WO1997026896A1

WO1997026896A1 - Apoptosis inducers

Info

Publication number: WO1997026896A1
Application number: PCT/JP1997/000116
Authority: WO
Inventors: Takeshi Sakai; Hideo Kitano; Fu-Gong Yu; Shinji Nakayama; Kaoru Kojima; Hitomi Kimura; Yoshikuni Nakanishi; Kaoru Katayama; Takanari Tominaga; Kazuo Shimanaka; Katsushige Ikai; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.; Research Institute For Glycotechnology
Priority date: 1996-01-26
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 1997-07-31
Also published as: JP3555766B2; CN1528340A; CN1209749A; CA2243543A1; KR100555845B1; CN100406023C; CN1150003C; EA003902B1; KR100555844B1; AU1399997A; EA200300499A1; EP0919237A4; US6207652B1; KR20050044909A; EA199800662A1; EP0919237A1; US20010034335A1; EA005580B1; AU720004B2; US6593311B2

Description

明細書

アポトーシス誘発剤

発明の属する技術分野

本発明は、医薬品として利用可能なアポトーシス誘発剤、制がん剤及び発がん予防剤に関する。また、本発明はアポトーシス機構解明、アポトーシス誘発阻害剤スクリーニング等に有用なアポトーシス锈発方法を提供する。更に本発明により純化されたフコース硫酸含有多糖及びその分解物が提供され、フコース硫酸含有多糖分解物の製造や、構造究明に有用なフコース硫酸含有多糖分解酵素が提供される。従来の技術

近年、細胞組織の死に関し、アポト一シス（apoptos i s 、アポブト一シスともいう；自爆死あるいは細胞自滅）と言う様式が注目されている。

このアポトーシスは、病理的細胞死である壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組込まれている死であると考えられている。すなわち何らかの外部的又は内部的要因が引き金となってアポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化され、この遺伝子を元にプログラム死遺伝子タンパク質が生合成され、生成したブログラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至ると考えられている。このようなアポトーシスを所望の組織、細胞で発現せしめることができれば、不要若しくは病原細胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極めて意義深いものである。発明が解決しょうとする課題

本発明の目的は、アポトーシスを誘発する作用を有する安全性の高い化合物を開発し、該化合物を含有するアポトーシス誘発剤、制がん剤、発がん予防剤、及び該化合物を有効成分として使用するアポトーシス誘発方法を提供することにある。また本発明の化合物の分解物の製造に有用な該化合物分解酵素を提供することにあ-る。課題を解決するための手段

本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明はアポトーシス誘発剤に関し、フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を含有することを特徴とする。本発明の第 2の発明はアポトーシス绣発方法に閱し、フコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物を有効成分として使用することを特徴とする。本発明の第 3の発明は制がん剤に関し、本発明の第 5又は第 6の発明のフコ一ス硫酸含有多糖及び/又はその分解物を含有することを特徴とする。本発明の第 4の発明は発がん予防剤に関し、フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を含有することを特徴とする。本発明の第 5の発明は下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に関する

( 1 ) 構成糖：ゥロン酸を含有する。

(2) フラボパクテリゥム（Flavobacteriu画） s p . SA-0082 (FERM BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下記式（ 1 ) 、（Π)、（III) で表される化合物より選択される一種以上の化合物が生成する。

6JI713«I 本発明の第 6の発明は下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に関する。

( 1 ) 構成糖：ゥ口ン酸を実質的に含有しない。

( 2 ) フラボバクテリゥム（F lavobacter i uB) s P . S A - 0 0 8 2 ( F E R M B P— 5 4 0 2 ) の生産するフコダイン分解酵素により実質上低分子化されな

^„ 本発明の第 7の発明は本発明の第 5の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫酸含有多糖混合物を塩類の存在下、酸性多糖凝集能のある薬剤で処理し、沈殿物を除去する工程を包含することを特徴とする。本発明の第 8の発明は本発明の第 5の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫酸含有多糖混合物を、 2価の陽イオンの混在下に陰イオン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包含することを特徴とする。本発明の第 9の発明は本発明の第 5の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、本発明の第 5の発明のフコース硫酸含有多糖を製造する際に、共存する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰ィオン交換基を有する物質を用いて除去する工程を包含することを特徴とする。本発明の第 1 0の発明は本発明の第 6の発明のフコース硗酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫酸含有多糖混合物を、ゥロン酸を含むフコース硫酸含有多糖を分解する能力を有する分解酵素、又は該分解酵素をもつ微生物で処理して目的の多糖を採取する工程を包含することを特徴とする。本発明の第 1 1の発明は本発明の第 6の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硗酸含有多糖混合物を、塩類の存在下、酸性多糖凝集能のある薬剤で目的の多糖を沈殿させる工程を包含することを特徴とする。本発明の第 12の発明は本発明の第 6の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫酸含有多糖混合物を、 2価の陽イオンの混在下に陰イオン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包含することも特徴とする。本発明の第 13の発明は本発明の第 6の発明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に Mし、本発明の第 6の発明のフコース硓酸含有多糖を製造する際に、共存する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰ィオン交換基を有する物質を用いて除去する工程を包含することを特徴とする。本発明の第 14の発明はフコース硗酸含有多糖混合物の製造方法に関し、海藻から本発明の第 7、 8、 10、 1 1又は 12の発明に使用するフコース硫酸含有多糖混合物を抽出する際に、酢酸ィオンとカルシウムィオンを共存させることを特徴とする。本発明の第 15の発明は下記の理化学的性質を有することを特徴とするェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素に関する。

( i ) 作用：下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に作用して、該フコース硫酸含有多糖を低分子化させる。

( a) 構成糖：ゥロン酸を実質的に含有しない。

( b ) フラボバクテリゥム（F vobacteriun) s P . S A- 0082 (F E RM BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により実質上低分子化されない。

下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に作用しない。

( c)構成糖：ゥロン酸を含有する。

( d ) フラボパクテリゥム（Flavobacteriu園） s p. S A- 0082 (F ERM B P— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下 3己式（ I ) 、（11) 、（HI) で表される化合物より選択される一種以上の化合物が生成する。

( II )

.6df/X3d 9689Z/Z.6 ΟΛΑ

.6df/X3d 9689 6 ΟΛ ( i i ) 至適 P H ：本酵素の至適 P Hは 7 ~ 8付近にある。

( i i i ) 至適温度：本酵素の至適温度は 3 0 - 3 5 'C付近である。本発明の第 1 6の発明はカルシウム源と本発明の第 1 5の発明のェンド型フコ —ス硫酸含有多糖分解酵素を含有する酵素組成物に関する。本発明の第 1 7の発明は本発明の第 1 5の発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の製造方法に関し、本発明の第 1 5の発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有するアルテロモナス属細菌を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴とする。本発明の第 1 8の発明はフコース硫酸含有多糖の低分子化物に関し、本発明の第 1 5の発明のェンド型フコース硗酸含有多糖分解酵素を本発明の第 8の発明のフコース硫酸含有多糖に作用させて取得してなるものであることを特徴とする。本発明者らは様々な純化されたフコース硫酸含有多糖やその分解物を得ることに成功し、次いでそれらの生物活性を検討し、それらの物質ががん細胞に対してアポトーシスを誘発させること及び強い制がん作用を示すことを見出した。またフコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物が強い発がん抑制作用を示すことを見い出した。更に本発明の分解物の調製に有用なフコース硫酸含有多糖分解酵素の単離に成功し、本発明を完成させた。図面の簡単な説明

図 1 はフコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を示したものである。

図 2はセフアクリル S— 5 0 0を用いたゲルろ過法により測定したフコース硗酸含有多糖一 Uの分子量分布を示したものである。

図 3はフコース硫酸含有多糖一 Uの I Rスぺクトルを示したものである。

図 4はフコース硫酸含有多糖一 Uの 1 H— N M Rスぺクトルを示したものである。図 5は糖化合物（ a ) のビリジルー（ 2 ) —ァミノ化糖化合物（ P A— a ) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示したものである。

図 6は糖化合物（ b ) のビリジルー（ 2 ) —ァミノ化糖化合物（ P A— b ) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示したものである。

図 7は糖化合物（ c ) のビリジルー（ 2 ) —ァミノ化糖化合物（ P A— c ) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示したものある。

図 8は糖化合物（a) のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示したものである。

図 9は糖化合物（b) のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示したものである。

図 1 0は糖化合物（c) のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示したものである。

図 1 1は糖化合物（a) のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示したものである。

図 1 2は糖化合物（b) のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示したものである。

図 1 3は糖化合物（c) のマスマス分析（ネガテイブ測定）により得られた結果を示したものである。

図 1 4は糖化合物（a) の 1H— NMRスぺクトルを示したものである。図 1 5は糖化合物（b) の 1H— NMRスペクトルを示したものである。図 1 6は糖化合物（c) の 1H— NMRスペクトルを示したものである。

図 1 7はセフアクリル S— 500を用いたゲルろ過法により測定したフコース硫酸含有多糖一 Fの分子量分布を示したものである。

図 1 8はフコース硫酸含有多糖一 Fの I Rスぺクトルを示したものである。図 1 9はフコース硫酸含有多糖一 Fの 1H— NMRスぺクトルを示したものである。

図 20は本発明により得られるェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の P H と相対活性の関係を示すグラフである。

図 2 1は本発明により得られるヱンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の温度と相対活性の関係を示すグラフである。

図 22はセル口ファイン G CL— 300を用いたゲルろ過法により測定した、フコース硫酸含有多糖一 Fを本発明により得られるェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素により分解する前後の分子量分布を示したものである。

図 23は本発明により得られるェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の反応液中のカルシウムイオン澳度と相対活性の関係を示すグラフである。

図 24は実施例 19一（6) においてセル口ファイン GC L— 300を用いたゲルろ過法により測定した、フコース硫酸含有多糖一 Fを本発明により得られるェンド型フコース ¾酸含有多糖分解酵素により分解したものの分子量分布を示したものである。

図 25はフコース硫酸含有多糖一 Fを本発明により得られるェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素により分解したものの I Rスベタトルを示したものである。図 26はフコース硫酸含有多糖一 Fを本発明により得られるエンド型フコース硗酸含有多糖分解酵素により分解したものの 1H— NMRスぺクトルを示したものである。

図 27は HL— 60細胞の培養液に実施例 1、 1 5、及び 18で得られたフコース硫酸含有多糖を l ms/m l となるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。

図 28は MOLT— 3細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例 12で得られたフコース «Ε酸含有多糖一 F、実施例 15及び 17で得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。

図 29は HCT 1 16細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品、実施例 1で得られたフコース磙酸含有多糖混合物、実施例 1 2で得られたフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 F、 F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4、実施例 15で得られたフコース硫酸含有多糖、及びへパリン及びデキストラン硫酸を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。

図 30は HCT 1 16細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な澳度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。

図 3 1 は A G S細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な澳度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。

図 3 2は S W 4 8 0細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な港度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。

図 3 3は W i D r細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例 1 2で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、 F— F d— 3及び F— F d— 4及び実施例 1 5で得られたフコース硫酸含有多糖を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示したものである。

図 3 4は W i D r細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濂度で添加したときの培蹇時間と培養液中の生細胞数の閲係を示したものである。発明の実施の形態

以下、本発明に関して具体的に説明する。

本発明に使用されるフコース硫酸含有多糖は特に限定されるものではなく例えばヒバマタ由来の物、ガゴメ昆布由来の物、マ昆布由来の物、ワカメ由来の物その他すベての褐藻植物由来の物を使用することができる。また、ナマコも体壁にフコース硫酸含有多糖を持っていることが知られているが、本発明にはナマコ由来のフコース硫酸含有多糖も使用することができる。また本発明にはフコース硫酸含有多糖の分解物も使用することができる。フコース硫酸含有多糖の分解方法としては酸処理等の化学的に分解する方法、超音波処理など物理的に分解する方法、あるいは酵素的に分解する方法等が挙げられる。

本発明者らは、上記のような様々なフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物をがん細胞の培養液に添加したところ添加後 1 曰から数日で癌細胞がアポトーシスを起こすことを見出した。また、正常細胞に対しては毒性を示さないことも確認した。本発明において、フコース硫酸含有多糖とは、分子中にフコース砬酸を含有する多糖であり、特に限定はないが、例えば褐藻植物、ナマコ等に含有されている

〔左右田徳郎監修、江上不二夫編集、共立出版株式会社、昭和 3 0年 1 2月 1 5 曰発刊、多糖類化学、第 3 1 9頁、第 3 2 1頁〕。なお褐藻植物由来のフコース硫酸含有多糖はフコィダン、フコィジン、フカンと通称され、いくつかの分子種があることが知られているがこれらは総称的にフコィダンと呼ばれることが多い。例えば、市販シグマ社製のフコィダンを 1 3種もの分子種に分けたという報告があり〔カーボハイドレートリサーチ（Carbohydrate Research)、第 2 5 5巻、第 2 1 3〜 2 2 4頁（ 1 9 9 4 ) 〕、その中にはフコースを主成分とする一群と、ゥロン酸を数％含み構成糖にフコースやマンノースを多く含む一群の分子種がある。その生物活性についてはマクロファージ活性増強、癌転移抑制、抗凝血等様々なものが報告されているが、フコース硫酸含有多糖には分子種があるため活性の本体がどの分子種にあるかを調べるためにはフコース硫酸含有多糖を分離精製して調べる必要があった。フコース硫酸含有多糖には、ゥロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコースのものと、ゥロン酸を数％含み構成糖にフコースやマンノースを含むもの等がある。以下、本明細耆においてはゥロン酸を実質的に含まない方をフコース硫酸含有多糖一 Fとし、ゥロン酸を含むフコース硫酸含有多糖をフコース硫酸含有多糖一 Uとし、両者の混合物をフコース硫酸含有多糖混合物と記載する。これまでに知られているフコース硗酸含有多糖一 Fゃフコース硫酸含有多糖一 Uを分離する方法は分子量分画ゃ陰ィオン交換樹脂による分離であり、その分離は不充分なため薬品や機能性食品として大量調製が困難なものであった。また、フコース硫酸含有多糖から着色性物質を完全に除去することは困難なことが知られており、市販のフコィダン等にも着色性物質が含まれている。通常この着色性物質はポリフノールが重合したものであり極めて反応性が強く様々な酵素反応を阻害したり細胞の生育を阻害したり、また、例えば接した樹脂や樹脂性の容器等に不可逆的に吸着することがある。そのためフコース硫酸含有多糖の生物活性を正確に調べるため、また、容器や樹脂等の汚染を防ぐためにはフコース硫酸含有多糖から反応性の強い着色性物質を除去する必要があった。また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール洗浄残渣等からフコース硗酸含有多糖混合物を抽出する際に可溶性の酢酸バリゥムゃ塩化バリゥムゃ塩化カルシウムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができるため、後の精製が有利であることが知られているが、可溶性のバリゥム塩は廃液の処理などが容易ではなく、また塩化カルシウムは海藻と混合すると p Hが変動するため非分解性のフコース硫酸含有多糖を得るには P H調整が必要である。この P H調整の際に海藻粉末が粘性を帯びて凝集することがあるため、その後の抽出効率が低下したり固液分離とりわけろ過が困難となることがある。すなわち、現在フコース硫酸含有多糖の産業上の有用性が期待されているにも関わらず、分子種的に分別が充分なフコース硫酸含有多糖一 Fゃフコース硫酸含有多糖一 Uの市販品もなく、またその効率的な製造方法に関する報告もない。更には市販のフコース硫酸含有多糖には上記のように反応性の強い着色性物質が含まれている。フコース硫酸含有多糖には様々な活性があるが、前述のごとくその分別調製が困難であるためいまだに実質上純化されたフコース硫酸含有多糖一 Fゃフコース硫酸含有多糖一 Uは得られていなかった。

しかしながら本発明により、実質上純化されたフコース硫酸含有多糖一 U、その簡便な抽出方法及びフコース硫酸含有多糖一 Uの製造方法が提供された。また本発明により、通常、フコース硫酸含有多糖から除去困難で酵素反応阻害や樹脂の汚染等をもたらす反応性の強い着色性物質を除去したフコース硫酸含有多糖一 Uが提供された。

更に本発明により、実質上純化されたフコース硫酸含有多糖一 F、その簡便な抽出方法及びフコース硫酸含有多糖一 Fの製造方法が提供された。

また本発明により、通常、フコース硫酸含有多糖から除去困難で酵素反応阻害や樹脂の汚染等をもたらす反応性の強い着色性物質を除去したフコース硫酸含有多糖一 Fが提供された。本発明に使用するフコース硫酸含有多糖としては、褐藻植物、ナマコ等のフコース硫酸含有多糖含有物を、例えばそのまま乾燥、粉砕して用いても良く、またフコース硫酸含有多糖含有物よりのフコース硫酸含有多糖抽出液、該抽出液よりの精製物を使用しても良い。フコース硫酸含有多糖抽出液の調製方法、抽出液からの精製方法は公知の方法で行えばよく、特に限定はない。また、本発明に使用する、フコース硫酸含有多糖分解物とは、フコース硫酸含有多糖を酵素化学的方法、化学的方法、物理学的方法で分解して得られるものであり、公知の酵素化学的方法、化学的方法、物理学的方法を使用することができる。また、本発明に使用するフコース硗酸含有多糖、フコース硫酸含有多糖分解物とはその薬学的に許容される塩を包含する。フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植物としては、例えば、山田幸雄序、瀬川宗吉著、保育社、昭和 52年発刊の原色日本海藻図鑑、第 22~52頁に記載の褐藻植物があり、例えば、ヒバマタ（Fucus evanescens) 、ガゴメ昆布（Kjel 1議 aniella crass ifol iaノ、マ昆 (Laminar ia japonica) 、ワカメ (Undaria pi nnatけ ida)等を使用し、フコース硫酸含有多糖を調製することができる。

フコース硫酸含有多糖を含有するナマコとしては、例えば、特開平 4一 9 1 0 27号公報記載のナマコがあり、例えばマナマコ（Stichopus japonicus)> -セクロナマコ（Holothuria leucosp i 1 ota)等を使用することができ、該公報記載の方法にて、フコース硗酸含有多糖を調製することができる。フコース硫酸含有多糖は硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し塩を形成する。これらのフコース硗酸含有多糖、それらの分解物は塩になつた状態が安定であり、通常ナトリゥム及び又は力リゥム等の塩の形態で単離される。これらの物質の塩はダウェックス 5 O W等のllィオン交換樹脂で処理することによって遊離のフコース硫酸含有多糖、遊離のそれらの分解物に導くことが可能である。また、これらは、更に必要に応じ公知憤用の塩交換を行い、所望の種々の塩に交換することができる。フコース硫酸含有多糖、それらの分解物の塩としては、薬学的に許容される塩が用いられ、例えば力リウム、ナトリゥム等のアルカリ金厲塩、カルシウム、マグネシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩、ピリジユウム等の有機塩基との塩、及びアンモユウム塩等が挙げられる。フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植物、ナマコ等は乾燥後、粉砕処理を行うことにより、フコース硫酸含有多糖含有粉体を翻製することができる。

フコース硫酸含有多糖含有粉体から熱水抽出、希酸抽出を行うことによってフコース硫酸含有多糖抽出液を調製することができる。

フコース硫酸含有多糖含有物からの抽出温度、時間としては 0 ~ 2 0 0て、 1 〜3 6 0分の範囲から目的に応じ選択すれば良いが、通常 1 0— 1 5 0て、 5 ~ 2 4 0分、好適には 5 0 - 1 3 O 'C 1 0 ~ 1 8 0分の範囲より選択して行うのが良い。

フコース硫酸含有多糖含有率を高めるための抽出物精製手段としては、塩化力ルシゥム、酢酸バリウム等を用いたフコース硫酸含有多糖の分画方法、塩化セチルビリジ -ゥム等の酸性多糖凝集剤を用いたフコース硫酸含有多糖の分画方法、塩類の存在下で酸性多糖凝集剤を用いるフコース硫酸含有多糖の分画方法、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー等があり、必要に応じこれらを組合せて、精製を行うことができる。フコース硫酸含有多糖の分解方法としては、フコース硫酸含有多糖分解酵素を使用する方法、酸分解を行う方法、超音波処理を行う方法等フコース硫酸含有多糖分解方法として公知の方法を使用することができ、分解物の精製は上記方法にて行えばよい。通常、褐藻類には複数種のフコース硫酸含有多糖が存在するが、本発明に使用される褐藻類の種類は特に限定されるものではなく、例えばヒバマ夕由来のもの，ガゴメ昆布由来のもの、マ昆布由来のもの、ワカメ由来のもの、その他すベての褐藻類由来のものを使用することができる。フコース硫酸含有多糖の製造にはまず、褐藻類の水系溶媒による抽出液を得る。また、抽出に供する海藻は生海藻でも良いが、抽出液を得る前に褐藻を乾燥したり、乾燥粉末にしたり、 6 0 ~ 1 0 0 %のアルコールやアセトン等で洗浄したり、ホルムアルデヒド、ァセトアルデヒド、グルタルアルデヒド、アンモニア等を含む水溶液に浸しておけばフコース硫酸含有多糖への着色性物質の混入が大幅に減少するため有利である。

また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール洗浄残渣等からフコース硫酸含有多糖を抽出する際に可溶性の酢酸バリウム、塩化バリウム、又は塩化カルシウムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができるため後の精製が有利であるが上述した理由により抽出の際には、 1 m M ~ 1 M程度の酢酸カルシウム溶液で 5 0 ~ 1 3 O 'Cで抽出するのが好ましい。

海藻が厚手で粉末（粒子）が大きい場合、最初から 0 . 2 M以上の酢酸カルシゥムを用いると抽出効率が悪くなることがあるので、まず水で抽出したものに、酢酸カルシウムを加えて、生じるアルギン酸の沈殿を除去すれば良い。

しかしながらフコース硫酸含有多糖をアルギン酸と同時に抽出したい場合や、抽出時ある程度分解したものを得たい場合等では溶媒及び抽出条件は特に限定されるものではなく、水あるいは、食塩、塩化マグネシウム等の様々な濃度の中性塩類水溶液、クェン酸、リン酸、塩酸等様々な濃度の酸性水溶液、水酸化ナトリゥム、水酸化カリウム等の様々な濃度のアルカリ性水溶液が使用でき、緩衝剤や防腐剤を加えても良い。抽出液の P Hや抽出温度、抽出時間なども特に限定されないが、一般にフコース硫酸含有多糖は酸やアルカリに対して弱いため、酸性溶液やアルカリ性溶液を使用する場合低分子化が進行し易い。加熱温度、時間、 p H等を調整することにより、任意の分解物を調製することができ、例えばゲルろ過処理、分子量分画膜処理等により、分解物の平均分子量、分子量分布等を調整することができる。すなわち本発明のフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 Fの分子量及び糖組成はフコース硫酸含有多糖の原料の収權期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異なり、またフコース硫酸含有多糖の抽出時の加熱条件、 P H条件等により異なる。例えば酸によりフコース硫酸含有多糖は加水分解され、アルカリ条件下ではゥロン酸のー脱雜により、低分子化が進行する。従って本明細書に記載したフコース硫酸含有多糖一 U、フコース碇酸含有多糖一 Fの分子量、分子量分布はその 1例にすぎず、フコース硫酸含有多糖の処理条件により、その分子量、分子量分布は容易に変化させ得る。例えば、弱アルカリ性で 1 0 0 •C、 1時間加熱し、脱塩に際し、ボアサイズ 3 0 0の分子ふるい膜を使用すれば、分子量分布 1 0 0 0から 1万程度のフコース硫酸含有多糖一 U、フコース硫酸含有多糖一 Fが調製でき、使用する条件によって任意の分子量、分子量分布の本発明のフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 Fを調製できる。前記の褐藻類の抽出液からアルギン酸や中性糖等を除くためには、例えば 0 . 2 - 0 . 6 Mの濃度の食塩などの塩類の存在下、これ以上沈殿が生じなくなるまで塩化セチルビリジニゥム等の酸性多糖凝集剤を加え、沈殿を集めれば良い。必要に応じてこの沈殿を 0 . 2 ~ 0 . 6 Mの港度の食塩などの塩類溶液で洗浄後、沈殿中の塩化セチルビリジニゥムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、フコース硫酸含有多糖混合物を得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖混合物から色素を除くために、この沈殿を溶解後陰ィオン交換樹脂や多糖性の樹脂で処理したり限外ろ過等を行ってもよい。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。本発明者らは 0 . 6 ~ 3 Mの 1種類又は 2種類以上の塩類の存在下で本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fと本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uが酸性多糖凝集剤に対して全く異なる挙動を示すことを見出した。

例えば本発明の方法を用いて、フコース硫酸含有多糖混合物の水溶液から本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uを分離することができる。

まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液に 1種又は 2種以上の塩類を添加しその総澳度を 0 . 6 ~ 2 Mとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、塩化カルシゥム等で特に限定されるものではない。

通常本発明のフコース硗酸含有多糖一 Fと本発明のフコース硫酸含有多糖一 U を分離する場合 1 . 5 M程度の塩濃度で目的は達成できる（後妃する図 1 の锐明参照）。例えば上記塩類の塩濃度を 1 . 5 Mに調整した後塩化セチルビリジニゥム等の酸性多糖凝集剤をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加するとフコース硫酸含有多糖一 Fが沈殿を形成するので、沈殿を除去すると本発明のフコ一ス硫酸含有多糖一 Uの溶液が得られる。必要に応じてこの溶液を澳縮後、 4倍量のェタノールなどで溶液中のフコース硫酸含有多糖一 Uを沈殿させ、沈殿中の塩化セチルビリジユウムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uを得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖一 Uから色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよい。次に本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fのみを効率的に製造したい場合は、塩化セチルピリジニゥム等で凝集させる際に、 0 . 2〜0 . 6 Mの塩濃度ではなく、例えば 2 Mの塩濃度にすれば沈殿は本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fのみを含む。本発明者らは、フコース硫酸含有多糖を陰イオン交換樹脂で精製する際に 2価の陽ィオンが共存すると単位榭脂量当りに吸着するフコース硫酸含有多糖量が增加し、フコース疏酸含有多糖の分離が良くなることも見出した。すなわち、本発明の方法を用いて本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uを製造する際には、まずフコース硫酸含有多糖混合物に 2価の陽ィオン源となる薬品を好ましくは 1 m M以上添加する。次に、陰イオン交換樹脂を 2価の陽イオンを好ましくは 1 mM以上含む液で平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖混合物を吸着させる。この陰ィォン交換樹脂を平衡化した液で充分洗浄後、例えば塩化ナトリウムのグラジェントによりフコース硫酸含有多糖を溶出させる。本方法を用いる場合、添加する 2価陽ィオンの濃度は 1 mM以上ならばよいが、本発明のフコース硫酸含有多糖一 U をカラムに吸着させる目的の時は 0. 5M未満が望ましい。また本方法に用いる 2価の陽ィオン源となる薬品はカルシウム塩ゃバリゥム塩が特にその効果が優れているが、特に限定されるものではなく、硫酸マグネシウム、塩化マンガン等も使用することができる。また、褐藻類から通常の方法でフコース硗酸含有多糖混合物を製造すると上述のように反応性の強い着色性物質が混入し、それらが接する樹脂や樹脂性容器を汚染したり、酵素反応や細胞生育を阻害したりする。この着色性物質は多糖性の物質あるいは陰ィオン交換基を有する物質に結合あるいは吸着させれば容易に除去できることを見出した。すなわち、フコース硫酸含有多糖を含む溶液に例えば、セル口ファイン、 GC L— 2000 (生化学工業社製）や、セフアクリル S— 5 00、セフアデッスク G— 200、セファロース C L一 2B (共にフアルマシア社製）等の多糖性の樹脂あるいは、 DE AE—セル口ファイン A— 800 (生化学工業社製）、 D E AE—セファロース F F、 D E A E—セフアデックス A— 5 0、 QAE—セフアデ -ノクス A— 50、 DEAE—セファセル（共にファルマシァ社製）、 TSK—ゲル DE AE—トヨパール 650、 TSK—ゲル D EAE トョパール 550 ( トーソ一社製）、アンバーライト系の陰ィオン交換樹脂（オルガノ社販売）キトバール系の陰ィオン交換樹脂（富士紡繽社製）等の陰イオン交換基を有する物質を添加かくはん後除去したり、あるいはこれらを充てんした力ラムにフコース硫酸含有多糖を含む溶液を通過させればこの反応性の強い着色性物質は容易に除去できる。但し、陰イオン交換樹脂の場合フコース硫酸含有多糖も結合し得るので、着色性物質を吸着させる時に塩濃度を 2 M程度にしておくことが好ましい。本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uは例えば実施例 6に β己載のように調製することができる。以下、このフコース硫酸含有多糖一 Uの理化学的性質を示すが、本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uはこの例に限定されるものではない。本発明のフコース硫酸含有多糖一 U、及び実施例 8で得た本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fの各塩化ナトリゥム濃度における、過剰量の塩化セチルビリジニゥム存在下における沈殿形成性を図 1に示す。

図 1 の縦軸は沈殿形成率（％) を示し、横軸は塩化ナトリウム港度（M ) を示す。図中、実線及び白丸は本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uの各塩化ナトリゥム瀵度での沈殿形成率を示し、図中、点線及び白三角は本発明のフコース硫酸含有多糖— Fの各塩化ナトリウム濃度（M ) での沈殿形成率を示す。沈殿形成率の測定は、溶液温度 3 7てにて、以下のように行った。

本発明のフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 Fをそれぞれ 2 %の濃度で水及び 4 Mの塩化ナトリウムに溶解し、これらを様々な割合で混合することにより様々な澳度の塩化ナトリゥムに溶解したフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硗酸含有多糖一 F溶液を各 1 2 5 I ずつ調製した。次に、塩化セチルビリジ-ゥムを 2 . 5 %の濃度で水及び 4 Mの塩化ナトリゥムに溶解し、それらを混合することにより様々な濃度の塩化ナトリウムに溶解した 1 . 2 5 % の塩化セチルピリジユウム溶液を調製した。

水に溶解している 2 %の本発明のフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 Fを 1 . 2 5 %の塩化セチルピリジニゥムで完全に沈殿させるには容量で 3 . 2倍必要であった。そこで、各濃度の塩化ナトリウムに溶解した 2 %のフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 Fの各 1 2 5 1 に対して各々の港度の塩化ナトリゥムに溶解した塩化セチルピリジニゥム溶液を 4 0 0 1添加後、充分かくはんし、 3 0分放置後、遠心分離し上清中の糖含量をフユノ一ルー硫酸法〔アナリティカルケミストリー（Anal yt ica l Chen istry) 、第 2 8巻、第 3 5 0頁（ 1 9 5 6 ) 〕により測定し、各塩化ナトリゥム港度下での各フコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を算出した。得られた本発明のフコース硗酸含有多糖一 Uの分子量をセフアクリル S— 50 0を用いたゲルろ過法により求めたところ、約 1 9万を中心とした分子量分布を示した（図 2参照）。なお、図 2において、縦軸はフ -ノール一硫酸法により測定した試料中の糖含を 480 n mの吸光度で示し、横軸はフラクシ _s ンナンバーを示す。

なお、ゲルろ過の条件を下妃に示す。

カラムサイズ： 3. 08X 162. 5 c m

溶媒： 0. 2 Mの塩化ナトリウムと 1 0%のエタノールを含む 1 OmMのリン酸ナトリゥム緩衝液（PH6. 0)

流速： 1. 5m l /分

サンブル搌度： 0. 25%

サンブル液量： 20m l

分子量標準物質： Shodex STANDARD P-82 (昭和電工社製）次に、得られた本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uの成分を分析した。

まず、ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（Journal of Biolo gical Chenistry), 第 1 75巻、第 595頁（ 1 948) の記載に従いフコース量を定量した。

次に、得られたフコース硫酸含有多糖一 Uの乾燥標品を 1規定の塩酸に 0. 5 %の瀵度で溶解し、 1 10'Cで 2時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、グライコタツグ（GlycoTAG) 及びグライコタツグリージ： t ントキット（Glyc oTAG Reagent Kit) (共に宝酒造社製）を用いて加水分解して得られた単糖の遼元性末端をピリジルー（2) —ァミノ化（PA化）し、 HP LCにより構成糖の比率を調べた。なお、 HP L Cの条件は下記によった。

装匱： L一 6200型（曰立製作所製）

カラム：パルパ 'ソクタイブ A (4. 6 mm 1 50 mm：宝酒造社製）溶離液： 70 OmMホウ酸緩衝液（PH9. 0) ：ァセトニトリル = 9 ： 1 検出：蛍光検出器 F— 1 1 50 (日立製作所製）にて励起波長 3 1 0 n m、蛍光波長 380 nmで検出

流速： 0. 3m 1 /分

力ラム温度： 65 次に、アナリティカルノ、 *ィオケミストリー（Analytical Bioche匿 istry)、第 4巻、第 330頁（ 1962) の記載に従いゥロン酸量を定量した。

次に、バイオケミカルジャーナル（Biochemical Journal )、第 84巻、第 1 06頁（ 1962) の記載に従い硫酸含量を定量した。

以上の結果、得られたフコース硫酸含有多糖一 Uの構成糖はフコース、マンノース、ガラクトース、グルコース、ラムノース、キシロース、ゥロン酸であった。その他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、主要成分のフコース：マンノース：ガラクト一ス：ゥロン酸：硫酸基はモル比で約 10 : 7 : 4 : 5 : 20であった。次に、フコース硫酸含有多糖一 Uのカルシウム塩の I Rスペクトルをフーリ変換赤外分光光度叶 J I R-D I AMOND20 (日本電子社製）により測定したところ図 3に示すスぺクトルが得られた。なお、図 3において縦軸は透過率 (%) 、横軸は波数（cm— 1) を示す。次に、本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uのカルシウム塩の NMRスぺクトルを 50 OMH zの核磁気共鳴装置 J NM- α 500型核磁気共鳴装置（日本電子社製）により測定したところ図 4に示すスぺクトルが得られた。

図 4中、縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ P P m) を示す。なお、】H— NMRでの化学シフト値は HODの化学シフト値を 4. 65 p pmとして表した。

^¾H -NMR (D₂ 0)

«55. 27 (マンノースの 1位の H) 、 5. 07 (フコースの 1位の H) 、 4. 49 (フコースの 3位の H) 、 4. 37 (グルクロン酸の 1位の H) 、 4. 04 (フコースの 4位の H) 、 3. 82 (フコースの 2位の H) 、 3. 54 (ダルクロン酸の 3位の H) 、 3. 28 (ダルク口ン酸の 2位の H) 、 1. 09 (フコースの 5位の CH3 の H) この本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uの凍結乾燥物の比旋光度を高速 ·高感度旋光計 SEPA— 300 (堀場製作所製）により測定したところ、一 53. 6 度であつた。本発明者らは、以下に述べるごとく得られた本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uの構造を決定した。フコース硫酸含有多糖一 Uを分解する能力を有する分解酵素によるフコース硫酸含有多糖一 Uの分解及び分解物の精製

精製したフコース硫酸含有多糖一 Uに下紀のェンド型フコィダン分解酵素を作用させ分解物の精製を行った。

すなわち、 1 %のフコース硫酸含有多糖一 U溶液 16m】と、 50mMのリン酸緩衝液（PH8. 0) 12m I と 4Mの塩化ナトリウム 4m I と 32mUZm 1のェンド型フコィダン分解酵素溶液 8 m 1を混合し、 25 'Cで 48時間反応させた。反応の進行と共に 230 nmの吸光度が増加することを確認し、本酵素によりフコース硫酸含有多糖一 ϋが分解されていることが判明した。この反応液をマイクロァシライザ一 G3 (旭化成社製）により脱塩後、 DEAE—セファロース F Fにより 3つの画分（ a ) 、（ b ) 、及び（ c ) に分離精製した。

なお、上記のェンド型フコィダン分解酵素は以下の方法により調製される。該エンド型フコィダン分解酵素の生産に用いる菌株としては、該ェンド型フコィダン分解酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよいが、具体例としては例えば、フラボバクテリゥム（Flavobacter iuB) s P . S A - 0082 株（F ERM B P— 5402 ) が挙げられる。本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りである。

1. フラボパクテリゥム s P . S A— 0082株

a . 形態的性質

( 1 ) 本菌は短かん菌である。

幅 0. 8 ~ 1. 0〃 m

長さ 1. 0〜 1. 2 /zm

(2 ) 胞子の有無なし

( 3 ) グラム染色性陰性

b . 生理的性質

( 1 ) 生育の温度範囲

37て以下で生育できる。好適な生育温度は 1 5~28'Cである

(2 ) 酸素に対する態度好気性

( 3 ) 力タラ一ゼ陽性

(4) ォキシダーゼ陽性

(5 ) ゥレアーゼ弱陽性

(6 ) 酸の生成

D—グルコース陽性

ラクトース陽性

マルトース陽性

D—マンニトール陽性

スクロース陰性

トレハロース陰性

(7 ) 加水分解

デンプン陰性

ゼラチン陽性

カゼイン陰性

エスクリン陽性

(8 ) 硝酸塩の還元陰性

( 9 ) インドールの生成陰性 ( 1 0 ) 硫化水素の生成陰性

( 1 1 ) ミルクの凝固陰性

( 1 2 ) ナトリゥムの要求性陽性

( 1 3 ) 塩類要求性

0 %食塩培地での生育陰性

1 %食塩培地での生育陰性

海水培地での生育陽性

( 1 4 ) キノン系メナキノン 6

( 1 5 ) 菌体内 D NAの G C含量 32%

( 1 6 ) O F—テスト 0

( 1 7 ) 集落の色調黄色系

( 1 8 ) 運動性なし

( 1 9 ) 滑走性なし本菌株は、バージーズマユユアルォブシスティマティック *クテリオロジー (Bergey's Manual of Systesat ic Bacteriology) 、第 1巻 ( 1 984) 及びバージーズマユユアルォブディターミネイティブバクテリオロジー (Bergey's Manual of Deter籠 inative Bacter iology) 第 9巻 ( 1 99 4 ) に記載のフラボバクテリゥムアクアタイル（Flavobacteriu靂 aquati le)、及びフラ 'ナ *クテリクムメ " =·ンゴセプチカム (Fiavobacteriun nen ingosepticum) (D 縁細菌と考えられるが、前者とはスクロースを資化して酸を形成しない点、カゼインを分解できない点、エスクリンを分解できる点、ゼラチンを液化できる点、ゥレアーゼが陽性である点が異なり、後者とはカゼインが分解できない点、 37 'Cでの生育が遅い点が異なる。そこで本菌株をフラポバクテリゥムに属する細菌と同定し、フラボパクテリゥム s p. S A— 0 082と命名した。なお、上記菌株は Flavobacterium s P . S A— 008 2と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 [曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 3 05 ) ] に平成 7年 3月 29曰より F E RM P— 1 4872 として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に F E R M B P— 5 4 0 2 (国際寄託への移管請求曰：平成 8年 2月 1 5曰）として寄託されている。本菌株の培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、ェンド型フコィダン分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコィダン、海藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ一、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニゥム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。本ェンド型フコィダン分解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、一般に培養温度は、 1 5 ~ 3 0 、培地の p Hは 5 ~ 9がよく、 5〜7 2時間の通気かくはん培養で本ェンド型フコィダン分解酵素の生産量は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本エンド型フコィダン分解酵素の生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。本エンド型フコィダン分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。

上記のフラボパクテリゥム s p . S A— 0 0 8 2株を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。

次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、ィオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコィダン分解酵素を含まない純化された本ェンド型フコィダン分解酵素を得ることができる。

また、上述の培養液から菌体を除去した培養液上清中にも本酵素（菌体外酵素）が大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができるェンド型フコィダン分解酵素の精製例を示す。

フラボバタテリゥム s p . SA- 0082 ( F E RM B P— 5402) をグルコース 0. 25%、ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 05%を含む人工海水（ジャマリンラボラトリ一製） p H 7. 5からなる培地 600 m 1 を分注して殺菌した（ 1 20て、 20分） 2 リットルの三角フラスコに接種し、 24 で 24時間培養して種培養液とした。グルコース 0. 25%、ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 05%、及び消泡剤（信越化学工業製 KM70) 0. 0 1 %を含む人工海水（ジャマリンラボラトリ一製） P H 7. 5からなる培地 20 リットルを 30 リットル容のジャーファーメンターに人れ 1 20てで 20分殺菌した。冷却後、上記の種培養液 600 m l を接種し、 24'Cで 24時間、毎分 1 0 リットルの通気量と毎分 1 25回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。

この菌体を、 20 OmMの食塩を含む 2 OmMの舴酸ーリン酸緩衝液（ P H 7. 5) に魅濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本エンド型フコィダン分解酵素の活性を測定したところ、培地 1 m 1 中に 5 mUの活性が検出された。

本抽出液に、終壞度が 90 %飽和となるように硫酸アンモ-ゥムを加え、かくはん溶解後遠心分離し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸蜀して、 50m Mの食塩を含む 2 OmMの酢酸ーリン酸緩衝液（ P H 7. 5) で充分透析した。透析により生じた沈殿を遠心分雜により除去後、あらかじめ 5 OmMの食塩を含む 2 O mMの酢酸一リン酸緩衝液（ P H 7. 5) で平衡化した D E A E—セファロース F Fのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて充分洗浄後、 5 OmMから 60 OmMの食塩のグラジェントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が 4Mとなるように食塩を加え、あらかじめ 4Mの食塩を含む 20 mMのリン酸緩衝液（ p H 8. 0 ) で平衡化したフヱ二ルセファロース C L一 4 Bのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で充分洗浄後、 4Mから 1 Mの食塩のグラジェントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を限外ろ過器で濃縮後、あらかじめ 5 O mM食塩を含む 1 OmMリン酸緩衝液で平衡化したセフアクリル S— 300でゲルろ過を行い活性画分を集めた。この酵素の分子量をセフアクリル S— 300の保持時間から求めたところ約 46万であつた。次にこの活性画分を 25 OmMの食塩を含む 1 OmMのリン酸緩衝液（ P H 7 ) で透析した。この酵素液を、あらかじめ 25 OmMの食塩を含む 1 OmM のリン酸緩衝液（ PH7) で平衡化したモノ（Mono) Q HR5 5のカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で充分洗浄後、 250 mMから 45 OmMの食塩のグラジェントにより溶出させ、活性圇分を集め、精製酵素を得た。以上の精製ェ程を表 1に示す。

総夕ンバク量総活性比活性収率工程 (雇 g) (ミリ単位）（ミリ単位 /■ (¾) 菌体抽出液 61,900 101,000 1.63 100 硫安塩析 33,800 88,600 2.62 87.7

DEAE-セファロース FF 2, 190 40,400 18.4 40.0 フ； t二ルセファロース CL-4B 48.2 29,000 601 28.7 セフアクリル S-300 7.24 19,600 2,710 19.4 モノ Q 0.824 15,000 18,200 14.9

本酵素の活性測定は下記の様に行う。

2. 5%のガゴメ昆布由来のフコィダン溶液 50 / 1 と、 1 0 // 1の本酵素と、 60 \ の 667 mM塩化ナトリゥムを含む 83mMリン酸緩衝液 P H 7. 5を混合し、 37'C、 3時間反応させた後、反応液 105 1 と水 2 m 1 を混合かくはんし、その 230 nmにおける吸光度（AT) を測定する。対照として、本酵素の代りに、本酵素を溶解している上記緩衝液のみを用いて同様の条件により反応させたもの及びフコィダン溶液の代りに水のみを用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様に吸光度を測定する（AB 1及び AB 2) 。 1単位の酵素は、上記反応系において 1分間に 1 〃 mo 1のマンノースとゥロン酸の間のグリコシド結合を脱離的に切断する酵素量とする。切断された結合の定量は、脱離反応の際に生じた不飽和ゥロン酸のミリモル分子吸光係数を 5. 5 として計算し行う。なお、酵素の活性は下記式により求める。

(AT-AB 1 -AB 2) X2. 105 120/5. 5 105 0. 01 X 1 80 =U/m 1

2. 1 05 ：吸光度を測定するサンブルの液量（m 1 )

1 20 ：酵素反応液の液量（ w 1 )

5. 5 :不飽和ゥロン酸の 230 n mにおけるミリモル分子吸光係数（ZmM) 1 05 ：希釈に用いる反応液の液置（/ 1 )

0. 0 1 ：酵素液量（m 1 )

180 ：反応時問（分）タンパク質の定量は、酵素液の 280 nmの吸光度を測定することにより行う。その際 l mgZm lのタンパク質溶液の吸光度を 1 . 0として計算する。なお基質のガゴメ昆布由来のフコィダンは次の様に調製した。

乾燥ガゴメ昆布を自由粉砕機 M— 2型（奈良機械製作所製）により粉砕し、 1 0倍量の 85%メタノール中で 70 、 2時間処理後、ろ過し、残渣を 1 0倍量のメタノール中で 70て、 2時間処理し、ろ過する。残渣に 20倍量の水を加え、 1 00'C、 3時間処理しろ過により抽出液を得る。抽出液の塩濃度を 40 OmM の塩化ナトリゥム溶液と同じにした後、セチルピリジ -ゥムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離する。その沈殿を、エタノールで充分洗浄し、セチルビリジ -ゥムクロリドが完全に除去できたら、限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量 1 0万）（アミコン社製）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去する。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコィダンを得る。酵素反応生成物の構造解析

上記のヱンド型フコィダン分解酵素は、フコース硫酸含有多糖一 U中に存在する D—マンノースと D—グルクロン酸の間の α 1—4結合を脱離的に分解する酵素であり、得られたフコース硫酸含有多糖一 Uに作用させると下記式（ I ) 、（ II) 、及び（III) の構造を有するオリゴ糖が生成した。

O=C =O

-8S-

6df/X3J 9689Z 6 OA\ 以下、詳細に説明する。

上記の DEAE—セファロース F Fで分離精製した 3つの画分（a) 、（b) 、及び（ c ) をそれぞれ一部だけグライコタツグ及びグライコタツグリージ -ントキットを用いて遼元性末端を、ピリジルー（2 ) —ァミノ化（P A化）し、各 PA化糖（PA— a) 、（八ー 1)) 、及び（？八ー <; ) を得た。（PA— a ) 、（PA— b) 、及び（PA— c) を HPLCにより分析した。

なお、 HP L Cの条件は下 βによった。

(ァ）分子量分画カラムを用いた HPL C分析

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム： SHODEX S B— 803 (4. 6 X 25 Omm) (昭和電工社製）溶離液： 0. 2 M塩化ナトリウム：ジメチルスルホキシド = 9 ： 1

検出：蛍光検出器 F— 1 150 (日立製作所製）にて励起波長 320 nm、蛍光波長 400 nmで検出

流速： 1 m 1 /分

力ラム温度： 50

(ィ）逆相カラムを用いた H PLC分析

装匱： L一 6200型（日立製作所製）

カラム： L一力ラム（4. 6X25 Omm) 〔（財）化学薬品検査協会〕溶離液： 50mM齚酸ートリェチルァミン（ P H 5. 5)

流速： 1 m l Z分

力ラム温度： 40 図 5、 6、及び 7には各々ビリジルー（2) —アミノ化糖化合物（P A— a) 、 (PA— b)、及び（PA— c) の HP L Cの各溶出パターンを示し、図において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時間（分）を示す。下記に式（ I ) 、式（Π) 、及び式（ΠΙ) で表される化合物、すなわち（ a ) ( b ) 、及び（ c ) の物性を示す。図 8に（ a ) の、図 9に（ b ) の、図 1 0に（ c ) のマスのスペクトルを示し、図 1 1 に（ a ) の、図 1 2に（ b ) の、図 1 3に（ c ) のマスマスのスペクトルを示し、各図において縦軸は相対強度（％) 、横軸は m/z値を示す。

更に図 1 4は（ a ) の、図 1 5は（ b ) の、図 1 6は（c ) の 1H— NHRスぺクトルを示し、各図において縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ P P m) を示す。

なお、 1H— NHRでの化学シフト値は H ODの化学シフト値を 4. 6 5 P P mとして表した。

( a ) の物性

分子量 564

M S m/ z 5 63 CM- H⁺ 〕 -

MS/MS m/ z 97 H S 04 - 、 1 57 〔不飽和 D—ダルクロン酸一 H2 0— H+ — 、 1 75 〔不飽和 D—グルクロン酸一 H+ - 、 22 5 L一フコース硫酸一Η2 θ— H+ 〕 - 、 24 3 CL—フコース硫酸一 H⁺ 〕 — 、 3 1 9 〔不飽和 D—グルクロン酸と D—マンノースが結合したもの一 H2 0 -H+ 一、 4 05 〔M—不飽和 D—グルクロン酸一 H 48 3 CM- S O3一 H 一

1H - NMR (D2 0)

δ 5. 78 ( 1 Η, d， J = 3. 7 H z , 4"一 H) 、 5. 26 ( 1 H, d , J = 1 . 2 H z , 1 - H) 、 5. 1 2 ( 1 H, d , J = 4. 0 H z， 1 ' 一 H) 、 5. 0 3 ( 1 H, d， J = 6. l H z，ー H) 、 4. 47 ( 1 H, d - d , J = 3. A , 1 0. 4 H z , 3 ' 一 H) 、 4. 2 1 ( 1 H, b r - s , 2 - H) 、 4. 1 2 ( 1 H, m, 5 ' - H) 、 4. 1 0 ( 1 H, d - d , J = 3. 7 , 5. 8 H z , 3 " - H) 、 4. 0 3 ( 1 H, d , J = 3. 4 H z , 4' 一 H) 、 3. 86 ( 1 H, m, 3 - H) 、 3. 83 ( 1 H, d - d, J = 4. 0, 1 0. 4 H z, 2 ' 一 H) 、 3. 72 ( 1 H, m, 4一 H) 、 3. 72 ( 1 H, m, 5-H) 、 3. 70 (2H, m, 5 - CH₂ の H2 ) 、 3. 65 ( 1 H, d— d , J = 5. 8, 6. 1 H z, 2" - H) 、 1. 08 (3H, d , J = 6. 7H z， 5' — C H3 の ) 糖組成 Lーフコース：不飽和 D—グルクロン酸： D—マンノース = 1 ： 1 ： 1

(各 1分子）

硗酸塩 1分子（L一フコースの 3位）

なお、 1H— NMRにおけるビークの帰属の番号は下記式（IV) の通りである。

( b ) の物性

分子量 724

MS m/z 723 〔M - H+ 〕 -、 361 〔M - 2H⁺ 〕 2- MS/MS m/ z 97 〔HS04 〕—、 175 〔不飽和 D—グルクロン酸一 H⁺ 〕— 、 243 〔Lーフコース硫酸一 H⁺ 〕 -、 321 M-SO3 一 2H ⁺ 〕 2 -、 405 〔M—不飽和 D—グルクロン酸一 2S 03一 H+ 〕— 、 417 (M- L一フコースー 2 S03一 H+〕一

1H - NMR (D2 0) δ 5. 66 ( 1 H, d, J = 3. 4 H z , 4〃一 H) 、 5. 27 ( 1 H, d， J = 7. 3H z， 1 "一 H) 、 5. 22 ( 1 H, d , J = 1. 8 H z , ' — H ) 、 5. 21 ( 1 H, d, J = 3. 7 H z , 1 ' — H) 、 4. 50 ( 1 H, d, J = 3. 1 H z, 4' 一 H) 、 4. 32 ( 1 H, q , J = 6. 7 H z , 5' 一 H ) 、 4. 27 ( 1 H, d - d , J =3. 7, 10. 4H z, 2' 一 H) 、 4. 2 1 ( 1 H, d - d, J = 3. 4, 6. 7H z, 3" - H) 、 4. 18 ( 1 H, d 一 d, J = 1. 8， 1 1. 0 H z, 5 - CHの H) 、 4. 1 5 ( 1 H, b r - s， 2 - H) 、 4. 10 ( 1 H, d - d， J = 5. 8, 1 1. OHz、 5— CHの H) 、 3. 99 ( 1 H, d— d, J = 3. 1， 10. 4 H z, 3 ' — H) 、 3. 90 ( 1 H, m, 5 - H) 、 3. 82 ( 1 H, m, 3 - H) 、 3. 82 ( 1 H, m, 4-H) 3. 54 ( 1 H, b r— t , J = 7. 3H z, 2" - H) 、 1. 1 1 ( 3H， d， J = 6. 7H z， 5' 一 CH3 の H3 ) 糖組成 L一フコース：不飽和 D—グルクロン酸： D—マンノース = 1 ： 1 ： 1

(各 1分子）

硗酸塩 3分子（Lーフコースの 2位と 4位及び D—マンノースの 6位）

なお、 1H— NMRにおけるビークの^属の番号は下記式（V) の通りである。

0

II

0—— S-OH

( ) ( c ) の物性

分子重 1 1 28

MS m/ z 1 1 27 〔M - H⁺ 〕 -

MS/MS m/ z 97 〔HS C 〕 - 、 1 75 (不飽和 D—ダルクロン酸一 H⁺ 〕 - 、 225 〔Lーフコース硫酸一 H2 O— H⁺ 〕 - 、 243 〔L一フコース硫酸一 H+ 〕 — 、 37 1 〔M—不飽和 D—グルクロン酸一 Lーフコース一 SO 3 — 2 H+ 〕 2-、 405 〔硫酸化 L一フコースと D—マンノースが結合したもの一 H 72 1 〔M一 D一マンノース一 Lーフコース一 S 03一 H2 0一 H

1H - NMR (D₂ 0)

δ 5. 69 ( I H, d , J = 3. 7H z , (4) " —H) 、 5. 34 ( 1 H, s , ( 1 ) - H) 、 5. 1 6 ( I H, s， 1一 H) 、 5. 1 0 ( 1 H, d , J = 4. 0 H z， ( 1 ) ' 一 H) 、 5. 50 ( 1 H， d , J = 3. 7 H z , 1 ' 一 H ) 、 . 93 ( I H, d， J = 6. 4 H z , ( 1 ) —H) 、 4. 50 ( I H, d - d , J = 3. 4, 1 0. 7 H z , 3 ' 一 H) 、 4. 47 ( 1 H, d - d, J = 3. 4, 1 0. 4 H z , ( 3) ' 一 H) 、 4. 39 ( 1 H, d , J = 7. 9 H z， 1 " —H) 、 4. 33 ( I H, b r - s，（2 ) - H) 、 4. 1 ( 1 H, m, 2 - H) 、 4. 1 2 ( l H， m, (3) " —H) 、 4. 1 2 ( 1 H, m, 5 ' — H) 、 4. 1 2 ( 1 H， m, (5) ' 一 H) 、 4. 04 ( 1 H， m, 4' 一 H) 、 4. 03 ( 1 H， m, (4) ' 一 H) , 3. 85 ( I H, m， 2 ' 一 H) 、 3. 85 ( I H, m, (2) ' 一 H) 、 3. 82 ( 1 H, m, 3 - H) 、 3. 8 2 ( 1 H, m, (3) - H) 、 3. 73 ( 1 H, m, 4一 H) 、 3. 73 ( 1 H, m, 5 - H) 、 3. 73 ( 1 H， m, (4)一 H) 、 3. 70 (2 H, m, 5 - CH2 の H2 ) 、 3. 70 ( 2H, m, (5) 一 CH2 の H2 ) 、 3. 67 ( 1 H, m， 5" - H) 、 3. 62 ( 1 H, m， 4"一 H) 、 3. 62 ( 1 H， m，

(2) " —H) 、 3. 62 ( 1 H， m, (5) - H) 、 3. 5 1 ( I H, t , J = 8. 9 H z， 3 " - H) 、 3. 28 ( 1 H, t , J = 7. 9 H z , 2" - H) 、 1. 09 ( 3 H, d , J = 6. 7 H z, (5 ) ' 一 CH3 の H3 ) 、 1. 07 ( 1 H, d， J = 6. 7 H z , 5' 一じの）糖組成 L—フコース：不飽和 D—ダルクロン酸： D—グルクロン酸： D—マンノース =2： 1 ： 1 ： 2 (Lーフコースと D—マンノース各 2分子と不飽和 D—グルクロン酸と D—グルクロン酸各 1分子）

硗酸塩 2分子（各 Lーフコースの 3位）

なお、 1H— NMRにおけるビークの烯厲の番号は下 3己式（VI) の通りである。

得られたフコース硫酸含有多糖一 uに上記ェンド型フコィダン分解酵素を作用させると反応の進行と共に脱離反応が起こつて 230 n mの吸光度が増加するが、脱離反応の生成物となる不飽和へキス口ン酸基が主要反応生成物のすべてにあることから得られたフコース硫酸含有多糖一 Uの分子内にへキスロン酸とマンノースが交互に結合した糖鎖の存在が示唆された。得られたフコース疏酸含有多糖一 Uの構成糖の多くはフコースであるためフコース硫酸含有多糖一 Uは一般の多糖より酸に分解され易い。一方、へキスロン酸やマンノースの結合は比較的酸に強いことが知られている。本発明者らはガゴメ昆布のフコース硗酸含有多糖混合物の分子内に存在するへキス口ン酸とマンノースが交互に結合している糖鎖中のへキスロン酸の種類を明らかにするためにカーボハイドレートリサーチ、第 12 5卷、第 283〜 290頁（ 1984) の方法を参考にして、まずフコース硫酸含有多糖混合物を 0. 3Mのシユウ酸に溶解し 100'C、 3時間処理したものを分子量分画し、分子量が 3000以上の画分を集め、更に陰イオン交換樹脂により吸着分を集めた。この物質を凍結乾燥後 4Nの塩酸で酸加水分解し、 PH8に調整後、 PA化し、 HPLCによりゥロン酸の分析を行った。なお HP LCの条件は下記によった。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム：パルパック夕イブ N (4. 6 mmX 250 mm) (宝酒造社製）溶離液： 200 mM酢酸ートリエチルァミン緩衝液（ P H 7. 3) ：ァセトニ

トリル = 25 ： 75

流速： 0. 8m 1 /分

力ラム温度： 40*C

なお、 P A化へキスロン酸の標準物質はグルクロン酸はシグマ社製、ガラクッ口ン酸は和光純薬社製、ィズロン酸はシグマ社製の 4ーメチルゥンベリフヱリル α— Lーィズロニドを加水分解したもの、マンヌロン酸及びグルロン酸はァクタ •ケミカ ·スカンヂナヴィ力（Acta C eiica Scandinavica)、第 15巻、第 13 97〜 1398頁（ 1961 ) 記載の方法に従い、和光純薬社製のアルギン酸を加水分解後陰ィオン交換樹脂で分離したものを PA化することにより得た。この結果、上記フコース硫酸含有多糖混合物の糖鎖中に含まれるへキスロン酸はグルク口ン酸のみであることが判明した。更に上記糖鎖の加水分解物中のグルクロン酸を陰ィオン交換樹脂により D—マンノースと分離し凍桔乾燥後その比旋光度を測定したところ右旋性でありダルクロン酸は D—グルクロン酸であることが判明した。

また、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖混合物をあらかじめ上記のェンド型フコィダン分解酵素で処理したものについても上記と同様にシュゥ酸で酸加水分解したが、 D—ダルク口ン酸と D—マンノースが交互に結合したポリマーは検出されなかった。このことから、上記のエンド型フコィダン分解酵素が脱離反応により切断するフコース硫酸含有多糖の骨格構造は D—グルクロン酸と D—マンノースが交互に結合した構造を持つことが判明した。更に、 D—グルクロン酸と D—マンノースのそれぞれの結合位置とグリコシド結合のァノメリック配置を調べるため、シュゥ酸分解により得られたボリマーを NMR分析した。

ポリマーの NMRの測定結果を以下に示す。但し、 1H— NMRでの化学シフト値はトリェチルァミンのメチル基の化学シフト値を 1. 1 3 P pmに、 ¹³ C— NMRではトリエチルアミンのメチル基の化学シフト値を 9. 32 p pmとして表した。

1H - NMR (D2 0)

δ 5. 25 ( 1 Η, b r - s, 1 - H) 、 4. 32 ( 1 H, d， J = 7. 6 H z , 1 ' 一 H) 、 4. 00 ( 1 H, b r - s, 2— H) 、 3. 71 ( 1 H, m, 5' —H) 、 3. 69 ( 1 H， m， 5— CHの H) 、 3. 68 ( 1 H， m, 3 - H) 、 3. 63 ( 1 H, m, 5 - CHの H) 、 3. 63 ( 1 H， m, 4 ' 一 H) 、 3. 57 ( 1 H， m, 4 - H) 、 3. 54 ( 1 H， m, 3 ' - H) 、 3. 53 ( 1 H, m, 5 - H) 、 3. 25 ( 1 H， t, J = 8. 5Hz、 2' 一 H) ¹³C - NMR (D2 0)

5 1 75. 3 (5' 一 COOHの C) 、 102. 5 ( 1 ' 一 C) 、 99. 6 ( 1一 C) 、 78， 5 (2 - C) 、 77. 9 (4' 一 C) 、 77. 0 (3 ' 一 C ) 、 76. 7 (5' 一 C) 、 73. 9 (5 - C；) 、 73. 7 (2' 一 C) 、 70. 6 (3 - C) 、 67. 4 (4一 C) 、 61. 0 (5 - CH2 OHの C) なお、ビークの帰属の番号は下記式（VII) の通りである：

D—グルクロン酸の 1位の立体配置はそのビシナル結合定数が 7. 6 H zであることから /?一 D—ダルク口ン酸であると決定した。

また、マンノースの 1位の立体配置はその化学シフト碴から 5. 25 p pmであることから α— D—マンノースであると決定した。

構成糖の結合様式は 1H検出異種核検出法である HMB C法を用いて行った。

Η— NMRの埽属には DQF— COS Υ法及び ΗΟΗΑΗΑ法を、 ¾3_C -NM Rの屈には H S Q C法を用いた。

HMBCスペクトルにより 1一 Hと 4' 一 Cの間及び 4' 一 Hと 1一 Cの間、 1 ' 一 Hと 2— Cの間及び 2— Hと 1 ' 一 Cの間にそれぞれクロスビークが認められた。このことから D—グルクロン酸は結合で D—マンノースの 2位に、 D 一マンノースは α結合で D—ダルクロン酸の 4位にそれぞれ結合していることが明らかとなった。

上記の結果を考え併せると、（a) は、還元末端残基である D—マンノースに不飽和 D—グルクロン酸と、硗酸基が結合した L一フコースが結合した構造を持つこと、（b) は硫酸基が結合した還元末端残基である D—マンノースに不飽和 D—グルクロン酸と、 2個の硫酸基が結合した Lーフコースが桔合した構造を持つこと、（c ) は還元末端残基である D—マンノースに D—グルクロン酸と、硗酸基が結合した Lーフコースが結合し、その D—グルクロン酸に D—マンノースが結合し、更にその D—マンノースに不飽和 D—グルクロン酸と、碇酸基が結合した L一フコースが結合した構造を持つことが判明した。以上、得られたフコース硫酸含有多糖一 Uは、 D—グルクロン酸と D—マンノースが交互に結合した構造を持ち、少なくとも 1つ以上の D—マンノースに L一フコースが結合している構造を有する。

また、下記一般式（VIII) で表される部分構造を有する（但し、式中の少なくとも 1つのアルコール性水酸基は疏酸エステル化しており、また nは 1以上の整数を表す）。

本発明により、本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖一 Uが提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uは構成糖としてゥロン酸を含有し、フラボバタテリゥム S P. S A- 0082 ( F E R M BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化し、少なくとも上記式（ 1 ) 、（H) 、（III) で表される化合物より選択される 1 種以上の化合物が生成する。その分子量、分子量分布、糖組成は本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uをなんら限定するものではなく、任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖一 uを翻製することができ、糖組成等の理化学的性質が明確なフコース硫酸含有多糖を提供することができる。

本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uはフコース硫酸含有多糖一 Fの有する ¾い抗凝血活性を有さず、抗凝血活性を実質上示さないフコース硓酸含有多糖が提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uは純化されたフコース硗酸含有多糖として制がん剤、抗転移剤、発がん予防剤等に使用でき、また抗フコース硫酸含有多糖抗体の抗原としても有用である。更にこのフコース硫酸含有多糖一 Uより、上記式（ I ) 、（1 1 ) 、（1 H ) 等の構造を有するオリゴ糖が製造でき、これらの新規化合物の製造にも有用である。次に本発明のフコース硫酸含有多糖一 F及びその製造方法について記載する。本発明の方法を用いて本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fを製造する際にはフコース硫酸含有多糖一 Uを分解する能力を有する分解酵素をフコース硫酸含有多糖混合物に作用させればよく、酵素反応が終了後低分子化したフコース硫酸含有多糖一 Uを限外ろ過などで除去すればよい。上記分解酵素はフコース硗酸含有多糖一 Uを逮択的に分解できる醉素であればいかなる酵素でもよいが、具体例としては例えば、フラボパクテリゥム（Fl avobacter iun) s p . S A— 0 0 8 2株 ( F E R M B P— 5 4 0 2 ) が生産する上記のェンド型フコィダン分解酵素が挙げられる。本酵素を作用させる場合は酵素反応が有利に進むように基質濃度や温度、 P H 等を設定すればよいが、基質濃度は通常 0 . 1から 1 0 %程度、温度は 2 0から 4 0 'C付近、 p Hは 6から 9付近が望ましい。また、フコース硫酸含有多糖混合物を培地に添加し、フコース硫酸含有多糖一 Uを分解する能力を有する分解酵素生産能を有する微生物をその培地で培養し、培養後の培地から精製してもよい。使用する微生物はフコース硫酸含有多糖一 U を分解する能力を有する分解酵素を生産する微生物であればいかなる微生物でもよいが、具体的には上記記載のフラボパクテリゥム S P. S A— 0082株

( F E RM B P— 5402 ) 又はフコイダノノ、 'クタ一マリナス（Fucoidanob acter larinus) S I— 0098株（F ERM B P— 5403) が挙げられる。培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、該分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコィダン、海藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラクト

—ス、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ一、肉ヱキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニゥム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。

また、培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、フコース硫酸含有多糖一 Uの分解活性が最大になるように設定するのはもちろんのことであるが、一般に培養温度は 15~30 、培地の pHは 5〜9で、 5~72時間の通気かくはん培養を行えばよい。培養終了後、低分子化したフコース硫酸含有多糖一 Uや培地中のフコース硫酸含有多糖一 F以外の成分は限外ろ過などで除去すればよい。なお、上記のフコイダノバクタ一マリナス S I— 0098株は、青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りであ ®

1. フコイダノバクタ一マリナス S I— 0098

a. 形態的性質

( 1 ) 本菌は双球菌（短かん菌）である。

幅 0. 5〜0. 7 im

長さ 0. 5~0. 7 am

(2 ) 胞子の有無なし

(3) グラム染色性陰性

b. 生理的性質 ( 1 ) 生育の温度範囲

37 'Cで生育できる。好通な生育温度は 15~28 である,

(2 ) 酸素に対する態度好気性

(3) カタラーゼほ性

(4 ) ォキシダーゼ陰性

( 5 ) ゥレアーゼ陰性

(6 ) 加水分解

デンプン陽性

ゼラチン陰性

カゼイン陰性

エスクリン隔性

(7 ) 硝酸塩の通元陰性

(8 ) インドールの生成陰性

(9) 硗化水素の生成陽性

(10) ミルクの «|固陰性

(11) ナトリクムの要求性頃性

(12) 塩類要求性

0%食塩培地での生育陰性

1 %食塩培地での生育陰性

海水培地での生育陽性

(13) キノン系メナキノン 7

(14) 菌体内 D NAの GC含 S 61 %

(15) 細胞壁のジアミノビメリン酸陰性

(16) グリコリル試 K 陰性

(17) ヒドロキシ脂肪酸の存在隅性

(18) 0 F—テスト 0

(19) 集落の色調特徴的な集落色素を生成せず

(20)連勦性あり

(21) 滑走性なし (22) 鞭毛極単毛本菌株は、バージーズマニュアルォブディターミネイティブバクテリォロジ一、第 9巻（ 1994) に記載の基本分類によればグループ 4 (グラム陰性好気性かん菌及び球菌）に分類される。しかしながら本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン 7を有し、 GC含量が 61 %の点でグループ 4に属する菌と大いに異なる。基本的にグラム陰性細菌は電子伝達鎖にュビキノンを有し、グラム陽性細菌はメナキノンを有している。

グラム陰性細菌であるフラボパクテリゥム属及びシトファーガ（Cytophaga)属は例外的に電子伝達鎖にメナキノンを有しているが、これらの属に厲する細菌の G C含量は、土壌細菌であるシトファーガァーベンシコラ（Cytophaga arvens icola)が 43〜46%、海洋細菌であるシトファーガジフルエンス（Cytophag a diffluens)、シトファーガファーメンタンス ( Cytophaga fer編 entans) 、シトファーガマリーナ（Cytophaga carina) 、及びシトファーガゥリギノーサ (Cytophags ul inosa)が 42%であり、本菌株の性質とは全く異なる。更に、本菌株と既同定株の 1 6 S r DNA配列の相同性を比較したところ、最も相同性の高い賊同定株べルコミクロビゥムスピノサム (Verruco画 icrobiun spinosuB) においてもその相同性は、 76. 6%であった。 1 6 S r D NA配列の相同性が 90%以下の場合、両細菌の厲が異なることは一般に広く知られていることから、本発明者らは、本菌株は既存の属に属さない新属の細菌であると断定し、よって本菌株をフコイダノバクタ一マリナス S I— 0098と命名した。なお上記菌株は Fucoidanobacter narinus S I一 0098と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 [日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305) ] に平成 7年 3月 29日より F ERM P— 1 4873 として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に F E RM

BP— 5403 (国際寄託への移管請求 S ：平成 8年 2月 1 5日）として寄託されている。本発明者らは前述のように 0 . 6 ~ 3 Mの 1種類又は 2種類以上の塩類の存在下で本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fとフコース硫酸含有多糖一 Uが酸性多糖凝集剤に対して全く異なる挙動を示すことも見出した。

例えば本発明の方法を用いて、フコース硫酸含有多糖混合物の水溶液から本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fを分離することができる。

まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液に 1種又は 2種以上の塩類を添加しその総濃度を 0 . 6〜3 Mとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。こうして塩 »度を瘸整した後塩化セチルビリジユウム等の酸性多糖凝集剤をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、沈殿を集めると本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fが得られる。

しかし上記塩澳度を 2 M超にすると本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fが塩化セチルビリジニゥムにより沈殿を形成しにくくなるので注意を要する。本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fとフコース硫酸含有多糖一 Uを分離する目的では通常 1 . 5 M程度の塩濂度で目的は連成できる（図 1の説明参照）。次に必要に応じてこの沈殿を洗浄後、沈殿中の塩化セチルピリジニゥムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fを得る。こうして得られた本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fから色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよい。本発明者らは、前述の様にフコース K酸含有多糖を陰イオン交換樹脂で精製する際に 2価の陽ィオンが共存すると単位樹脂量当りに吸着するフコース硫酸含有多糖釐が增加し、フコース硗酸含有多糖の分離が良くなることも見出している。すなわち、本発明の方法を用いて本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fを製造する際には、まずフコース硫酸含有多糖混合物に 2価の陽ィオン源となる薬品を好ましくは 1 m M以上添加する。次に、陰イオン交換樹脂を 2価の隔イオンを好ましくは 1 mM以上含む液で平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖混合物を吸着させる。この陰ィオン交換樹脂を平衡化した液で充分洗浄後、例えば塩化ナトリウムのグラジントによりフコース硫酸含有多糖一 Fを溶出させる。本方法を用いる場合、添加する 2価陽イオンの壤度は 1 mM以上ならばよい。また本方法に用いる二価の陽ィオン源となる薬品はカルシウム塩ゃバリゥム塩が特にその効果が優れているが、特に限定されるものではなく、硫酸マグネシウム、塩化マンガン等も使用することができる。本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fは例えば実施例 8に記載のように得ることができる。以下、このフコース疏酸含有多糖の理化学的性質を示すが、本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fはこの例に限定されるものでは無い。得られたフコース碇酸含有多糖一 Fの分子量をセフアクリル S— 500を用いたゲルろ過法により求めたところ、約 19万を中心とした分子量分布を示した（図 17参照）。なお、図 17において、縦軸はフノール一硫酸法により測定した試料中の糖含量を 480 n mの吸光度で示し、横軸はフラクシ a ンナンバーを示す。

また、ゲルろ過の条件を下記に示す。

カラムサイズ： 3. 08 X 162. 5 cm

溶媒： 0. 2 Mの塩化ナトリウムと 10%のエタノールを含む 1 OmMのリン酸ナトリゥム緩衝液（pH6. 0)

流速： 1. 5m I /分

サンブル禳度： 0. 25%

サンブル液量： 20m l

分子量標準物質： Shodex STANDARD P-82 (昭和電工社製）次に、得られた本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fの成分を分析した。

まず、ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（Journal of Biolo gical Chemistry), 第 175巻、第 595頁（ 1948) の記載に従いフコース量を定量した。

次に、得られたフコース硫酸含有多糖一 Fの乾燥標品を 1規定の塩酸に 0. 5 %の濃度で溶解し、 1 10 で 2時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、グライコタツグ及びグライコタツグリージ；ントキットを用いて加水分解して得られた単糖の通元性末端をピリジルー（2) —ァミノ化（PA化）し、 HP LCにより構成糖の比率を調べた。なお、 HP L Cの条件は下記によった。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム：パルパックタイプ A (4. 6 mm 15 Omm)

溶離液： 700 mMホウ酸緩衝液（pH9. 0) ：ァセト - トリル = 9 : 1 検出：蛍光検出器 F— 1 1 50 (日立製作所製）にて励起波長 310 nm、蛍光波長 380 nmで検出。

流速： 0. 3m 1 分

力ラム温度： 65 次に、アナリティカルパイオケミストリー（Analytical Bioche跚 istry)、第 4巻、第 330頁（ 1962) の記載に従いゥロン酸量を定 5した。

次に、バイオケミカルジャーナル（Bioche腿 ical Journal)、第 84巻、第 1 06頁（ 1962) の記載に従い硫酸含量を定置した。

以上の桔果、得られたフコース硫酸含有多糖一 Fの構成糖はフコース、ガラクトースで、そのモル比は約 1 0 : 1であった。ゥロン酸及びその他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコースと «Ε酸基のモル比は約 1 ： 2であつ

1 %のフコィダン一 F溶液 16m 1と、 5 OmMのリン酸緩衝液（P H 8. 0) 12m I と 4 Mの塩化ナトリウム 4m l と 32mU/m lの前出のフラボバクテリウム S P. SA-0082 (FERM B P— 5402 ) 由来のエンド型フコィダン分解酵素溶液 8m 1を混合し、 25*Cで 48時間反応させた。反応による分解物の生成は認められず、その低分子化も認められなかった。

次に、得られたフコース硫酸含有多糖一 Fのカルシウム塩の I Rスペクトルをプーリ変換赤外分光光度計 J I R— D I AMOND20 (日本電子社製）により測定したところ図 18に示すスぺクトルが得られた。なお、図 18において縦軸は透過率（％) 、横軸は波数（c m— 1) を示す。次に、得られたフコース硫酸含有多糖一 Fのナトリウム塩の NMRスぺクトルを 50 OMH zの核磁気共鳴装置 J ΝΜ- 500型核磁気共鳴装置（日本電子社製）により測定したところ、図 19に示すスぺクトルが得られた。図 1 9中、縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ P P m) を示す。なお、 1H— NMRでの化学シフト値は HODの化学シフト値を 4. 65 p pmとして表した。

1H - NMR (D2 0)

5. 30 (フコースの 1位の H) 、 1. 19 (フコースの 5位の CH3 の H) 次に、得られたフコース硫酸含有多糖一 Fの凍結乾燥物の比旋光度を高速 ·高感度旋光計 S E P A— 300 (堀場製作所製）により測定したところ、一 135 度であつた。本発明により、本発明のフコース硫酸含有多糖一 Uと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖一 Fが提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fは構成糖としてゥロン酸を実質的に含有せず、フラボパクテリゥム S P. SA— 0082 (F E RM BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化されない。その分子量、分子量分布、糖組成は本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fをなんら限定するものではなく、任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖一 Fを調製することができ、糖組成、還元末端等の理化学的性質が明確で、 ¾酸化度が極めて高いフコース硫酸含有多糖一 Fを提供することができる o 本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fは、実質上抗凝血活性を有さないフコース硫酸含有多糖一 uと分離しているため、強い抗凝血活性を有しており、該フコース硫酸含有多糖一 F及び Z又はその分解物は純化されたフコース ½酸含有多糖として抗凝血剤に使用でき、また抗フコース硗酸含有多糖抗体の抗原としても有用である。本発明のフコース磙酸含有多糖、その分解物をがん細胞の培養液に 1 ju g Z m 1以上の濃度で添加すれば、添加後 1 曰から数日で癌細胞はアポトーシスを起こす。すなわち、本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解物は強いアポトーシス锈発作用を有する。なお、これらの物質は正常細胞にはアポトーシスを锈発せず、毒性も示さない。特に、食用褐藻植物、ナマコ由来のフコース硫酸含有多糖、その分解物は安全性が高い。本発明のアポトーシス誘発剤を製剤化するには、フコース硫酸含有多糖及び/ 又はその分解物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せればよい。一般的には、本発明のフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と E合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、頼粒剤、散剤、粉末剤、カブセル剤等の固形剤、通常液剤、懸灞剤、乳剤等の液剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体を添加することにより液状となし得る乾 «I品とすることができる。

本発明のアポトーシス锈発剤は、経口剤、あるいは注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。

医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マン-ット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、瑭味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。これらの具体例としては、以下に示す物が挙げられる》 (結合剤）デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシブ口ビルスターチ、メチルセルロース、カルポキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、ェチルセルロース、ボリビニルビ口リドン、マクロゴール。

(崩壊剤）デンプン、ヒドロキシプロビルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロビルセルロース。

(界面活性剤）ラゥリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、シ β糖脂肪酸エステル、ボリソルベート 8 0。

(潤沢剤）タルク、ロウ類、水素添加植物油、シ a糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール。

(流動性促進剤）軽質無水ケィ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ゲイ酸ァルミ -ゥム、ケィ酸マグネシウム。

また、経口用の液剤としては、懸濁液、ェマルジ ₃ ン剤、シロップ剤、エリキシル剤とすることができ、これらの各種剤型には矮味、矯臭剤、着色剤を配合してもよい。

一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分であるフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドゥ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセィ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ボリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。本発明のアポトーシス踩発剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。本発明のアポトーシス誘発剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年 (S &、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人 1 日当り 1 ~ 1 0 0 O m g、好ましくは 1 0 ~ 2 0 0 m grである。もちろん投与量は、種々の条件によつて変動するので、上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。制がん作用を有する、本発明のフコース硫酸含有多糖一 U、フコース硫酸含有多糖一 F及び/又はその分解物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば制がん剤を製造することができる。制がん剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。一般的には、本発明のフコース硓酸含有多糖及び/又はその分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、頼粒剤、散剤、粉末剤、カブセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤であることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。

制がん剤としては、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによつても投与することができる。

医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準じ使用すれば良い。

制がん剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。制がん剤としての投与置は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人 1 日当り l ~ 1 0 0 0 m gr、好ましくは 1 0 ~ 2 0 0 m gである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で充分な埸合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。発がん抑制作用を有する、フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組台せ製剤化すれば発がん予防剤を製造することができる。発がん予防剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。一般的には、フコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、頼粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。

発がん予防剤としては、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。

発がん予防剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。発がん予防剤としての投与置は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないがー般には製剤中に含有される有効成分の重が成人 1 曰当り l〜 1 0 0 0 m g、好ましくは 1 0 ~ 2 0 0 m srである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で充分な壜合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解物は天然由来物質であり、マウスに経口投与を行っても毒性は認められない。本発明の薬剤は感染症、免疫機能の低下又は昂進あるいはがん疾患、ウィルス性疾患等の治療剤として用いることが期待される。発がん予防剤として健康保持に使用することができる。また本発明のアポトーシス誘発方法は生体防御機構、免疫機能あるいはがん、ウィルス性疾患等との関係の研究、アポトーシス誘発阻害剤の開発等に有用である。特に、食用掲藻植物、食用ナマコから、本発明のフコース硗酸含有多糖、その分解物を調製すれば、これらは食品として長い歴史を有するものであり、これらから調製したフコース ¾酸含有多糖、その分解物は、経口投与の埸合において、極めて安全性の高いものである。次にフコース硫酸含有多糖は極めて分子量が大きな硫酸化多糖であり、そのまま医薬品として用いるより、抗原性、均一性、抗凝血活性などの改善のため、フコース磙酸含有多糖をある程度分解することが必要とされているが、本発明により、フコース硫酸含有多糖一 Fのみを選択的に分解する酵素、該酵素を作用させて得られるフコース ¾酸含有多糖一 Fの低分子化物が提供された。本発明に使用される菌株としては、アルテロモナス（A eroMnas ) 属細菌に属し、本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよい。また、賅エンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有する菌株の具体例としては、例えば、アルテロモナス S P . S N— 1 0 0 9株が挙げられる。該菌株由来のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素をフコース硫酸含有多糖に作用させれば、本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fの低分子化物を得ることができる。本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りである。

a . 形態的性質

( 1 ) 本菌はかん菌である。

幅約 1 m 長さ約 2 ^ m

(2) 胞子の有無なし

(3) グラム染色性陰性

b . 生理的性質

( 1 ) 生育の温度範囲

好適な生育温度は 15— 30 である。 4 'Cあるいは 40 では生育できな、。

(2) 酸素に対する態度好気性

(3) カタラーゼ陽性

(4) ォキシダーゼ暘性

(5) リパーゼ陽性

(6) 資化性

グルコース隔性

マンノース陰性

スクロース陽性

ラクトース陰性

セロビオース頃性

メリビオース陰性

マンュトール陽性

グリセリン陽性

メタノール陰性

DL—リンゴ酸陰性

コハク酸陰性

フマル酸陰性

クェン酸陰性

サリシン陰性

(7) 加水分解

デンプン陰性

ゼラチン陰性 (8) 硝酸塩の還元陰性

(9) 脱窒反応陰性

( 10 アルギン酸の分解 R§性

( 1 1 ) ーヒドロキシ K酸の利用陰性

( 12) ポリヒドロキシ醵酸の蓄積陰性

( 13 ) ナトリクムの要求性陽性

( 1 )塩類要求性

0%食塩培地での生育陰性

1 %食塩培地での生育陰性

海水培地での生育隔性

( 15) キノン系ュビキノン 8

( 16 ) 菌体内 DNAの GC含量 36%

( 17 ) 0 F—テスト 0

( 18)集落の色調特徴的色素を生成せず

( 19)発光性陰性

(20)運動性 K性

(21 ) 鞭毛極単毛本菌株は、バージーズマニュアルォブシスティマティックノクテリオロジ一、第 1卷、第 343〜 352頁（ 1984) 、及びバージーズマ二ユアルォブディターミネイティブパクテリォロジ一、第 9巻、第 75頁、第 1 32〜 133頁（ 1994) に記載されているアルテロモナス属細菌と同定した < しかしながら、本細菌の生理的性状は文献に記載されているいずれの菌種とも一致せず G C含量も低い値であった。そこで、本菌株をアルテロモナス S P. S N- 1009と命名した。

なお上記菌株は A erouonas s P. S N - 1009と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 [臼本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305) ] に平成 8年 2月 13日より FERM P— 15436として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に F E RM BP - 5 7 4 7 (国際寄託への移管猜求曰：平成 β年 1 1月 1 5曰）として寄託されている。本発明に使用する菌株の培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコース硗酸含有多糖、海藻粉末、アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコース、マン - トール、グリセロール、サッカロース、マルトース等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ一、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニゥム等が適当である。その他にナトリゥム塩、リン酸塩、力リゥム塩、マグネシゥム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。

また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育する本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培饕条件により変動するが、一般に培養温度は、 1 5て~ 3 0て、培地の Ρ Ηは 6 ~ 9がよく、 5 ~ 7 2時問の通気かくはん培養で本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の生産量は最高に達する。

培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。

上記のアルテロモナス S P . S Ν— 1 0 0 9を適当な培地で培餐し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。

次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコィダン分解酵素を含まない純化された本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を得ることができる。また、上述の培養液から菌体を除去した培養液上清中にも本酵素が大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができる。本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の化学的及び理化学的性質は次の通りである。

( i )作用：下き己理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖、すなわちフコ

一ス硗酸含有多糖一 Fに作用して、該フコース硓酸含有多糖一 F を低分子化させる。

( ) 構成糖：ゥロン酸を実質的に含有しない。

( b ) フラボバクテリゥム（Flavobacteriu隨） s p， SA-0082 (F E RM B P— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により実質上低分子化されない。

下妃理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖、すなわちフコース硗酸含有多糖一 Uに作用しない。

( c )構成糖：ゥ口ン酸を含有する。

( d ) フラボバクテリゥム（Flavobacteriu删） s p . SA-0082 (F ERM B P— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下記式（ I ) 、（H) 、（III) より選択される少なくとも一種以上の化合物が生成する。

O= =O

(ii) 至適 p H ：本酵素の至適 p Hは 7~ 8付近である（図 20 ) 。

すなわち図 20は本酵素の p Hと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％) 、横軸は P Hを示す。実線は、還元性末端を PA化したフコース硫酸含有多糖一 F (PA- F F ) を基質に用いた曲線であり、点線は下記（V ) 一（2 ) 3載のフコース硫酸含有多糖— Fを基質に用いた場合の曲線である。

(iii) 至適温度：本酵素の至適温度は 30~35 *C付近である（図 2 1 ) 。すなわち図 2 1 は、本酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％) 、横軸は温度 C) を示す。実線は、還元性末端を P A化したフコース硫酸含有多糖一 F ( PA- F F ) を基質に用いた場合の曲線であり、点線は下記（V ) — （ 2 ) 記載のフコース硫酸含有多糖一 Fを基質に用いた場合の曲線である。

(iv) 分子量：本酵素の分子量を、セフアクリル（Sephacryl) S - 2 00 (フアルマシア社製）を用いたゲルろ過法により求めたところ、約 1 0万であった。

( V ) 酵素活性の測定方法：

本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素活性の測定は次のようにして行った。

まず、本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の基質となるフコース硫酸含有多糖一 F、及び P A— F Fを下記（ 1 ) から（3 ) の工程により調製した。

( 1 ) ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物の調製

乾燥ガゴメ昆布 2 K gを自由粉砕機 M— 2型（奈良機械製作所製）により粉砕し、 4. 5倍量の 8 0%エタノール中で 80て、 2時間処理後、ろ過した。残渣に対し、上記 80 %エタノール抽出、ろ過という工程をさらに 3回緣り返し、ェタノール洗浄残渣 1 870 gを得た。残渣に 36リットルの水を加え、 1 00'C、 2時間処理し、ろ過により抽出液を得た。抽出液の塩澹度を 40 O mMの塩化ナトリゥム溶液と同じにした後、 5%のセチルビリジェゥムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離した。その沈殿を、 80 %のェタノ —ルで繰り返し洗浄し、セチルビリジ -ゥムクロリドを完全に除去した後、 3 リットルの 2M塩化ナトリクムに溶解し、不溶物を遠心分離で除去し、 2Mの塩化ナトリゥムで平衡化した 100m 1の DEAE—セル口ファイン A— 800を懸濁し、かくはん後ろ過し、樹脂を除いた。このろ液を、 2 Mの塩化ナトリウムで平衡化した 100m 1の DEAE—セルロフアイン A— 800のカラムにかけ、通過画分を限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量 10万）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物 82. 2 srを得た。

(2) フコース硫酸含有多糖一 Fの調製

上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物 68Γを 600m l の 0. 2 Mの塩化カルシゥムを含む 2 OmMの酢酸ナトリウム（pH 6. 0) に溶解後、あらかじめ 0. 2 Mの塩化カルシウムを含む 2 OmMの酢酸ナトリウム（pH6. 0 ) で平衡化した 3600m 1の DEAE—セファロース F Fのカラムにかけ、 0. 2 Mの塩化カルシウムを含む 2 OmMの齚酸ナトリウム（pH6. 0) で充分力ラムを洗浄後、 0~2Mの塩化ナトリウムのグラジェントで溶出した。

塩化ナトリゥム濃度が 0. 75 M以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖一 F画分を集め、排除分子量 1 0万の限外ろ過胰を装着した限外ろ過器で港縮脱塩後凍結乾燥し、フコース磙酸含有多糖一 Fの凍結乾燥標品を、 3. 3 sr得た。

(3) PA— FFの調製

上記のフコース硫酸含有多糖一 Fの凍結乾燥標品 12mgを水 480 ^ 1に溶解し、 12 1ずつ 36本に分注後、凍結乾燥しグライコタツグ及びグライコ夕ッグリージヱントキットを用いて還元性末端を、 P A化し、 P A— F Fを得た。得られた PA— FFを、 15m Iの 10%のメタノールを含む 1 OmMの舴酸アンモニゥム溶液に溶解し、セル口ファイン GCL— 300のカラム（40 X 90 Omm) によりゲルろ過し、高分子画分を集めた。得られた高分子画分をポアサイズ 3500の透析膜を用いて充分透析して脱塩し、次にエバボレーターにより 5m 1に濃縮して本発明のヱンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の基質用 PA— FFとした。

また、こうして得られた PA— F Fを、市販のビリジルー（2) —アミノ化フコース（宝酒造社製）の蛍光強度（励起波茛 320 n m、蛍光波長 400 n m) と比較することにより定量したところ約 40 nmo 1であった。上記（ 1 ) 及び（2) の工程により得られたフコース硫酸含有多糖一 Fを用いて本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の活性を測定するときは下記の要傾で行った。

すなわち、 2. 5%のフコース硗酸含有多糖一 F溶液 1 2 1 と、 6〃 1の 1 M塩化カルシウム溶液と 12 1の 1 M塩化ナトリゥム溶液と、 72// 1の 50 mMの酢酸とイミダゾールとトリス一塩酸を含む緩衝液（PH7. 5) と、 1 8 n 1の本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素とを混合し、 30*C、 3時間反応させた後、反応液を 1 00て、 1 0分間処理し、遠心分雜後、 1 00 を HPLCにより分析し、低分子化の程度を測定した。

対照として、本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の代りに、本発明のェンド型フコース磙酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及びフコース硫酸含有多糖一 F溶液の代りに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様に H P L Cにより分析した。

1単位の酵素は、上記反応系において 1分間に 1 /mo 1のフコース疏酸含有多糖一 Fのフコシル結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定量は下記式により求めた。

{ (12 X2.5)/(100 MF) } X {(MF/M)-1} X {0.12/(180 X0.01) } =U/il

( 1 2X2. 5 ) / 100 ：反応系中に添加したフコース硫酸含有多糖一 F (m 8： )

MF ：基質フコース硫酸含有多糖一 Fの平均分子量

M：反応生成物の平均分子量

(MF/M)一 1 ： 1分子のフコース硫酸含有多糖一 Fが酵素により切断された数

1 80 ：反応時間（分）

0. 01 ：酵素液量（m l )

0. 1 2 :反応液総量（m l ) なお、 HP L Cの条件は下妃によった。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム： OH p a k KB - 804 (8mmX 300mm) (昭和電工社製）溶離液： 5 mMのアジ化ナトリウム、 25 mMの塩化カルシウム、及び 50 m

Mの塩化ナトリゥムを含む 25mMのィミダゾール緩衝液（ P H 8) 検出：視差屈折率検出器（ S h o d e x R 1 — 7 1、昭和電工社製）流速： 1 m l /分

カラム温度： 25 反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ST ANDARD P— 82、昭和電工社製）を上妃の H P L C分析と同条件で分析し、ブルランの分子 Sと OH P a k KB— 804の保持時間との閩係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。上記（ 1 ) ~ (3) の工程により得られた P A— F Fを用いて本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の活性を測定するときは下記の要領で行った。すなわち、 8 0 0 1 / 1 の八ー溶液2 1 と、の 1 M塩化力ルシゥム溶液と 1 0 1 の 1 M塩化ナトリゥム溶液と、 23 ^ 1 の水と、 50 " 1 の 5 OmMの酢酸とィミダゾールとトリスー塩酸を含む緩衝液（ P H 8. 2) と、 1 0 1 の本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素とを混合し、 3 0 、 3時間反応させた後、反応液を 1 00'C、 1 0分間処理し、遠心分龌後、 80 1 を HP L Cにより分析し、低分子化の程度を測定した。

対照として、本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の代りに、本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及び Ρ Α— F F溶液の代りに水を用いて反応を行つたものを用意し、それぞれ同様に HP L Cにより分析した。

1単位の酵素は、上記反応系において 1分間に 1 mo 1 のフコース疏酸含有多糖のフコシル結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定量は下記式により求めた。

16X 10-6X { (MF/H -1 } X {1/(180X0.01) }

1 6 x l 0-⁶ :反応系中に添加した PA— F F ( o 1 )

MF ：基質 PA— F Fの平均分子量

M：反応生成物の平均分子量

(MF/M) 一 1 ： 1分子のフコース硫酸含有多糖一 Fが酵素により切断された数

1 80 ：反応時間（分）

0. 0 1 ：酵素液量（m l ) なお、 HP L Cの条件は下記によった。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム： OH p a k S B— 803 (8 X300 鵬腫）（昭和電工社製）溶離液： 5 mMのアジ化ナトリウム及び 1 0 %のジメチルスルホキシドを含む

200 mMの塩化ナトリゥム溶液

検出：蛍光検出器 F-1150 (日立製作所製）にて励起波長 3 20 n m> 蛍光波長 400 n mで検出。

流速： 1 m 1 Z分

力ラム温度： 50 反応生成物の平均分子置の測定のために、市販の分子量既知のブルラン（S T AND ARD P— 82、昭和電工社製）をグライコタツグ及びグライコタツグリージントキットを用いて還元性末端を、 P A化し、様々な分子量の P A 化ブルランを得た。得られた様々な分子量の P A化ブルランを上記の H P LC分折と同条件で分析し、プルランの分子量と OH P a k S B— 803の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした

タンパク質の定置は、酵素液の 280 nmの吸光度も測定することにより行つた。その際 1 msr/m 1のタンパク質溶液の吸光度を 1. 0として計算した。本発明者らは、以下に述べるように、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の作用機作を決定した。

( 1 ) ェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素によるフコース硫酸含有多糖一 F の分解及び分解物の纜製

精製したガゴメ昆布由来のフコース硗酸含有多糖一 Fに本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を作用させ、分解物の翻製を行った。

まず、フコース硫酸含有多糖分解酵素の生産を行った。すなわち、アルテロモナス S P. S N- 1 009 (F E RM B P— 5747 ) を、グルコース 0. 25%、ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 05%を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製） PH8. 2からなる培地 600m 1を分注して殺菌した（ 1 20*C> 20分） 2リットルの三角フラスコに接種し、 25 で 26時問培養して種培養液とした。ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 02%、前妃のガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖 0. 2%、及び消泡剤（信越化学工業社製 KM7 0) 0. 0 1 %を含む人工海水 P H8. 0からなる培地 20 リットルを 30 リットル容のジャーフアーメンターに入れて 120てで 20分殺菌した。冷却後、上妃の種培養液 60 Om Iを接種し、 24てで 24時間、毎分 10リットルの通気璗と毎分 250回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、分画分子量 1万の限外ろ過器により濂縮後 85%飽和硫安塩折し、生じた沈 ¾を遠心分離により集め、 1 0分の 1澳度の人工海水を含む 2 OmMのトリスー塩酸緩衝液（ P H 8. 2) に対して充分透析し、 600 m 1の粗酵素を得た。

こうして得られた粗酵素のうち 40m l と、人工海水 44m lと、前記のフコース硫酸含有多糖一 F 51 Omsと水 36m 1を混合し、 P Hを 8に調整し、 2 5てで 48時間反応後、セル口ファイン GCL— 300によりゲルろ過を行い、 4画分に分け、分子量の大きな方から順に、 F— F d— 1 (分子量 25000超 ) 、 F - F d - 2 (分子量 25000〜 1 2000超）、 F— F d— 3 (分子量 1 2000〜 6500超）、及び F— F d— 4 (分子量 6500以下）とした。これらの 4画分を脱塩後凍結乾燥し、乾燥品をそれぞれ 170mg、 270mgr、

300mgr、及び 340m g得た。フコース硫酸含有多糖一 Fの酵素分解物、すなわち低分子化物のセルロフアイン GC L— 300によるゲルろ過の結果を図 22に示す。図 22において縦軸は

480 n mの吸光度（フェノール硫酸法による発色量）、横軸はフラクシ _β ンナンバーを示し、 1 フラクション 1 0 m Iである。カラムボリュームは 1 075 m 1であり、溶出液は 1 0%のエタノールを含む 0. 2 Mの酢酸アンモニゥム溶液である。

図 22中、白丸印はフコース硫酸含有多糖一 Fの酵素分解物を、黒三角印は酵素分解前のフコース硫酸含有多糖一 Fをそれぞれゲルろ過した結果を表す。

上記セルロファイン GCL— 300の結果から、本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素の反応生成物の分子量分布は約 1 000~3万程度であることが判明した。

(2) 酵素反応生成物の還元末端糖及び中性糖組成の分析

上記の F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4の一部をグライコタツグ及びグライコタツグリージユントキットを用いて還元性末端を P A化し、得られた各 P A化糖（PA— F— F d— 1 ) 、（PA— F— F d -2) 、 (PA-F-F d - 3) 、及び（PA— F— F d— 4) を 4規定の塩酸、 100 'C 3時間処理により加水分解し、 HP L Cにより還元末端糖を調べた。なお、 HP LCの条件は下記によった。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム：パルパックタイプ A (4.6 iiiiX 150 mm) (宝酒造社製）

溶離液： 70 OmMほう酸緩衝液（PH 9) ：ァセトニトリル =9 : 1

検出：蛍光検出器 F— 1 150 (日立製作所製）にて励起波長 3 1 0 n m、蛍光波長 380 n mで検出。流速： 0. 3 m I 分

力ラム温度： 65で

この結果、（PA— F-F d - 1 ) 、 (PA-F -F d -2) > (PA-F— F d— 3) 、及び（PA— F— F d— 4) の還元末端糖は総てフコースであった _c また、 F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4の中性糖組成を下記の方法により測定した。なお、基質に用いたフコース硫酸含有多糖 — Fを硫酸加水分解後グライコタツグ及びグライコタツグリージ X ントキットを用いて構成糖の邇元性末端を P A化し、上記の酵素反応生成物の S元性末端を分析したときと同じ HP L C条件で分析したところ、フコースとガラクトースのみしか検出されず、それらの立体配位はそれぞれ L及び Dであったので生成物に関しても Lーフコースと D—ガラクトースのみを測定した。

すなわち、構成糖の一つである D—ガラクトースの含量を調べるために F—キツト乳糖 Zガラクトース（ベーリンガーマンハイムャマノゥチ社製）を用い、锐明害に従って D—ガラクトースのみを測定できる反応系を構築し、別に 4規定の塩酸で 1 00 、 2時間加水分解した F— F d— 1、 F— F d— 2、 F - F d 一 3、及び F— F d— 4を中和後この反応系で測定した。更にもう一方の構成糖である Lーフコースを定量するために、クリニカルケミストリー（Clinical Cheaistry)、第 36巻、第 474~476頁（ 1 990) 記載の方法に従って、別に 4規定の塩酸で 100て、 2時間加水分解した F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4を中和後この反応系で測定した。

以上の結果 L一フコースと D—ガラクトースの比率は F— F d— 1、 F - F d 一 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4それぞれおよそ 100 ： 44、 1 00 ： 27、 100 ： 5、及び 1 00 ： 1であった。

以上の結果をまとめると、本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素は、フコース疏酸含有多糖一 Fに作用してフコシル結合を加水分解し、分子重約 1 0 00~3万程度の低分子化物を生成し、その低分子化物は分子量が大きいほどガラクトース含量が高いことが判明した。なお、低分子化物の還元性末端はすべて Lーフコースであつた。次に、本酵素の基質特異性を瘸ベるためにフコース疏酸含有多糖一 Uに本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素を作用させた。

すなわち、 2. 5%のフコース硫酸含有多糖一 U溶液 1 2 // 1 と、 6 ^ 1 の 1 M塩化カルシウム溶液と 1 2 1 の 1 M塩化ナトリゥム溶液と、 72 I の 50 mMのイミダゾール緩衝液（ pH 7. 5 ) と、 1 8 / 1 の本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素（ 1. 6mU/m 1 ) とを混合し、 30'C、 3時間反応させた後、反応液を 1 00 、 1 0分間処理し、遠心分離後、 1 00 1 を11 P L Cにより分析し、低分子化の程度を測定した。

対照として、本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の代わりに、本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて同様の条件により反応させたものを用意し、同様に H P L Cにより分析した。

なお、 HP LCの条件は次の通りである。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム： OH p a k KB— 804 (8 MX 300 議躍）（昭和電工社製）溶雜液： 5mMのアジ化ナトリウム、 25 mMの塩化カルシゥム、及び 50 m

Mの塩化ナトリゥムを含む 25mMのィミダゾール緩衝液（ PH8) 検出：視差屈折率検出器（ S h o d e X R I — 7 1、昭和電工社製）流速： 1 m 1 /分

カラム温度： 25て

その結果、本発明のフコース硫酸含有多糖分解群素は、フコース硗酸含有多糖一 Uを全く低分子化しなかった。既述のように、本発明は、上 3己した本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素と、カルシウム源とを含有する酵素組成物に関する。

使用可能なカルシウム源としては、固形組成物においては、例えば塩化カルシゥム、炭酸カルシウム、齚酸カルシウムのようなカルシウム塩、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、あるいはそれらの水和物などが挙げられる。他方、水、アルコール等の溶媒中に溶解、懸蜀、乳化させた液状組成物においては、カルシウム源は、前記したような単体であっても、あるいは溶解などによりイオン化した状態のものであってもよい。

これらカルシゥム源は、当該酵素を賦活又は安定化するので有効である。

したがって、上記酵素組成物は上記したカルシゥム源の作用効果を阻害しない範囲で、用途に応じて常用の添加剤を含有していてもよい。本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素をフコース硫酸含有多糖一 F含有物に作用させることによって、フコース硫酸含有多糖一 Fの低分子化物を調製することができる。フコース硫酸含有多糖一 F含有物としては、例えばフコース硫酸含有多糖一 F精製品でもよく、また前述フコース磙酸含有多糖混合物でもよく、更に褐藻類海藻の水性溶媒抽出物でもよい。フコース硫酸含有多糖一 F含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中のフコース硫酸含有多糖澳度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考慮して選定すればよい。フコース硫酸含有多糖一 F溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液の P Hは通常中性で、酵素反応は通常 3 O 'C付近で行う。酵素量、反応時間などを調整することによって、低分子化物の分子量を調整することができる。次に低分子化物を分子量分画することによって、更に均一な分子量分布のフコース硫酸含有多糖一 F低分子化物を調製することができる。分子量分画は通常よく使用されている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理などの精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理を行い、凍結乾燥することによって、本発明の低分子化物の乾燥品を調製することもできる。実施例以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は重量％を意味する。実施例 1

ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物 2 k gを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を 9リツトルの 8 0 %エタノールに懸濁し 8 0 'C、 2時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して上記ェタノール洗浄、ろ過という操作を 3回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を 4 0 リットルの水に懸濁後、 9 5て、 2時間処理し、ろ過した。残渣を熟水で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース疏酸含有多糖を含む抽出液 3 6 リットルを得た。得られた抽出液 1 . 8 リットルを凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖標品 1 5 . 4 gを得た。次に残りの抽出液に 0， 4 Mとなるように食塩を加え、更に 5 %の塩化セチルピリジユウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を 3 リットルの 0 . 4 M食塩水に懸濁後遠心分雜し、洗浄した。この洗浄操作を 3回線り返した後沈殿に 1 リットルの 4 M食塩水を添加し、よくかくはん後エタノールを 8 0 %となるように添加し、かくはん後遠心分雜により沈殿を得た。この沈殿を 8 0 %ヱタノール中に懸濁し、遠心分離するという操作を、上清中の 2 6 0 n mの吸光度が 0になるまで繰り返した。この沈殿を 2 Mの食塩水 3 リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、 2 Mの食塩水で平衡化した 1 0 0 m l の D E A E—セル口ファイン A— 8 0 0 (生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を 2 Mの食塩水で平衡化した D E A E—セルロファイン A— 8 0 0 カラムにかけ、非吸着分を排除分子量 1 0万以下のホ口フアイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は 7 6 gであつた。実施例 2 マ昆布を充分乾燥後、乾燥物 2 k 8Γを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を 9リットルの 80%エタノールに懸濁し、 80 、 2時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を 3回繰り返し、エタノール洗浄残渣を得た。この残渣を 40リットルの水に懸 ¾後、 95· (：、 2時間処理し、ろ過した。残缉を熱水で洗浄し、マ昆布のフコース硫酸含有多糖を含む抽出液 36リットルを得た。得られた抽出液に 0. 4 Mとなるように食塩を加え、更に 5%の塩化セチルピリジユウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を 3リットルの 0. 3M食塩水に懸灑後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を 3回線り返した後沈殿に 1 リットルの 4 M食塩水を添加し、よくかくはん後ェタノールを 80 %となるように添加し、かくはん後遠心分雜により沈殿を得た。この沈殿を 80 %エタノール中に懸瘸し、遠心分雜するという操作を、上清中の 260 nmの吸光度が 0になるまで綴り返した。この沈殿を 2Mの食塩水 3リツトルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、 2 Mの食塩水で平衡化した 100m lの DEAE—セル口ファイン A— 800 (生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を 2Mの食塩水で平衡化した D E AE—セルロフアイン A— 800カラムにかけ、非吸着分を排除分子量 10万以下のホロフアイバーを儎えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は 528：であった。

実施例 3

マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の抽出

マ昆布を充分乾燥後、 2 k sを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を 9リットルの 80%エタノールに懸溷し 80'C、 2時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を 3回線り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を 36 リットルの 0. 2M酢酸カルシウム溶液に懸 S後、 95て、 2時間処理し、ろ過した。残渣を 4リットルの 0. 2 M酢酸カルシウム溶液で洗挣し、マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の抽出液 36リットルを得た。実施例 4

マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の翻製

実施例 3で得られたろ液に、 5%の塩化セチルビリジユウムを、それ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を 3リットルの 0. 3M食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を 3回繰り返した後沈殿に 1 リットルの 4 M食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを 80% となるように添加し、かくはん後遠心分雜により沈殿を得た。この沈殿を 80% エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清中の 260 nmの吸光度が 0になるまで繰り返した。この沈殿を 2 Mの食塩水 3リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、 2Mの食塩水で衡化した 100m lの D EAE— セル口ファイン A— 800 (生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を 2 Mの食塩水で平衡化した D E A E—セルロファイン A— 800力ラムにかけ非吸着分を排除分子量 10万以下のホ口ファイバ一を備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分雜及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は 52 であった。また、このフコース硓酸含有多糖混合物は多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。実施例 5

実施例 4記載のフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥物を 18：ずつ 4つ秤量し、それぞれ水、 0. 2Mの塩化ナトリウム、 0. 2Mの塩化カルシウム、 0. 2 Mの塩化マグネシゥムに溶解した。次に、 500m lの DEAE—セファロース F Fのカラムを 4本用意し、内 2本を 0. 2Mの塩化ナトリウム、 1本を 0. 2Mの塩化カルシウム、 1本を 0. 2Mの塩化マグネシウムでそれぞれ平衡化した。 0. 2Mの塩化ナトリウムで平衡化したカラムの一方をカラムの 1 0倍量の水で洗浄した。水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムにそれぞれ溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をそれぞれ水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシゥムでそれぞれ平衡化した DEAE—セファロース F Fのカラムにかけ、それぞれを平衡化に用いた溶液で充分に洗浄し、次に、 0から 4 Mの塩化ナトリウムのグラジェントで溶出させた。この結果、塩化カルシゥム及び塩化マグネシゥムを用いた系のみカラムにかけたフコース硫酸含有多糖混合物の総量がカラムに吸着した。水及び食塩で平衡化したカラムには 0. 4 g相当のフコース硫酸含有多糖しか吸着しなかった。

また、いずれのカラムにおいても、本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fとフコース硫酸含有多糖一 Uは実質的に分離された。実施例 6

ガゴメ昆布を充分乾燥後、 2 k 8Γを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を 9リットルの 80%エタノールに懸濁し 80 、 2時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残淹を得た。この残渣に対して上記ヱタノール洗浄、ろ過という操作を 3回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を 36リットルの 0. 2M酢酸カルシウム溶液に懸瘸後、 95*C、 2時間処理し、ろ過した。残淹を 4リットルの 0. 2 M酢酸カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物抽出液 36リットルを得た。

このろ液を排除分子量 10万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器により 2リットルに澳縮し、次に、終濃度が 1. 5Mとなるように食塩を添加し 5%の塩化セチルビリジ-ゥムをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清を限外ろ過により 1 リットルに濃縮し、 4 リットルのエタノールを添加し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿に 10 Om 1の 4 M食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを 80%となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を 80%エタノール中に懸額し遠心分離するという操作を、上清中の 260 nmの吸光度が 0になるまで繰り返した。この沈殿を 2 Mの食塩水 2リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、 2 Mの食塩水で平衡化した 5 Om lの DEAE—セルロファイン A— 800 (生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を 2 Mの食塩水で衡化した D EAE—セル口ファイン A— 800力ラムにかけ非吸着分を排除分子量 10万以下のホ口ファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分雜及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥したフコース硗酸含有多糖一 Uの重量は 15 であった。また、この本発明のフコース磙酸含有多糖一 Uは多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。

またこのフコース硫酸含有多糖一 Uは、前 βエンド型フコィダン分解酵素を作用させると上記式（ I ) 、（I!)、及び（III) で表されるォリゴ糖を生じた。実施例 7

ガゴメ毘布を充分乾燥後、 2 k srを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を 9リットルの 80%エタノールに懸濁し 80て、 2時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して上記ェタノール洗浄、ろ過という操作を 3回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を 36リットルの 0. 2M酢酸カルシウム溶液に懸濁後、 95て、 2時間処理し、ろ過した。残渣を 4リットルの 0. 2 M酢酸カルシゥム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物抽出液 36リットルを得た。得られたろ液に 5 %の塩化セチルビリジニゥムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を 3リットルの 0. 4M食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を 3回繰り返した後沈殿に 1 リットルの 4 M食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを 80%となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈澱を得た。この沈殿を 80%ヱタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清中の 260 nmの吸光度を 0になるまで繰り返した。この沈殿を 2Mの食塩水 3リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、 2Mの食塩水で平衡化した 100m 1の DEAE—セル口ファイン A— 800 (生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を 2 Mの食塩水で平衡化した D E AE—セルロファイン A— 800カラムにかけ非吸着分を排除分子量 10万以下のホロフアイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は 90 であった。また、このフコース硗酸含有多糖混合物は多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。このフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥物を 7 g- 枰量し、 0. 2 Mの塩化カルシウムに溶解した。次に、 4000m lの DEAE ーセファロース F Fのカラムを 0. 2Mの塩化カルシウムで平衡化した。 0. 2 Mの塩化カルシウムに溶解したフコース硫酸含有多糖混合物を DEAE—セファロース F Fのカラムにかけ、 0. 2Mの塩化カルシウムで充分洗浄し、次に、 0 〜4Mの塩化ナトリウムのグラジェントで溶出させた。溶出画分の内塩化ナトリゥム馕度が 0. 05〜0. 8 Mの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥し、実質的にフコース硫酸含有多糖一 Fと分離されたフコース硫酸含有多糖一 Uを 2. 1 g得た。

また、上記溶出画分の内塩化ナトリウム濃度が 0. 9~1. 5Mの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥し、実質的にフコース硫酸含有多糖—Uと分離されたフコース硫酸含有多糖一 Fを 4. 7 sr得た。実施例 8

フコース硫酸含有多糖一 Fの製造

実施例 7で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を 1. 28：枰量し、 1. 5M の塩化ナトリウム溶液に終澳度 0. 2%となるように溶解し、 1. 25%の塩化セチルビリジニゥムの 1. 5M塩化ナトリゥム溶液をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を遠心分離により集め、この沈 ¾を 500 m 1の 1. 5M食塩水に懸溺後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を 3回繰り返した後沈殿に 1 リットルの 4 M食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを 80%となるように添加し、かくはん後遠心分雜により沈殿を得た。この沈殿を 80%ェタノ —ル中に懸濁し遠心分離するという操作を、上淸中の 260 nmの吸光度が 0になるまで繰り返した。この沈殿を 2 Mの食塩水 50 Om 1に溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、 2 Mの食塩水で平衡化した 1 m lの DEAE—セルロブァイン A— 800 (生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を 2 Mの食塩水で平衡化した D EAE—セル口ファイン A— 800力ラムにかけ非吸着分を排除分子量 10万以下のホロフアイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾煖フコース硫酸含有多糖

— Fの重量は 71 Omgであった。また、このフコース硗酸含有多糖一 Fは多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこのフコース硫酸含有多糖一 Fはゥロン酸を含まずフコースを構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fであった。実施例 9

フコース硫酸含有多糖一 Fの酵素的精製方法

実施例 7で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を l O gr枰量し、 500m l の人工海水に溶解後、前記フラボパクテリゥム S P. SA-0082 (FE RM BP— 5402) 由来のエンド型フコィダン分解酵素を 5 ϋ添加し 25 ' (：、 50時間反応させた。反応液を排除分子量 10万以下のホロファィバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心分雜及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖一 Fの重量は 6 grであった。また、このフコース硫酸含有多糖一 Fは多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこのフコース硫酸含有多糖一 Fはゥロン酸を含まず、フコースを構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fであることが判明した。実施例 10

フコース硫酸含有多糖一 Fの培養的精製方法

実施例 7で得られたフコース硗酸含有多糖混合物を 60 g秤量し、 20リットルの人工海水に溶解後ぺブトン 200 gと酵母エキス 4 sを加え、 30リットルのジャーフアーメンターに入れ滅菌後、前記フラボパクテリゥム s p. S A 一 0082株（F ERM B P— 5402) を植菌して 25 'C、 24時間培養した。培養液を遠心分離し菌体を除去後、排除分子量 10万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾嫫フコース硫酸含有多糖一 Fの重量は 36 であった。また、このフコース硫酸含有多糖一 Fは多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこのフコース碇酸含有多糖一 Fはゥロン酸を含まずフコースを構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fであることが判明した。実施例 1 1

実施例 7記載のフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥物を 1 rずつ 4っ枰量し、それぞれ水、 0. 2Mの塩化ナトリウム、 0. 2Mの塩化カルシウム、 0. 2Mの塩化マグネシウムに溶解した。次に、 500m lの DEAE—セファロース FFのカラムを 4本用意し、内 2本を 0. 2Mの塩化ナトリウム、 1本を 0. 2Mの塩化カルシウム、 1本を 0. 2Mの塩化マグネシウムでそれぞれ平衡化した。 0. 2Mの塩化ナトリウムで平衡化したカラムの一方をカラムの 1 0倍量の水で洗浄した。水、塩化ナトリウム、塩化カルシゥム、塩化マグネシクムにそれぞれ溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をそれぞれ水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシゥムでそれぞれ平衡化した D EAE—セファロース F Fのカラムにかけ、それぞれを平衡化に用いた溶液で充分洗浄し、次に、 0から 4 Mの塩化ナトリウムのグラジントで溶出させた。この結果、埴化カルシウム及び塩化マグネシゥムを用いた系のみカラムにかけたフコース硗酸含有多糖混合物の総置がカラムに吸着した。水及び食塩で平衡化したカラムには 0. 4 sr相当のフコース硗酸含有多糖しか吸着しなかった。

また、いずれのカラムにおいても、フコース硫酸含有多糖一 Fとフコース硫酸含有多糖一 Uは実質的に分離された。実施例 12

実施例 1記載のフコース硫酸含有多糖混合物を 78Γ抨簠し、 800m lの 0. 2 Mの塩化カルシウムに溶解した。次に、 4リツトルの DEAE—セファロース F Fのカラムを 0. 2Mの塩化カルシウムで平衡化し、上妃フコース硫酸含有多糖溶液を全重力ラムにかけ、 8リットルの 0. 2 M塩化カルシウム溶液で洗浄後、 0から 4 Mの塩化ナトリウムのグラジェントで溶出させた。溶出画分の内ゥ口ン酸が検出される画分（塩化ナトリゥム濃度約 0. 9M以下：フコース硫酸含有多糖一 U) 、ゥロン酸が検出されない画分（塩化ナトリゥム澹度約 1 · 2M付近：フコース硫酸含有多糖一 F) のそれぞれを脱塩後凍結乾燥し、乾燥品をそれぞれ 1. 4 g及び 4. 8 gr得た。実施例 13

実施例 1で得られるフコース硫酸含有多糖混合物に、フラボパクテリゥム s p. SA-0082 (F E RM B P— 5402 ) の生産するエンド型フコィダン分解酵素を作用させると下記の構造を有するォリゴ糖を生成する。

-Z8-

UOO/L6dT/lDd 9689Z/ム 6 OAV

本発明者らは、下記の酵素反応を行い、上記オリゴ糖を得た。

すなわち、 2. 5%の実施例 1のフコース硫酸含有多糖混合物溶液 8 Om 1 と、 5 OmMのリン酸緩衝液（ p H 7. 5) 60m l と 4 Mの塩化ナトリウム 2 Om 1 と 32mUZm l のエンド型フコィダン分解酵素溶液 4 Om 1 を混合し、 25 •Cで 48時間反応させた。

反応液をセルロファイン G C L— 300 (生化学工業社製）のカラムにより分子量分画し、分子量 2000以下の画分を集めた。この画分をマイクロァシライザ一 G 3により脱塩後、 D E AE—セファロース F Fにより 3つの画分を分離し、再度脱塩後、凍結乾燥した。こうして上記各式（ I )、（11) 、（111) のオリゴ糖をそれぞれ 25 Omg、 3 1 0m g、 52msr得た。実施例 14

実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物 1 0 gを 0. 2Mのクェン酸 500 m l に溶解し、 PHを 2. 9に網整後、 1 00 "Cで 3時間処理した。この加水分解物に 1 Mの酢酸カルシウム溶液を 1 5 Om 1添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去後セルロファイン GC L— 25によるゲルろ過で分子量分画し（分子璗 5000以上、 500 0〜3000超、 30 00~2000超、 2000 〜 1 000超、 1 000〜 500超、 500以下）、分子量の大きい方から頭に、 G F d -0 1 i一 1、 G F d - 0 1 i - 2、 G F d - 0 1 i - 3、 G F d - 0 1 i一 4、 G F d— 0 1 i— 5、及び GF d— 0 1 i — 6とした。これらの 6画分を脱塩後凍結乾燥し、乾燥品をそれぞれ 2. 3 «r、 1. 7 s、 0. 88 s、 1. 88Γ、 1. 4 g、及び 0. 728Γ得た。実施例 1 5

実施例 1 で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を 608Γ枰量し、 20 リットルの人工海水に溶解後ぺプトン 2008Γと酵母エキス 4 gを加え 30 リットル容のジャーフアーメンターに入れ滅菌後、フラボパクテリゥム s p. SA— 0 082 (F ERM B P— 5 402) を植菌し 25て、 24時間培養した。培養液を遠心分離し、菌体を除去後、排除分子量 10万以下のホロフアイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖一 F の重量は 36 であった。実施例 1 6

マナマコを 5 k sr解体し、内臓を除去し、体壁を集めた。体壁湿重量 200 s 当り 500m lのアセトンを加え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着色物質がなくなるまでァセトンで洗浄した。この残渣を吸引乾嫒し 1 40 8Γの乾燥物を得た。この乾燥物に 0. 4Mの食塩水 2. 8リットルを加え、 1 0 O'Cで 1時間処理後、ろ過し、残渣を 0. 4Mの食塩水で充分洗浄し、抽出液 3. 7リットルを得た。この抽出液に 5%のセチルビリジニゥムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈殿を 0. 4Mの食塩水に懸漏後再度遠心分雜し、得られた沈殿に 1 リツトルの 4 M食塩水を添加し、ホモジナイザーで処理後、かくはんしながら 4リットルのェタノールを添加し、 1時間かくはん後、ろ過し、沈殿を得た。この沈殿に対して、 80% ェ夕ノールに懸濁後ろ過という工程を上清の 260 n mの吸光度が 0になるまで繰り返した。得られた沈殿を 2リトルの 2 M食坦水に魅濁し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子量 3万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完全に脱塩後、凍結乾燥し 3. 7 gのフコース硗酸含有多糖を得た。実施例 17

ヒバマタ（Fucus vesiculosus ) を充分乾煖後、乾燥物 2 k 8：を自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を 9リットルの 80%エタノールに懸漏し、 80 、 2時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を得た。この残渣に対して上妃エタノール洗浄、ろ過という操作を 3回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を 40リットルの水に懸濁後、 1 00· (：、 2時間処理し、ろ過した。ろ液に 0. 5Mとなるように塩化ナトリゥムを加え、更に 5%の塩化セチルピリジニゥムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を 3リットルの 0. 4M塩化ナトリゥムに懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を 3回繰り返した後沈殿に 250 の塩化ナトリゥムを加え、 3リットルのエタノール中に懸濁し、遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を 80%エタノール中に ¾酒し、遠心分離するという操作を、上清中の 260 n mの吸光度が 0になるまで繰り返した。この沈殿を 2 Mの塩化ナトリウム 3リツトルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、 2 Mの食塩水で平衡化した 100m 1の D EAE—セルロフアイン A— 800 (生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を 2Mの塩化ナトリゥムで平衡化した D EAE—セルロフアイン A— 800カラムにかけ非吸着分を排除分子量 10万以下のホロフアイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び塩化ナトリウムを完全に除去後、遠心分雜及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖の重量は 9 2 であった。実施例 18

わかめ（Undaria pinnatif ida)を充分乾燥後、 2 k gを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を 9リットルのエタノールに懸濁し、 75'C、 1時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を得た。この残渣に対して 80%のエタノールを 9リットル添加、かくはんし、 80て、 1時間処理後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。この残渣に対して、上記 80%エタノール洗浄、ろ過という操作を 3回繰り返し、エタノール洗浄残澄 1908 srを得た。この残渣のうち 684 gを 9リットルの 0. 2 M舴酸カルシウムに懸濁後、 95 *C、 1 時間処理し、 24時間静置後その上清を得た。上清を除去した沈殿に 9リットルの 0. 2 M酢酸カルシウムを添加かくはんし、 1時間静置後上清を得、上記上清と合せた。こうして得られた上清をろ紙でろ過後、排除分子量 10， 000のホロファィバーを備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、 35 Om 1に馕縮した。瀵縮液を遠心分離し、沈殿を除去後、 2mMの塩化ナトリウムを添加しながら限外ろ過し、完全に酢酸カルシウムを除去後、凍結乾燥し、凍結乾燥物 3. 2 gを得た。凍結乾燥物中のフコース硫酸含有多糖の重量は 3. 1 srであった。実施例 1 9

( 1 ) ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物の調製

乾燥ガゴメ昆布 2 K sを自由粉砕機 M— 2型（奈良機械製作所製）により粉砕し、 4. 5倍量の 80%エタノール中で 80て、 2時間処理後、ろ過した。残渣に対し、上記 80 %エタノール抽出、ろ過という工程を更に 3回繰り返し、エタノール洗浄残渣 1 870 gを得た。残渣に 36 リツトルの水を加え、 1 00て、 2時間処理し、ろ過により抽出液を得た。抽出液の塩澳度を 40 OmMの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、 5 %のセチルビリジルクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離した。その沈殿を、 80%のエタノールで繰り返し洗浄し、セチルビリジニゥムクロリドを完全に除去した後、 3 リットルの 2M塩化ナトリゥムに溶解し、不溶物を遠心分離で除去し、 2Mの塩化ナトリゥムで平衡化した 1 00m l の D EAE—セル口ファイン A— 800を懸濁し、かくはん後ろ過し、樹脂を除いた。このろ液を、 2Mの塩化ナトリウムで平衡化した 1 00m 1 の D EAE—セル口ファイン A— 800のカラムにかけ、通過圃分を限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量 1 0万）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾 <gして精製ガゴメ昆布フコース硗酸含有多糖混合物 82. 2 gを得た。

(2) フコース硗酸含有多糖一 Fの調製

上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物 68Γを 600m l の 0. 2 Mの塩化カルシウムを含む 2 OmMの酢酸ナトリウム（ PH 6. 0) に溶解後、あらかじめ 0. 2Mの塩化カルシウムを含む 2 OmMの齚酸ナトリウム（ P H6. 0 ) で平衡化した 3600m 1 の DEAE—セファロース F Fのカラムにかけ、 0. 2 Mの塩化カルシウムを含む 2 OmMの酢酸ナトリウム（ P H6. 0) で充分力ラムを洗浄後、 0~2Mの塩化ナトリウムのグラジェン卜で溶出した。塩化ナトリゥム濃度が 0. 75 M以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖一 F画分を集め、排除分子量 1 0万の限外ろ過胰を装着した限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖一 Fの凍結乾燥標品を 3. 3 8Γ得た。 (3 ) エンド型フコース硗酸含有多糖分解酸素の調製

アルテロモナス S P. S N- 1 009 (F E RM B P一 5747) を、グルコース 0. 25%、ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 05%を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製） p H 8. 2からなる培地 600 m 1 を分注して殺菌した（ 1 20 、 20分） 2リットルの三角フラスコに接種し、 25てで 25時間培養して種培養液とした。ペプトン 2008：、酵母エキス 4 g、及び消泡剤（信越化学工業社製 KM70) 4m 1 を含む人工海水 P H 8. 0からなる培地 1 8 リツトルを 30リツトル容のジャーフアーメンターに入れて 1 20てで 20分殺菌した。冷却後、別に 1 20*C；、 1 5分殺菌した 2 リットルの人工海水に溶解した 208：の実施例 8の方法を用いて調製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖一 F及び上記の種培養液 600m l を接種し、 24てで 20時間、毎分 1 0 リットルの通気釐と毎分 250回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。

培養上清中の本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素の活性をフコース硫酸含有多糖一 Fを基質に用いて測定したところ、 5mU/m l ·培養液であった。得られた培養上清を、分画分子量 1万の限外ろ過器により »縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去し、 85%飽和硫安塩折し、生じた沈殿を遠心分離により集め、 1 0分の 1澳度の人工海水（ジャマリン S) を含む 2 OmMのトリス一塩酸緩衝液（ P H 8. 2) に対して充分透析し、 40 Om 1 の粗酵素を得た。得られた粗酵素液を、あらかじめ 5mMのアジ化ナトリウム及び 1 0分の 1濂度の人工海水（ジャマリン S ) を含む 2 OmMのトリス一塩酸緩衝液（ P H8. 2) で平衡化した D E AE—セル口ファイン A— 800 (生化学工業社製）の力ラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて充分洗浄後、同緩衝液中に 1 0 0mM、 200 mM、 300mM、 400mM、及び 600 mMの塩化ナトリウムを含む溶液で溶出し、活性画分を集めた。

得られた部分精製酵素の活性はフコース硫酸含有多糖一 Fを基質に用いて測定したところ、 1 0200mU ( 1 0. 2 U) であった。なお、他のフコース硗酸含有多糖分解酵素の混入は認められなかった。得られた部分精製酵素の一部をあらかじめ 1 0分の 1濃度の人工海水（ジャマリン S) 及び 5 mMのアジ化ナトリゥムを含む 1 OmMのトリス一塩酸酸緩衝液 ( P H 8. 0) で平衡化したセフアクリル S— 200でゲルろ過を行い、その分子量を求めたところ約 1 0万であった。

( 4 ) 上記実施例で得た部分精製酵素及び P A— F Fをそれぞれ酵素源及び基質として本酵素の活性に及ぼすカルシゥム瀵度の検討を行った。酵素反応に用いる緩衝液には 5 OmMの酢酸、ィミダゾール、及びトリス一塩酸を含む PH7の緩衝液を用いた。また、反応液には終濃度 40 OmMの塩化ナトリゥムを溶存させた。

反応液中の塩化カルシウム濃度を 0~ 1 0 OmMまで変化させ、酵素活性を測定したところ、図 23に示すような結果が得られた。なお、図 23において、縦軸は相対活性（％) 、横軸は反応液中カルシウム濃度（mM) を示す。

この結果、本酵素はカルシウム塩の存在下著しく活性が高められることが判明した。

(5) 本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を下記 6種類の緩衝液で透析しながら 5てで 20時間保持した後、残存活性を測定した。

1. 2 OmMトリスー塩酸緩衝液（PH8. 2)

2. 5 mMアジ化ナトリウムを含む 20 mMトリス一塩酸緩衝液（ P H 8. 2)

3. 5mMアジ化ナトリゥム及び 5 OmM塩化ナトリゥムを含む 2 OmMトリスー塩酸緩衝液（PH8. 2)

4. 5 mMアジ化ナトリゥム及び 500 mM塩化ナトリウムを含む 20 mMトリスー塩酸緩衝液（PH8. 2)

5. 5mMアジ化ナトリウム、 5 OmM塩化ナトリウム、及び 1 OmM塩化カルシゥムを含む 2 OmMトリスー塩酸緩衝液（P H8. 2)

6. 5 mMアジ化ナトリゥム及び 1 0分の 1濃度の人工海水（ジャマリン S) を含む 2 OmMトリスー塩酸緩衝液（ pH8. 2) 以上の結果、 1、 2、及び 3の緩衝液で透析した本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素は失活し、 4、 5、及び 6の緩衝液で透析した本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素は活性が保持された。

このことから本酵素は 500 mMの塩化ナトリクムの存在下あるいは 1 OmM のカルシウムィオンの存在下で安定化されることが判明した。

(6) 上己実施例で瘸製したフコース硫酸含有多糖一 Fを 58Γ秤重し、 471 m Iの 5 OmMイミダゾ一ル緩衝液（PH8)、 1 2. 5m lの 4M塩化ナトリゥム、 6. 25m lの 4 M塩化カルシウム、及び実施例 19— (3) で得られた本発明のフコース硗酸含有多糖分解酵素の部分精製品 10m l (6mU相当）を混合し、 25てで 120時間反応させたところフコース硫酸含有多耱ー Fの低分子化物が得られた。

得られた低分子化物の I R及び N MRの分析結果はそれぞれ図 25及び図 26 に示すとおりであった。また、セルロフ yイン G C L— 300でゲルろ過したところ、図 24に示す結果が得られた。すなわち、本物質は分子量 1000〜30 000にわたつて分布するものである。

また、本物質の硫酸含量は S04 (分子置 96) として 46%であり、中性糖組成はフコース：ガラクトース = 100 ： 4であった。

なお、図 24〜図 26における縦軸及び横軸は、それぞれ図 2 ~図 4と同義である。実施例 20

56て、 30分間処理した牛胎児血清（J RHバイオサイエンス社）を 10% 含む RPM I 1640培地（ギブコ社製）にて 37 で培養したヒト前骨髄性白血病細胞 HL— 60 (ATC C C R L - 1964) を ASF 104培地（味の素社製）にて 5X 105個 /9m 1 となるように懸濁した。この懸濁液 9m 1を 4つ用意し、それぞれの魅溷液に対し、実施例 1、 12、及び 15で得られたフコース硗酸含有多糖の生理食塩水溶液（5msrZm 1 ) のフィルター処理液〔ポ了サイズ 0· 20 zmのセルロースアセテート胰（コーニング社製）でろ過したもの（以下フィルター処理はこの条件で行った）〕を 1 m】添加し、 37 、 5 %二酸化炭素存在下で 40時間培養した。培養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた細胞を 1 OmMのエチレンジアミンテトラアセテート及び 0. 5%のナトリウムラゥロイルサルコシネートを含む 50 mMのトリス塩酸緩衝液 (pH 7. 8) 20 / 1にて懸溷し、 l OmsZm lのリポヌクレアーゼ A (シグマ社製）を 1 1添加して 50 、 30分間処理した後、 1 Omsr m Iのブロティネース Kを 1 ^ 1添加して 50て、 1時間処理した。処理後の細胞をサンブルとして、 2%のァガロースゲルを用いて 1 00 Vの定電圧の下で電気泳動を行った。このゲルをェチジゥムブロミド溶液に 30分間浸した後、トランスィルミネー夕を用いてゲル中の D N Aの状態を確認したところ、アポトーシスに特有の DN Aラダ一が確認された。更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として知られているァクチノマイシン Dの 1 0/ g/m 1溶液を上記のフコース硫酸含有多糖の代りに用いて同様に操作したところ、培養 20時間で、フコース硗酸含有多糖の場合と同じ DN Aラダ一が確認できた。

この結果より、 HL— 60細胞は実施例 1、 1 2、及び 1 5で得られたフコース硫酸含有多糖によりアポトーシスを誘発されることが明らかとなった。

HL— 60 (ATC C C C L-240) を用い、実施例 1、 1 2、及び 1 5 で得られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔5msrZm l となるように 1 20mM の塩化ナトリウムを含む 30 mMのへぺス緩衝液（ PH7. 2) に溶解し、 12 1 · (：、 20分間オートクレープ処理したもの〕のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 21

56て、 30分間処理した牛胎児血清（ J RHバイオサイエンス社）を 1 0% 含む R PM I 1640培地（ギブコ社製）にて 37 'Cで培養したヒト前骨髄性白血病細胞 HL— 60 (ATC C CCL一 240) を AS F 104培地（味の素社製）にて 5X 1 0⁵ 個 Z9m 1 となるように魅濁した。この懸灑液 9 m】に対し、実施例 1 5で得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液（5 msr/m 1 ) のフィルター処理液を 1 m 1添加し、 37 、 5%二酸化炭素存在下で 20 時間培養した。培養した細胞を遠心分戴により上清と分離した。得られた細胞を「アポトーシス実験ブロトコール j (秀瀾社、田沼靖ー監修、第 93〜95頁、 1 99 5年）に従ってギムザ染色した。すなわち得られた細胞をカルノァ固定液 (齚酸：メタノール = 1 ： 3) を用いてスライドグラス上に固定し、ギムザ色素 (メルク社製）を用いて染色し、光学顕微鏡により観察したところアポトーシス特有の核の断片化が観察された。この結果より HL— 60細胞は実施例 1 5で得られたフコース碇酸含有多糖によりアポトーシスを起こすことが明らかとなった。実施例 1 5で得られたフコース硫酸含有多糖溶液〔5mg/m 1 となるように 1 20 mMの塩化ナトリゥムを含む 3 OmMのへぺス緩衝液（ P H7. 2) に溶解し、 1 2 1て、 20分間オートクレープ処理したもの〕のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 22

56 、 30分間処理した牛胎児血清（J RHバイオサイエンス社）を 1 0% 含む RPM I 1 640培地（ギブコ社製）にて 37てで培養したヒト前骨 ¾性白血病細胞 HL— 60 (AT C C C C L一 240) を AS F 1 04培地（味の素社製）にて 5 X 1 05 コ 4. 5m 1 となるように懸溷した。この液 4. 5 m 1 を 4つ用意し、それぞれの懸 S液に対し、実施例 1、 1 5、及び 1 8で得られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔 1 0mg/m l となるように 1 20 mMの塩化ナトリウムを含む 3 OmMのへぺス緩衝液（ P H 7. 2) に溶解し、 1 2 1て、

20分間オートクレーブ処理したもの〕及び 1 20 mMの塩化ナトリゥムを含む

3 OmMのへぺス緩衝液を 0. 5 m l添加し、 37 *C、 5%二酸化炭素存在下で培養し、培養開始後 24時間及び 40時間後に細胞数をトリパンブルー染色法で計測した。この結果を図 27に示す。図 27は HL— 60細胞の培養液に実施例 1、 1 5、及び 1 8で得られたフコース硫酸含有多糖を 1 mgZm 1 となるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦轴は培養液中の生細胞数（X 1 05 コ Z5m 1 ) も示す。図 27中、培地に添加したフコース硫酸含有多糖の種類は、口印が無添加（対照）、 +印が実施例 1、 ·印が実施例 1 5、 X印が実施例 1 8で得られたフコース硫酸含有多糖であることを示す。また、この時死細胞は細胞の縮小及び断片化等アポトーシスに特有の形態を示した。すなわちこれらの結果から、 HL— 60細胞は実施例 1、 1 5、及び 1 8 で得られたフコース硫酸含有多糖によりアポトーシスを誘発され細胞増殖を著しく抑制されることが判明した。

実施例 1、 1 5、及び 1 8で得られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔 1 Oms / 1 となるように 1 2 OmMの塩化ナトリウムを含む 3 OmMのへぺス緩衝液 ( H 7. 2) に溶解し、フィルター処理したもの〕のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 23

56 'C 30分間処理した牛胎児血清（J RHバイオサイエンス社）を 1 0% 含む R PM I 1 640培地（ギブコ社製） 9m 1 にヒト急性リンパ芽球性白血病細胞 MOLT— 3 (ATC C CRL— 1 552) を 5X 1 05 個 /9 m l となるように懸濁した。この懸 S液 9m 1 を 5つ用意し、それぞれに実施例 1、 2、 1 2、及び 1 6で得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液（5 mgZm 1 ) のフィルター処理液を 1 m 1添加し、 37 、 5%二酸化炭素存在下で 60 時間培養した。培養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた細胞を 1 OmMのエチレンジアミンテトラアセテート及び 0. 5%のナトリウムラウ口ィルサルコシネートを含む 5 OmMのトリス塩酸緩衝液（ P H 7. 8) 20 1 にて魅濁し、 l Omsr/m l のリボヌクレアーゼ A (シグマ社製）を 1 1添加して 50 、 30分間処理した後、 1 OmsZm 1 のプロティネース Kを 1 I 添加して 50· (：、 1時間処理した。処理後の細胞をサンブルとして、 2%のァガロースゲルを用いて 1 00 Vの定電圧の下で電気泳動を行った。このゲルをェチジゥムブロミド溶液に 30分間浸した後、トランスイルミネータを用いてゲル中の DN Aの状態を確認したところ、アポトーシスに特有の D NAラダーが確認された。更に確認のためアポト一シスを誘発する試薬として知られているァクチノマイシン Dの 1 0〃 8r/m l 溶液を上妃のフコース硗酸含有多糖の代りに用いて同様に操作したところ、培養 20時間で、フコース疏酸含有多糖の場合と同じ D N Aラグーが確認できた。

この結果より実施例 1、 2、 1 2、及び 1 6で得られたフコース硓酸含有多糖は MO L T— 3細胞に対してアポトーシスを锈発することが判明した。

実施例 1、 2、 1 2及び 1 6で得られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔5mg /m l となるように PB S ( 8 grの塩化ナトリウム、 0. 28：の塩化力リウム、 2. 9 8Γのリン酸水素ニナトリム 1 2水和物、及び 0. 2 8：のリン酸二水素カリゥムを 1 リットルの水に溶解したもの）に溶解し、 1 2 1 、 20分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトーシス銹発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 24

56 *C、 30分間処理した牛胎児血清（ J RHバイオサイエンス社）を 1 0% 含む R PM I 1 640培地（ギブコ社製）にて 37てで培養したヒト急性リンバ芽球性白血病細胞 MOLT— 3 (ATC C CRL - 1 552) を RPM I 1 6 40培地にて 5 X 1 03 コ /m l となるように懸額し、 FALCON社製 24ゥヱルブレート上の各ゥ j：ルに 1. 8m lずつ分注した。それぞれの懸 ¾液に対し、 0. 5 msr/m 1 となるように P B Sに溶解後ろ過滅菌した実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例 1 2で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、実施例 1 5及び 1 7で得られたフコース《£酸含有多糖、及びデキストラン疏酸（分子量 50万、和光純薬社製）の溶液をそれぞれ 0. 2 m 1 ずつ添加し、 37て、 5%二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として P B Sのみを同璗添加し、同様に培養した。培養開始 2日、 4日、 6日、 8曰後の生細胞数をトリパンブル一染色法により計測した。この結果を図 28に示す。すなわち図 28は MO LT— 3細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例 12で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、実施例 15及び 17で得られたフコース ½酸含有多糖、及びデキストラン硫酸を 0. 5msr/m 1 となるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（曰）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 1 コ /2m I ) を示す。図 28中、培地に添加した砝酸化多糖の種類は、 O印が無添加（対照）、 ·印が実施例 12で得られたフコース硓酸含有多糖一 F、口印が実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖、厶印が実施例 17で得られたフコース疏酸含有多糖、鼴印が実施例 15で得られたフコース硫酸含有多糖であることを示す。デキストラン硓酸は実施例 15で得られたフコース碇酸含有多糖の場合と実質的に同じ曲線を示した。

また、この時死細胞は細胞の縮小及び断片化等ァポトーシスに特有の形態を示した。すなわちこれらの結果から、 MOLT— 3細胞は実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例 12で得られたフコース疏酸含有多糖一 F、実施例 1 5及び 17で得られたフコース硓酸含有多糖、及びデキストラン硫酸によりアポトーシスを誘発され細胞增殖を著しく抑制されることが判明した。

実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例 12で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、実施例 15及び 17で得られたフコース ½酸含有多糖、及びデキストラン硫酸（分子 S50万、和光純薬社製）の各溶液（0. 5mgZm 1 となるように P B Sに溶解後、 121て、 20分間オートクレープ処理したもの）のアポトーシス锈発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 25

56*C、 30分間処理した牛胎児血清（J RHバイオサイエンス社）を 10% 含む R PM I 1640培地（ギブコ社製）にて 37 で培養したヒト前骨髄性白血病細胞 HL— 60 (ATC C CCL— 240) を AS F 104培地（味の素社製）にて 5X 104個/ 900// 1 となるようにお、濁した。この懸濁液 900 1を 9つ用意し、それぞれの懸灞液に対し、生理食埕水、及び実施例 1で得たフコース硫酸含有多糖標品、 F— F d— 1~F— F d— 4、及び実施例 13で得られた 3種のフコース谤酸含有ォリゴ糖の各生理食塩水溶液（ 1 Omsr/m 1 ) フィルター処理液を 100 1添加し、 37て、 5 %二酸化炭素存在下で 40時間培養した。培養した細胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を 31ベた。

この結果、フコース硫酸含有多糖標品、 F— F d— 1 ~F— F d— 4及び 3種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加した H L— 60細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を圼した。また、生理食塩水を添加した HL— 60細胞は細胞数が約 4倍に増加したが、フコース硫酸含有多糖標品、 F— F d 一 1 ~F— F d— 4及び 3種のフコース硫酸含有ォリゴ糖を添加した H L -60 細胞は細胞数が全く增加しないものから 1 0分の 1以下になるものまでが見られ、これらフコース疏酸含有多糖標品、 F— F d— 1 ~F— F d— 4及び 3種のフコース硫酸含有オリゴ糖のアポトーシス誘発作用により HL— 60細胞の増殖が抑えられることが判明した。

更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として知られているァクチノマイシン Dの 1 0〃 sr/m 1溶液を上記のフコース硫酸含有ォリゴ糖の代りに用いて同様に操作したところ、培養 20時間で、フコース硫酸含有オリゴ糖の場合と同じょうに、細胞の縮小及び細胞断片化がみられた。この結果より、 HL— 60細胞は実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品、 F— F d— 1 ~F— F d— 及び実施例 1 3で得られたフコース硫酸含有ォリゴ糖によりアポトーシスを誘発されることが明らかとなった。

実施例 1で得たフコース硫酸含有多糖標品、 F— F d— 1〜F— F d— 4及び実施例 1 3で得られた 3種のフコース硫酸含有ォリゴ糖の各溶液〔 10 msr/m 1 となるように 1 2 OmMの塩化ナトリウムを含む 3 OmMへぺス緩衝液（P H 7) に溶解し、 1 21て、 20分間オートクレープ処理したもの〕のアポトーシス銹発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 26

肺癌細胞 A— 549 (AT C C CC L一 1 85) 、 SV 40形質転換した肺細胞 W I— 38 V A 13 ( A T C C C C L— 75. 1 ) 、及び肝癌細胞 H e p G 2 (ATC C HB - 8065 ) をそれぞれ 1 04個/ 1 · 8m l となるよう、 56て、 30分間処理した牛胎児血清（J RHバイオサイエンス社）を 10 %含む RPM I 1640培地に懸濁した。この懸溷液を 1. 8m 1ずつ分注し、それぞれの懸濁液に対し、各癌細胞毎に生理食塩水、及び実施例 1及び 15で得られたフコース硫酸含有多糖、及び実施例 14で得られた 6種のフコース硫酸含有ォリゴ糖の各生理食塩水溶液（ 1 msr/m 1 ) のフィルター処理液を 200〃 1添加し、 37'C、 5%二酸化炭素存在下で 6日間培菜した。培養した細胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を翻べた。

この結果実施例 1及び 15で得られたフコース硗酸含有多糖、及び実施例 14 で得られた 6種のフコース硫酸含有ォリゴ糖のうち分子 S 2000以上の 3画分を添加した肺癌細胞 A— 549、 S V40形質転換した肺細胞 W I— 38 VA 1 3、及び肝癌細胞 He p G 2はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。また、生理食塩水を添加した各癌細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例 1及び 15で得られたフコース硗酸含有多糖、及び実施例 14で得られた 6種のフコース疏酸含有ォリゴ糖のうち分子量 2000以上の 3画分を添加した各種癌細胞は細胞数が減少し、これらのフコース硫酸含有多糖及びォリゴ糖のアポトーシス誘発作用により各種癌細胞の増殖が抑えられることが判明し実施例 1及び 15で得られたフコース硗酸含有多糖、及び実施例 14で得られた 6種のフコース硫酸含有ォリゴ糖の各 PB S溶液（ 1 mg/m 1 ) の 121て、 20分間オートクレープ処理物のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 27

結腸癌細胞 HCT 1 16 (ATCC C C L一 247) 、及び胃痛細胞 AG S (ATCC CRL— 1739) をそれぞれ 10⁴ 個 Z 1. 8 m 1 となるよう、 56て、 30分間処理した牛胎児血清（J RHバイオサイエンス社）を 10%含む Mc C o y' s 5 a培地（ギブコ社製）、 Ham' s F 12培地（ギブコ社製）にそれぞれ懸濁した。この懸溺液を 1. 8m lずつ分注し、それぞれの懸濁液に対し、各癌細胞毎に生理食塩水、及び実施例 1、 12、及び 15で得られたフコース碇酸含有多糖及び F— F d— 1 ~F— F d— 4の 4種のフコース硫酸含有ォリゴ糖の各生理食塩水溶液（ 1 Omsr/m 1 ) のフィルター処理液を 200 n 1添加し、 37で、 5%二酸化炭素存在下で 48時間培養した。培 ¾した細胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べた。

この結果実施例 1、 12、及び 15で得られたフコース硫酸含有多糖及び F— F d— 1~F— F d— 4の 4種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加した結腸癥細胞 HCT 1 16及び胃癌細胞 AG Sはすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。また、生理食塩水を添加した各種癌細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例 1、 12、及び 15で得られたフコース硗酸含有多糖及び F— F d— 1〜F— F d— 4の 4種のフコース硫酸含有ォリゴ糖を添加した各種癌細胞は細胞数が減少し、これらのフコース硫酸含有多糖及びォリゴ糖のアポトーシス锈発作用により各種癌細胞の增殖が抑えられることが判明した。

実施例 1、 12、及び 15で得られたフコース硫酸含有多糖及び F— F d - 1 - F d一 4の 4種のフコース硫酸含有ォリゴ糖の各 P B S溶液（ 1 Omg/ m l ) の 121て、 20分問オートクレープ処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 28

56て、 30分間処理した牛胎児血清（J RHバイオサイエンス社）を 10% 含む Mc C 0 y， s 5 a培地（ギブコ社製）にて 37てで培養したヒト結腸癌細胞 HCT 1 16を Mc C o y' s 5 a培地にて 5 X 10³ コ /m 1 となるように懸濁し、 FALCON社製 24ゥュルプレート上の各ゥルに 1. 8 m 1ずつ分注した。それぞれの魅濁液に対し、 P B Sに溶解させた 10 m 8T/m Iの実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合物、実施例 12で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、フコース硫酸含有多糖一 U、 F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4、実施例 1 5で得られたフコース硫酸含有多糖の各溶液、及び PBSに溶解させた 5msr/m lのへパリン（和光純薬社製）及びデキストラン硫酸（分子量 50万、和光純薬社製）を 1 2 1 · ( 、 20分間オートクレープ処理したものを 0. 2m l添加し、 37て 5%二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として PB Sのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始 1 日、 2日、 3日、 4日後の生細胞数を Γ組織培養の技術」（第 2版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、 1 990年））記載の方法 (第 26~28頁）に従って計測した。すなわち、血球計箅板上のトリパンブル一染色による方法で計測した。得られた結果を図 29に示す。すなわち図 29は HC T 1 1 6細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース《£酸含有多糖標品、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例 12で得られたフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 F、 F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4、実施例 1 5で得られたフコース硓酸含有多糖を 1 msr/m 1、及びへパリン及びデキストラン硫酸を 0. 5msrZm 1 となるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（日）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 104 コ /2m 1 ) を示す。図 29中、培地に添加したフコース硫酸含有多糖あるいはオリゴ糖の種類は、 O印が無添加（対照）、翁印が実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品、騸印が実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物である。実施例 1 2で得られたフコース ½酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 F、 F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4、及び実施例 1 5で得られたフコース硫酸含有多糖は実施例 1で得られたフコース硗酸含有多糖混合物の場合と実質的に同じ曲線を示した。またへパリン及びデキストラン硫酸は実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品の場合と実質的に同じ曲線を示した。この結果 PB Sを添加した HCT 1 16細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例 1で得られたフコース磙酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合物、実施例 12で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、フコース硫酸含有多糖一 U、 F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4、実施例 1 5で得られたフコース硫酸含有多糖、へバリン、及びデキストラン硫酸を添加した H C T 1 16細胞は細胞数がほとんど増加しないか、あるいは減少した。また、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合物、実施例 12で得られたフコース磙酸含有多糖一 F、フコース ¾酸含有多糖一 U、 F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F - F d— 4、実施例 15で得られたフコース硗酸含有多糖、へパリン、及びデキストラン硗酸を添加した HCT 1 16細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。

すなわち、これらのフコース磙酸含有多糖及びオリゴ糖、へパリン、及びデキストラン硫酸のアポトーシス锈発作用により HC T 1 16細胞の増殖が抑制されることが判明した。

PB Sに溶解させた l Omsr/m lの実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖摞品、フコース硫酸含有多糖混合物、実施例 12で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、フコース «Ε酸含有多糖一 U、 F— F d— 1、 F— Fd— 2、 F - F d 一 3、及び F— F d— 4、実施例 15で得られたフコース磙酸含有多糖の各溶液のフィルター処理液、及び P B Sに溶解させた 5m sr/m Iのへパリン、及びデキストラン硫酸の各フィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 29

56て、 30分間処理した牛胎児血淸（J RHバイオサイエンス社）を 10% 含む Mc C o y' s 5 a培地（ギブコ社製）にて 37 'Cで培養したヒト結腸癌細胞 HCT 1 16を Mc C o y' s 5 a培地にて 5 X 103 コ Zm I となるように懸濁し、 F AL C ON社製 24ゥルプレート上の各ゥルに 1. 8 m 1ずつ分注した。それぞれの ¾S液に対し、 PB Sに溶解させた 2 OmsrZm 1、 30 msr/m 1 及び 50mg/m lの実施例 1で得られたフコース¾酸含有多糖標品の溶液を 121 、 20分間オートクレープ処理したものを 0. 2m l添加し、 37t；、 5%二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として PB Sのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」 ( 第 2版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、 1 99 0年） 3己載の方法（第 26~ 28頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。得られた結果を図 30に示す。すなわち図 30は HC T 1 1 6細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 1 0⁴ コノ 2m 1 ) を示す。図 30中、培地へのフコース硫酸含有多糖標品の添加量は、 O印が無添加（対照）、鲁印が 2ms/ m l、画印が 3m grZm l、黒三角印が 5msr/m 1 である。この結果 P B Sを添加した HC T 1 1 6細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加した HC T 1 1 6細胞は細胞数が減少した。

また、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加した HC T 1 1 6細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。

すなわち、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品は少なくとも 2msr / 1 の濃度で H C T 1 1 6細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。

PB Sに溶解させた 20m 8rZm l、 30m sr/m l 、及び 50mgr/m l の実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上己に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 30

56 、 30分間処理した牛胎児血清（J RHバイオサイエンス社）を 1 0% 含む H am' s F 1 2培地（ギブコ社製）にて 3 7 'Cで培養したヒト胃癌細胞 AG Sを H am' s F 1 2培地にて 5 X 1 03 コ/ m 1 となるように懸濁し、 F AL C ON社製 24ゥルプレート上の各ゥルに 1. 8 m l ずつ分注した。それぞれの懸蜀液に対し、 P B Sに溶解させた 20 m grZm 1、 30m gr/m 1 > 及び 5 OmsrZm 1 の実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を 1 2 1 · (：、 20分間オートクレープ処理したものを 0. 2m l 添加し、 3 7 、 5 %二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として P B Sのみを同量添加し同様に培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第 2版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、 1 990年）妃載の方法（第 26~28頁）に従つて計測した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。得られた結果を図 3 1に示す。すなわち図 3 1は AG S細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース硗酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 1 04 コ /2m I ) を示す。図 3 1中、培地へのフコース硫酸含有多糖標品の添加量は、 O印が無添加（対照）、秦印が 2msr/m 1、 ■印が 3m8T/m 1、黒三角印が 5mgZm 1 である。この結果 PB Sを添加した AG S細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例 1 で得られたフコース硫酸含有多糖標品を終鑲度で 3 msrZm 1以上添加した AG S細胞は細胞数が減少し、 2 ms/m 1 を添加したものも著しく細胞の増殖が抑制された。

また、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加した AG S細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。

すなわち、実施例 1で得られたフコース硗酸含有多糖標品は少なくとも 2mg /m I の濃度で A G S細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。

P B Sに溶解させた 20m g/m l、 30 m g/m U 及び 50mgr/m l の実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上己に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 3 1 56 'C、 30分間処理した牛胎児血清（J RHバイオサイエンス社）を 1 0% 含む L一 1 5培地（ギブコ社製）にて 37てで培養したヒト結腸癌細胞 SW48 0 ( A T C C C C L一 228) を L一 1 5培地にて 5 X 103 コ/ m 1 となるように懸濁し、 FAL CON社製 24ゥヱルプレート上の各ゥエルに 1. 8m l ずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、 PB Sに溶解させた 1 OmgZm 1、 3 Om gr/m I ^ 及び 50m«r/m lの実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を 1 21て、 20分間オートクレープ処理したものを 0. 2m l添加し、 37· ( 、 5 %二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として P B Sのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培蓑の技術」（第 2版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、 1 990年）記載の方法（第 26-28頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。得られた結果を図 32に示す。すなわち図 32は SW480細胞の培蹇液に実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培餐液中の生細胞数（X 10⁴ コ Z2m I ) を示す。図 32中、培地へのフコース硫酸含有多糖標品の添加量は、〇印が無添加（対照）、き印が l msr/m 1、顬印が 3ms/m l、黒三角印が 5mgZm 1 である。この結果 PB Sを添加した SW480細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を終濃度で 3m gZm 1以上添加した SW480細胞は細胞数が減少し、 l mg/m l を添加したものも著しく細胞の増殖が抑制された。

また、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加した SW 480細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。

すなわち、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品は少なくとも 1 mg /m 1 の濃度で S W480細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞の增殖を抑制できることが判明した。 PB Sに溶解させた 1 0mgZm l、 30mgZm l、及び 50mg/m lの実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖樣品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 32

56 、 30分間処理した牛胎児血清（J RHバイオサイエンス社）を 1 0% 及び N E AA (大日本製薬社製）を 1 %含む D MEM培地（大日本製薬社製）にて 37 'Cで培養したヒト結腸癌細胞 W i D r (AT C C C C L一 2 1 8) を上記培地にて 5 X 1 03 コ/ m 1 となるように懸濁し、 FALCON社製 24ゥ - ルブレート上の各ゥルに 1. 8m lずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、 PB Sに溶解させた l Oms m lの実施例 1で得られたフコース疏酸含有多糖混合物、実施例 1 2で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、 F— F d— 3及び F 一 F d— 4、及び実施例 1 5で得られたフコース硫酸含有多糖の各溶液を 1 2 1 *C、 20分間ォ一トクレーブ処理したものを 0. 2m l添加し、 37て、 5%二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として P B Sのみを同量添加し、同様に培餮した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第 2版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、 1 990年）記載の方法（第 26〜28頁）に従つて計測した。すなわち、血球計算板上のトリバンブルー染色による方法で計測した。得られた結果を図 33に示す。すなわち図 33は W i D r細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース磙酸含有多糖混合物、実施例 1 2で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、 F— F d— 3及び F— F d— 4及び実施例 15で得られたフコース硫酸含有多糖を 1 ms/m 1 となるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 1 コ /2 m 1 ) を示す。図 33中、培地に添加したフコース硫酸含有多糖の種類は、 O印が無添加（対照）、讕印が実施例 12で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、 ·印が実施例 1 5で得られたフコース ½酸含有多糖である。 F— F d— 3及び F— F d— 4は実施例 1 5で得られたフコース硫酸含有多糖の場合と実質的に同じ曲線を示した。この結果 P B Sを添加した W i D r細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例 1で得られたフコース ¾酸含有多糖混合物、実施例 12で得られたフコース疏酸含有多糖一 F、 F - F d一 3及び F— F d— 4、及び実施例 15で得られたフコース硫酸含有多糖を添加した W i D r細胞は細胞数が減少した。

また、実施例 1で得られたフコース硓酸含有多糖混合物、実施例 12で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、 F— F d— 3及び F— F d— 4、及び実施例 15 で得られたフコース硫酸含有多糖を添加した W i D r細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。

すなわち、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例 12で得られたフコース硫酸含有多糖一 F、 F— F d— 3及び F— F d— 4、及び実施例 15で得られたフコース硫酸含有多糖は W i D r細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。

PB Sに溶解させた 1 Om g/m 1の実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例 12で得られたフコース硗酸含有多糖一 F、 F— F d— 3及び F— F d— 4、及び実施例 1 5で得られたフコース硫酸含有多糖の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 33

56て、 30分間処理した牛胎児血清（J RHバイオサイエンス社）を 10% 及び NEAA (大日本製薬社製）を 1 %含む DMEM培地（大日本製薬社製）にて 37てで培養したヒト結腸癌細胞 Wi D r ( AT C C CC L一 21 8) を上記培地にて 5 X I 0³ コ/ m 1 となるように魅涵し、 F A L C ON社製 24ゥェルプレート上の各ゥュルに 1. 8m lずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、 PB Sに溶解させた 10mgZm l、 30msrZni l、及び 50mg/m lの実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を 121て、 20分間ォートクレープ処理したものを 0. 2m l添加し、 37 、 5%二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として P B Sのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第 2版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、 1 990年）記載の方法（第 26~28頁）に從つて計測した。すなわち、血球計算板上のトリバンブルー染色による方法で計測した。得られた結果を図 34に示す。すなわち図 34は W i D r細胞の培養液に実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（X I 04 コ 2 m l ) を示す。図 34中、培地へのフコ —ス硫酸含有多糖標品の添加量は、 O印が無添加（対照）、 ·印が 1 m grZm 1、鼴印が 3 msr/m l、黒三角印が 5msr/m I である。この結果 P B Sを添加した W i D r細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を終澳度で 3m g/m 1以上添加した W i D r細胞は細胞数が減少し、 l msr/m l を添加したものも著しく細胞の増殖が抑制された。

また、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加した W i D r細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。

すなわち、実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品は少なくとも 1 mgr /m 1 の澳度で W i D r細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。

P B Sに溶解させた 1 0m sr/m l、 3 Omsr/m 1 > 及び 50m sZm l の実施例 1で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。実施例 34

56 、 30分間処理した牛胎児血清（ J RHバイオサイエンス社）を 1 0% 含む R PM I 1 640培地（ギブコ社製）にて 37てで培養したヒト前骨髄性白血病細胞 H L— 60 (ATC C C C L— 240) を AS F 1 04培地（味の素社製）にて 5 X 1 04 コ/ 900 ^ 1 となるように懸濁し、 F A L C 0 N社製 6 ゥ -ルプレート上の各ゥ -ルに 4. 5m l ずつ分注した。それぞれの懸濁液に対し、実施例 1 9一 (6) 記載のフコース硫酸含有多糖一 Fの低分子化物を凍結乾燥したものを 1 OmgrZm 1 となるように 1 2 OmMの塩化ナトリゥムを含む 3 OmMへぺス緩衝液（ PH7 ) に溶解し、フィルターろ過処理したものを 0. 5 m l添加し、 37て、 5%二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として上記緩衝液のみを同量添加し、同様に培養した。培養開始 22時間後と 46時間後の生細胞数を組織培養の技術（第 2版）（朝倉出版、日本組織培餐学会編）記載の方法（第 26-28頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上のトリバンブルー染色による方法で計測した。

この結果 H L— 60細胞は上記のフコース硫酸含有多糖一 Fの低分子化物を凍結乾燥したものによりアポトーシスを誘発され、細胞增殖速度が抑制されることが判明した。実施例 35

ヒト前骨髄性白血病細胞 H L— 60を、 56 、 30分間処理した牛胎児血清 ( J R Hバイォサイエンス社製）を 1 0%含む RP M I 1 640培地（ギブコ社製）に 5 X 1 0⁴ m 00 u 1 となるように懸濁した。この懸濁液を 6つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、 1 20 mMの塩化ナトリウムを含む 30 mMのへぺス緩衝液（ P H 7) 及び同緩衝液に 1 OmsrZm 1 で溶解させた実施例 1 9一 (2) 記載のフコース硫酸含有多糖一 F、 F-F d - 1 > F— F d— 2、 F - F d— 3、及び F— F d— 4のフィルター処理液をそれぞれ 1 00 I添加し、 3 7て、 5%二酸化炭素存在下で 46時間培養した。

培養開始後 22時間及び 46時間に培養液中の生細胞数を測定した。

また、ヒト前骨 «性白血病細胞 HL— 60を、 A S F 1 04培地（味の素社製）に 5 X 1 0⁴ 個/ 900 1 となるように懸濁した。この懸濁液を 6つ用意し、それぞれの懸蜀液に対し、 1 20 mMの塩化ナトリゥムを含む 30mMのへぺス緩衝液（ PH7) 及び同緩衝液に 1 Om sr/m I で溶解させたフコース硫酸含有多糖- F、 F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d -3、及び F— F d— 4のフィルター処理液をそれぞれ 1 00 ^ I添加し、 37 、 5%二酸化炭素存在下で 40時間培蹇した。

培養開始後 16時間及び 40時間に培 ft液中の生細胞数を測定した。

また、上記 2種類の培養を行った細胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べた。

この結果、 A S F 1 04培地で培養した細胞においては、フコース硫酸含有多糖一 F、 F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4を添加した細胞が総て細胞縮小及び細胞断片化等のァボトーシスの特徴を呈し、生細胞数はほとんど増加がみられなかったかあるいはほぽ完全に死滅していた。緩衝液のみ添加した培地において細胞数は約 3倍に増加していた。一方、 R P M I 1 6 40培地で培養した細胞においては F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F - F d - 4を添加した細胞のみが総て細胞縮小及び細胞断片化等のアポト一シスの特徴を呈し、細胞はほとんど死滅していた。緩衝液のみ添加した培地において細胞数は約 3倍に増加し、フコース硫酸含有多糖— Fを添加した培地において細胞数は約 2. 5倍に増加していた。

以上の結果から、フコース硫酸含有多糖一 Fは無血清培地で癌細胞に対して強いアポトーシス誘発作用を持つが、 F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4は、無血清培地でも血清培地でも非常に強いアポトーシス誘発作用を持つことが判明した。更に確 ISのため、ヒト前骨镟性白血病細胞 HL— 60を、 56て、 30分間処理した牛胎児血清（ J RHバイオサイエンス社製）を 1 0 %含む R PM I 1 6 4 0培地（ギブコ社製）に 5 X 1 0⁴ 個/ 900 β 1 となるように懸濁した。この懸濁液 9m 1を 2本用意し、それぞれに、 12 OmMの塩化ナトリウムを含む 3 OmMのへぺス緩衝液（ P H 7) 及び同緩衝液に 1 OmgZm 1で溶解させた F 一 F d—4のフィルター処理液をそれぞれ 1 m 1添加し、 37· (：、 5%二酸化炭素存在下で 16時間培養した。培養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた細胞を 1 OmMのエチレンジアミンテトラアセテート及び 0. 5%のナトリウムラウロイルサルコシネートを含む 50 mMのトリス塩酸緩衝液（ P H 7. 8 ) 20 u \ にて懸酒し、 l OmsrZm l リボヌクレアーゼ A (シグマ社製）を I I 添加して 50 、 3 0分間処理した後、 1 O msr/m I のブロティネ一ス Kを 1 1添加して 50て、 30分間処理した。処理後の細胞をサンブルとして、 2 %のァガロースゲルを用いて 1 00 Vの定電圧の下で電気泳動を行った < このゲルをェチジゥムブ口ミド溶液に 30分間浸した後、トランスイルミネー夕一を用いてゲル中の DN Aの状態を確認したところ、アポトーシスに特有の DN Aラダ一が確認された。さらに確認のためアポトーシスを誘発する試薬として知られているァクチノマイシン Dを上記の F— F d — 4の代わりに用いて同様に操作したところ、 F— F d— 4の場合と同じ DN Aラダ一が確認できた。

すなわち、本発明のェンド型フコース硗酸含有多糖一 F分解酵素によりフコース硫酸含有多糖一 Fを分解するとがん細胞に対するァボト一シス誘発作用が強くなることが判明した。実施例 36

2 1才女性及び 32才男性の健常人静脈血を採血し、 1 リットル当りダルコ一スを 1 00mg、 C a C l 2 * 2?12 0を0. 74 ms、 MsrC l 2 を 1 9. 9 2msr、 KC l を 40. 26 msr、 N a C I を 737 1 msr、トリス一塩酸を 1 756. 5 m sを含む液で 2倍希釈後、リンパ球分離溶液（大日本製薬販売）をあらかじめ希釈血液の 2倍容量を入れた遠心分離管の中に静かに重層し、 1 8〜 20· (：、 400 grで 30分間遠心分雜した。遠心後、リンパ球分離溶液の上層のリンパ球画分を集めた。

こうして得られた健常リンバ球を 1. 9 X 1 0⁵ 個ずつ 24ゥュルのプレートに添加し、 1. 8 m 1 の 1 0 %牛胎児血清（56て、 30分処理後のもの）を含む R P M I — 1 640培地に 0. 2m l の 5m srZm l の上記各実施例で得られたフコース硫酸含有多糖、その分解物を 1種類ずつ加えた培地を加え 37'Cで培養した。コントロールとしてはフコース《£酸含有多糖溶液の代りに生理食塩水を添加した。培養開始後、顕微鏡で各ゥルの細胞の形態変化及び生細胞数を測定した。この結果、各種フコース硫酸含有多糖、その分解物を加えたゥルもコントロールのゥ _Λルも細胞形態に差がなく、また生細胞数の差もほとんど無く、 1 3日目にはどちらの細胞もほとんど死滅した。この結果より、フコース硫酸含有多糖、その分解物は癌細胞に対して強くアポトーシスを誘発させる濃度においても健常細胞に毒性を示さないことが判明した。実施例 37

フコース硫酸含有多糖一 Uの固形がんに対する制がん作用マウス固形がん Me t hA (4X 106c e I l s マウス）を 8週齡の雌性 B ALBZcマウス（体重約 208Γ) の腹部に皮下注射した。その後、引き较いて同じ箇所に 10日間実施例 6記載のフコース硫酸含有多糖一 U ( 100 mg/k sr/d a y) を皮下注射した。一方コントロール群には生理的食塩水を同様に皮下注射した。 2週間後にマウス腹部に形成されたがん組織を摘出して、その重量を測定した。結果を表 2に示す。すなわち、コントロール群では平均癌重量は 1. 258：であったのに対し、フコース硫酸含有多糖一 U投与群では 0. 28 gであり、有意 (コントロール群に対し p <0. 01 ) な制がん作用を示した。抑制率は 77. 6%であった。 .

実施例 38 フコース硫酸含有多糖の発がん予防作用

( 1 ) 6週令の S p r a g u r e— D aw l e yラツト（雄） 1 9匹に、 7. 4msrZk sのァゾキシメタン（ナカライテスク社製）を背部皮下投与し、以降 1週間に 1回、 1 0週目まで背都皮下投与した。なお投与時は、ァゾキシメタンを 0. 9%の塩化ナトリウムを含む PH6. 5の 0. 1 Μリン酸緩衝液に溶解し、毎回 1 00 " I となるように溶液の濃度を瘸整した。

上記 19匹中 5匹に対しては最初のァゾキシメタン投与と同時に連日、実施例 1の記載に準じ調製した、ガゴメ昆布熱水抽出液 7 Om 1を 30週目まで飲料水として経口投与した。この熱水抽出液は 2m g m 1のフコース硫酸含有多糖混合物を含有し、 1 40mg"Zk 8：のフコース硗酸含有多糖混合物が連曰経口投与された。

なお上記 1 9匹中 1 4匹に対してはフコース硫酸含有多糖は投与せず、水道水を飲料水として与え、対照群とした。

30週目までに対照群の外耳巣がん発生が 1 4匹中 1 4匹見られたのに対し、フコース硫酸含有多糖混合物投与群は 5匹中 1匹であり、顕著な発がん抑制作用が認められた。

なお 30週目までに対照群は 3匹死亡したが、フコース硗酸含有多糖混合物投与群は全匹生存した。また 30週目の対照群の平均体重が 7 1 6 gであるのに対し、フコース硫酸含有多糖混合物投与群の平均体重は 81 7 であった。一方ァゾキシメタン非投与のラット群（ 5匹）の平均体重は 788 grであり、フコース硫酸含有多糖混合物投与群の体重増加はァゾキシメタン非投与のラツト群と同等であつた。

次に、対照群の 4匹を遴抜し、 30週目より連日、上記ガゴメ昆布熱水抽出液 40m l (フコース硫酸含有多糖混合物 8 Omgr) を飲料水として経口投与した。

36週目において、 4匹中 2匹の外耳巣がんが顕著に退縮し、フコース硫酸含有多糖の制がん作用が認めらた。

以上フコース硫酸含有多糖の経口投与により、化学発がん剤による発がん予防作用、化学発がん剤による体重增加抑制の防止作用、更にはがん組織の退縮が認められた。実施例 3 9 注射剤

実施例 1で製造したフコース硫酸含有多糖混合物を注射用蒸留水に溶解し 5 % 溶液とした。この溶液を凍結乾燥用バイアル瓶 1バイアル中に、フコース硫酸含有多糖として 5 O m sr充てんし、凍結乾燥を行った。別に溶解液として生理食塩水 2 m I を添加した。実施例 4 0 注射剤

下記処方に従い注射剤を調製した。フコース硫酸含有多糖一 U [実施例 1 2 ] 4 0 m gr

生食塩水適罱

1 アンブル当り 2 m l

同様に実施例 1 2記載のフコース硫酸含有多糖一 Fを使用し注射剤を調製した < 実施例 4 1 錠剤

下記処方に従い錠剤を調製した < フコース硫酸含有多糖標品（実施例 1 ) 1 0 m 8：

コーンスターチ 6 5 m 8Γ

カルボキシメチルセルロース 2 0 m 8Γ

ボリビ二ルビ口リドン

ステアリン酸マグネシム 2 m g

1錠当り 1 0 0 m gr

実施例 4 2 注射剤

F - F d - 1 を注射用蒸留水に溶解し 5 %溶液とした。この溶液を凍結乾燥用バイアル瓶 1バイアル中に、フコース硫酸含有多糖として 5 O m s充てんし、凍結乾燥を行った。別に溶解液として生理食塩水 2 m 1 を添加した。実施例 43 注射剤

下記処方に従い注射剤を調製した。

実施例 1 9一（6) で得られたフコース硫酸含有多糖一 F

の低分子化物の凍結乾燥物 40mg

牛理食塩水 M

1ァンブル当り 2 m 1 実施例 44 錠剤

下記処方に従い錠剤を調製した。

実施例 1 9一（6) で得られたフコース疏酸含有多糖一 F

の低分子化物の凍結乾燥物 l Omsr

コーンスターチ 65msr

カルボキシメチルセルロース 20mg

ポリビエルビ口リドン 3 m gr

ステアリン酸マグネシウム 2 m g

1錠当り 1 0 Omsr 発明の効果

本発明により不要若しくは病原細胞に対してアポトーシス誘発作用を有し、がん等の異常增殖細胞疾患や、ウィルス性疾患において、病変細胞にアポトーシスを誘発させ、該疾患の予防、治療に有効な薬剤が提供される。とりわけ大腸がん、胃がん等消化器系のがんの場合、本発明の薬剤を経口投与することによりがん細胞にァポトーシスを起こさせることができるため、天然食品由来のフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を有効成分とする本発明の薬剤は非常に消化器系がんに適した制がん剤である。またその発がん予防効果により、化学発がん剤等による発がんも予防できる。本発明の薬剤は、食用の褐藻植物、食用のナマコ等、食用 ½質を原料として安価に大畺に供給可能であり、旦っ安全性が高い点においても優れている。また、フコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物を含有する食品又は飲料を日常的に摂取することにより、健康を維持、増強することができる。また、本発明により簡便なアポトーシス誘発方法が提供され、本発明の方法を使用することにより、アポトーシス機構解明の研究、アポトーシス誘発阻害剤の開発等を行うことができる。また本発明により、フコース硫酸含有多糖一 Fを実質的に含まず、反応性の強い着色性物質を除去した糖鎖工学、医学等の分野で有用な本発明のフコース硫酸含有多糖一 U及びその分解物が提供され、その効率的な製造方法も提供された。更に本発明により、フコース硫酸含有多糖一 Uを実質的に含まず、反応性の強い-着色性物質を除去した糖鎖工学、医学等の分野で有用な、本発明のフコース硫酸含有多糖一 F及びその分解物が提供され、その効率的な製造方法も提供された。本発明により、フコース硫酸含有多糖一 Fの構造解析や分解、フコース硫酸含有多糖一 Fの生物活性の検索に有用なフコース硫酸含有多糖一 Fの低分子化物の製造に用いることができるェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素、その製造方法、及びがん細胞に対するアポトーシス锈発作用が強いフコース硫酸含有多糖一 Fの該酵素による低分子化物が提供された。また、本発明によりこれまで安定的に製造されなかった本発明のェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素を、カルシウムィオンの存在下極めて安定的に製造することができるようになった。さらに、本発明により、カルシウムイオンの存在下本発明のンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を極めて効率よく働かせることが可能となった。

Claims

請求の範囲

1. フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を含有することを特徴とするアポトーシス誘発剤。

2. フコース硫酸含有多糖が下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖である請求項 1記載のアポトーシス誘発剤。

( 1 ) 構成糖：ゥ口ン酸を含有する。

( 2 ) フラボバクテリゥム（Flavobacteriue) s P . S A - 0082 (F ER M B P— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下記式（ 1 ) 、（11) 、（111) で表される化合物より選択される一種以上の化合物が生成する。

-911-

II0O/.6df/I.Dd 9689 ん 6 OAV

3. フコース硫酸含有多糖が下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖である請求項 1記載のアポト一シス誘発剤。

( 1 ) 構成糖：ゥ口ン酸を実質的に含有しない。

( 2 ) フラボバクテリゥム（Flavobacteriua) s p. S A - 0082 (F ER M B P— 5402) の生産するフコダイン分解酵素により実質上低分子化されない。

4. 分解物が請求項 2記載のフコース硫酸含有多糖の分解物である請求項 1記載のアポトーシス誘発剤。

5. 分解物が下記式（ 1 ) 、（11) 、（III) で表される化合物から選択される化合物である請求項 4記載のアポトーシス誘発剤。

-6Π-

/ム 6dfAL d 9689Z/.6 OAV

6. 分解物が請求項 3記載のフコース硫酸含有多糖にアルテロもナス S P. SN- 1009 (FERM BP— 5747) が生産する下記の理化学的性質を有するェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を作用させ得られる分解物である請求項 1記載のアポトーシス誘発剤。

( i ) 作用：下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に作用して、該

フコース硫酸含有多糖を低分子化させる。

( a)構成糖：ゥロン酸を実質的に含有しない。

( b ) フラボバクテリゥム（Flavobacteriu塵） s P . SA-0082 (F E RM B P— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により実質上低分子化されない。

( c )構成糖：ゥ口ン酸を含有する。

( d ) フラボパクテリゥム（Flavobacteriu^) s P . S A- 0082 (F E RM BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下妃式（ I ) 、（Π) 、（HI) で表される化合物より選択される一種以上の化合物が生成する。

-821 -

91 lOO/t6df /XDd (ii) 至適 PH：本酵素の至適 pHは 7~8付近にある。

(Hi)至適温度：本酵素の至適温度は 30~35で付近である。

7. 分解物が分子量分画されたものである請求項 6記載のアポトーシス誘発剤 _c

8. 分解物がフコース硫酸含有多糖にフラボバタテリゥム s p. SA—0 082 (F ERM B P— 5402) が生産するエンド型フコィダン分解酵素を作用させ得られるボアサイズ 10万の限外ろ過膜で排除されない分解物である請求項 1記載のアポトーシス誘発剤。

9. 分解物がフコース硫酸含有多糖の存在下でフラボバタテリゥム S P.

S A- 0082 (F ERM BP— 5402) を培養し、得られる培養液から分画されるポアサイズ 10万の限外ろ過膜で排除されない分解物である請求項 1記載のアポトーシス誘発剤。

10. 分解物がフコース硫酸含有多糖を酸分解し得られた分解物である請求項 1 記載のアポトーシス誘発剤。

11. 分解物が分子量分画されたものである猜求項 103己載のアポトーシス誘発剤。

12. フコース硫酸含有多糖がガゴメ昆布、マ昆布、ヒバマタ、ワカメ、マナマコのいずれか由来のフコース碇酸含有多糖である請求項 1 ¾載のアポトーシス锈発剤。

13. フコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物を有効成分として使用することを特徴とするアポトーシス ¾発方法。

14. フコース硫酸含有多糖が下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖である請求項 13記載のアポトーシス誘発方法。

( 1 ) 構成糖：ゥ口ン酸を含有する。

( 2 ) フラボパクテリゥム（Flavobacteriu雇） s p. SA-0082 (FER M B P— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下妃式（ 1 ) 、（11) 、（ΠΙ) で表される化合物より選択される一種以上の化合物が生成する。 -9ZI-

U00/L6dr/lDd -9ZI-

6dT/13d 9689 ん 6 OAV

15. フコース硫酸含有多糖が下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖である請求項 1 3記載のアポトーシス誘発方法。

( 1 ) 構成糖：ゥ口ン酸を実質的に含有しない。

(2) フラボパクテリゥム（ avobacteriu漏） s P . SA— 0082 (FER M B P— 5402) の生産するフコダイン分解酵素により実質上低分子化されない。

16. 分解物が請求項 1 4記載のフコース碇酸含有多糖の分解物である請求項 1 3記載のアポトーシス誘発方法。

17. 分解物が下記式（ I ) 、（11) 、（ΠΙ) で表される化合物から逮択される化合物である請求項 16記載のアポトーシス誘発方法。

-621-

.6df/XDd 9689Z/Z.6 OAV

18. 分解物が猜求項 15妃載のフコース¾酸含有多糖に下記理化学的性質を有するアルテロモナス S P. SN- 1009 (F ERM BP— 5747) が生産するェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を作用させ得られる分解物である請求項 13記載のアポトーシス誘発方法。

( i ) 作用：下妃理化学的性質を有するフコース硗酸含有多糖に作用して、該フコース硫酸含有多糖を低分子化させる。

( a)構成糖：ゥ口ン酸を実質的に含有しない。

( b ) フラポパクテリゥム（FlavobacteriuB) s p. SA-0082 (F ERM BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により実質上低分子化されない。

( d ) 構成糖：ゥ口ン酸を含有する。

( e ) フラボパクテリゥム（Flavobacteriu讓） s p. SA-0082 (F ERM BP— 5402) の生産するフコィダン分解醉素により低分子化し、少なくとも下紀式（ I )、（11) 、（ΠΙ) で表される化台物より逮択される一種以上の化合物が生成する。

-ιει-

/.6df/X3d 96893 ム 6 OAV -281-

6df/XDJ 9689Z/.6 ΟΛ\ (ii)至適 pH：本醉素の至適 p Hは 7 ~8付近にある。

(iii) 至適温度：本酵素の至適温度は 30-35て付近である。

19. 分解物が分子量分画されたものである請求項 18記載のアポトーシス誘発方法。

20. 分解物がフコース硫酸含有多糖にフラボパクテリゥム S P. S A- 0 082 (F ERM BP— 5402) が生産するェンド型フコィダン分解酵素を作用させ得られるポアサイズ 10万の限外ろ過膜で排除されない分解物である猜求項 1 3記載のアポトーシス誘発方法。

21. 分解物がフコース «Ε酸含有多糖の存在下でフラボパクテリゥム S P.

S A- 0082 (FERM BP— 5402) を培養し、得られる培養液から分画されるポアサイズ 10万の限外ろ過膜で排除されない分解物である請求項 13 記載のアポトーシス誘発方法。

22. 分解物がフコース硫酸含有多糖を酸分解し得られた分解物である請求項 1 3 己載のアポトーシス誘発方法。

23. 分解物が分子量分画されたものである請求項 22記載のアポトーシス誘発方法。

24. フコース硗酸含有多糖がガゴメ昆布、マ昆布、ヒバマ夕、ワカメ、マナマコのいずれか由来のフコース磙酸含有多糖である請求項 13記載のアポトーシス誘発方法。

25. 請求項 2~9のいずれかに記載のフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を含有することを特徴とする制がん剤。

26. 請求項 1~1 1のいずれかに記載のフコース碇酸含有多糖及び又はその分解物を含有することを特徴とする発がん予防剤。

27. 下記理化学的性質を有することを特徴とするフコース硫酸含有多糖。

( 1 ) 構成糖：ゥロン酸を含有する。

( 2 ) フラポバクテリウム（F vobacteriu膽） s P - S A - 0082 (FER M B P— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下記式（ 1 ) 、（Π)、（ΙΠ) で表される化合物より遣択される一種以上の化合物が生成する。 SI-

^6df /XDd 96893：/ム 6 OAV

28. フコース硫酸含有多糖混合物を塩類の存在下、酸性多糖凝集能のある薬剤で処理し、沈殿物を除去する工程を包含することを特徴とする猜求項 2 7記載のフコース硫酸含有多糖の製造方法。

29. フコース硗酸含有多糖混合物を、 2偭の隔イオンの混在下に陰イオン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包含することを特徴とする請求項 2 7記載のフコース硫酸含有多糖の製造方法。

30. 請求項 2 7記載のフコース硫酸含有多糖を製造する際に、共存する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰ィオン交換基を有する物質を用いて除去する工程を包含することを特徴とする諝求項 2 7妃載のフコース硫酸含有多糖の製造方法。

31. 下記理化学的性質を有することを特徴とするフコース硓酸含有多糖。

( 1 ) 構成糖：ゥ口ン酸を実質的に含有しない。

( 2 ) フラポパクテリゥム（Flavobacter iui) s P . S A - 0 0 8 2 ( F E R M B P— 5 4 0 2 ) の生産するフコダイン分解酵素により実質上低分子化されない。

32. フコース硫酸含有多糖混合物を、ゥロン酸を含むフコース磙酸含有多糖を分解する能力を有する分解酵素、又は該分解群素ももつ微生物で処理して目的の多糖を採取する工程を包含することを特徴とする請求項 3 1記載のフコース硫酸含有多糖の製造方法。

33. フコース硫酸含有多糖混合物を、塩類の存在下、酸性多糖凝集能のある薬剤で目的の多耱を沈殿させる工程を包含することを特徴とする請求項 3 1記載のフコース硫酸含有多糖の製造方法。

34. フコース硫酸含有多糖混合物を、 2価の頃イオンの混在下に陰イオン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包含することを特微とする請求項 3

1記載のフコース硫酸含有多糖の製造方法。

35. 請求項 3 1記載のフコース硫酸含有多糖を製造する際に、共存する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰ィオン交換基を有する物質を用いて除去する工程を包含することを特徴とする請求項 3 1記載のフコース硓酸含有多糖の製造方法。

36. 海藻から請求項 2 8、 2 9、 3 2、 3 3、又は 3 4記載のフコース硫酸含有多糖混合物を抽出する際に、酢酸イオンとカルシウムィオンを共存させることを特徴とするフコース硫酸含有多糖混合物の製造方法。

37. 下記の理化学的性質を有することを特徴とするェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素。

( a ) 構成糖：ゥ口ン酸を実質的に含有しない。

( b ) フラボパクテリゥム（FlavobacteriuB) s P . SA-0082 (F E RM BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により実質上低分子化されない。

( c ) 構成糖：ゥ口ン酸を含有する。

( d ) フラボバクテリゥム（Flavobacteriun) s p. S A- 0082 (F ERM BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下記式（ I ) 、（11) 、（ΠΙ) で表される化合物より選択される一種以上の化合物が生成する。

( I )

OH

-681-

df/X3d 9689Z/.6 OAV (ii) 至適 PH ：本酵素の至適 pHは 7〜8付近にある。

(iii) 至適温度：本酵素の至適温度は 30-35 "C付近である。

38. カルシウム源と請求項 37紀載のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を含有する酵素組成物。

39. 請求項 37記載のェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有するアルテ口モナス属細菌を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴とする請求項 37記載のェンド型フコース磙酸含有多糖分解酵素の製造方法。

40. 請求項 37記載のェンド型フコース《£酸含有多糖分解酵素を猜求項 31記載のフコース硫酸含有多糖に作用させて取得してなるものであることを特徴とするフコース硫酸含有多糖の低分子化物。