4mLにそれぞれ懸濁し、50℃の水浴中で3時間振盪してゲルを調製した。これに塩酸を終濃度0.2Nとなるように加えて2時間振盪した。室温に戻し水酸化ナトリウムを添加して塩酸を中和し、さらに0.5Mリン酸緩衝液((pH 6.5)を0.5mL添加して溶液のpHを6.5に調整した。得られた加水分解物を遠心分離(10000rpm、10min)して不溶物を除きSephacryl S-200(1×45cm)カラムに懸け10mMリン酸緩衝液(pH6.5)で分画溶出した。ガラクトマンナンの加水分解物は18〜22.5mLの溶出位置に回収された。これをリン酸緩衝液に対して透析した後限外濃縮器によって濃縮した。この加水分解物の濃度をフェノール硫酸法によって測定した。
Balb/cマウス(8週齢、♂)の脾臓をISCOV培地中でほぐし細胞懸濁液を調製し、さらにLympholite-M(CedarLane Laboratories社)を用いた比重遠心分離法によりリンパ球分画を回収した。 調製したリンパ球をIL-4(R&D社、最終濃度100ng/ml)、抗CD-40抗体(Serotec社、最終濃度200ng/ml)、及び2-mercaptoethanol(最終濃度50nM)を含むISCOV培地で2×106/mlの濃度になるように調整し、96-wellマイクロプレートの各wellに180μL/Wellずつ分注した。これにPBS(-)10μL及びコンニャクグルコマンナン加水分解物10μLを添加し炭酸ガス培養器中で7日間培養した。培養後、各々wellの培養上清を回収し産生されたIgE抗体濃度を測定した。
(1)コンニャクグルコマンナン加水分解物の調製
コンニャクグルコマンナン(和光純薬)20mgを蒸留水2mLに懸濁し75℃の水浴中で1時間振盪してコンニャクゲルを調製した。これに各濃度の塩酸を終濃度で1.0N、0.5N、0.25N、0.125Nとなるように加えて1時間振盪した。室温に戻し水酸化ナトリウムを添加して塩酸を中和し、さらに0.5Mリン酸緩衝液(pH 6.5)を0.5mL添加して溶液のpHを6.5に調整した。得られた加水分解物を遠心分離(10000rpm、10min)して不溶物を除き、HiPrep 26/60 Sephacryl S-300HR(2.6×60cm)(Amersham Bioscience社)カラムに懸けて10mMリン酸緩衝液(pH6.5)で分画溶出した。得られた画分についてフェノール硫酸法により全糖を測定したところ、加水分解物は塩酸の濃度が高いほど低分子量の位置に溶出されることが分かった(図3)。このゲル濾過カラムでの分子量分画範囲は、球状タンパクとして見積もった場合は10KDから1500KD、デキストランとして見積もった場合は2KDから400KDである(Amersham Bioscience社)。加水分解されたコンニャクグルコマンナン分子の特性からデキストランの分画範囲と類似の挙動をとると考えられることから、コンニャクグルコマンナン加水分解物は塩酸濃度を調節することによって、およそ1KDから400KD程度までの広い分子量分布の範囲で調製されたことになる(図3)。それぞれの全糖のピークを中心に画分を集め、1KDから数100KDの分子量範囲をカバーする一連の加水分解物を調製することができた。集めた画分をリン酸緩衝液に対して透析した後、それぞれ予想される分子量に対応する限外濃縮器を用いて濃縮した。これらの加水分解物の糖としての濃度をフェノール硫酸法によって測定した。
実施例1(2)及び実施例2(2)と同様の方法によりin vitro 抗体産生系におけるIgE産生抑制効果を調べた。試料としては、(1)で調製した分子量の異なるコンニャクグルコマンナン加水分解物を用いた。7日間培養後、各wellの培養上清を回収し産生されたIgE濃度を測定した。
アトピー性皮膚炎に伴い肌のかゆみがおこり、それを掻くことにより症状が悪化し、またかゆみが増大するという悪循環が見られる。この現象から、皮膚を掻くことによって、破壊された角化細胞(ケラチノサイト)が症状の悪化の原因であることが考えられる。ケラチノサイト(PAM-212細胞)の抽出物をBalb/cマウスに投与することによって、血中IgE産生が刺激されることが明らかにされている。また、Balb/cマウスの脾臓細胞を用いたin vitro IgE産生系にPAM-212細胞抽出物を添加することによって顕著にIgE産生が亢進することが明らかにされている(Yamamoto T, Kaneko S et al, (2002) Increase in serum IgE levels following injection of syngeneic keratinocyte extracts in BALB/c mice. Arch Dermatol Res 294: 117-23、森本謙一、他.マウス角化細胞株由来IgE産生増強因子のIgEクラススイッチに及ぼす影響.アレルギー51(9・10), 992(抄), 2002)。そこで、ケラチノサイト抽出物によるin vitro IgE産生系を用いて、IgE産生亢進に対するコンニャクグルコマンナン加水分解物のIgE産生抑制効果を調べた。
Balb/cマウス(8週齢、♂)の脾臓をISCOV培地中でほぐして細胞懸濁液を調製し、さらにLympholite-M(CedarLane Laboratories社)を用いた比重遠心分離法によりリンパ球分画を回収した。調製したリンパ球をIL-4(R&D社、最終濃度100ng/ml)、抗CD-40抗体(Serotec社、最終濃度200ng/ml)、及び2-mercaptoethanol(最終濃度50nM)を含むISCOV培地で2×106/mlの濃度になるように調整し、96-wellマイクロプレートの各wellに180μL/Wellずつ分注した。これにケラチノサイト抽出物10μL及びコンニャクグルコマンナン加水分解物10μLを添加し、炭酸ガス培養器中で7日間培養した。コンニャクグルコマンナン加水分解物は実施例1(1)と同様にして調製した。培養後、各wellの培養上清を回収し産生されたIgE抗体濃度を測定した。
Claims (3)
- グルコマンナン又はガラクトマンナンの加水分解物であって、グルコマンナン又はガラクトマンナンを塩酸により加水分解して調製される、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて球状タンパク換算で約60kDに相当する分子量を示す加水分解物を有効成分とするアレルギー体質改善剤。
- グルコマンナン又はガラクトマンナンの加水分解物であって、グルコマンナン又はガラクトマンナンを塩酸により加水分解して調製される、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて球状タンパク換算で約60kDに相当する分子量を示す加水分解物を有効成分とするIgE抗体産生抑制剤。
- グルコマンナン又はガラクトマンナンの加水分解物であって、グルコマンナン又はガラクトマンナンを塩酸により加水分解して調製される、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて球状タンパク換算で約60kDに相当する分子量を示す加水分解物を含有するアレルギー体質改善食品。
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