JP2662667B2 - アミラーゼｘ−２３およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はハイドロキノン等のフェ
ノール性ＯＨ基を有する化合物等に糖転移を行なうアミ
ラーゼＸ−２３（以下、本酵素という）及びその製造法
に関する。ハイドロキノン等の糖転移化合物は食品、化
粧品及び医薬品等の分野で利用できる。

【０００２】

【従来の技術】糖及びアルコール性ＯＨ基に糖転移を行
なうアミラーゼに関する研究は古くから行なわれてい
る。例えば、アミラーゼシンポジウムＶｏｌ．１０ １
９７５第８１頁〜８９頁に糖質に糖転移を行なう酵素の
報告がされている。しかし、長年糖転移を行なう酵素の
研究がされてきたにもかかわらず、化合物中のフェノー
ル性ＯＨ基及びフラボノイド類縁化合物中のＯＨ基に糖
転移を行なう酵素に関する研究はない。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本酵素は次の理化学的性
質を有する。 １．作用 フェノール類縁化合物又はフラボノイド類縁化合物等の
受容体が存在しなければ、マルトオリゴ糖、アミロー
ス、アミロペクチン、各種スターチ等のα−１，４結合
を持つグルカンを分解（加水分解）する。しかし、フェ
ノール類縁化合物又はフラボノイド類縁化合物及びマル
トオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン各種スターチ
等のα−１，４結合を持つグルカンが同時に存在すれ
ば、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、各
種スターチ等のα−１，４結合を持つグルカンを分解す
ると共にフェノール類縁化合物又はフラボノイド類縁化
合物中のＯＨ基に、α結合で糖転移を行なう。

【０００４】２．受容体特異性 ハイドロキノン又はジメトキシフェノール等フェノール
類縁化合物中のフェノール性ＯＨ基もしくはフラボン、
イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバノノ
ール、カテキン、オーロン、アントシアニジン、カルコ
ン又はジヒドロカルコン等のフラボノイド類縁化合物中
のＯＨ基に、α結合で糖転移を行なう。

【０００５】３．至適ｐＨおよび安定ｐＨ 可溶性デンプンを加水分解した場合、至適ｐＨはｐＨ６
〜７であり、安定ｐＨはｐＨ５〜８である（図１）。ハ
イドロキノンに糖転移を行なう場合、至適ｐＨはｐＨ５
〜８であり、安定ｐＨはｐＨ４〜１３である（図２）。

【０００６】４．力価測定法 （α−アミラーゼ活性測定法）アミラーゼ活性は、次の
ようにして測定される。４０℃にインキュベーションし
た酵素液５０μｌに４０℃にインキュベーションした
１．５％可溶性デンプン（４０ｍＭ酢酸−Ｎａ緩衝溶液
によりｐＨ５．５に調製する）２００μｌを添加し、４
０℃で１０分間反応させる。この反応液に、０．５Ｎ酢
酸と０．５Ｎ塩酸とを５：１に混合した液２ｍｌ添加し
て撹拌することにより反応を停止させる。この溶液０．
１ｍｌを採取し、０．００５％ヨウ素及び０．０５％ヨ
ウ化カリウムを含有する溶液５ｍｌを添加して撹拌し、
室温にて２０分間放置する。この溶液の６６０ｎｍにお
ける吸光度を測定し、この吸光度をｃとする。別にブラ
ンクとして上記酵素液の代わりに精製水を用いた溶液を
調整し同様の操作を行なって得られた吸光度をＢとす
る。このようにして得られたｃ及びＢからアミラーゼ活
性Ａが次式によって得られる。 Ａ＝（Ｂ−Ｃ）／Ｂ ×１０ ただし、アミラーゼ活性の１単位はＢ値の１０％である
とする。

【０００７】（糖転移率の測定法）糖転移率は次のよう
にして測定される。可溶性デンプン又はマルトペンタオ
ース等の供与体１０％及びハイドロキノン又はカテキン
等のフェノール性ＯＨ基を有する化合物の受容体２％を
含む溶液並びに酵素液を１：１で混合し、４０℃にて１
６〜２４時間反応させる。反応液を１５倍希釈し、ＨＰ
ＬＣ（ＭＥＲＣＫ社製のＯＤＳカラムＲＰ−１８を使
う。ｐＨ２．５に調整した１０％メタノールの溶離液を
用いる）にて分析を行なう。検出は２８０ｎｍにおける
吸光度により行なう。またコントロールとして酵素液の
代わりに精製水を用いた溶液を調製し上記と同様の操作
を行なう。糖転移率は、次式により算出される。 糖転移率＝配糖体のピーク面積／コントロールの受容体
のピーク面積×１００

【０００８】５．作用適温の範囲 ｐＨ５．５において３０℃から７０℃まで安定して糖転
移を行なう（図３）。

【０００９】６．阻害剤 銅イオン及び亜鉛イオンに阻害されるが、ＥＤＴＡ、カ
ルシウムイオン、マンガンイオン、バリウムイオン、マ
グネシウムイオン及びコバルトイオンの阻害をほとんど
受けない（図４）。

【００１０】７．失活の条件 １００℃において１５分間処理すると完全に失活する。

【００１１】８．精製方法 培養液から菌体を除去した後、硫安（８０％飽和）によ
る塩析を行ない得られた沈殿を溶かし透析を行なう。こ
れをＱ−セファロースカラムクロマトグラフィー（ｐＨ
５．５の０〜０．５ＭＮａＣｌ濃度勾配を用いる）にか
けた後、透析を行なう。ついでフェニルセファロースカ
ラムクロマト（０．８Ｍ〜ＯＭ硫安濃度勾配を用いる）
にかけた後、透析を行なう。透析内液をスーパーロース
１２によるゲルろ過を行ない凍結乾燥後、精製標品を得
る。このような方法で精製した本酵素は、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを示す。

【００１２】９．分子量 約６５０００である（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動による）。

【００１３】１０．紫外線吸収スペクトル 極大吸収は２６７ｎｍであり、極小吸収は２５２ｎｍで
ある（図５）。

【００１４】１１．アミノ酸分析 アミノ酸組成は、図６のとおりである。

【００１５】本酵素は、例えばバチルス サブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｘ−２３（生
工研菌寄託第Ｐ−１３５６０号）（以下、本菌株とい
う）の培養物から採取し、精製する。本菌株は、発明者
らにより土壌から分離された新菌株である。本菌株の菌
学的性質を以下に示す。尚、培養温度は特に記載の無い
限り３０℃である。

【００１６】（菌学的性質） １．形態学的性質（肉汁寒天培地） １）細胞の形及び大きさ （０．６〜０．７）×（１．５〜３）μｍの桿菌であ
る。連鎖性は無い。 ２）胞子を有する。 ３）グラム染色は陽性である。

【００１７】２．生育状態 １）肉汁寒天平板培地では生育良好である。表面は白色
でしわが有る。 ２）肉汁寒天斜面培地では生育良好である。表面は白色
から褐色でしわが有る。 ３）肉汁液体培地では生育良好である。液は混濁する。 ４）食塩肉汁液体培地では７％の食塩濃度で生育でき
る。

【００１８】３．生理学的性質 １）硝酸塩の還元は陽性である。 ２）デンプンの資化性は陽性である。 ３）カタラーゼの生成は陽性である。 ４）オキシダーゼの生成は陽性である。 ５）生育温度の範囲は５０℃までである。 ６）グルコース、キシロース、マンニトールから酸を形
成する。ただしガス発生を伴わない。 ７）アセチルメチルカルビノールの生成は陽性である。 ８）嫌気的条件下で生育できない。

【００１９】以上の結果をバージーのマニュアル第２巻
（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌｏｆ Ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．２ １
９８６）と照合して、本菌はバチルス サブチリスと同
定した

【００２０】（培養条件）本菌株の培地は格別である必
要はなく、通常の培地が用いられる。炭素源としては、
デンプン、グリセリン，グルコース，セロビオース，シ
ュクロース及びラクトース等が用いられる。窒素源とし
てはポリペプトン、肉エキス、大豆タンパク及び総合ア
ミノ酸が用いられる。無機塩類としてはＮａＣｌ、リン
酸１カリウム、リン酸２カリウム及び硫酸マグネシウム
等が用いられる。その他必要に応じてビタミン類等微量
栄養素が加えられる。たとえば、可溶性デンプン １．
０％、ポリペプトン ０．５％、肉エキス ０．５％及
びＮａＣｌ ０．３％から成り、ｐＨが６．８の培地が
好適に用いられる。ｐＨ６〜８好ましくはｐＨ７．０、
温度は２５℃〜３５℃で、約１〜５日間好ましくは約３
日間好気的に撹拌又は振とうしながら培養を行なう。本
酵素は菌体外に分泌されるため培地中から回収される。

【００２１】（本酵素の採取方法）上記培養液から本酵
素を採取、精製するために、既知の精製方法が単独もし
くは併用して用いられる。例えば、上記培養液をろ過又
は遠心分離にかけて菌体を除去しろ液又は上清液を得
る。このろ液又は上清液を必要に応じて濃縮し、限外ろ
過または透析を行なう。更に、硫安などにより塩析した
後、透析し、ついで陰イオンセファロース等による陰イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー
など各種クロマトグラフィー（例えば、ＱＡＥ−セファ
ロース、ＤＥＡＥ−セルロース、フェニルトヨパールな
ど）及びゲルろ過を単独又は、組み合せて用いることに
より精製を行なう。

【００２２】（配糖体の製造方法）ハイドロキノン又は
ジメトキシフェノール等のフェノール性ＯＨ基を持つ化
合物若しくはフラボン、イソフラボン、フラボノール、
フラバノン、フラバノノール、カテキン、オーロン、ア
ントシアニジン、カルコン又はジヒドロカルコン等のフ
ラボノイド類縁化合物１〜２０％、好ましくは１〜５％
と、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、各
種スターチ等のα−１，４結合を持つグルカン１〜２０
％、好ましくは５〜１０％とを含む溶液に、本酵素を添
加し、４０℃において約１６時間反応させる。各種溶媒
による分配及び各種クロマトグラフィーによる精製によ
り、この反応液から配糖体の精製標品を得ることができ
る。

【００２３】

【実施例】

（実施例１）０．５％可溶性デンプン、０．５％肉エキ
ス、０．５％ポリペプトン及び０．３％Ｎａｃｌを含有
する培地（ｐＨ６．８に調製する）５００ｍｌを、２０
００ｍｌ容の坂口フラスコにいれ、本菌株を接種し、３
０℃で３日間振とう培養した。この培養液を遠心分離
し、菌体を取り除いた上清液について硫安塩析を行なっ
た。まず硫安粉末を８０％飽和となるまで添加し、析出
した沈殿を遠心分離によって回収した。沈殿を５ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ５．５に調製する）に溶解し、同緩衝液
に対して一晩透析をおこない、脱塩を行なった。得られ
た透析内液を、同緩衝液により平衡化したＱ−セファロ
ースカラム（２．８×１０ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）にかけて酵素を吸着させた。ついで酢酸緩衝液中の
食塩濃度を０〜０．５Ｍに直線的に増加させる事により
グラジエント溶出を行なった。アミラーゼ活性を示す画
分（ＮａＣｌ濃度が０．０５〜０．２Ｍのところに相当
する）を回収し、５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５に調製
する）に対し一晩透析を行なった。この透析内液に１．
７Ｍになるまで硫安を加え、１．７Ｍ硫安を含む５ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ５．５に調製する）で平衡化したフェ
ニルトヨパールカラム（３．０×１０ｃｍ、Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社製）にかけて酵素を吸着させたのち酢酸緩衝
液中の硫安濃度を１．７〜０Ｍに直線的に減少させる事
によりグラジエント溶出をおこなった。アミラーゼ活性
を示す画分（硫安濃度が０．４〜０．０８Ｍのところに
相当する）を回収し、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５
に調製する）に対し一晩透析を行なった。透析内液を膜
濃縮し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液
により平衡化したスーパーロース１２カラム（１×３０
ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）によりゲルろ過をおこ
なった。これにより得られた活性画分と２８０ｎｍにお
ける吸収（タンパクによる吸収）の関係を図７に示す。
アミラーゼ活性は２８０ｎｍの吸収と同一面分の一つの
ピークとして現れた。この画分を精製水に対して充分透
析を行なった後、凍結乾燥し本酵素の精製標品約５ｍｇ
を得た。この精製標品は、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動及びＳＤＳ−ボリアクリルアミドゲル電気泳動を行
なうと単一のバンドとなり、電気泳動的に単一の物質で
あることが示された。

【００２４】（実施例２）ハイドロキノン１０％及びマ
ルトペンタオース２０％を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．５に調製する）に溶解した。この溶液１０ｍｌにア
ミラーゼ活性６０単位を有する本酵素液１０ｍｌを添加
した。上記溶液を４０℃において１６時間反応させた
後、３倍量の酢酸エチルを加え激しく振とうした。室温
において３０分間静置した後、水相画分を回収した。こ
の操作を３回行ない、未反応のハイドロキノンを完全に
取り除いた後、減圧乾燥を行った。試料を精製水に溶か
し精製水で平衡化した活性炭カラムに配糖体を吸着させ
た。次いで２０％メタノールで活性炭カラムに吸着して
いる未反応の糖を溶出した後、１００％メタノールによ
り配糖体を溶出した。１００％メタノール画分を減圧乾
燥した後、再び精製水に溶解し凍結乾燥を行った。以上
の操作によりハイドロキノンの配糖体を約２００ｍｇ得
ることができた。この精製標品をについて、α−グルコ
シダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）による処理を行ない上記
配糖化率の測定方法で示したＨＰＬｃ分析を行なったと
ころ、ハイドロキノンの配糖体（以下、グルコシルハイ
ドロキノンという）のピークが完全に消滅し、ハイドロ
キノンのピークが新たに出現した。このことより、グル
コシルハイドロキノンはハイドロキノンにグルコースが
α結合した配糖体であることがわかった。更に、グルコ
シルハイドロキノンの構造をＮＭＲ（ＪＮＭ−ＧＸ２７
０、ＪＥＯＬ社製）により確認したところ、上記と同様
の結果が確認された。またＮＭＲ分析の結果を図８に示
した。尚、この作用による糖転移率は、約２７％であっ
た。また、上記反応液に、反応開始６〜１５時間後に、
新たに供与体となるマルトペンタオース等を加えること
により更に糖転移率をあげることができた。反応開始６
時間後にマルトペンタオースを５％となるように添加し
た場合の糖転移率は、約４０％であった。

【００２５】（実施例３）カテキン２％及びマルトペン
タオース１０％を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５に調
製する）に溶解した。この溶液１ｍｌに、６単位のアミ
ラーゼ活性を有する本酵素液１ｍｌを添加し４０℃にお
いて１６時間反応を行なった。この反応液をＨＰＬＣに
より分析（ＯＤＳカラムＲＰ−１８を用い、アセトニト
リルと酢酸エチルと０．０５％リン酸とが１２部２部８
６部から成る溶液により溶出し２８０ｎｍにより検出し
た）したところ、未反応のカテキン以外に新たにカテキ
ンの配糖体のピークを確認した。さらに、この反応液に
ついてα−グルコシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）による
処理を行ない同様のＨＰＬＣ分析を行なったところ、カ
テキンの配糖体のピークが消滅し未反応のカテキンのピ
ークが増加した。このことよりカテキンの配糖体は、カ
テキンにグルコースがα結合した化合物であることを確
認した。尚、本反応における糖転移率は、約２５％であ
った。

【００２６】（実施例４）エピガロカテキン２％及びマ
ルトペンタオース１０％を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．５に調製する）に溶解した。この溶液１ｍｌに、６
単位のアミラーゼ活性を有する本酵素液１ｍｌを添加し
４０℃において１６時間反応を行なった。この反応液を
ＨＰＬＣにより分析（ＯＤＳカラムＲＰ−１８を用い、
アセトニトリルと酢酸エチルと０．０５％リン酸とが１
２部２部８６部から成る溶液により溶出し、で２８０ｎ
ｍにより検出した）したところ、未反応のエピガロカテ
キン以外に新たにエピガロカテキンの配糖体のピークを
確認した。さらに、この反応液についてα−グルコシダ
ーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）による処理を行ない同様のＨ
ＰＬＣ分析を行なったところ、エピガロカテキンの配糖
体のピークが消滅し未反応のエピガロカテキンのピーク
が増加した。このことよりエピガロカテキンの配糖体
は、エピガロカテキンにグルコースがα結合した化合物
であることを確認した。尚、本反応における糖転移率
は、約２８％であった。

【００２７】（実施例５）エピカテキンガレート２％及
びマルトペンタオース１０％を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．５に調製する）に溶解した。この溶液１ｍｌに、
６単位のアミラーゼ活性を有する本酵素液１ｍｌを添加
し４０℃において１６時間反応を行なった。ＨＰＬＣに
より分析（ＯＤＳカラムＲＰ−１８を用い、アセトニト
リルと酢酸エチルと０・０５％リン酸とが１２部２部８
６部から成る溶液により溶出し２８０ｎｍにより検出し
た）したところ、未反応のエピカテキンガレート以外に
新たにエピカテキンガレートの配糖体のピークを確認し
た。さらに、この反応液についてα−グルコシダーゼ
（ＴＯＹＯＢＯ社製）による処理を行ない同様のＨＰＬ
Ｃ分析を行なったところ、エピカテキンガレートの配糖
体のピークが消滅し未反応のエピカテキンガレートのピ
ークが増加した。このことよりエピカテキンガレートの
配糖体は、エピカテキンガレートにグルコースがα結合
した化合物であることを確認した。尚、本反応における
糖転移率は、約１３％であった。

【００２８】（実施例６）エピガロカテキンガレート２
％及びマルトペンタオース１０％を２０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５に調製する）に溶解した。この溶液１ｍｌ
に、６単位のアミラーゼ活性を有する本酵素液１ｍｌを
添加し４０℃において１６時間反応を行なった。この反
応液をＨＰＬＣにより分析（ＯＤＳカラムＲＰ−１８を
用い、アセトニトリルと酢酸エチルと０．０５％リン酸
とが１２部２部８６部から成る溶液により溶出し２８０
ｎｍにより検出した）したところ、未反応のエピガロカ
テキンガレート以外に新たにエピガロカテキンガレート
の配糖体のピークを確認した。さらに、この反応液につ
いてα−グルコシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）による処
理を行ない同様のＨＰＬＣ分析を行なったところ、エピ
ガロカテキンガレートの配糖体のピークが消滅し未反応
のエピガロカテキンガレートのピークが増加した。この
ことよりエピガロカテキンガレートの配糖体は、エピガ
ロカテキンガレートにグルコースがα結合した化合物で
あることを確認した。尚、本反応における糖転移率は、
約１２％であった。

【００２９】（実施例７）エピカテキン２％及びマルト
ペンタオース１０％を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５
に調製する）に溶解した。この溶液１ｍｌに、６単位の
アミラーゼ活性を有する本酵素液１ｍｌを添加し４０℃
において１６時間反応を行なった。この反応液をＨＰＬ
Ｃにより分析（ＯＤＳカラムでＲＰ−１８を用い、アセ
トニトリルと酢酸エチルと０．０５％リン酸ちが１２部
２部８６部から成る溶媒により溶出し２８０ｎｍにより
検出した）したところ、未反応のエピカテキン以外に新
たにエピカテキンの配糖体のピークを確認した。さら
に、この反応液についてα−グルコシダーゼ（ＴＯＹＯ
Ｂ０社製）による処理を行ない同様のＨＰＬＣ分析を行
なったところ、エピカテキンの配糖体のピークが消滅し
未反応のエピカテキンのピークが増加した。このことよ
りエピカテキンの配糖体は、エピカテキンにグルコース
がα結合した化合物であることを確認した。尚、本反応
における糖転移率は、約２３％であった。

【００３０】（実施例８）３，４ジメトキシフェノール
２％及びマルトペンタオース１０％を２０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．５に調製する）に溶解した。この溶液１ｍ
ｌに、６単位のアミラーゼ活性を有する本酵素液１ｍｌ
を添加し４０℃において１６時間反応を行なった。この
反応液をＨＰＬＣにより分析（ＯＤＳカラムＲＰ−１８
を用い、２５％メタノールで溶出し、２８０ｎｍにより
検出した）したところ、未反応の３，４ジメトキシフェ
ノール以外に新たに３，４ジメトキシフェノールの配糖
体のピークを確認した。さらに、この反応液についてα
−グルコシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）による処理を行
ない同様のＨＰＬＣ分析を行なったところ、３，４ジメ
トキシフェノールの配糖体のピークが消滅し未反応の
３，４ジメトキシフェノールのピークが増加した。この
ことより３，４ジメトキシフェノールの配糖体は、３，
４ジメトキシフェノールにグルコースがα結合した化合
物であることを確認した。

【００３１】（実施例９）３，５ジメトキシフェノール
２％及びマルトペンタオース１０％を２０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．５に調製する）に溶解した。この溶液１ｍ
ｌに、６単位のアミラーゼ活性を有する本酵素液１ｍｌ
を添加し４０℃において１６時間反応を行なった。この
反応液をＨＰＬＣにより分析（ＯＤＳカラムＲＰ−１８
を用い、２５％メタノールで溶出し、２８０ｎｍにより
検出した）したところ、未反応の３，５ジメトキシフェ
ノール以外に新たに３，５ジメトキシフェノールの配糖
体のピークを確認した。さらに、この反応液についてα
−グルコシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）による処理を行
ない同様のＨＰＬＣ分析を行なったところ、３，５ジメ
トキシフェノールの配糖体のピークが消滅し未反応の
３，５ジメトキシフェノールのピークが増加した。この
ことより３，５ジメトキシフェノールの配糖体は、３，
５ジメトキシフェノールにグルコースがα結合した化合
物であることを確認した。

【００３２】（実施例１０）２，３ジメトキシフェノー
ル２％及びマルトペンタオース１０％を２０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．５に調製する）に溶解した。この溶液１
ｍｌに、６単位のアミラーゼ活性を有する本酵素液１ｍ
ｌを添加し４０℃において１６時間反応を行なった。こ
の反応液をＨＰＬＣにより分析（ＯＤＳカラムＲＰ−１
８を用い、２５％メタノールで溶出し、２８０ｎｍによ
り検出した）したところ、未反応の２，３ジメトキシフ
ェノール以外に新たに２，３ジメトキシフェノールの配
糖体のピークを確認した。さらに、この反応液について
α−グルコシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）による処理を
行ない同様のＨＰＬＣ分析を行なったところ、２，３ジ
メトキシフェノールの配糖体のピークが消滅し未反応の
２，３ジメトキシフェノールのピークが増加した。この
ことより２，３ジメトキシフェノールの配糖体は、２，
３ジメトキシフェノールにグルコースがα結合した化合
物であることを確認した。

【００３３】（実施例１１）アセトアミノフェノン２％
及びマルトペンタオース１０％を２０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５に調製する）に溶解した。この溶液１ｍｌ
に、６単位のアミラーゼ活性を有する本酵素液１ｍｌを
添加し４０℃において１６時間反応を行なった。この反
応液をＨＰＬＣにより分析（ＯＤＳカラムＲＰ−１８を
用い、２５％メタノールで溶出し、２８０ｎｍにより検
出した）したところ、未反応のアセトアミノフェノン以
外に新たにアセトアミノフェノンの配糖体のピークを確
認した。さらに、この反応液についてα−グルコシダー
ゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）による処理を行ない同様のＨＰ
ＬＣ分析を行なったところ、アセトアミノフェノンの配
糖体のピークが消滅し未反応のアセトアミノフェノンの
ピークが増加した。このことよりアセトアミノフェノン
の配糖体は、アセトアミノフェノンにグルコースがα結
合した化合物であることを確認した。

【００３４】

【発明の効果】本発明により、新規のアミラーゼＸ−２
３が提供された。本酵素はハイドロキノン、カテキン及
びエピガロカテキンに２５％以上の糖転移率でα結合に
よる糖転移を行なう。また、ハイドロキノン、カテキン
及びエピガロカテキン以外のフェノール性ＯＨ基及びフ
ラボノイド類縁化合物中のＯＨ基に、マルトオリゴ糖、
アミロース、アミロペクチン及び各種スターチ等のα−
１，４結合を持つグルカンからα結合による糖転移を行
なう。

【００３５】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は可溶性デンプンを基質とした場合の本酵
素による加水分解の至適ｐＨ及び安定ｐＨを示す。縦軸
は、ｐＨ７における本酵素の加水分解活性を１００にし
たときの、相対活性を示す。横軸は、反応ｐＨを示す。

【図２】図２は可溶性デンプンを供与体、ハイドロキノ
ンを受容体とした場合の、本酵素が糖転移を行なう至適
ｐＨ及び安定ｐＨを示す。縦軸は、ｐＨ５における本酵
素による糖転移率を１００とした相対活性を示す。横軸
は、反応ｐＨを示す。

【図３】図３は本酵素のｐＨ５．５における至適温度、
及び熱安定性を示す。縦軸は５０℃における糖転移率を
１００とした相対活性を示す。横軸は反応温度を示す。

【図４】図４は本酵素の各種阻害剤に対する影響を示
す。本酵素８単位を含有する溶液（ｐＨは５．５に調製
する）に下記に示す化合物を１００ｍＭ存在させ、４０
℃で１時間処理した後、アミラーゼ活性測定法に準じて
残存活性の測定を行なった。

【図５】図５は本酵素の紫外線吸収スペクトルを示す。
縦軸は吸光度を示す。横軸は波長を示す。

【図６】図６は本酵素のアミノ酸組成を示す。

【図７】図７は本酵素のスーパーロース１２カラムクロ
マトグラフィーによる溶出曲線を示す。縦軸は２８０ｎ
ｍの吸光度及び酵素活性を示す。横軸はフラクション番
号を示す。

【図８】図８は本酵素の作用により得られたハイドロキ
ノングルコサイドのプロトンＮＭＲ分析を示す。

フロントページの続き (72)発明者 滝井 寛 大阪府大阪市西淀川区野里１丁目30−４ (72)発明者 寺田 喜信 大阪府大阪市西淀川区野里１丁目30−４ 審査官 村上 騎見高

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的性質を有することを特徴と
   するアミラーゼＸ−２３ 記 １．作用 フェノール類縁化合物又はフラボノイド類縁化台物等の
   受容体が存在しなければ、マルトオリゴ糖、アミロー
   ス、アミロペクチン、各種スターチ等のα−１，４結合
   を持つグルカンを分解（加水分解）する。しかし、フェ
   ノール類縁化合物又はフラボノイド類縁化合物及びマル
   トオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、各種スター
   チ等のα−１，４結合を持つグルカンが同時に存在すれ
   ば、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、各
   種スターチ等のα−１，４結合を持つグルカンを分解す
   ると共にフェノール類縁化合物又はフラボノイド類縁化
   合物中のＯＨ基に、α結合で糖転移を行なう。 ２．受容体特異性 ハイドロキノン又はジメトキシフェノール等フェノール
   類縁化合物中のフェノール性ＯＨ基もしくはフラボン、
   イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバノノ
   ール、カテキン、オーロン、アントシアニジン、カルコ
   ン又はジヒドロカルコン等のフラボノイド類縁化合物中
   のＯＨ基に、α結合で糖転移を行なう。 ３．至適ｐＨおよび安定ｐＨ 可溶性デンプンを加水分解した場合、至適ｐＨはｐＨ６
   〜７であり、安定ｐＨはｐＨ５〜８である（図１）。ハ
   イドロキノンに糖転移を行なう場合、至適ｐＨはｐＨ５
   〜８であり、安定ｐＨはｐＨ４〜１３である（図２）。 ４．力価測定法 （α−アミラーゼ活性測定法） アミラーゼ活性は、次のようにして測定される。４０℃
   にインキュベーションした酵素液５０μｌに４０℃にイ
   ンキュベーションした１．５％可溶性デンプン（４０ｍ
   Ｍ酢酸−Ｎａ緩衝溶液によりｐＨ５．５に調製する）２
   ００μｌを添加し、４０℃で１０分間反応させる。この
   反応液に、０．５Ｎ酢酸と０．５Ｎ塩酸とを５：１に混
   合した液２ｍｌ添加して撹拌することにより反応を停止
   させる。この溶液０．１ｍｌを採取し、０．００５％ヨ
   ウ素及び０．０５％ヨウ化カリウムを含有する溶液５ｍ
   ｌを添加して撹拌し、室温にて２０分間放置する。この
   溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度
   をＣとする。別にブランクとして上記酵素液の代わりに
   精製水を用いた溶液を調整し同様の操作を行なって得ら
   れた吸光度をＢとする。このようにして得られたＣ及び
   Ｂからアミラーゼ活性Ａが次式によって得られる。 Ａ＝（Ｂ−Ｃ）／Ｂ ×１０ ただし、アミラーゼ活性の１単位はＢ値の１０％である
   とする。 ５．作用適温の範囲 ｐＨ５．５において３０℃から７０℃まで安定して糖転
   移を行なう（図３）。 ６．阻害剤 銅イオン及び亜鉛イオンに阻害されるが、ＥＤＴＡ、カ
   ルシウムイオン、マンガンイオン、バリウムイオン、マ
   グネシウムイオン及びコバルトイオンの阻害をほとんど
   受けない（図４）。 ７．失活の条件 １００℃において１５分間処理すると完全に失活する。 ８．精製方法 培養液から菌体を除去した後、硫安（８０％飽和）によ
   る塩析を行ない得られた沈殿を溶かし透析を行なう。こ
   れをＱ−セファロースカラムクロマトグラフィー（ｐＨ
   ５．５の０〜０．５ＭＮａＣｌ濃度勾配を用いる）にか
   けた後、透析を行なう。ついでフェニルセファロースカ
   ラムクロマト（０．８Ｍ〜０Ｍ硫安濃度勾配を用いる）
   にかけた後、透析を行なう。透析内液をスーパーロース
   １２によるゲルろ過を行ない凍結乾燥後、精製標品を得
   る。このような方法で精製した本酵素は、ＳＤＳ−ポリ
   アクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを示す。 ９．分子量 約６５０００である（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
   電気泳動による）。 １０．紫外線吸収スペクトル 極大吸収は２６７ｎｍであり、極小吸収は２５２ｎｍで
   ある（図５）。 １１．アミノ酸分析 アミノ酸組成は、図６のとおりである。