JP3916682B2 - 配糖体の製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、好熱性菌バチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )由来のα−グルコシダーゼを利用した配糖体の製造方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
配糖体の製造方法として、従来、α−グルコシダーゼを用いて、マルトースをはじめとするマルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン又は各種デンプン等のα−1、4結合を持つグルカンを糖供与体として製造する方法が報告されている(特開平4−112798号公報)が、この方法では、アルコール性水酸基を有する化合物を糖受容体とすることは報告されているものの、フェノール性水酸基及びフラボノイド類縁化合物を糖受容体とする配糖体の製造方法については、報告されていない。
【0003】
また、アミラーゼの一種であるシクロデキストリン生成酵素を用いて配糖体を製造する方法も報告されている(日本農芸化学会誌Vol.67、No.5、1993、P93)が、この方法では、アルコール性水酸基を有する化合物の他に、フェノール性水酸基や、フラボノイド類縁化合物の配糖体を製造することができるものの、反応組成物が複雑になるため、もう1段酵素処理(グルコアミラーゼ処理)工程を経ねばならず、操作工程及びコストの面から問題が多かった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、操作工程が容易で、しかもアルコール性水酸基を有する化合物の他に、フェノール性水酸基を有する化合物やフラボノイド類縁化合物の配糖体を製造することのできる配糖体の製造方法を提供することを目的とするものである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意検討の結果、バチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )由来のα−グルコシダーゼが、水酸基を有する化合物に対して広く糖転移能を有するということを見出し、本発明に到達した。
【0006】
すなわち、本発明は、フェノール性水酸基を有する化合物とα−1、4結合を持つグルカンにα−グルコシダーゼを作用させて配糖体を製造するに際し、α−グルコシダーゼとしてバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)由来のα−グルコシダーゼを用いることを特徴とする配糖体の製造方法を要旨とするものである。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるフェノール性水酸基を有する化合物としては、ジメトキシフェノール、カテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、バニリン、カテコール、ピガノール、オイゲノール等が挙げられる。
【0008】
また、本発明に用いられるα−1、4結合を持つグルカンとしては、例えば、マルトース等のマルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、各種デンプン等が挙げられる。
【0009】
本発明に用いられるバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )由来のα−グルコシダーゼとしては、市販の酵素を用いてもよく(例えば、シグマ社製、G3651)、また、α−グルコシダーゼ産生能を有するバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )に属する細菌、例えばバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )UK563株(FERM P−7275)を培養することによって得られたものを用いてもよい。
【0010】
以下、このバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )UK563株の産生するα−グルコシダーゼの理化学的性質について説明する。
【0011】
(1)作用
α−1、4結合を持つグルカンの存在下で、アルコール性水酸基を有する化合物、フェノール性水酸基を有する化合物又はフラボノイド類縁化合物等の水酸基に、α結合で糖転移を行う。
【0012】
(2)至適pH
a.加水分解
p−ニトロフェニル−α−グルコピラノシド(以下、PNPGと略記する)を基質として各pHのリン酸緩衝液(ただし、pH6.0以下では酢酸緩衝液を、PH9.0以上ではグリシン−NaOH緩衝液を用いた)中で30℃で15分間反応させた結果、図1に示すとおり、至適pHはpH6.0であった。図1は、この酵素の加水分解活性のpHによる変化を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸にpHを示している。なお、酵素活性は測定値が最高値を示したとき(pH6.0)の活性を100とした相対活性で表した。
【0013】
b.糖転移
マルトースを糖供与体、ヒドロキノンを糖受容体として各pHのリン酸緩衝液(ただし、pH6.0以下では酢酸緩衝液を、PH9.0以上ではグリシン−NaOH緩衝液を用いた)中で、40℃で3時間反応させた結果、図2に示すとおり、至適pHは9.0であった。図2は、この酵素の糖転移活性のpHによる変化を示すグラフであり、縦軸に糖転移率を、横軸にpHを示している。なお、糖転移率は測定値が最高値を示したとき(pH9.0)の転移率を100とした相対転移率で表した。
【0014】
(3)作用適温の範囲
PNPGを基質として0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)中で各温度で15分間反応させた結果、図3に示すとおり、作用適温の範囲は30〜60℃であった。図3は、この酵素の活性に対する温度の影響を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸に温度を示しており、酵素活性は40℃での測定値を100とした相対活性で表した。
【0015】
(4)温度による失活の条件
100℃において20分間処理することにより完全に失活する。
【0016】
(5)分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で約50、000である。
【0017】
このような酵素は、上記のようなバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )を培養、精製することにより得ることができる。
培養に用いられる培地としては、炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フルクトース、澱粉加水分解物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢酸、乳酸等の有機酸類、さらに使用する細菌が資化しうるアルコール類、油脂、脂肪酸及びグリセリン等が使用でき、窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の無機又は有機物が使用できる。さらに無機塩類として、例えば、カリウム、コバルト等の各塩類や、必要に応じて微量金属塩、コーンスティープリカー、ビタミン類、核酸等を使用してもよく、細菌の一般的培地が使用できる。
【0018】
また、培養条件としては、これらの培地を用いて、30〜65℃、好ましくは45〜60℃、最適には58℃で、2〜6時間、好気的に培養すればよい。
【0019】
本発明に用いられるα−グルコシダーゼは、このようにして得られた菌体の菌体破砕液を、ゲルろ過クロマトグラフィー、疏水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを用いて精製することにより得ることができる。
【0020】
本発明において、フェノール性水酸基を有する化合物とα−1、4結合を持つグルカンにα−グルコシダーゼを作用させる際の、反応液中のフェノール性水酸基を有する化合物の濃度としては、0.1〜50重量%であることが好ましく、特に好ましくは1〜10重量%である。この場合、水に難溶な基質に対しては基質が溶解するように、アセトン、アセトニトリル等の水混和性有機溶媒を適当量添加してもよい。また、α−1、4結合を持つグルカンの濃度としては、1〜80重量%が好ましく、特にこのましくは10〜50重量%である。また、酵素の添加量としては、5〜30U/ミリリットルとなるように添加することが好ましく、特に10〜20U/ミリリットルとなるように添加することが好ましい。
【0021】
反応条件としては、30〜60℃、好ましくは40〜50℃で、3〜20時間反応させればよい。
【0022】
このようにして得られた配糖体は、反応後にグルコアミラーゼ処理等の後処理を行う必要は全くない。反応終了後は各種溶媒による抽出及び各種クロマトグラフィーによる精製により、配糖体の精製標品を得ることができる。
【0023】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、本発明におけるα−グルコシダーゼの活性及び糖転移率は以下のようにして測定した。
【0024】
(1)α−グルコシダーゼ活性の測定
α−グルコシダーゼ酵素液(又は蒸留水に凍結乾燥した酵素を溶解したもの)を、10mMのリン酸緩衝溶液(pH7.5)で0.006〜0.022U/ミリリットルとなるように希釈して、酵素溶液を調整した。
【0025】
0.1Mのリン酸緩衝液(pH6.3)1.0ミリリットルに、20mMのPNPG溶液0.5ミリリットルを加え、30℃で5分間インキュベーションした後、酵素溶液0.5ミリリットルを添加し、30℃で正確に15分間インキュベーションした。その後、0.2Mの炭酸ナトリウム溶液2.0ミリリットルを添加し、400nmにおける吸光度(C)を測定した。また、ブランクとして上記酵素溶液の代わりに精製水を用いて同様の操作を行って400nmにおける吸光度(Cb)を測定した。α−グルコシダーゼ活性(A)は、以下の式より算出した。
【0026】
【数1】
【0027】
なお、本発明においてα−グルコシダーゼ活性の1Uは、上記反応系で30℃で1分間に1μmolのPNPGを加水分解できる酵素量と定義する。
【0028】
(2)糖転移率の測定
α−1、4結合を持つグルカン(糖供与体)と水酸基を有する化合物(糖受容体)を含む80mMのほう酸緩衝溶液(pH9)に、α−グルコシダーゼを添加し、反応させた後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC、ODSカラムC−18(ミリポア社製)を用い、40%のメタノール溶液で溶出し254nmの吸光度により検出した)にて分析を行った。また、コントロールとして酵素無添加の溶液を調製し、同様の条件で分析を行った。糖転移率は、以下の式より算出した。
【0029】
【数2】
【0030】
参考例1(α−グルコシダーゼの調製)
培地(グルコース 0.35重量%、酵母エキス 0.3重量%、ペプトン 0.2重量%、KH2 PO4 0.04重量%、Na2 HPO4 ・12H2 O 0.04重量%、MgSO4 ・7H2 O 0.1重量%、pH7.8)20リットルに、バチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )UK563(FERM P−7275)を植菌し、58℃で5時間培養を行った後、培養液を遠心分離してバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )UK563の湿菌体約60gを得た。
【0031】
得られた湿菌体約60gを25mMのリン酸緩衝溶液(pH6)600ミリリットルに懸濁した後、フレンチプレンス(大日本製薬社製)で菌体を破砕した。この菌体破砕液をDEAE−セファロースカラムクロマトグラフィー(20cmφ×10cm、ファルマシア社製)にアプライし、25mMのリン酸緩衝溶液(pH6)の0〜0.2MのKCl濃度勾配により溶出を行った。得られた活性画分を限外ろ過膜(旭化成社製)を用いて脱塩、濃縮を行った後、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィー(5cmφ×10cm、ファルマシア社製)にアプライし、25mMのリン酸緩衝液(pH6)の0.8〜0Mの硫安濃度勾配により溶出を行った。得られた活性画分を限外ろ過膜(旭化成社製)を用いて脱塩、濃縮を行った後、凍結乾燥させることによりα−グルコシダーゼの精製標品約200mgを得た。このような方法で精製した酵素は、SDS−PAGEで単一のバンドを示した。
【0032】
実施例1
糖受容体として、ヒドロキノン、バニリン、レゾルシノール、カテコール、ピロガノール、オイゲノール、3,4−ジメトキシフェノールを用いて、以下のようにして配糖体を製造した。
【0033】
マルトース10重量%、糖受容体2重量%(ステビオシドは1重量%)、参考例1で調製したα−グルコシダーゼの10U/ミリリットル溶液を含む反応液1ミリリットルを40℃で3時間反応させた。配糖体が製造されているかどうかは、TLCを用いて確認した。
その結果を表1に示す。
【0034】
【表1】
【0035】
表1からわかるように、本発明の方法によれば、フェノール性水酸基を有する化合物においても配糖体を製造することができた。
【0042】
実施例2(ヒドロキノングルコシドの製造)
80mMのほう酸緩衝液(pH9)500ミリリットルにヒドロキノン10g及びマルトース50gを溶解し、この溶液に参考例1で調製したα−グルコシダーゼを10U/ミリリットルとなるように添加した。この溶液を40℃で3時間反応させた後、100℃で5分間処理して反応を停止させた。この反応液の糖転移率は30%であった。
【0043】
次に、得られた反応物中の未反応の原料を酢酸エチルにより抽出除去した。水層画分を50ミリリットルのDIAION HP−20(三菱化学社製)カラムに通液し、ヒドロキノングルコシドを吸着させ、蒸留水1リットルでカラムを洗浄した後、500ミリリットルのメタノールでヒドロキノングルコシドを溶出させた。得られたヒドロキノングルコシド画分を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによりヒドロキノングルコシドの粉末5.2gを得た。
【0044】
得られたヒドロキノングルコシドをα−グルコシダーゼ(東洋紡社製、AGH−211)で処理した後、HPLCで分析を行ったところヒドロキノングルコシドのピークがなくなり、ヒドロキノンのピークが増加したことから、このヒドロキノングルコシドは、ヒドロキノンにグルコースがα結合した化合物であることがわかる。
【0048】
実施例3(3、4−ジメトキシフェニルグルコシドの製造)
80mMのほう酸緩衝液(pH9)500ミリリットルに3、4−ジメトキシフェノール10g及びマルトース50gを溶解し、この溶液に参考例1で調製したα−グルコシダーゼを10U/ミリリットルとなるように添加した。この溶液を40℃で3時間反応させた後、100℃で5分間処理して反応を停止させた。この反応液の糖転移率は12%であった。
【0049】
次に、得られた反応物中の未反応の原料を酢酸エチルにより抽出除去した。水層画分を50ミリリットルのDIAION HP−20(三菱化学社製)カラムに通液し、3、4−ジメトキシフェニルグルコシドを吸着させ、蒸留水1リットルでカラムを洗浄した後、500ミリリットルのメタノールで3、4−ジメトキシフェニルグルコシドを溶出させた。得られた3、4−ジメトキシフェニルグルコシド画分を減圧濃縮した後、凍結乾燥することにより3、4−ジメトキシフェニルグルコシドの粉末1.8gを得た。
【0050】
得られた3、4−ジメトキシフェニルグルコシドをα−グルコシダーゼ(東洋紡社製、AGH−211)で処理した後、HPLCで分析を行ったところ3、4−ジメトキシフェニルグルコシドのピークがなくなり、3、4−ジメトキシフェノールのピークが増加したことから、この3、4−ジメトキシフェニルグルコシドは、3、4−ジメトキシフェノールにグルコースがα結合した化合物であることがわかる。
【0054】
実施例4(ヒドロキノングルコシドの製造)
80mMのほう酸緩衝液(pH9)500ミリリットルにヒドロキノン10g及びマルトース50gを溶解し、この溶液にバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)由来のα−グルコシダーゼ(シグマ社製、G3651)を10U/ミリリットルとなるように添加した。この溶液を40℃で3時間反応させた後、100℃で5分間処理して反応を停止させた。この反応液の糖転移率は28%であった。
【0055】
次に、得られた反応物中の未反応の原料をクロロホルムにより抽出除去した。水層画分を50ミリリットルのDIAION HP−20(三菱化学社製)カラムに通液し、ヒドロキノングルコシドを吸着させ、蒸留水1リットルでカラムを洗浄した後、500ミリリットルのメタノールでヒドロキノングルコシドを溶出させた。得られたヒドロキノングルコシド画分を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによりヒドロキノングルコシドの粉末4.6gを得た。
【0056】
得られたヒドロキノングルコシドをα−グルコシダーゼ(東洋紡社製、AGH−211)で処理した後、同様にHPLCで分析を行ったところヒドロキノングルコシドのピークがなくなり、ヒドロキノンのピークが増加したことから、このヒドロキノングルコシドは、ヒドロキノンにグルコースがα結合した化合物であることがわかる。
【0057】
【発明の効果】
本発明によれば、フェノール性水酸基を有する化合物の配糖体を簡便な工程により製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】バチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )UK563(FERM P−7275)由来のα−グルコシダーゼの加水分解活性に及ぼすpHの影響を示すグラフである。
【図2】バチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )UK563(FERM P−7275)由来のα−グルコシダーゼの糖転移活性に及ぼすpHの影響を示すグラフである。
【図3】バチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus )UK563(FERM P−7275)由来のα−グルコシダーゼの活性に及ぼす温度の影響を示すグラフである。
Claims (1)
- フェノール性水酸基を有する化合物とα−1、4結合を持つグルカンにα−グルコシダーゼを作用させて配糖体を製造するに際し、α−グルコシダーゼとしてバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)由来のα−グルコシダーゼを用いることを特徴とする配糖体の製造方法。
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JP24580395A JP3916682B2 (ja) | 1995-09-25 | 1995-09-25 | 配糖体の製造方法 |
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JPH0987294A JPH0987294A (ja) | 1997-03-31 |
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- 1995-09-25 JP JP24580395A patent/JP3916682B2/ja not_active Expired - Fee Related
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