JPH11123075A - 新規α−フコシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は有機溶媒に対し安定で、Fucα1-3Gl
cおよびFucα1-3GlcNAcを選択的に合成する作用を有す
るペニシリウム属(Penicillium)由来のα−フコシダー
ゼおよび、フコシルオリゴ糖またはフコース誘導体と糖
またはアルコールとを含有する水溶液で、本発明のα−
フコシダーゼによる酵素反応を行わせしめて、α1-3フ
コシド結合を有する糖質を製造する方法である。 【効果】 本発明の製造方法によって得られる化合物
は、Fucα1-3GlcおよびFucα1-3GlcNAcなどのα1-3フコ
シド結合を有する糖質であり、複合糖質の合成原料とし
て有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なα−フコシ
ダーゼおよびこれを用いたα1-3フコシド結合を有する
糖質の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】フコース(Fuc)を含むオリゴ糖は、広く
天然の糖タンパク質や糖脂質などの複合糖質糖鎖の構成
成分として存在している。特に、フコースがＮ−アセチ
ルグルコサミン（GlcNAc）に対してα1-3結合している
構造が際だって多くみられる。例えば、糖鎖腫瘍抗原と
して知られているシアリルルイスＸ（sLe^X）中、あるい
は母乳中等にもFucα1-3GlcNAcという部分構造が存在し
ている。そこでこのようなオリゴ糖の生理活性を詳細に
研究し、且つ利用方法を研究するために、フコースを含
むオリゴ糖の合成法の確立が求められている。

【０００３】しかしながら、フコースを含む糖鎖の合成
は、一部のものが化学合成または酵素合成によりなされ
ているのにすぎない。

【０００４】化学合成においては、種々のフコース含有
オリゴ糖が合成されているが、いずれも工程数が長く、
工業的生産には好ましくない。

【０００５】α1-3フコシド結合を有する糖質の酵素合
成法に関しては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus
niger)起源α−フコシダーゼを用いた転移反応による
合成法についての報告がある（K. Ajisaka and M. Shir
akabe, Carbohydr. Res., 224, 291-299(1992)および特
開平4-99492）のみである。しかし、アスペルギルス・
ニガー起源のα−フコシダーゼは有機溶媒に対して不安
定である。通常、パラニトロフェニル−α−フコピラノ
シド(pNP-α-Fuc)などを糖供与体として酵素合成反応を
行う場合には、この糖供与体は水よりも有機溶媒に溶解
しやすいことから水と有機溶媒の混合溶媒を用いる場合
が多い。したがって、有機溶媒に対して不安定であると
いうことは、酵素合成反応において酵素を多く必要とす
るということにもなり、好ましい物性ではない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、α1-3フコシド結合を有する糖質を効率的に合成す
るための有機溶媒に対し安定なα−フコシダーゼ、およ
び該酵素を用いた当該糖質合成法を提供することにあ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく種々検討した結果、前記α1-3フコシド結
合を有する糖質を選択的に合成でき、且つ有機溶媒に対
し安定な新規のα−フコシダーゼ[EC3.2.1.51]を見出
し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、特許請求
の範囲に記載の各請求項からなる。以下本発明を詳細に
説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明のα−フコシダーゼを産生
する微生物としては、ペニシリウム属に属する菌などが
あげられる。このうち、ペニシリウム・マルチカラーも
しくはペニシリウム・シトリナムが好ましい。これらの
微生物からα−フコシダーゼを得るには、公知の方法、
すなわち、当該微生物を培養して、その培養液上清ある
いは微生物菌体から取得する方法が適用できる。あるい
は、市販酵素、例えば、ラクターゼ製剤等に混在したα
−フコシダーゼを精製して用いることができる。

【０００９】次にα1-3フコシド結合を有する糖質の製
造法について述べるα−フコシダーゼは本来加水分解酵
素であるが、受容体濃度を高めると糖転移作用を触媒す
るようになる。糖供与体としては、フコイダン等の天然
の糖質、パラニトロフェニル−α−フコピラノシド等の
合成基質を用いることができるが、α−フコシル結合を
非還元末端に持つ糖質であればいずれでもよい。糖受容
体としては、グルコース（Glc）、Ｎ−アセチルグルコ
サミン、種々の糖、種々のアルコール類などのヒドロキ
シル基を持つ化合物を用いることができる。α1-3フコ
シド結合を有する糖質を合成する際は、フコース供与体
とフコース受容体との量比は、1:0.1〜1:10であるが好
ましくは1:0.2〜1:5である。尚、糖供与体と糖受容体と
が同一化合物であっても何ら差し支えない。α1-3フコ
シド結合した糖質の製造には、精製した酵素を用いるこ
とが好ましいが、部分精製酵素あるいは培養液をそのま
ま、または培養液を粉末化した粗酵素を用いても何ら差
し支えない。また、固定化酵素であっても構わない。

【００１０】以下、本発明の実施例を示し、さらに詳し
く説明するが本発明はこれらの実施例に限定されない。

【００１１】

【実施例】

実施例１ 酵素の精製 ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)
起源酵素標品ラクターゼＰ（ケイ・アイ化成社製）10g
を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)30mlに懸濁し、
４℃で攪拌した。約12時間後遠心分離（10,000 x g,10
分）を行い、上清を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.
4)で平衡化したQ-Sepharose FFカラム（5cm x 20cm）に
添加した。ついで、1M塩化ナトリウムを含む10mMリン酸
ナトリウム緩衝液(pH7.4)の濃度勾配によりα−フコシ
ダーゼを溶出させた。流速は2ml/minであった。

【００１２】至適pHおよび安定pH ペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼ100
μlを含む緩衝液(pH5.32〜8.25はリン酸緩衝液、pH3.34
〜6.22は酢酸緩衝液、pH1.17〜3.72はグリシン緩衝液)
1.5mlと5mM pNP-α-Fuc 500μlを混合し、37℃で反応さ
せた。10分後、0.2M炭酸ナトリウム溶液2mlを加え、反
応を停止させた。加水分解によって生成したパラニトロ
フェノール量を指標にした相対活性を図１に示す。pH5
付近において高い酵素活性が認められた。

【００１３】安定pHを調べるためにペニシリウム・マル
チカラー起源α−フコシダーゼ100μlを含む各pHの上記
緩衝液1.5mlを25℃で保持した。24時間後、反応液100μ
l、0.1Mリン酸緩衝液(pH 5.33)1.4mlおよびpNP-α-Fuc
500μlを混合し、37℃で反応させた。10分後、0.2M炭酸
ナトリウム溶液2mlを加え、反応を停止させた。加水分
解によって生成したパラニトロフェノール量を指標にし
た相対活性を図２に示す。

【００１４】酵素活性はpH3〜7において25℃の処理を24
時間しても失活しなかった。

【００１５】至適温度 ペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼ100
μlを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH 5.33)1.5mlおよびpNP-
α-Fuc 500μlを混合し、各温度で反応させた。10分
後、0.2M炭酸ナトリウム溶液2mlを加え、反応を停止さ
せた。加水分解によって生成したパラニトロフェノール
量を指標にした相対活性を図３に示す。

【００１６】図３から、ペニシリウム・マルチカラー起
源α−フコシシダーゼの至適温度は50℃であった。

【００１７】分子量 TSKゲルＧ3000SW（東ソー社製）によるゲルろ過法では
ペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシシダーゼの
分子量は約180000であった。

【００１８】有機溶媒に対する安定性 ペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼ100
μlおよび有機溶媒を10,20あるいは30(v/v)%を含む0.1M
リン酸緩衝液(pH 5.33)1.5mlを37℃で保持した。３時間
後、反応液100μl、0.1Mリン酸緩衝液(pH 5.33)1.4mlお
よびpNP-α-Fuc500μlを混合し、37℃で反応させた。10
分後、0.2M炭酸ナトリウム溶液2mlを加え、反応を停止
させた。加水分解によって生成したパラニトロフェノー
ル量を指標にしたα−フコシダーゼの残存活性を表１に
示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】30%ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中
でアスペルギルス・ニガー起源α−フコシダーゼの３時
間後の残存活性は約20%であったのに対し、ペニシリウ
ム・マルチカラー起源α−フコシダーゼの３時間後の残
存活性は約58%であった。また、20%ジオキサン中でのア
スペルギルス・ニガー起源およびペニシリウム・マルチ
カラー起源α−フコシダーゼの３時間後の残存活性はそ
れぞれ約14%および約55%であった。これらの結果から、
本発明のα−フコシシダーゼの方がアスペルギルス・ニ
ガー起源のα−フコシシダーゼよりも有機溶媒中での安
定性は高いことが示された。

【００２１】実施例２ ペニシリウム・マルチカラー起
源α−フコシシダーゼを用いるFucα1-3Glcの製造法 100mgのpNP-α-Fuc及び500mgのGlcを1mlのジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）および10mlの0.1Mの酢酸ナトリウム
緩衝液(pH5.0)からなる溶液に溶解し、これに0.6単位の
α−フコシダーゼ（ペニシリウム・マルチカラー起源）
を加え、37℃で振盪した。20時間後、反応液を100℃で
５分間加熱して酵素を熱失活させた。この反応液を活性
炭カラム（2.7cm x 50cm）に供し、水−40%エタノール
水溶液の濃度勾配により生成物を単離したところ、35.2
mgのFucα1-3Glcを得た。活性炭カラムからの糖の溶出
パターンを図４に、生成物の¹³Ｃ−ＮＭＲ(D₂O, 125MH
z)を図５に示す。

【００２２】実施例３ ペニシリウム・シトリナム起源
α−フコシシダーゼを用いるFucα1-3Glcの製造法 100mgのpNP-α-Fuc及び500mgのGlcを1mlのＤＭＦおよび
10mlの0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)からなる溶
液に溶解し、これに6.8単位のペニシリウム・シトリナ
ム（商品名「ヌクレアーゼアマノ（天野製薬社製）」）
の酵素剤中に含まれるα−フコシダーゼを加え、37℃で
振盪した。4.5時間後、反応液を100℃で５分間加熱して
酵素を熱失活させた。その後、実施例２と同様に生成物
を単離したところ、29.8mgのFucα1-3Glcを得た。

【００２３】実施例４ ペニシリウム・マルチカラー起
源α−フコシシダーゼを用いるFucα1-3GlcNAcの製造法 100mgのpNP-α-Fuc及び500mgのGlcNAcを1mlのＤＭＳＯ
および５mlの0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)から
なる溶液に溶解し、これに4.7単位のα−フコシダーゼ
（ペニシリウム・マルチカラー起源）を加え、37℃で振
盪した。４時間後、反応液を100℃で５分間加熱して酵
素を熱失活させた。この反応液を活性炭カラム（2.7cm
x 50cm）に供し、水−30%メタノール水溶液の濃度勾配
により生成物を単離したところ、43.2mgのFucα1-3GlcN
Acを得た。

【００２４】

【発明の効果】本発明の有機溶媒に対して安定な新規の
α−フコシダーゼを用いて、複合糖質糖鎖の重要な中間
体であるFucα1-3Glc、Fucα1-3GlcNAcおよびその誘導
体を効率的に合成できる。

【００２５】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のペニシリウム・マルチカラー起源α−
フコシダーゼのpH依存性を示す。○および□は、それぞ
れ酢酸緩衝液およびリン酸緩衝液を用いて測定したとき
の相対活性を示す。

【図２】本発明のペニシリウム・マルチカラー起源α−
フコシダーゼのpH安定性を示す。○、□および△は、そ
れぞれ酢酸緩衝液、リン酸緩衝液およびグリシン緩衝液
を用いて測定したときの相対活性を示す。

【図３】本発明のペニシリウム・マルチカラー起源α−
フコシダーゼの温度依存性を示す。

【図４】実施例２におけるフコシルオリゴ糖の溶出パタ
ーンを示す。

【図５】Fucα1-3Glcの¹³Ｃ−ＮＭＲを示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フコースがα−結合したフコシド化合物
   と糖受容体とからα1-3フコシド結合を選択的に形成す
   る作用を有するペニシリウム(Penicillium)属に属する
   微生物由来のα−フコシダーゼ。
2. 【請求項２】 ペニシリウム属に属する微生物が、ペニ
   シリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)種で
   ある請求項１記載のα−フコシダーゼ。
3. 【請求項３】 ペニシリウム属に属する微生物が、ペニ
   シリウム・シトリナム(Penicillium citrinum)種である
   請求項１記載のα−フコシダーゼ。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のα−フ
   コシダーゼを用いることを特徴とするα1-3フコシド結
   合を有する糖質の製造方法。